CN104673718B - 一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒，人肺炎支原体培养基包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5‑15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的禽蛋黄提取物含量为10‑100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2‑1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3‑1.0g/L。与现有技术相比，本发明的培养基在大量实践基础上进行实用创新设计，符合需要，确保临床Mp感染诊断的特异性、可靠性，同时体现使用方便、快速安全、环保及资源节约的要求。

Description

一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及一种支原体培养基及其诊断试剂盒，尤其是涉及一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒。

背景技术

被发现近百年的支原体是一类无细胞壁的原核细胞型微生物，介于病毒与细菌之间。目前已分离到150多种。与人类疾病有关的主要是肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae,Mp)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,简称Uu)及人型支原体(Mycoplasma hominis,简称Mh)等。Mp早就证明是非典型性肺炎的重要病原菌，诊断难度大，易引起并发感染，死亡率较高。2003年非典流行后，社区性呼吸道感染流行时，更加引起医疗界的关注。

Mp可进入血液，并可在呼吸系统以外的部位增殖，引起肺外并发症。并发症多出现于呼吸道症状后3～30d，常累及心血管系统、血液系统、中枢神经系统、皮肤及肝肾器官。随着对病原的不断认识和临床资料的不断积累，肺外感染的表现也越来越引起临床医生的关注和重视。

Mp的基因组小，仅是大肠杆菌的1/5～1/4，细胞小(小于100nm)且多形，有液体运动性；菌体集落小于1-2mm，肉眼难见，通常借助40-100倍显微镜检查计数。Mp生长繁殖的生理生化条件相对简单而自然地依附宿主组织细胞并有胞内生存的特点，难于人工培养且生长缓慢；与其他支原体的种间差异大，各有特点可用于分离、鉴别。此等造成临床诊断、治疗的困难，同时是研发技术的诀窍伏点。

国外Mp的培养分离有商品化的Difco、Oxoid等公司干燥基础基，法国生物梅里埃的成品培养基。液体培养常用试管、青霉素安培瓶，固体培养惯用圆形培养皿等，还有双相培养的，但是，均对习湿需CO₂的支原体的培养都不如人意。

商品液体培养基培养于37℃-38℃，4-7天，有的要10天后观察出报告。都以变色判断结果，有的阳性率低，有的出现假阳性。

我国对支原体基础及医院实验诊断的研究起步晚，多模仿国外方法，存在着临床培养阳性率低、易污染杂菌、出现假阳性等诸多问题，不能满足临床诊断治疗的需求；而且国内各实验室用于支原体的分离培养基，多数进口，价格昂贵；有的自制，质量不稳定，卫生管理部门已立法管理，促进研发创新产品。

Mp常用培养基为PPLO培养基，很多公司都有出售，但血清(常用马血清或猪血清)和抗生素自己添加，在液体培养基中通常要加入酚红做指示剂，当培养基由红色变为黄色时，即可判定Mp的生长。实际上，支原体的分离生长难，盲传几次，液体培养基变黄后，在固体培养基上出现典型菌落，才获得纯分离的菌株。

微生物学发展中，Mp曾称为“难养菌”，不但对营养要求严格，而且对培养环境中的湿度、温度、氧分压及基质pH等条件也很特殊。Mp生长繁殖的最适pH是7.4-7.6，60％～80％湿度环境。

传统的难养菌的分离培养及鉴定的方法，复杂、繁琐、易于污染、成本昂贵。本发明是从大量实践中总结经验而设计的，试制品能够满足临床诊断的特异性、可靠性要求，同时达到快速、安全、环保、资源节约。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种人肺炎支原体培养基及其诊断试剂盒。

本发明创新设计新的Mp培养基配方，适用于Mp感染引起非典型性肺炎病原体的分离培养及鉴别，而获取病原菌的临床诊断信息。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种人肺炎支原体培养基，包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5-15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的牛血清的含量为100ml/L，所述的禽蛋黄提取物含量为10-100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3-1.0g/L。

作为优选，每1000ml人肺炎支原体培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。

每1000mlTSB培养基含有以下成分：

所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm。

作为优选，所述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇。

所述的禽蛋黄提取物制备方法如下：

(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；

(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；

(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；

(4)用1N NaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。

所述的人肺炎支原体培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基灭菌后pH为7.4-7.6。

若使用固体培养基则每升培养基中加入琼脂10-15g。使用上述培养基时，再加入酚红指示剂、纳他霉素和氨苄青霉素，特别注意，在加氨苄青霉素时，要求先用蒸馏水(纯水)把小瓶内的粉剂氨苄青霉素充分溶解后再加到培养液中，同时要即用即配。

一种包括所述的人肺炎支原体培养基的诊断试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明的培养基能满足Mp选择性培养，以TSB配方为基础，还添加细胞培养基DMEM、蛋黄提取物等，有利于Mp的生长，在培养48-72h后，于固体培养基上可见菌落。培养基中若不加琼脂，即液体培养及药敏鉴定，40-44h可观察生长与否、报告结果。

(2)本发明的培养基选择性好：对怀疑Mp感染的患者标本(如痰、体液、组织等)检测，可以获得Mp病原菌的典型菌落，提供临床诊断信息；其他支原体(如Mh、Uu等)及常见细菌均不生长。

(3)本发明的培养基中添加有DMEM(dulbecco's modified eagle medium的缩写)，其特点是：氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；维生素含量为依格尔培养基的4倍；含有糖酵解途径中的重要物质—丙酮酸；含有微量元素金属离子。因此其适合于培养包括肺及肺癌细胞等多种细胞株。

(4)在原有支原体培养基中加入5-15％的DMEM，效果明显，突破支原体难培养的瓶颈。Mp生理生化特殊，生长繁殖加快，而且易与Uu/Mh鉴别。

(5)本发明的培养基中添加有禽蛋黄提取物，禽蛋黄提取物含有大量维生素A，维生素A系化合物是一种生物的有效的捕获活性氧的抗氧化剂，能防止脂质过氧化，参与糖蛋白的合成，对于上皮细胞的正常形成、发育与维持十分重要，也有利于支原体细胞生长繁殖及细胞膜糖蛋白等形成和稳定。故适当添加维生素A后，发现Mp生长繁殖加快了，使用本发明的支原体培养基，48-72h后，可40-100倍镜检到典型Mp菌落，也可见培养液变黄。对Mp分离培养、鉴别及药敏测定等检测、诊断报告提供方便。而一般市售同类产品，要4-7天甚至10天后，才能做出相同报告，因此使用本发明的培养基与试剂盒，能够提高时效性。

(6)本发明的培养基中添加有丙酮酸钠以及谷氨酰胺，其中，丙酮酸钠是重要的生理、能量代谢的中间体，谷氨酰胺能够促进支原体的生长，因此，本发明的培养基能够有利于支原体生长繁殖，适用于支原体的生理生化特殊性能。

(7)本发明的培养基在大量实践基础上进行实用创新设计，试制品验证使用符合需要，确保临床Mp感染诊断的特异性、可靠性，同时体现使用方便、快速安全、环保及资源节约的要求。

附图说明

图1为人肺炎支原体菌落的显微镜镜检图一；

图2为人肺炎支原体菌落的显微镜镜检图二。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

人肺炎支原体液体培养基制备：

配制与包装：

1、根据要配制培养基的数量，称量试剂，充分混合，(如固体培养基加琼脂10-15g)。

其中，禽蛋黄提取物制备方法如下：(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；(4)用1N NaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。

2、再加入酚红指示剂、纳他霉素和氨苄青霉素，特别注意，在加氨苄青霉素时，要求先用蒸馏水(纯水)把小瓶内的粉剂氨苄青霉素充分溶解后再加到培养液中，同时要即用即配。

3、有菌配制后，初步0.45um滤膜过滤。

4、初步过滤好的培养基，用稀酸碱调节pH到7.2～7.8，再用0.22um滤膜无菌过滤，在100级超净工作台上，无菌操作技术分装。用灭菌的5ml安瓿瓶，装量3-4ml/瓶，盖好橡胶塞及铝制封盖。分装好的安瓿瓶，存放中间体仓库，按质控工艺条件，取样做中间品质量检测。

5、中间体检验合格后，贴标签。

6、按试剂盒要求，在包装车间分装成品的小包装。20人份/盒。

7、在包装车间，完成产品大包装。

使用本实施例所配制的人肺炎支原体液体培养基进行人肺炎支原体培养后，36h后，用100倍奥林巴斯显微镜镜检到典型Mp菌落，如图1、图2所示，呈典型荷包蛋型，也可见培养液变黄。比市面上同类培养基培养速度快很多。

实施例2

人肺炎支原体液体培养基制备：

配制方法与实施例1相同。

实施例3

人肺炎支原体固体培养基——载玻片型培养盒的制备：

添加：

抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。

混合均匀后，无菌操作，取4-5ml加入培养盒，冷后盖好。

其他配制方法与实施例一相同。

实施例4

培养基的选择性验证

用质控菌株：解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，ATCC 27618，以下简称Uu)和人型支原体(Mycoplasma hominis，ATCC 23114，以下简称Mh)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，ATCC 15432，Mp)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)，大肠杆菌(ATCC 25922)，白色念珠菌(ATCC 10231)。在实施例3的液体培养基中培养，考察性能。结果如表1、表2所示：

表1人肺炎支原体临床检测试剂盒检验报告单

表1结果表明：3个支原体质控菌种，只有Mp在液体培养基中生长，在20h后，培养基由红变黄色；固体培养板上24-72h镜检出现荷包蛋状Mp典型菌落，菌落周围培养基渐变成黄色。表明本培养基具有Mp的选择生长特性。

表2人肺炎支原体临床检测试剂盒检验报告单

表2结果表明：3个质控菌种都不生长。

实验结论：通过标准菌种，即质控菌株：解脲支原体(Ureaplasma urealyticum，ATCC 27618，以下简称Uu)和人型支原体(Mycoplasma hominis，ATCC 23114，以下简称Mh)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，ATCC 15432，Mp)、金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)，大肠杆菌(ATCC 25922)，白色念珠菌(ATCC 10231)等培养观察，培养基平板上只有Mp菌种有荷包蛋状典型菌落生长；接种Mp的液体培养基由红色变黄色；且性能稳定。其他菌种都不生长，培养基红颜色不变。

实施例5：临床标本验证

随机选取3个临床细菌检验标本：

(1)接种—随机取本品3套，将各个标本的悬液用移液器取样100微升，分别滴加于实施例3的培养基表面上，让其自然摊平；

(2)在有CO₂环境下，于37℃恒温箱培养。

(3)结果观察—在培养18、24、36、48小时后观察结果，记录。

本实施例的临床标本验证报告单如表3所示，

表3人肺炎支原体临床检测试剂盒检验报告单

结果表明：3个尿道-生殖道标本培养都无菌生长，培养基红色不变色。选择性好。

结果分析：以上3个检验标本20130804、20130812及20130824使用本试剂盒检测结果表明：标本1，Uu培养阳性，有Uu感染；标本2，有淋病奈瑟氏菌感染；未见支原体。标本3，病原菌培养表明是Ng、Uu的混合感染。而用本品检测，都无菌生长，表明本品的特异性，仅适合Mp的分离培养及鉴定。

实施例6

临床支原体标本验证：临床诊断为“非典型性肺炎”痰液标本三份

本实施例的临床标本验证报告单如表4所示，

表4人肺炎支原体临床检测试剂盒检验报告单

检验结果：标本201203经72小时都无Mp生长，培养基红色不变；标本201233、201247经24小时，培养基颜色由红变成橘红色，36小时变成黄色，培养板镜检有Mp典型菌落。本品在非典型性肺炎的Mp检测有实用性。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，包括TSB培养基与添加剂，所述的添加剂包括牛血清、DMEM、禽蛋黄提取物、丙酮酸钠以及谷氨酰胺，所述的DMEM含量为人肺炎支原体培养基总含量的5-15％(体积分数)，以人肺炎支原体培养基总体积计，所述的牛血清的含量为100ml/L，所述的禽蛋黄提取物含量为10-100ml/L，所述的丙酮酸钠含量为0.2-1.0g/L，所述的谷氨酰胺含量为0.3-1.0g/L；

所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm；

所述的人肺炎支原体培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基灭菌后pH为7.4-7.6。

2.根据权利要求1所述的一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，每1000ml人肺炎支原体培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。

3.根据权利要求1所述的一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，每1000mlTSB培养基含有以下成分：

4.根据权利要求1所述的一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇。

5.根据权利要求1～4中任一所述的一种人肺炎支原体培养基，其特征在于，所述的禽蛋黄提取物制备方法如下：

(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；

(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；

(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；

(4)用1N NaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。

6.一种包括权利要求1所述的人肺炎支原体培养基的诊断试剂盒。