CN105255718A - 一种检验棉拭子及其制备方法和检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检验棉拭子及其制备方法和检验方法，该检验棉拭子包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层。本发明所述的检验棉拭子结构简单、成本低，用于检验细菌药敏性时，细菌生长刺激因子可以明显地刺激细菌的生长，其增殖培养的时间明显缩短，从而使整个检验过程时间缩短；由于细菌生长指示剂的存在，可以以颜色的变化来表示细菌生长菌落状况，即使在细菌菌落形成的早期，使用肉眼便可辨知，检测的灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，具体涉及一种检验棉拭子及其制备方法和检验方法。
背景技术
药敏检验是对细菌耐药性进行检测的试验。现有的药敏检验方法使用的培养基分为液体培养基和固体培养基两种，其检验方法通常为纸片检验法和浓度检验法，纸片检验法使用固体培养基，浓度检验法使用液体培养基。纸片检验法是通过观察药物纸片当贴于含有特定细菌的固体培养基表面后而形成的药物抑菌圈的大小，来确定该菌对药物的敏感性；浓度检验法是通过观察检测不同药物和不同药物浓度影响细菌生长的情况来确定细菌对药物的敏感性。
纸片检验法或浓度检验法，其整个药敏检验过程通常可分为细菌分离培养、细菌增殖、药敏检验三个步骤。目前鱼细菌病药敏的检测方法多为纸片检验法，其操作步骤为：①用无菌样本棉拭子从病鱼组织取样；②接种于固体培养基如琼脂培养基进行分离培养，37℃培养箱中培养24小时左右，把单个细菌培养成细菌菌落；③取少量的细菌菌落(1-3个)，将其溶解分散成浓菌液；④接种于固体培养基例如琼脂培养基表面上；⑤在固体培养基表面上贴上药物纸片；⑥放入37℃培养箱中培养24小时左右，观察药物抑菌圈，确定细菌对药物的敏感性。现有的纸片检验法的优点是操作方便、设备简单，但其存在的缺点为：(1)整个检验操作繁琐，所需的时间长，整个检验过程至少需要48小时左右。如果在药敏检验得到结果后再使用药物治疗，就会严重影响鱼病治疗控制时机。而实际生产中在没有药敏检验的情况下随便使用抗生素药物，不但不能取得有效的治疗效果，反而会导致细菌耐药的严重后果。
现有的浓度检验法主要有两种方式：一种是在细菌分离培养、细菌增殖浓集阶段采用固体培养基，其步骤与现有的纸片检验法相同，但药敏检验阶段的步骤与现有的纸片检验法不同，具体为：从固体培养基上取增殖或分离培养获得的细菌菌落(1-3个)、将其溶解分散成菌悬液、将菌悬液倒入按不同的药物和不同的浓度配制成的多个试验容器中、制成对比试验标本、观察检测试验容器中细菌生长情况、确定细菌对药物的敏感性。这种检验方法的优点是设备简单，投资小；但其存在以下缺点：(1)所需的时间长、(2)操作烦琐、(3)在配制多个药物浓度过程中容易被其他细菌污染，这样就可能造成错误的检验结果。另一种是在细菌分离培养、细菌增殖阶段采用液体培养基；这种检验方法通常采用仪器检验，例如BD公司的BACTEC9000MB全自动快速细菌培养鉴定药敏系统，其优点是操作简单，检验过程时间短，但其存在的缺点是仪器设备使用成本高。
总之，现有的常规细菌药敏检验方法存在以下缺点：(1)整个检验过程所需的时间长、(2)操作麻烦、(3)成本高，几乎不可能用于水产养殖的药敏快速检测。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检验棉拭子，采用该棉拭子用于检验细菌药敏性所需时间短、成本低，且操作简单。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种检验棉拭子，其包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层。
进一步的，本发明所述的抗生素恩诺沙星、盐霉素、恩拉霉素、泰乐菌素、沃尼妙林、氟洛芬、阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋、土霉素、金霉素、盐霉素、莫能霉素中的一种或两种以上复合；或者是四环素、呋喃唑哃、庆大霉素、青霉素重量份、氨苄青霉素、苯唑青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、霉卡那素、丁胺卡那霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗它霉素、地红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、交沙霉素、氯霉素、琥珀氯霉素、林可霉素、克林霉素、磺胺嘧啶、复方新诺明、氟哌酸、氧氟沙星、环丙沙星中的一种或两种复合。
进一步的，本发明所述的固体培养基包括蛋白胨20-30重量份、玉米淀粉10-20重量份、葡萄糖1-5重量份、丙酮酸钠0.1-2重量份、半胱氨酸盐酸盐0.05-1重量份、硫酸镁0.1-0.5重量份、丙磺酸半钠盐5-15重量份、磷酸氢二钠8-15重量份、特异显色剂0.0002-0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.05-0.2重量份、抑菌剂0.005-0.02重量份、琼脂12-18重量份；还包括浓度为2-20mg/L的细菌生长指示剂。
进一步的，本发明所述的固体培养基包括蛋白胨25重量份、玉米淀粉14重量份、葡萄糖2.5重量份、丙酮酸钠1.0重量份、半胱氨酸盐酸盐0.1重量份、硫酸镁0.3重量份、丙磺酸半钠盐11重量份、磷酸氢二钠10.7重量份、特异显色剂0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.1重量份、抑菌剂0.01重量份、琼脂15.2重量份；还包括浓度为2-20mg/L细菌生长指示剂。
进一步的，本发明所述的固体培养基的pH为7-8。
本发明的另一目的在于提供一种检验棉拭子的制备方法，通过该方法获得一种检验棉拭子，用于检验细菌药敏性；该制备方法包括以下步骤：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将抗生素配制成溶液，用0.1-0.5μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述抗生素液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子。
本发明还提供了一种利用本发明所述的检验棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法，该方法步骤如下：
1)制备样本溶液：无菌条件下，使用医用无菌棉拭子从病鱼的细菌感染目标组织取样，置于装有灭菌PBS的EP管中，混合均匀，得样本溶液；
2)无菌条件下，用无菌滴管吸取样本溶液，滴1滴样本溶液到上述检验棉拭子上，静置30-60秒，然后插入高压灭菌过的凝胶液中10-15秒，取出粘有凝胶液的棉拭子，将其浸入高压灭菌过的固化液中10-20秒，将其放入37℃培养12-14小时；根据其细菌生长菌落的生长状况确定细菌对药物的敏感性。
进一步的，本发明所述的凝胶液由胶体、生理盐水和抑菌剂组成，其中胶体浓度为7-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L；所述固化液由固化剂、抑菌剂以及生理盐水组成，其中，固化剂的的浓度为10-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L。
进一步的，本发明所述的凝胶为海藻酸钠、果胶、卡拉胶中的一种。
进一步的，本发明所述的固化剂为硼砂、含有钙离子或镁离子的溶液中的一种。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1本发明所述的检验棉拭子结构简单，不需要像纸片检验法所必需的设备，生产成本和使用成本低；
2.本发明所述的检验棉拭子中培养基包括有营养组份和缓冲剂，为细菌提供生长所需的营养和环境；
3.采用本发明所述的检验棉拭子检验细菌药敏性，细菌生长刺激因子可以明显地刺激细菌的生长，其增殖培养的时间明显缩短，从而使整个检验过程时间缩短；由于细菌生长指示剂的存在，可以以颜色的变化来表示细菌生长菌落状况，即使在细菌菌落形成的早期，使用肉眼便可辨知，检测的灵敏度高。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明所述的检验棉拭子的结构示意图；
图2为本发明所述的检验棉拭子的药敏实验结果图；
图3为普通棉拭子药敏实验结果图；
其中，各附图标记为：1、棉拭子柄；2、棉拭子头；3固体培养基层。
具体实施方式
如图1所示，本发明所述的检验棉拭子，其包括棉拭子柄1和棉拭子头2，所述棉拭子头2浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头2表面形成固体培养基层3。
进一步的，本发明所述的抗生素恩诺沙星、盐霉素、恩拉霉素、泰乐菌素、沃尼妙林、氟洛芬、阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋、土霉素、金霉素、盐霉素、莫能霉素中的一种或两种以上复合；或者是四环素、呋喃唑哃、庆大霉素、青霉素重量份、氨苄青霉素、苯唑青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、霉卡那素、丁胺卡那霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗它霉素、地红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、交沙霉素、氯霉素、琥珀氯霉素、林可霉素、克林霉素、磺胺嘧啶、复方新诺明、氟哌酸、氧氟沙星、环丙沙星中的一种或两种复合。
进一步的，本发明所述的固体培养基包括蛋白胨20-30重量份、玉米淀粉10-20重量份、葡萄糖1-5重量份、丙酮酸钠0.1-2重量份、半胱氨酸盐酸盐0.05-1重量份、硫酸镁0.1-0.5重量份、丙磺酸半钠盐5-15重量份、磷酸氢二钠8-15重量份、特异显色剂0.0002-0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.05-0.2重量份、抑菌剂0.005-0.02重量份、琼脂12-18重量份；还包括浓度为2-20mg/L的细菌生长指示剂。
进一步的，本发明所述的固体培养基包括蛋白胨25重量份、玉米淀粉14重量份、葡萄糖2.5重量份、丙酮酸钠1.0重量份、半胱氨酸盐酸盐0.1重量份、硫酸镁0.3重量份、丙磺酸半钠盐11重量份、磷酸氢二钠10.7重量份、特异显色剂0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.1重量份、抑菌剂0.01重量份、琼脂15.2重量份；还包括浓度为2-20mg/L细菌生长指示剂。
上述方案中，固体培养基的成分包括有营养组份和缓冲剂，作用是为细菌提供生长所需的营养和环境。对不同的细菌，可以选用不同的营养物质配方；例如，罗非鱼链球菌细菌可以选用只适用链球菌生长的配方，鱼类嗜水气单胞菌可以选用只适用嗜水气单胞菌生长的配方。
上述方案中细菌生长指示剂为一种肉眼可观察到的显色反应，具体可以选择氯化三苯四氮唑(TTC)，其原理为当TTC被细菌细胞吸收后，能接收细胞脱氧酶中的氢，还原为一种红色的不易扩散和不容易溶于水的三苯基甲，使菌落产生红色，这样可有效地区分菌落和非菌落，根据观察点的数量来确定细菌的生长状况。而在培养基中加抑菌剂主要用于抑制致病菌以外的其它杂菌或霉菌的生长。
进一步的，本发明所述的固体培养基的pH为7-8。
本发明的另一目的在于提供一种检验棉拭子的制备方法，通过该方法获得一种检验棉拭子，用于检验细菌药敏性；该制备方法包括以下步骤：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将抗生素配制成溶液，用0.1-0.5μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述抗生素液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子。
本发明还提供了一种利用本发明所述的检验棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法，该方法步骤如下：
1)制备样本溶液：无菌条件下，使用医用无菌棉拭子从病鱼的细菌感染目标组织取样，置于装有灭菌PBS的EP管中，混合均匀，得样本溶液；
2)无菌条件下，用无菌滴管吸取若干样本溶液，滴1滴(约50μl)样本溶液到上述检验棉拭子上，静置30-60秒，然后插入高压灭菌过的凝胶液中10-15秒，取出粘有凝胶液的棉拭子，将其浸入高压灭菌过的固化液中10-20秒，将其放入37℃培养12-14小时；根据其细菌生长菌落的生长状况确定细菌对药物的敏感性。
在上述利用本发明所述的检验棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法中，当检验棉拭子上的固体培养基表面涂上待测感染致病菌后，再在外面涂上一层凝胶状保护膜，可以阻断环境中其它杂菌和霉菌对待测病原菌样本的污染，这个保护层还可以防止固体培养基内水分蒸发影响细菌的生长，这层膜也不会影响细菌的气体交换。固化剂能与凝胶液反应，使凝胶也在一定时间内形成稳定的凝胶。进一步的，本发明所述的凝胶液由胶体、生理盐水和抑菌剂组成，其中胶体浓度为7-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L；所述固化液由固化剂、抑菌剂以及生理盐水组成，其中，固化剂的的浓度为10-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L。
进一步的，本发明所述的凝胶为海藻酸钠、果胶、卡拉胶中的一种。
进一步的，本发明所述的固化剂为硼砂、含有钙离子或镁离子的溶液中的一种。
上述方法中，所述病鱼的细菌感染目标组织可以是肝脏，脾脏，肾脏，腮，脑，肠道等。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所用到的原料、试剂以及设备均可以通过购买获得。
实施例1
一种检验棉拭子，其包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层；该检验棉拭子通过以下方法制备而成：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将恩诺沙星配制成浓度为1-10μg/ml的溶液，用0.1μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述溶液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子；
其中固体培养基包括蛋白胨20重量份、玉米淀粉20重量份、葡萄糖5重量份、丙酮酸钠0.1重量份、半胱氨酸盐酸盐0.05重量份、硫酸镁0.1重量份、丙磺酸半钠5重量份、磷酸氢二钠8重量份、特异显色剂TTC0.0002重量份、细菌加速生长刺激因子0.05重量份、抑菌剂0.005重量份、琼脂12重量份；还包括浓度为2mg/L的细菌生长指示剂。
实施例2
一种检验棉拭子，其包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层；该检验棉拭子通过以下方法制备而成：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将氟苯尼考配制成浓度为10-50μg/ml的溶液，用0.22μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述溶液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子；
所述的固体培养基包括蛋白胨25重量份、玉米淀粉14重量份、葡萄糖2.5重量份、丙酮酸钠1.0重量份、半胱氨酸盐酸盐0.1重量份、硫酸镁0.3重量份、丙磺酸半钠盐11重量份、磷酸氢二钠10.7重量份、特异显色剂TTC0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.1重量份、抑菌剂0.01重量份、琼脂15.2重量份；还包括浓度为2-20mg/L细菌生长指示剂。
实施例3
一种检验棉拭子，其包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层；该检验棉拭子通过以下方法制备而成：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将青霉素G配制成浓度为1-20μg/ml的溶液，用0.22μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述溶液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子；
所述的固体培养基包括蛋白胨30重量份、玉米淀粉10重量份、葡萄糖5重量份、丙酮酸钠2重量份、半胱氨酸盐酸盐1重量份、硫酸镁0.5重量份、丙磺酸半钠盐15重量份、磷酸氢二钠15重量份、特异显色剂TTC0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.2重量份、抑菌剂0.02重量份、琼脂18重量份；还包括浓度为20mg/L的细菌生长指示剂。
应用实施例1
利用本发明所述的检验棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法，该方法步骤如下：
1)制备样本溶液：无菌条件下，取疑似链球菌感染致死罗非鱼，使用70％酒精棉球将鱼全身体表进行涂擦消毒，无菌条件下，刨开腹腔，使用取样环在肝脏上取样，或取腹水样本，然后将取样环放到加有200μlPBS的1.5mlEP管中，稍加混合后取出取样环，制成样本溶液；
2)无菌条件下，用无菌滴管吸取样本溶液滴1滴(约50μl)样本溶液到实施例2的检验棉拭子上，静置30-60秒，然后插入高压灭菌过的凝胶液中10-15秒，取出粘有凝胶液的棉拭子，将其浸入高压灭菌过的固化液中10-20秒，将其放入37℃培养12-14小时；观测比较对照检验棉拭子与药敏检验棉拭子细菌生长菌落(紫红色)的生长状况或药物抑菌效果，确定对药物的敏感性；链球菌在生长繁殖过程中会形成紫红色色团，如果氟苯尼考药物对链球菌有抑制作用则含有药物的棉拭上面的检验标本周围不能形成紫红色色团，因而可判定氟苯尼考药物对罗非鱼链球菌有抑菌效果，实验结果参见图2。
对比实施例1
利用不含有氟苯尼考的普通棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法，该方法步骤按照上述应用实施例1的方法进行，作为与应用实施例相比较的对照例，实验结果参见图3。
图2中棉拭子头表面没有出现紫红色菌落，而在图3中棉拭子头的表现表现为紫红色；图2和图3的结果表明通过本发明的含有氟苯尼考的检验棉拭子可以明显检测出罗非鱼链球菌对氟苯尼考的药敏性，从而体现了本发明的检验棉拭子能够明显检测出细菌的药敏性。
在本发明中，发明人进行细菌培养时偶然发现某些小分子神经递质如去甲肾上腺素可以明显地刺激细菌的生长，并进一步验证了细菌生长刺激因子去甲肾上腺素后12小时细菌生长变化，具体结果见表1使用上述去甲肾上腺素在其它细菌如大肠杆菌，沙门氏杆菌，链球菌等进行刺激生长验证，结果均表明，细菌生长的速度显著快于未加去甲肾上腺素的对照组。
表1
| 去甲肾上腺素 | 大肠杆菌 | 沙门氏杆菌 | 无乳链球菌 |
| 加 | 1.3×107cfu | 2.1×107cfu | 8.6×107cfu |
| 未加 | 2.5×105cfu | 7.3×104cfu | 1×106cfu |
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种检验棉拭子，其特征在于，其包括棉拭子柄和棉拭子头，所述棉拭子头浸入抗生素后插入固体培养基中在棉拭子头表面形成固体培养基层。
2.根据权利要求1所述的检验棉拭子，其特征在于，所述抗生素恩诺沙星，盐霉素、恩拉霉素、泰乐菌素沃尼妙林、氟洛芬、阿莫西林、氟苯尼考、头孢噻呋、土霉素、金霉素、盐霉素、莫能霉素中的一种或两种以上复合；或者是四环素、呋喃唑哃、庆大霉素、青霉素重量份、氨苄青霉素、苯唑青霉素、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、链霉素、庆大霉素、霉卡那素、丁胺卡那霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗它霉素、地红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、交沙霉素、氯霉素、琥珀氯霉素、林可霉素、克林霉素、磺胺嘧啶、复方新诺明、氟哌酸、氧氟沙星、环丙沙星中的一种或两种复合。
3.根据权利要求1所述的检验棉拭子，其特征在于，所述固体培养基包括蛋白胨20-30重量份、玉米淀粉10-20重量份、葡萄糖1-5重量份、丙酮酸钠0.1-2重量份、半胱氨酸盐酸盐0.05-1重量份、硫酸镁0.1-0.5重量份、丙磺酸半钠盐5-15重量份、磷酸氢二钠8-15重量份、特异显色剂0.0002-0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.05-0.2重量份、抑菌剂0.005-0.02重量份、琼脂12-18重量份；还包括浓度为2-20mg/L的细菌生长指示剂。
4.根据权利要求1所述的检验棉拭子，其特征在于，所述固体培养基中包括蛋白胨25重量份、玉米淀粉14重量份、葡萄糖2.5重量份、丙酮酸钠1.0重量份、半胱氨酸盐酸盐0.1重量份、硫酸镁0.3重量份、丙磺酸半钠盐11重量份、磷酸氢二钠10.7重量份、特异显色剂0.0005重量份、细菌加速生长刺激因子0.1重量份、抑菌剂0.01重量份、琼脂15.2重量份；还包括浓度为2-20mg/L细菌生长指示剂。
5.根据权利要求4所述的检验棉拭子，其特征在于，所述固体培养基的pH为7-8。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的检验棉拭子的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：
1)制备抗生素-药敏检验棉拭子：将抗生素配制成溶液，用0.1-0.5μm滤器过滤，制得抗生素液，然后在无菌条件下将由高压灭菌的棉拭子的棉拭子头插入到上述抗生素液中；
2)浸培养基：将固体培养基中加入双蒸水混合，然后高压灭菌，待培养基降温至50-60℃时，转入到EP离心管中，将步骤1)制备的抗生素-药敏检验棉拭子的棉拭子头插入到培养基中1-3秒，取出并放置于无菌培养皿中冷却，避免棉拭子头与培养皿壁接触；即得到检验棉拭子。
7.利用权利要求1-5任一项所述的检验棉拭子检验鱼病细菌药敏性的方法，其特征在于，该方法步骤如下：
1)制备样本溶液：无菌条件下，使用医用无菌棉拭子从病鱼的细菌感染目标组织取样，置于装有灭菌PBS的EP管中，混合均匀，得样本溶液；
2)无菌条件下，用无菌滴管吸取样本溶液，滴1滴样本溶液到上述检验棉拭子上，静置30-60秒，然后插入高压灭菌过的凝胶液中10-15秒，取出粘有凝胶液的棉拭子，将其浸入高压灭菌过的固化液中10-20秒，将其放入37℃培养12-14小时；根据子细菌生长菌落的生长状况确定细菌对药物的敏感性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述凝胶液由胶体、生理盐水和抑菌剂组成，其中胶体浓度为7-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L；所述固化液由固化剂、抑菌剂以及生理盐水组成，其中，固化剂的的浓度为10-20g/L，抑菌剂的浓度为0.01g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述凝胶为海藻酸钠、果胶、卡拉胶中的一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述固化剂为硼砂、含有钙离子或镁离子的溶液中的一种。
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| CN107287275A (zh) * | 2016-03-31 | 2017-10-24 | 启新生物科技有限公司 | 培养基、包含其的试剂盒、及其应用 |
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