CN104694425B - 泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用，每1000ml培养基含有以下成分：蛋白胨15g、胰胨15g、氯化钠5g、尿素5g、精氨酸5g、0.4％酚红10ml、牛血清50ml、DMEM 50‑150ml、自制生物因子5‑15ml，纯水加入定容至1000ml。与现有技术相比，本发明的培养基由于添加剂的加入，提高了培养基的性能及选择性，营养成分更丰富，容易满足Uu及Mh的生长繁殖要求，一般情况下，比传统培养基提早一天观察、报告结果。

Description

泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种培养基，尤其是涉及一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用。
背景技术
支原体(Mycoplasma)是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过0.22um滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。支原体于1898年由Nocard等首次分离出来，1956年正式命名为支原体(Mycoplasma)，在微生物分类中建立了一个新的独立的纲——柔膜体纲(Mollicutes)，并在近20年来迅速成为一门独立的微生物学的分支学科，即支原体学(Mycoplasmology)。
支原体是介于病毒与细菌之间微生物，目前已分离到150多种。与人类疾病有关的主要有肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,简称Uu)及人型支原体(Mycoplasma hominis,简称Mh)。Uu和Mh被国际公认为泌尿生殖道感染(俗称“性病”)的重要病原体。
支原体基因组小，一般仅是大肠杆菌的1/5～1/4，基因组中编码氨基酸和辅助因子生物合成的基因极少；缺乏能量代谢途径中所需的许多重要基因，如厌氧代谢途径、电子传递链、ED途径、发酵、糖异生和三羧酸循环等相关基因；对脂肪酸和磷脂代谢基因和调控基因较少。因此，支原体是氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化作出调整，仅在特定环境中生存。支原体细胞小(小于100nm)且多形，有液体运动性；菌体集落小于1-2mm，肉眼难见，通常借助40-100倍显微镜检查计数。因此，支原体生长繁殖的生理生化相对简单而自然地依附宿主组织细胞并有胞内生存的特点，人工培养生长缓慢；Uu/Mh种间差异大，可用于分离、鉴别。
总之，支原体的特殊性，造成临床诊断、治疗的困难，同时是研发技术的关键点。
具有数十年历史的国外支原体的培养分离培养基包括商品化的Difco、Oxoid等公司干燥基础基，法国生物梅里埃的成品培养基，均占有中国相当大的市场。法国生物梅里埃公司甚至把研发中心及一些大宗产品生产基地建在上海浦东高科技开发区。液体培养常用试管、青霉素安培瓶进行培养，固体培养惯用圆形培养皿等，还有双相培养基，市场上产品五花八门，真假难分，但是均对习湿需CO2的支原体的培养、鉴别及药敏测定存在各种各样、不如人意的问题。
目前Uu、Mh的单一培养基只能供一种支原体生长，在37℃-38℃温箱培养2-4天，观察、出结果。通常以培养基变色判断生长与否，有的阳性率低，有的是假阳性高。
解脲脲原体(Uu)是脲原体属中的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有15～25um，须在40～100倍显微镜下观察，故旧称T株。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，患者小便往往带有臊腥味。在培养基中加入尿素并以硫酸锰(菌落呈棕色)作指示剂极易与Mh等支原体作出鉴别。
人型支原体(Mh)可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长。用培养基培养时，营养要求比细菌高。由于它没有细胞壁，因此对青霉素等不敏感，但对四环素、卡那霉素、链霉素、氯霉素等作用于核蛋白体的抗生素等有杀伤作用，Mh对林可霉素敏感而对红霉素耐药，Uu则相反；支原体对热抵抗力差，通常55℃经15分钟处理即灭活。石碳酸、来苏儿易将其杀死。
泌尿生殖道感染Uu和/或Mh后，可出现尿道炎症状，男性可继发慢性前列腺炎，在检查前列腺液时，可见活泼、泳动的微生物群体。支原体还继续感染精道、精囊和睾丸，影响精子和精液的质量；主要通过性生活传播，初期患者大多无明显症状，后期可引起生殖系统炎症，是不孕不育的重要原因。女性的泌尿生殖道的带菌、发病情况更严重。
我国对支原体基础及医院实验诊断的研究起步晚，多模仿国外方法，存在着临床培养阳性率低、易污染杂菌、出现假阳性等诸多问题，不能满足临床诊断治疗的需求；而且国内各实验室用于支原体的分离培养基，多数进口，价格昂贵；有的自制，质量不稳定，卫生管理部门已立法管理，促进研发创新产品。
常规的支原体诊断方法与技术如下：
(1)基因诊断方法的建立：核酸杂交、PCR及连接酶链反应(LCR)具有快速、敏感、特异性高等优点，已成功用于支原体的检测，但操作不当可出现假阳性或假阴性结果。
(2)重组支原体抗原诊断：近年来将支原体种特异性和多型高度保守的表位编码基因重组以制备重组抗原，制备mAb，采用标记技术用于临床诊断，以ELISA快速测定支原体抗原较为普遍；放射核素标记因有辐射危害，已逐渐被非放射性标记物所替代。此外，支原体检验中微量化与自动化也是诊断的发展方向。
(3)培养检测：临床微生物培养，可见活菌、菌落，是最直接的方法，即谓“金标准”，临床20～48h即可出报告。目前方法不够完善。
目前，商业产品及文献中介绍的常用的支原体培养基如下：
最常用的基础培养基——Hayflick培养基(PPLO培养基)，牛心粉50g、蛋白胨10g、氯化钠5g、加14g琼脂粉为固体培养基。根据、Uu、Mh的需要，配制如下的培养基：
解脲支原体培养基：基础培养基70ml、马血清20ml、25％的酵母浸液10ml、30％尿素0.33ml、0.4％酚红0.5ml、制霉素0.001g、青霉素10万IU，pH 6.0。
人型支原体培养基：基础培养基70ml、马血清20ml、25％的酵母浸液10ml、30％L－精氨酸0.33ml、0.4％酚红0.5ml、制霉素0.001g、青霉素10万IU，pH 6.3。
由于解脲支原体培养基与人型支原体培养基的生长环境不同，并且生长所需要的成分不同，因此，现在还没有能够同时进行解脲支原体与人型支原体同时培养的培养基。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种成分较为简单、能够同时进行Uu与Mh培养的泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM 50-150ml，自制生物因子5-15ml；
纯水加入定容至1000ml。
作为优选，每1000ml培养基还含有以下抑制剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。
作为进一步优选，每1000ml培养基还含有以下成分：
添加剂：DMEM100ml、自制生物因子10ml、氨苄青霉素1百万单位、纳他霉素50mg；
纯水加入定容至1000ml。
所述的自制生物因子为禽蛋黄提取物，所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm。
作为优选，所述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇。
所述的禽蛋黄提取物制备方法如下：
(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；
(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；
(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；
(4)用1N NaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。
所述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为5.8-6.2，进一步优选，所述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为6.0-6.2。
所述的培养基在4℃-10℃下保存。
一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基的应用，，Uu和/或Mh的标本和/或新鲜培养物菌浓度达到104-106ccu/ml时，以1-5wt％的比例接种入培养基中，37℃～38℃温箱培养，18-22h后观测Uu培养情况，28-36h后观测Mh培养情况。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、此配方经过改良，添加剂的加入能够提高培养基的性能及选择性，营养成分更丰富，容易满足Uu及Mh的生长繁殖要求，如维生素A，具有抗氧化作用，有利防止氧自由基的有害作用；促进一些酶基因表达增加必须酶活性；有机硒是一些酶的活性中心的硒的供体，酶活提高有利于支原体的生长繁殖，一般情况下，比传统培养基提早一天观察、报告结果。
2、本发明的培养基有液体、固体的平行培养，容易比较，菌落观察，金标结果更直观。
3、本发明的培养基含尿素适合Uu需要、精氨酸适合Mh需要，而且pH调节至5.8-6.2，基本符合二者生长要求，Uu生长分解尿素产氨，很快使pH提高，指示剂由黄变红色，Uu可分解锰盐，菌落变为褐锈色，与Mh菌落有明显区别；而Mh存在，有精氨酸提供生长繁殖能源，培养基pH也会慢慢提高，达到更合适的6.0～7.5范围，可以快速生长，液体培养基，很快变为红色；固体平板上Mh的菌落一般比较大，它不分解锰盐，菌落呈灰白色。当Uu与Mh混合培养时，同时生长，培养基pH易提高，往往高于Uu的合适范围，此时，Uu生长繁殖不利，其菌落较小，而且，当pH高，红色深时，菌体死亡，不利于传种。
4、利用本发明培养基，做药敏测定时，利用Uu与Mh对红霉素(EM)及林可霉素(CLM)的天然耐药性(r)差异，可以作明确的鉴别：Uu属S-EM、r-CLM；Mh属r-EM、S-CLM。
附图说明
图1为镜检支原体培养的阳性结果镜检图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM 50ml，自制生物因子5ml；
纯水加入定容至1000ml。
其中，自制生物因子为禽蛋黄提取物，禽蛋黄提取物中含有维生素A、有机硒，还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇，其中维生素A含量为2～10u/ml，有机硒含量为0.2～2.0ppm。
禽蛋黄提取物禽蛋黄提取物制备方法如下：(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以1：2重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；(4)用1N NaoH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000RPM离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。
培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为5.8-6.0，培养基在4℃-5℃下保存。
实施例2
一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM 150ml，自制生物因子15ml；氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg；
纯水加入定容至1000ml。
自制生物因子的制备同实施例1。
培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为6.0-6.2，培养基在7℃-8℃下保存。
实施例3
一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM100ml、自制生物因子10ml、氨苄青霉素1百万单位、纳他霉素50mg；
纯水加入定容至1000ml。
自制生物因子的制备同实施例1。
培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为6.1-6.2，培养基在9℃-10℃下保存。
实施例4
一种如实施例3所述的泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基的应用，首先将培养基0.22um滤膜过滤除菌；在100级超净环境下无菌分装，Uu和/或Mh的标本和/或新鲜培养物菌浓度达到104-106ccu/ml时，以1-5wt％的比例接种入培养基中，37℃-38℃温箱培养，18-22h后观测Uu培养情况，28-36h后观测Mh培养情况。镜检支原体培养的阳性结果如图1所示，浅色菌落为人型支原体(Mh)，深色菌落是解脲脲原体(Uu)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM 50-150ml，自制生物因子5-15ml；
纯水加入定容至1000ml；
所述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为5.8-6.2；
所述的自制生物因子为禽蛋黄提取物，所述的禽蛋黄提取物中含有维生素A及有机硒，所述的维生素A含量为2～10u/ml，所述的有机硒含量为0.2～2.0ppm，所述的禽蛋黄提取物制备方法如下：
(1)取新鲜富硒鸡蛋置入70v/v％乙醇溶液中浸泡30分钟；
(2)在超净工作台上无菌操作取蛋黄，将蛋黄置于无菌烧瓶中；
(3)向含有蛋黄的无菌烧瓶中以蛋黄和乙醇重量比为1：2的重量比例，加入90v/v％乙醇，充分搅拌、混匀，封闭瓶口后置于4℃～8℃下，保存20-24h；
(4)用1N NaOH调节步骤(3)处理后溶液的pH至7.0～8.0，并6000rpm离心，取上清液，将上清液以0.45μm滤膜无菌过滤后，滤液即为禽蛋黄提取物，将滤液无菌分装后，备用。
2.根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每1000ml培养基还含有以下抑菌剂：氨苄青霉素1百万单位，纳他霉素50mg。
3.根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，每1000ml培养基含有以下成分：
添加剂：DMEM100ml、自制生物因子10ml、氨苄青霉素1百万单位、纳他霉素50mg；
纯水加入定容至1000ml。
4.根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，所述的禽蛋黄提取物还含有微量的不饱和脂肪酸类与磷脂类物质，以及10-25v/v％的乙醇。
5.根据权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，所述的培养基通过稀酸稀碱调节酸碱度，使培养基pH为6.0-6.2。
6.根据权利要求1～3中任一所述的一种泌尿生殖道支原体Uu、Mh分离培养基，其特征在于，所述的培养基在4℃-10℃下保存。
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