CN108866148A - 一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法 - Google Patents

一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于有机化学技术领域，公开了一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法，步骤一，对MCF‑7细胞增殖抑制率，随着蛇毒浓度的升高2.5μg/ml‑40μg/ml，MCF‑7的抑制率表现为上升的趋势；HE染色后，显微镜下观察；AO/EB荧光染色，凋亡的细胞染色较深，荧光较亮，且形态呈圆状或固缩状、团块状结构；Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下可观察；MCF‑7细胞由腹蛇蛇毒处理24h后，经AnnexinV‑FITC/PI双染流式细胞术得出流式图，左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。

Description

一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法
技术领域
本发明属于有机化学技术领域，尤其涉及一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药 物的检测方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：湘西是五步蛇原产地。自古以来蛇 毒是宝，五步蛇蛇毒居首，素有“软黄金”之称，但比黄金珍贵。湘西人用蛇 毒救人，可追溯到远古时期。湘西人招蛇术，就是最早使用蛇毒的见证。《本 草纲目》载：“蛇，春出冬藏，善于收藏阳气、修身养性，全身是宝。”《神 农本草经》载：“内达脏腑，外彻肌肤，活血祛风，清除百毒，补精气、补中 气”。中国是最早使用蛇疗治病的国家之一。蛇类入药我国历代传统中医名著都有详尽的记载，并得到广泛的应用，如西汉的《神农本草》、梁的《本草经 集注》、宋的《开宝本草》、明的《本草纲目》、《本草图经》、《本草拾遗》 和《中国毒蛇学文献》、《贵州药用动物药典》、《中华人民共和国药典》、 《中药大词典》、《中国动物药》等。中国专利申请号：2016102149912，发明 名称：一种玉液琼浆乳状酒及其制备方法，发明公开了一种玉液琼浆乳状酒， 包括调制酒及食用胶，所述调制酒及食用胶的重量比为99.1-99.7；所述调制酒包括以下重量份的原料：公丁香8-12份、桂花4-6份、糯米788-1182份、冰糖 39.4-118.2份。其制备方法为将食用胶加入到热水中密闭搅拌至所述食用胶完全 融化，得食用胶溶液；将调制酒与食用胶溶液混合均匀后灌装、冷藏得乳状酒。 上述发明虽然公开了乳状酒的制作，但是却无法实现蛇毒乳状酒制备，不能使 新鲜蛇毒稳定悬浮于白酒酒液中并且保持蛇毒酶活性。
综上所述，现有技术存在的问题是：调制酒无法实现蛇毒乳状酒制备，不 能使新鲜蛇毒稳定悬浮于白酒酒液中并且保持蛇毒酶活性。如果单纯的将蛇毒 原液混入白酒酒液中，那白酒中的乙醇成分会使蛇毒酶中活性成分变性且使蛇 毒缩水聚体程絮凝状态无法真正溶于酒液中，这样的话在使用药剂时就无法真 正发挥蛇毒中活性酶成分对体内癌细泡的抑制作用甚至很可能会出现使用者蛇 毒中毒的情况。
解决上述技术问题的难度和意义：
难度在于要使蛇毒均匀且充分的融于白酒酒液当中的同时还要保持蛇毒酶 的活性成分不能变性，这样就必须添加其它合适的成分以达到配成能有效抑制 癌细胞的蝮蛇蛇毒药剂。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药 物的检测方法。
本发明是这样实现的，一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法，所 述抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法包括：
步骤一，对MCF-7细胞增殖抑制率，随着蛇毒浓度的升高2.5μg/ml-40μg/ml， MCF-7的抑制率表现为上升的趋势；
步骤二，HE染色后，显微镜下观察，正常细胞，胞浆被伊红染成不同程度 的粉红色或桃红色，胞核被苏木素染成的蓝色，细胞结构清晰，边界清楚；经 蝮蛇蛇毒处理24h后，细胞体积缩小，胞质致密，形成致密质块，核染色质致 密深染，可见凋亡小体；
步骤三，AO/EB荧光染色，凋亡的细胞染色较深，荧光较亮，且形态呈圆 状或固缩状、团块状结构；MCF－7细胞经蝮蛇蛇毒处理24h后，早期凋亡细胞 包膜完整任然呈现绿色荧光但核染色质固缩，晚期凋亡细胞包膜破损，呈橘红 色荧光，坏死细胞亦是橘红色荧光；
步骤四，Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下可观察到，正常的MCF －7细胞呈均匀蓝色，色泽清楚，边界清晰；新鲜蝮蛇蛇毒处理24h后的MCF －7细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白；
步骤五，MCF-7细胞由腹蛇蛇毒处理24h后，经AnnexinV-FITC/PI双染流 式细胞术得出流式图，左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，右上象限为 晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。
进一步，所述步骤三四种细胞形态：活细胞：绿色荧光并呈正常结构；早 期凋亡细胞：绿色荧光且核染色质呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞：橘红色 荧光且核染色质呈固缩状或圆珠状；坏死细胞：橘红色荧光形似鬼影状。
本发明的另一目的在于提供一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物，所述抑制 人乳腺癌细胞增殖的药物为蛇毒。
本发明的另一目的在于提供一种蛇毒在抑制人乳腺癌细胞增殖中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过科学的配伍，利用稳 定剂，解决了新鲜蛇毒于酒液中不能保持抑制人乳腺癌细胞活性的问题，本发 明中制备的蛇毒乳状酒具有抑制人乳腺癌细胞生长的作用，抑制率达到20％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法流程 图。
图2是本发明实施例提供的蝮蛇蛇毒处理24h后HE染色结果示意图；
图2中：A：对照组,B,C,D,E,F:2.5,.5,10,20,40μg/ml组。
图3是本发明实施例提供的蛇毒处理24h后AO/EB染色结果示意图；
图3中：A：对照组,B,C,D,E,F:2.5,5,10,20,40μg/ml组。
图4是本发明实施例提供的蝮蛇蛇毒处理24h后Hoechst33258染色结果 示意图；
图4中：对照组,B,C,D,E,F:2.5,5,10,20,40μg/ml组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的目的在于克服现有技术中不能使新鲜蛇毒在酒液中保持蛇毒抑制 人乳腺癌细胞生长的活性问题，提供一种蛇毒酒制备方法，通过本发明实现新 鲜蛇毒酒液保持抑制人乳腺癌细胞生长活性的制备方法。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例提供的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物为蛇毒。
如图1所示，本发明实施例提供的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方 法包括以下步骤：
S101：将白酒与稳定剂溶液以体积比19：1混合，搅拌；
S102：将新鲜蛇毒加入制备的含有白酒和稳定剂溶液的混合液中，搅拌；
S103：将混合液，以MTT法检测对人子宫颈癌细胞生长的作用。
下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述。
1 对MCF-7细胞增殖抑制率
MTT结果显示(表1)，随着蛇毒浓度的升高(2.5μg/ml-40μg/ml)，MCF-7 的抑制率表现为上升的趋势，呈浓度依赖性，各实验组与对照组比有统计学意 义(P＜0.05)；另外随着时间的延长(12-48h)，MCF－7的抑制率同样逐渐上 升，亦有时间依赖性(P＜0.05)。
2 HE染色
HE染色后，显微镜下观察，正常细胞，胞浆被伊红染成不同程度的粉红色 或桃红色，胞核被苏木素染成的蓝色，细胞结构清晰，边界清楚。经蝮蛇蛇毒 处理24h后，细胞体积缩小，胞质致密，形成致密质块，核染色质致密深染， 可见凋亡小体(图2)。
3 AO/EB荧光染色
吖啶橙(AO)能透过完整的细胞膜，使细胞呈现绿色荧光。溴乙啶(EB)不能 透过完整的细胞膜，仅能透过受损的细胞膜，发橘红色荧光。凋亡的细胞染色 较深，荧光较亮，且形态呈圆状或固缩状、团块状结构。正常细胞核呈现荧光 的深浅不一且具有清晰的结构。二者形态相异，容易区分。在荧光显微镜下观 察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)：绿色荧光并呈正常结构；早期凋亡细胞 (VA)：绿色荧光且核染色质呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞(NVA)：橘红色荧 光且核染色质呈固缩状或圆珠状；坏死细胞(NVN)：橘红色荧光形似鬼影状。
荧光显微镜下可观察到，对照组细胞胞膜完整，结构清楚，呈绿色荧光； MCF－7细胞经蝮蛇蛇毒处理24h后，早期凋亡细胞包膜完整任然呈现绿色荧光 但核染色质固缩，晚期凋亡细胞包膜破损，呈橘红色荧光，坏死细胞亦是橘红 色荧光(图3)。
近年来，陆续有报道，蝮蛇，眼镜蛇，金环蛇，银环蛇等多种蛇毒能够促 进肺癌细胞及内皮细胞的凋亡，并且可以从不同受体、破坏细胞膜、破坏线粒 体、细胞周期、信号转到等多方面发挥作用。
4 Hoechst33258荧光染色
由于细胞凋亡后染色质会固缩，Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下 可观察到，正常的MCF－7细胞呈均匀蓝色，色泽清楚，边界清晰。新鲜蝮蛇 蛇毒处理24h后的MCF－7细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色 有些发白(图4)。
5 流式细胞术检测细胞凋亡
MCF-7细胞由腹蛇蛇毒处理24h后，经AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术 得出流式图，左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，右上象限为晚期凋亡 细胞，右下象限为早期凋亡细胞。各浓度组(2.5,.5,10,20,40μg/ml)的凋亡率 分别为(8.92±0.09)、(17.42±0.21)、(31.56±0.19)、(56.13±0.11)、(70.97±0.17)， 相比于对照组(0.64±0.15)要高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法，其特征在于，所述抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法包括：
步骤一，将白酒与稳定剂溶液以体积比19：1混合，搅拌；
步骤二，将新鲜蛇毒加入制备的含有白酒和稳定剂溶液的混合液中，搅拌；
步骤三，将混合液，以MTT法检测对人子宫颈癌细胞生长的作用。
2.如权利要求1所述的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法，其特征在于，所述抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法进一步包括：
步骤一，对MCF-7细胞增殖抑制率，随着蛇毒浓度的升高2.5μg/ml-40μg/ml，MCF-7的抑制率表现为上升的趋势；
步骤二，HE染色后，显微镜下观察，正常细胞，胞浆被伊红染成不同程度的粉红色或桃红色，胞核被苏木素染成的蓝色，细胞结构清晰，边界清楚；经蝮蛇蛇毒处理24h后，细胞体积缩小，胞质致密，形成致密质块，核染色质致密深染，可见凋亡小体；
步骤三，AO/EB荧光染色，凋亡的细胞染色较深，荧光较亮，且形态呈圆状或固缩状、团块状结构；MCF－7细胞经蝮蛇蛇毒处理24h后，早期凋亡细胞包膜完整任然呈现绿色荧光但核染色质固缩，晚期凋亡细胞包膜破损，呈橘红色荧光，坏死细胞亦是橘红色荧光；
步骤四，Hoechst33258荧光染色后，荧光显微镜下可观察到，正常的MCF－7细胞呈均匀蓝色，色泽清楚，边界清晰；新鲜蝮蛇蛇毒处理24h后的MCF－7细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白；
步骤五，MCF-7细胞由腹蛇蛇毒处理24h后，经Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术得出流式图，左下象限为活细胞，左上象限为坏死细胞，右上象限为晚期凋亡细胞，右下象限为早期凋亡细胞。
3.如权利要求2所述的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法，其特征在于，所述步骤三四种细胞形态：活细胞：绿色荧光并呈正常结构；早期凋亡细胞：绿色荧光且核染色质呈固缩状或圆珠状；晚期凋亡细胞：橘红色荧光且核染色质呈固缩状或圆珠状；坏死细胞：橘红色荧光形似鬼影状。
4.一种如权利要求2所述抑制人乳腺癌细胞增殖的药物的检测方法检测的抑制人乳腺癌细胞增殖的药物，其特征在于，所述抑制人乳腺癌细胞增殖的药物为蛇毒。
5.一种如权利要求4所述蛇毒在抑制人乳腺癌细胞增殖中的应用。
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