CN106420770A - 一种治疗糖尿病血管并发症的自噬诱导剂及在药学上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以泽泻醇B作为自噬诱导剂治疗糖尿病及血管并发症的新用途，以及在药学上的应用。本发明通过透射电镜、免疫荧光检测、Westernblot、等实验方法充分证明了泽泻醇B在调控非酶糖基化终末产物(AGEs)导致的人肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、视网膜细胞、心肌细胞自噬障碍中的作用。本发明发现泽泻醇B诱导细胞自噬的标志物及作用机制。因此，本发明的提出将使泽泻醇B在用于自噬作用机制相关的疾病的治疗，尤其是能够受益于自噬障碍诱导的糖尿病及其血管并发症治疗及药物开发中具有广泛的应用前景。

Description

一种治疗糖尿病血管并发症的自噬诱导剂及在药学上的应用

技术领域

本发明涉及一种以泽泻醇B为天然活性化合物作为自噬诱导剂及其在治疗糖尿病血管并发症的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

糖尿病已经成为现代人群常见的疾病之一，严重影响着人类健康和生活健康。糖尿病不仅体现在机体血糖的水平，更重要的是，糖尿病引发的血管并发症已成为影响健康的重要原因。最新流行病学调查显示，目前中国确诊的糖尿病患者约为1.14亿，糖尿病前期人群约为1.4亿。而在糖尿病人群中，都或多或少存在一种或多种并发症，如肾病、视网膜病变等。据研究显示，糖尿病10年以上患者，存在并发症的患者达到90％以上。糖尿病及其血管并发症的防治已成为我国卫生医疗事业的重要课题。

代谢紊乱是糖尿病及其血管并发症的根本原因。目前有研究表明高糖血症可视为细胞营养条件改变的状态下，血管细胞、肾细胞、心肌细胞、视网膜细胞等细胞中营养敏感信号通路的改变引起代谢紊乱，导致高血糖导致的晚期糖基化终末产物的积聚、线粒体中活性氧物质的过量等，可能是造成糖尿病血管并发症的原因。

自噬(autophagy)是广泛存在于真核细胞的一种溶酶体依赖性蛋白降解过程，也是存在于真核生物细胞中的一种高度保守的保护性机制。通过吞噬自身细胞质或细胞器以维持自身代谢所需和细胞内稳态。自噬对多种疾病的发生具有保护作用，如：癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、肝病、糖尿病、糖尿病血管并发症、肾病、自身免疫病及感染等。因此，自噬可能成为基于糖尿病及血管并发症发病机制的新的预防和治疗靶点，通过干预，可逆转上述病理信号通路的改变，可以起到保护胰岛细胞、肾脏、眼球等靶器官的作用。

泽泻(Alisma orientalis)为多年沼生植物泽泻科植物泽泻的干燥块茎，是中医临床常用中药之一，具有利水、清湿热和泄热等功效，可用于治疗小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛等病症。近代药理证明泽泻具有抑制动脉粥样硬化和活血化瘀的功效，以及利尿、降低血压血糖和抗高血脂等作用。泽泻醇B是泽泻的主要三萜类成分，是泽泻功效的主要活性成分。有报道显示，泽泻醇B可作为自噬诱导剂，用于肿瘤的治疗中。但是，尚未将该化合物应用于糖尿病及血管并发症的治疗中。

本发明将为糖尿病及其血管并发症提供一种有效的治疗药物，并将其应用于药学领域。

附图说明

图1 MTT法检测HK-2细胞存活率

图2透射电镜和免疫荧光检测HK-2细胞自噬(A)以及LC3II半定量分析(B)

图3 Western blot检测HK-2细胞自噬水平

图4 Western blot检测HK-2细胞凋亡蛋白的相对表达水平

图5 Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路水平

图6泽泻醇B对HUVEC细胞自噬水平的影响

图7泽泻醇B对心肌细胞自噬水平的影响

图8泽泻醇B对视网膜细胞自噬水平的影响

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗糖尿病及其血管并发症的治疗药物，并将其应用于药物开发中，该活性成为源于泽泻或其他来源的泽泻醇B。

所述的细胞为肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、视网膜细胞。

本发明的技术方案：

1、采用透射电镜、免疫荧光检测、流式细胞仪、Western blot和免疫细胞化学检实验、q-PCR实验充分证明了泽泻醇B在诱导肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、视网膜细胞自噬中的作用。

2、本发明将诱导自噬活性化合物可以按照药学领域的常规技术方法，与多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明药物具有以下优点：

1、本发明公开了泽泻醇B对糖基化终末产物诱导的肾小管上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、视网膜细胞自噬作用。有研究表明自噬在细胞的稳态和功能中起重要作用，主要体现在两个方面：一方面在营养不足的情况下实现能量物质再利用，另一方面在应激状态下能清除构型异常的胞质蛋白质，并消化受损和多余的细胞器，从而维持细胞内稳态。因此，泽泻醇B可通过激活自噬来阻止或延缓糖尿病及其并发症靶器官的损伤。这种独特的诱导功效的发现，将会使泽泻类药物在糖尿病及血管并发症治疗中得到重要应用。

2、本发明以细胞自噬理论为背景，研究并阐明天然有效成分作用和机制，为开发糖尿病及血管并发症防治药物作用提供了靶点和策略。

3、本发明为糖尿病及其血管并发症提供了新的治疗候选药物。

4、本发明的自噬诱导剂可加工成适宜剂型，如注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、丸剂、喷雾剂、乳剂、外用制剂，用于糖尿病及血管并发症的治疗。

具体实施方式

实施例1 MTT检测HK-2细胞活力

1、仪器与试剂：

人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、CO₂细胞培养箱、数显恒温搅拌循环水浴锅、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置显微镜、微量移液器、全自动酶标仪。

2、实验方法

(1)HK-2细胞体外培养

用低糖DMEM+10％FBS培养基进行培养，在温度37℃、5％CO₂条件下生长至80％-90％汇合时进行细胞传代。倾倒去除培养器皿内的培养基，用PBS洗涤细胞1次，弃去PBS，根据培养面积加入适量0.1％胰酶溶液消化，37℃放置3～5min，并在倒置显微镜下观察，待到绝大部分细胞变圆并悬浮后即加入培养基终止消化，吹吸几次以离散成团的细胞，按1:3比例进行细胞传代。传代后的细胞24h后全数换液一次。

(2)MTT检测HK-2细胞活力

取对数生长期的HK-2细胞，将其消化后调整到一定细胞浓度，均匀接种于96孔板上，在37℃，5％CO₂的培养箱培养24h，吸弃培养基，分别加入含终浓度为1024μM、512μM、256μM、128μM、64μM、32μM、16μM、8μM和4μM、5％CO₂条件下培养48～96h后，每孔加入20μl(5mg/ml)MTT，在相同条件的泽泻醇B和DMEM培养基100μl，将加完样的96孔板置培养箱中于37℃下继续培养6h，吸弃孔内培养基，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，37℃恒温振荡10min，全自动酶标仪测定各孔OD值。细胞存活率计算公式如下：

3、实验结果

用MTT法检测不同浓度的细胞存活率(图1)。给予不同浓度的泽泻醇B，结果显示HK-2细胞的存活率与泽泻醇B呈浓度依赖关系，且ED50＝254.00±1.75μM。随着泽泻醇B浓度的增加(4-1024μM)，细胞的存活率逐渐降低(从99.82±14.94％到38.81±16.38％)。细胞存活率≥95％时，可保证药物对细胞毒性较小，故本实验选用32μM的泽泻醇B(细胞存活率为95.71±17.59％作为后期的研究。

实施例2 透射电镜和免疫荧光检测HK-2细胞自噬

1、仪器与试剂：

人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、戊二醛、锇酸、丙酮、包埋液、3％醋酸铀-枸橼酸铅、吖啶橙染液、CO₂细胞培养箱、数显恒温搅拌循环水浴锅、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、透射电镜、超薄切片机、倒置荧光显微镜。

2、实验方法

(1)透射电镜法检测HK-2细胞自噬

按实施例1所述方法培养HK-2细胞，将处于对数生长期的HK-2细胞按2×10⁶个/瓶均匀接种到直径为6cm的培养皿中，过夜贴壁培养后，加入终浓度为32uM的泽泻醇B，以未加药物的细胞作为对照组。继续于培养箱孵育24h，收集细胞，制成单细胞悬液，然后用预冷的PBS洗涤2次，然后缓慢加入预冷的2.5％的戊二醛4℃固定90min，用PBS漂洗后，再用1％锇酸4℃固定30min,用PBS洗涤后，将细胞用连续梯度(10％为梯度，50—100％)的乙醇和纯丙酮脱水，然后包埋于Epon812树脂中，切片后用醋酸铀-柠檬酸铅染色在透射下观察细胞的超显微结构。

(2)免疫荧光检测HK-2细胞自噬

取对数生长期的HK-2细胞，将其消化后调整到一定细胞浓度，均匀接种于24孔板上，在37℃，5％CO₂的培养箱培养24h后，吸弃培养基，细胞给予200μg/ml AGEs处理，加入终浓度为32μM的泽泻醇B，以未加药物的细胞作为对照组。加药处理时间结束后弃各孔中原有培养基，采用PBS洗涤2次，加入吖啶橙染液700μl染色40s，弃取吖啶橙染液，用PBS洗涤2次，加入700μl PBS，置于倒置荧光显微镜下观察并拍照。然后PS处理及分析实验结果。

3、实验结果

由图2A所示，泽泻醇B(32μM)与HK-2细胞共孵育24h后，能增加AGEs诱导的HK-2细胞形成双层膜结构的自噬体。免疫荧光图片可以观察到绿色荧光强度明显增强，同时LC3II半定量分析表明，与AGEs组相比，LC3II含量明显增高(P<0.05)(图2B)。

实施例3 Western blot检测自噬相关蛋白表达

1、仪器与试剂

人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；DDMEM(低糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、组织蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、发光液(ECL)、SDS、丽春红、PVDF膜；抗体：兔抗人LC3多克隆抗体、兔抗人Atg-5单克隆抗体、兔抗人Atg-12单克隆抗体、兔抗人Beclin-1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗、中性树胶、苏木素、DAB、乙醇、3％过氧化氢、培养皿、CO₂细胞培养箱、数显恒温搅拌循环水浴锅、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置显微镜、微量移液器、SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪、点离机、雪花制冰机、全自动酶标仪、4000M化学发光成像系统、-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

(1)Western blot检测自噬相关蛋白表达

细胞总蛋白的提取：将处于对数生长期的HK-2细胞均匀接种到96孔板中，过夜贴壁培养后，细胞给予200μg/ml AGEs处理，加入含有32μM的泽泻醇B的新鲜培养液，同时设立对照(加等量的DMEM培养液)，培养一定时间后取出。弃培养液，加入4℃预冷的PBS清洗两次，加入新鲜配制的蛋白裂解液，连同收集的悬浮细胞置于冰上裂解30min，用无菌细胞刮刀刮取细胞收集于1.5ml的无菌离心管中，4℃12000rpm离心10min，留取上清，分装于0.2ml离心管中，-80℃保存。

BCA法测定总蛋白浓度：取适量的蛋白标准品，并在96孔板的第一排中按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入孔中，每个孔加磷酸盐缓冲液(PBS)补足到20μl，最后再在每个孔里面加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)200ul,温箱中放置半小时后在酶标仪上完成标准曲线的绘制；取5μl蛋白样品溶液加入PBS15μl，最后每孔加入BCA工作液：A+B液(A:B＝50:1)液200μl，温箱中放置半小时后96孔板放入酶标仪反应，反应后可读取总蛋白的浓度。

SDS-PAGE电泳制备：

配分离胶：根据待测目的蛋白的分子量的大小而配置不同浓度的分离胶,吹打十余下后把分离胶分别加入安装好的制胶槽内，胶的高度最好离小玻璃板3cm左右，待加完胶后加入异丙醇，可以使分离胶平坦外还可以促进分离胶的凝固。30min后观察发现分离胶已经聚合则可以开始制备浓缩胶。

配浓缩胶：去掉分离胶上层封的异丙醇，最后用滤纸吸干净，迅速放入刚刚制备的浓缩胶；然后两边同时插入梳子，这样可以减少气泡的混入。放置1.5h至凝胶完全聚合备用。

样品上样：将制备好的胶固定到电泳槽里面，倒入足够的电泳液，将梳子拔出，取出处理好的样品，按照样品的顺序依次加样。蛋白上样量为20μg，并加入蛋白上样缓冲液。变性样品点离后上样跑SDS-PAGE胶。

垂直电泳：把样品加入梳子所形成的的上样孔后，调节电压至50V恒压，时间为30min，待样品电泳至分离胶和浓缩胶的交界处时可以改变电泳条件，改为90V恒压，电泳时间90min，使样本在分离胶中迅速分离，待所需检测的蛋白分子量的的条带分离明显并且溴酚蓝带将达到胶的底部时，停止电泳。

转膜：将与分离胶大小一致的PVDF膜在含1×Transfer Buffer中浸泡15min，与分离胶、滤纸和海绵垫一起放入预冷的1×Transfer Buffer中浸泡5min。按照说明安装转膜系统：从负极到正极依次为海绵垫、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸和海绵垫。转膜夹放入转膜槽中(转膜槽置冰水中)，恒压90V转膜1.5h。

鉴定转膜效果：转膜结束后小心夹取PVDF膜，右上角做标记用来区分正反面，放入10×丽春红溶液PBS稀释9倍的溶液中，大约2min加去离子水漂洗，转膜成功就可以看到PVDF膜上有一些大小不一的红染的条带。

封闭：用BSA封闭液将PVDF膜放置在封闭袋中，放在摇床上匀速摇荡1h。

孵育一抗：去除封闭液，可与PBS清洗5次5min，然后将PVDF膜转移到杂交袋中同时加入已经稀释好的一抗，封口后放到4℃的冰箱过夜。

洗一抗：第二天将杂交袋中的一抗回收，取出PVDF膜，放在干净的盛有PBS-T的培养皿中，放置在摇床上，洗膜5次，每次5min。

孵育二抗：将洗过的膜再次放入杂交袋中，加入相应的稀释好的二抗，封口后放置在摇床上匀速孵育1h,注意室温不宜过高。

洗二抗：用PBS-T洗5次，每次5分钟。

加ECL液：将膜放于显影膜上，将PVDF膜的正面(吸附有蛋白质的一面)朝上，把已混合好A液和B液的ECL液滴于PVDF膜上，包好显影膜。

曝光：将上述处理好的显影膜放在柯达化学发光成像仪中，调节曝光时间，成功后可以看到深浅不同的条带。

扫描并分析结果：采用图像分析软件进行吸光度分析。以所测得的各指标的吸光度与内参照β-actin吸光度的比值代表定量值。

3、实验结果

本实验使用自噬相关指标LC3II/LC3I比值、Atg-5、Atg-12和Beclin-1来评价泽泻醇B诱导的自噬。由图3所示，与空白组相比，AGEs可抑制LC3I向LC3II的转化，以及下调Atg-5、Atg-12和Beclin-1表达水平；与AGEs组相比，泽泻醇B给药组可显著增加LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5、Atg-12和Beclin-1蛋白的表达水平(P<0.05)。结果说明，泽泻醇B可提高AGEs诱导的HK-2细胞自噬的水平。

实施例4 Western blot和免疫细胞化学检测凋亡相关蛋白表达

1、仪器与试剂：

人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、组织蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、发光液(ECL)、SDS、丽春红、PVDF膜；抗体：Bcl-2抗体、Bcl-xl抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗、中性树胶、苏木素、DAB、乙醇、3％过氧化氢、培养皿、CO₂细胞培养箱、数显恒温搅拌循环水浴锅、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置显微镜、微量移液器、SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪、点离机、雪花制冰机、全自动酶标仪、4000M化学发光成像系统、-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

实验方法同实施例3。

3、实验结果

细胞的凋亡与一系列的凋亡相关蛋白表达有关，如Bcl-2家族。Bcl-2和Bcl-xl是Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白。图4结果显示：相比于模型组，泽泻醇B给药组细胞Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有显著的提升(P<0.05)。结果表明，泽泻醇B可通过上调Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平而抑制HK-2细胞凋亡。

实施例5 泽泻醇B对肾小管上皮细胞PI3K/Akt/mTOR通路相关表达

1、仪器与试剂

人近端肾小管上皮细胞株(HK-2)；DMEM(低糖)培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、组织蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、发光液(ECL)、SDS、丽春红、PVDF膜、抗体：PI3K、Akt、mTOR、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗；中性树胶；苏木素、DAB、乙醇、3％过氧化氢、培养皿、CO₂细胞培养箱、数显恒温搅拌循环水浴锅、细胞培养超净工作台、低温超速离心机、倒置显微镜、微量移液器、SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪、点离机、雪花制冰机、全自动酶标仪、4000M化学发光成像系统、-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

实验方法同实施例3。

3、实验结果

图5结果显示：相比于空白组，泽泻醇B给药组中PI3K/Akt/mTOR通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白水平都存在显著地降低(P<0.05)。结果表明，泽泻醇B可抑制HK-2细胞的PI3K/Akt/mTOR通路。

实施例6 泽泻醇B对人血管内皮细胞自噬作用的影响

1、仪器与试剂

人血管内皮细胞(HUVEC)；DMEM(低糖培养基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS缓冲液；牛血清白蛋白(BSA)；组织蛋白裂解液；BCA蛋白浓度测定试剂盒；发光液(ECL)；SDS；丽春红；PVDF膜；抗体：兔抗人LC3多克隆抗体、兔抗人Beclin-1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗；中性树胶；苏木素；DAB；乙醇；3％过氧化氢；培养皿；CO₂细胞培养箱；数显恒温搅拌循环水浴锅；细胞培养超净工作台；低温超速离心机；倒置显微镜；微量移液器；SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪；点离机；雪花制冰机；全自动酶标仪；4000M化学发光成像系统；-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

(1)细胞培养及药物处理

将处于对数生长期的HUVEC细胞均匀接种到96孔板中，过夜贴壁培养后，细胞丰度约为80％时，加入含有32μM的泽泻醇B的新鲜培养液，同时设立对照(加等量的DMEM培养液)，培养一定时间后取出。弃培养液，加入4℃预冷的PBS清洗两次，加入新鲜配制的蛋白裂解液，连同收集的悬浮细胞置于冰上裂解30min，用无菌细胞刮刀刮取细胞收集于1.5ml的无菌离心管中，4℃12000rpm离心10min，留取上清，分装于0.2ml离心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

检测和分析方法同实施例3。

3、实验结果

本实验使用自噬相关指标LC3II/LC3I比值、Atg-5和Beclin-1来评价泽泻醇B对AGEs诱导的血管内皮细胞HUVEC自噬紊乱的调节作用。由图6所示，与AGEs组相比，泽泻醇B给药组中LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5、Atg-12和Beclin-1蛋白的表达水平均有显著地提高(P<0.05)。结果说明，泽泻醇B可上调AGEs诱导的HUVEC细胞自噬的能力。

实施例7 泽泻醇B对人心肌细胞自噬作用的影响

1、仪器与试剂

人心肌细胞(H9C2)；DMEM(低糖培养基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS缓冲液；牛血清白蛋白(BSA)；组织蛋白裂解液；BCA蛋白浓度测定试剂盒；发光液(ECL)；SDS；丽春红；PVDF膜；抗体：兔抗人LC3多克隆抗体、兔抗人Beclin-1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗；中性树胶；苏木素；DAB；乙醇；3％过氧化氢；培养皿；CO₂细胞培养箱；数显恒温搅拌循环水浴锅；细胞培养超净工作台；低温超速离心机；倒置显微镜；微量移液器；SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪；点离机；雪花制冰机；全自动酶标仪；4000M化学发光成像系统；-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

(1)细胞培养及药物处理

将处于对数生长期的H9C2心肌细胞均匀接种到96孔板中，过夜贴壁培养后，细胞丰度约为80％时，加入含有32μM的泽泻醇B的新鲜培养液，同时设立对照(加等量的DMEM培养液)，培养一定时间后取出。弃培养液，加入4℃预冷的PBS清洗两次，加入新鲜配制的蛋白裂解液，连同收集的悬浮细胞置于冰上裂解30min，用无菌细胞刮刀刮取细胞收集于1.5ml的无菌离心管中，4℃12000rpm离心10min，留取上清，分装于0.2ml离心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

检测和分析方法同实施例3。

3、实验结果

本实验使用自噬相关指标LC3II/LC3I比值、Atg-5来评价泽泻醇B对AGEs诱导的人心肌细胞H9C2的自噬。由图7所示，与AGEs组相比，泽泻醇B给药组中LC3II/LC3I比值Atg-5蛋白的表达水平均有显著地提高(P<0.05)。结果说明，泽泻醇B可促进AGEs抑制的H9C2心肌细胞自噬的形成。

实施例8 泽泻醇B对视网膜细胞自噬作用的影响

1、仪器与试剂:

人视网膜细胞(ARPE-19)；DMEM(低糖培养基)；胎牛血清；胰蛋白酶；PBS缓冲液；牛血清白蛋白(BSA)；组织蛋白裂解液；BCA蛋白浓度测定试剂盒；发光液(ECL)；SDS；丽春红；PVDF膜；抗体：兔抗人LC3多克隆抗体、兔抗人Beclin-1单克隆抗体、兔抗人β-actin多克隆抗体；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的二抗；中性树胶；苏木素；DAB；乙醇；3％过氧化氢；培养皿；CO₂细胞培养箱；数显恒温搅拌循环水浴锅；细胞培养超净工作台；低温超速离心机；倒置显微镜；微量移液器；SDS-PAGE凝胶电泳及转膜仪；点离机；雪花制冰机；全自动酶标仪；4000M化学发光成像系统；-80℃超低温冰箱。

2、实验方法

(1)细胞培养及药物处理

将处于对数生长期的ARPE-19细胞均匀接种到96孔板中，过夜贴壁培养后，细胞丰度约为80％时，加入含有32μM的泽泻醇B的新鲜培养液，同时设立对照(加等量的DMEM培养液)，培养一定时间后取出。弃培养液，加入4℃预冷的PBS清洗两次，加入新鲜配制的蛋白裂解液，连同收集的悬浮细胞置于冰上裂解30min，用无菌细胞刮刀刮取细胞收集于1.5ml的无菌离心管中，4℃12000rpm离心10min，留取上清，分装于0.2ml离心管中，-80℃保存。

(2)Western blotting

检测和分析方法同实施例3。

3、实验结果

本实验使用自噬相关指标LC3II/LC3I比值、Atg-5和Beclin-1来评价泽泻醇B对AGEs诱导的人视网膜细胞ARPE-19的自噬。由图8所示，与AGEs组相比，泽泻醇B给药组中LC3II/LC3I比值、LC3、Atg-5和Beclin-1蛋白的表达水平均有显著地提高(P<0.05)。结果说明，泽泻醇B可引起AGEs抑制的ARPE-19细胞自噬的形成。

Claims (3)

1.一种治疗糖尿病血管并发症的自噬诱导剂，其特征在于该代谢紊乱自噬诱导剂为泽泻醇B，所述的诱导自噬是通过上调自噬标志物LC3-II与自噬相关蛋白LC3I、Atg-5、Atg-12、Beclin-1，上调抑制凋亡相关蛋白Bcl-2、Bcl-x1，通过调控PI3K/Akt/mTOR通路实现的。

2.根据权利要求1所述一种治疗糖尿病血管并发症的自噬诱导剂，其特征在于利用制剂领域相应的药物剂型，应用具体剂型如注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、丸剂、喷雾剂、乳剂、外用制剂。

3.根据专利要求2所述的一种治疗糖尿病血管并发症的自噬诱导剂，其用途在于治疗糖尿病血管并发症、糖尿病、心血管病变、肾病，所述的病种包括糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病心血管病、糖尿病足、慢性肾病、肾炎、冠心病、和急慢性肾损伤。