CN102888441A - 肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肺炎支原体检测技术领域，具体公开了一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括培养管、药敏鉴别板、以及盛装有无菌矿物油的容器单元，在培养管中盛装有基础液、促生长剂、生长指示剂、以及杂菌抑制剂，药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区。本发明通过培养液配方中杂菌抑制剂的设计，解决了细菌和真菌引起的假阳性问题；本发明通过培养液配方中促生长剂、生长指示剂的设计，解决了检测时间过长问题；本发明通过鉴别区的设计，解决了其它支原体引起的假阳性问题；本发明通过药敏区的设计，解决了快速准确的Mp药敏试验问题。因此，本发明能够有效避免假阳性，且检测周期更短。

Description

肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种肺炎支原体检测技术领域，具体涉及一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，以及采用该试剂盒检测肺炎支原体的检测方法。

背景技术

肺炎支原体(myeoplasmapneumoniae，Mp)是介于细菌和病毒之间、兼性厌氧、能独立生活的最小微生物，经呼吸道传播，是呼吸道感染的主要病原体，其引起的支原体肺炎占非细菌性肺炎的1/3以上。

临床检测肺炎支原体(MP)感染的方法有以下几种：

1、检测血清中的Mp抗体：本法快速简便，阳性率高，但Mp抗体是人体受Mp感染刺激的产物，感染后数周才能检出，可维持数月至数年。因此，Mp抗体阳性结果与Mp感染不同步；

2、简单鉴别培养：本法培养基中含葡萄糖，仅靠分解葡萄糖产酸使指示剂变色原理对Mp进行鉴别，因许多微生物(包括非致病支原体)也能葡萄糖产酸，故检测假阳性常见；

3、选择鉴别培养：本法培养基中加有美兰和葡萄糖，因只有Mp等极少数微生物能在含美兰的培养液中生长而分解葡萄糖产酸，故结果较准确，故国外实验室多推荐采用；

4、Mp基因检测(PCR法)：本法直接检测Mp的基因，为临床提供Mp感染的直接依据，但对人员、环境、设备、试剂要求高，稍不慎则易出现假阳性及假阴性；

简单培养+药敏试验法：如专利CN101748187A、CN101555517A，由培养液和药敏微孔板组成。培养液属简单鉴别培养液，抑菌成分单一；药敏微孔板参照检测泌尿系统感染支原体(解脲支原体、人型支原体)使用的方法制备，不含选择鉴别(如美兰还原耐受)功能，难于无法避免细菌、真菌、其它支原体引起的假阳性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测周期短、且能够避免假阳性的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒以及检测方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用技术方案如下：

一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：

培养管，在所述培养管内盛装有：为Mp生长提供基本营养的基础液、提高Mp生长速度的促生长剂、指示MP生长进度的生长指示剂、以及抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂；

药敏鉴别板，该药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区；所述鉴别区包括四个鉴别微孔，所述四个鉴别微孔分别盛装有干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、以及β-内酰胺类药物(β-Lac)；所述药敏试验区包括14组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔，在各组药敏检测单元内分别盛装有红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、以及壮观霉素，其同一组药敏检测单元的两个药敏微孔中盛装的药物浓度不相同；以及

盛装有无菌矿物油的容器单元。

所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述基础液为支原体培养基基础、Hayflick培养基、改良马丁培养基中的任一种。

所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述促生长剂包括主成分和添加成分；所述主成分为浓度5％～20％的马血清或小牛血清；所述添加成分为酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、卵黄液中的一种或几种。

所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述生长指示剂包括葡萄糖、酚红、以及脱氢酶色原底物。

所述肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒中，所述杂菌抑制剂包括万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。

一种使用所述试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，包括以下步骤：

将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；

再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中；

将矿物油以1滴每孔的量添加至各个微孔中；

将试剂盒放置在35℃～37℃的环境下培养24～72小时，根据微孔颜色变化判定结果。

结果判断如下：

鉴别区：Arg-TTC-MB-β-Lac表现为黄-红-黄绿-黄为Mp，否则为其它支原体；

药敏区：同种药物低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均红，判敏感；低浓度(L)孔变黄、高浓度(H)孔红，判中敏；低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均黄，判耐药。

本发明的有益效果如下：

1、本发明通过培养液配方中杂菌抑制剂的设计，解决了细菌和真菌引起的假阳性问题；

2、本发明通过培养液配方中促生长剂、生长指示剂的设计，解决了检测时间过长问题；

3、本发明通过鉴别区的设计，解决了其它支原体引起的假阳性问题；

4、本发明通过药敏区的设计，解决了快速准确的Mp药敏试验问题。

具体实施方式

下面将结合具体实施方法来详细说明本发明，在本发明的示意性实施及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本发明的试剂盒由培养管、鉴别药敏板、无菌矿物油组成；

其中，培养管指装在西林瓶内的培养液，由基础液、促生长剂、生长指示剂、杂菌抑制剂组成，具体是：

基础液：目的是为Mp生长提供基本营养。可选市售的支原体培养基基础、Hayflick培养基(PPLO培养基)、改良马丁培养基中任一种，比例按说明书进行；

促生长剂：目的是提高Mp生长速度，缩短检测时间。主成分可选马血清、小牛血清中任一种，浓度在5％～20％间；添加成分可选用酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、自制卵黄液等成分，可单一或组合添加；

生长指示剂：由葡萄糖、酚红、脱氢酶色原底物组成，目的是使Mp稍有生长，培养液即出现颜色变化，从而缩短检测时间；

杂菌抑制剂：由万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、甲氧苄氨嘧啶(TMP)等组合而成L；可各种非支原体的杂菌生长，避免细菌、真菌引起的假阳性。

药敏鉴别板：有32个微孔，前4孔为鉴别区，后28孔为药敏试验区

鉴别区：孔内分别含干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、β-内酰胺类药物(β-Lac)，因Mp不分解精氨酸、还原TTC、耐受并还原美兰、耐受β-内酰胺类药物，表现为特殊的颜色谱，从而能确认检出物是否为Mp；

药敏区：共28微孔，2微孔/组，用于盛装14种不同的药物进行敏感性试验，同一组的两个微孔分别盛装不同浓度的相同药物。具体14种药物为红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、壮观霉素。

该试剂盒的具体制备如下：

1、培养管的制备

先分别配制各组分，后将各组分混合，3.6ml/瓶分装到西林瓶内即得。各组分制法为

基础液：称Hayflick培养基干粉38g，加蒸馏水750ml，溶解，调节pH7.4±0.2，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

促生长剂：酵母浸出粉3g溶于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤，与自制卵黄液20ml、小牛血清200ml混合；

生长指示剂：葡萄糖5g、脱氢酶色原底物50mg、0.4％酚红10ml、蒸馏水20ml混合溶解，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

杂菌抑制剂：取万古霉素10mg、二性霉素B5mg、多粘菌素B 25000U、甲氧苄氨嘧啶5mg溶解于10ml蒸馏水中，0.22um孔径的微孔滤膜过滤；

2、鉴别药敏板的制备

准备溶液：

鉴别微孔液：以甲醇为稀释剂，按浓度要求分别配制Arg、TTC、MB、β-Lac溶液，按100ul/孔计算，终浓度Arg为0.5％，TTC为0.05％，MB为0.2％，β-Lac为100mg/L；

药敏微孔液：以国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的判定药物敏感MIC值为低浓度标准(L)、耐受MIC值为高浓度标准(H)，以甲醇为稀释剂，分别配制14种药物的28种相应浓度的溶液；

包被：50ul/孔加至特定微孔中；

干燥：25℃避光干燥；

封装：装入铝箔袋封口。

使用该试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，包括以下步骤：

将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；

再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中；

将矿物油以1滴每孔的量添加至各个微孔中；

将试剂盒放置在35℃～37℃的环境下培养24～72小时，根据微孔颜色变化判定结果。

结果判断如下：

鉴别区：Arg-TTC-MB-β-Lac表现为黄-红-黄绿-黄为Mp，否则为其它支原体；

药敏区：同种药物低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均红，判敏感；低浓度(L)孔变黄、高浓度(H)孔红，判中敏；低浓度(L)孔、高浓度(H)孔均黄，判耐药。

以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：

培养管，在所述培养管内盛装有：为肺炎支原体(Mp)生长提供基本营养的基础液、提高肺炎支原体(Mp)生长速度的促生长剂、指示肺炎支原体(Mp)生长进度的生长指示剂、以及抑制其他杂菌生长的杂菌抑制剂；

药敏鉴别板，该药敏鉴别板包括鉴别区和药敏试验区；所述鉴别区包括四个鉴别微孔，所述四个鉴别微孔分别盛装有干燥的精氨酸(Arg)、氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)、美兰(MB)、以及β-内酰胺类药物(β-Lac)；所述药敏试验区包括14组药敏检测单元，每组药敏检测单元包括两个药敏微孔，在各组药敏检测单元内分别盛装有红霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、四环素、强力霉素、米诺环素、罗红霉素、左氧氟沙星、氧氟沙星、阿奇霉素、克拉霉素、斯帕沙星、环丙沙星、以及壮观霉素，其同一组药敏检测单元的两个药敏微孔中盛装的药物浓度不相同；以及

盛装有无菌矿物油的容器单元。

2.根据权利要求1所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于：

所述基础液为支原体培养基基础、Hayflick培养基、改良马丁培养基中的任一种。

3.根据权利要求1所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于：

所述促生长剂包括主成分和添加成分；

所述主成分为浓度5％～20％的马血清或小牛血清；

所述添加成分为酵母浸出粉、丙酮酸钠、半胱氨酸、异抗坏血酸、卵黄液中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于：

所述生长指示剂包括葡萄糖、酚红、以及脱氢酶色原底物。

5.根据权利要求1所述的肺炎支原体快速培养、鉴别与药敏的试剂盒，其特征在于：

所述杂菌抑制剂包括万古霉素、啶酸、二性霉素B、多粘菌素B、以及甲氧苄氨嘧啶(TMP)。

6.一种使用权利要求1所述试剂盒检测肺炎支原体的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

将样本拭子放入培养管的培养液中充分洗脱挤干；

再将培养液以100微升每孔(ul/孔)的量加入至药敏鉴别板的微孔中；

将矿物油以1滴每孔的量添加至各个微孔中；

将试剂盒放置在35℃～37℃的环境下培养24～72小时，根据微孔颜色变化判定结果。