CN114917240B - 一种杜仲组合物及其在治疗肾小球疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种杜仲组合物及其在治疗肾小球疾病中的应用，所述杜仲组合物由如下组分组成：桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷。本发明具有治疗肾小球疾病、阿霉素诱导的足细胞损伤等效果显著的优点。

Description

一种杜仲组合物及其在治疗肾小球疾病中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种杜仲组合物及其在治疗肾小球疾病中的应用。

背景技术

足细胞(podocyte)，即肾小球脏层上皮细胞，由间充质肾干细胞发育而来，其附着于肾小球基底膜(GBM)的外侧，连同GBM和毛细血管内皮细胞一起，构成肾小球血液滤过屏障。

足细胞蛋白是维持足细胞的正常功能不可或缺的成分，相关蛋白的缺失或突变都会引起足细胞的损伤。其中，跨膜蛋白Nephrin由NPHS1编码，是维持SD结构的关键分子。它不仅在与足细胞间的联系中承担中心位置，还控制着足细胞内的许多信号通路。同时，Nephrin的胞内端与肌动蛋白细胞骨架相连，因此对足细胞的肌动蛋白也有调节能力。Nephrin是维持足细胞与肾小球滤过功能所必需的蛋白，该蛋白的损失会不可逆地改变足细胞的状态。Podocin则是由NPHS2编码的足细胞蛋白，并只在分化后的足细胞内表达。Podocin位于SD的插入位点，N端与C端都位于胞质内，其中C端与Nephrin缔合，并能与其他跨膜蛋白相互协作维持足细胞的功能，因此是SD结构的支架蛋白。

阿霉素(Adriamycin,ADR)是能够抑制DNA合成的抗肿瘤蒽环类药物，它在肾脏中的积累可以引起肾毒性。阿霉素凭借直接的细胞毒性导致足细胞损伤并破坏肾小球滤过屏障：一方面，阿霉素抑制了足细胞DNA合成诱导足细胞凋亡，另一方面阿霉素诱导了线粒体功能紊乱与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成。阿霉素对足细胞的损伤除了在结构上表现为肌动蛋白细胞骨架重排外，关键蛋白Nephrin与Podocin都会不同程度地呈现下降趋势。

足细胞的损伤常见于各种肾小球疾病，包括但不限于：局灶性阶段性肾小球硬化、糖尿病肾病以及膜增生性肾小球肾炎。当足细胞受损时，足突的肌动蛋白细胞骨架将发生重组，足突与足突之间形成融合，进一步促使足细胞剥落，导致SD结构被破坏。不可逆的足细胞损伤将会使得滤过屏障受损，导致血浆蛋白损失到尿液中产生蛋白尿。

研究发现，采用中医药治疗肾病不但可以减轻并抑制病情反复，还能增强机体免疫机能，并保护能保护肾脏正常的滤过功能，减缓肾功能损伤的程度，预防多种并发症的发生。例如，《黑蔓提取物TRE1对PAN诱导的足细胞损伤的保护作用及机制》一文公开了黑蔓提取物TRE1能够通过促进足细胞自噬以及活化PI3K/AKT信号通路实现对足细胞损伤的保护作用。《肾复康Ⅵ方对阿霉素肾病大鼠疗效及肾小球分子屏障影响的实验研究》则公开了肾复康Ⅵ方(包括黄芪、党参、石韦、黄柏、益母草、丹参、山药、水蛭等中药)可以通过改善podocin、nephrin蛋白表达，改善阿霉素肾病大鼠的病变状态，减少阿霉素肾病大鼠24h尿蛋白含量，降低血清甘油三酯的含量。

目前，杜仲可作为一种中药材与其他药材配伍用于治疗糖尿病肾病等疾病，但其利用十分有限。因此，进一步研究杜仲中有效成分的组合物在足细胞损伤相关疾病中的应用，不仅为足细胞损伤相关疾病的预防和/或治疗提供了一种新的思路，同时也进一步克服了常规中药制剂中因成分繁多导致副作用难以确定的弊端，极大地提高了其治疗效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种治疗肾小球疾病、阿霉素诱导的足细胞损伤等效果显著的杜仲组合物。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种杜仲组合物，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷。

优选地，所述的杜仲组合物，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷1-5份、京尼平苷酸1-5份和松脂醇二葡萄糖苷1-5份。

更优选地，所述的杜仲组合物，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷3-5份、京尼平苷酸2.5-5份和松脂醇二葡萄糖苷3-5份。

更优选地，所述的杜仲组合物，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷4-5份、京尼平苷酸2.5-5份和松脂醇二葡萄糖苷4-5份。

本发明还涉及一种制剂，包括上述的杜仲组合物。

优选地，所述制剂还包括药学上可接受的辅料。

更优选地，所述药学上可接受的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。

优选地，所述制剂为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。

本发明还涉及上述的杜仲组合物或上述的制剂在制备Akt信号通路激动剂中的应用。

本发明还涉及上述的杜仲组合物或上述的制剂在制备足细胞损伤相关药物中的应用。

优选地，所述的足细胞损伤由抗生素诱导引起。

更优选地，所述的抗生素为阿霉素。

本发明还涉及上述的杜仲组合物或上述的制剂在制备预防和/或治疗足细胞损伤相关疾病药物中的应用。

优选地，所述的足细胞损伤相关疾病包括微小病变性肾病、局处节段性肾硬化、膜性肾病、感染、狼癌性肾炎或中毒。

本发明还涉及上述的杜仲组合物或上述的制剂在制备治疗肾小球疾病药物中的应用。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的杜仲组合物可以促进人足细胞增殖，并激活胞内Akt信号通路。

(2)本发明提供的杜仲组合物可以改善阿霉素损伤后的人足细胞生存率，并增加Nephrin表达量、下调Cleaved caspase 3以减少足细胞的凋亡。

(3)本发明提供的杜仲组合物可以改善ADR诱导的纤维蛋白Fibronectin上升，改善足细胞损伤的细胞状态。

(4)本发明优化了桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸和松脂醇二葡萄糖苷的用量配比，在预防和/或治疗足细胞损伤相关疾病方面效果进一步提高。

附图说明

图1为人足细胞分化前后的细胞形态图。倒置荧光显微镜调节至20倍镜下视野；标尺：200μm。

图2为人足细胞分化前后的Podocin蛋白免疫荧光染色图。其中，第一行为分化前的足细胞，第二行为分化7天后的足细胞；从左到右依次为白光、DAPI、Podocin与merge结果；倒置荧光显微镜调节至10倍镜下视野；标尺：200μm。

图3为8％FBS条件下，1μg/mL ADR处理前后Nephrin表达量的变化分析。

图4为8％FBS条件下，1μg/mL ADR处理前后Cleaved caspase 3蛋白的WesternBlot条带图。

图5为8％FBS条件下，1μg/mL ADR处理前后Cleaved caspase 3表达量的变化分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一种杜仲组合物，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷1份、京尼平苷酸5份和松脂醇二葡萄糖苷5份。

实施例2

一种杜仲组合物，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷5份、京尼平苷酸1份和松脂醇二葡萄糖苷1份。

实施例3

一种杜仲组合物，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷1份、京尼平苷酸1份和松脂醇二葡萄糖苷1份。

对比例1-对比例6配方，如表1所示。

表1

测试例1

1、工作液配置

1.1、1X PBS缓冲液

表2 1X PBS缓冲液

1.2、10X电泳缓冲液

表3 10X电泳缓冲液

1.3、10X转膜缓冲液

表4 10X转膜缓冲液

1.4、10X TBS缓冲液

表5 10X TBS缓冲液

1.5、人足细胞增殖培养基

表6人足细胞增殖培养基(无菌操作)

1.6、人足细胞分化培养基

表7人足细胞分化培养基(无菌操作)

1.7、10μg/mL CollagenⅠ乙酸溶液

无菌操作，将57.5μL乙酸加入50mL ddH₂O充分涡旋。用5mL注射器将乙酸溶液小心地推入0.22μm滤膜(注意速度不能过快)，并收集过滤后的溶液至50mL离心管中。再将149.7μL CollagenⅠ溶液缓缓加入乙酸溶液并充分混匀，缠封口膜放入4℃冰箱保存。

2、人足细胞培养

2.1、CollagenⅠ包被细胞培养耗材

无菌操作，将CollagenⅠ乙酸溶液加入细胞培养耗材，使其覆盖皿底/孔底，室温放置1h。随后弃去溶液，用无菌1X PBS淋洗三遍，缠封口膜放入4℃冰箱保存。使用前，用无菌1X PBS再次淋洗一遍。

2.2、细胞增殖

无菌操作，用足细胞增殖培养基重悬复苏的人足细胞，随后在CollagenⅠ包被的培养皿中加入6-7mL的细胞悬液，八字交叉混匀并静置10分钟，最后放入33℃CO₂培养箱中增殖培养。

2.3、细胞传代与分化

无菌操作，待细胞增殖至70％会合度后，加入1mL胰酶室温消化，同时轻轻晃动培养皿。待细胞呈现圆球状后，吸出胰酶，并加入胰酶3倍体积的足细胞增殖培养基终止反应。小心均匀地吹落贴壁细胞，按1:3的比例传代培养。按每孔8000、6000或4000个细胞，将细胞悬液铺入CollagenⅠ包被的6孔板、12孔板或96孔板中，八字交叉混匀并静置10分钟，放入33℃CO₂培养箱培养。一天后，更换足细胞分化培养基，放入37℃CO₂培养箱分化培养7-10天。

3、免疫荧光染色

3.1、细胞固定

小心地吸去所有培养基，将1X PBS缓缓滴加在细胞爬片上，并轻轻晃动培养皿浸洗爬片。随后将免疫荧光固定液小心地滴加在细胞爬片上，固定15分钟。最后用1X PBS浸洗爬片3遍，每遍3分钟。

3.2、细胞通透

将含0.5％Triton-X100的细胞通透液小心地滴加在细胞爬片上，处理10分钟。随后用1X PBS浸洗3遍，每遍3分钟。

3.3、封闭

用细胞封闭液处理细胞爬片90分钟，随后弃去。

3.4、孵育一抗

将抗NPHS2抗体按1：100稀释，小心地滴加在细胞爬片上。将培养皿小心平稳地放入湿盒中，置于4℃冰箱过夜。随后吸走一抗，用1X TBST浸洗3遍，每遍3分钟。

3.5、孵育二抗

避光操作，将1：200稀释的Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)，小心地滴加在细胞爬片上，室温孵育1小时。随后吸走二抗，用1X TBST浸洗3遍，每遍3分钟。

3.6、DAPI染核

避光操作，将DAPI染色液小心地滴加在爬片上，室温孵育5分钟。随后用1X TBST浸洗4遍。

3.7、封片与拍照

避光操作，在载玻片上滴加一滴PBS，随后用镊子小心地将爬片扣出，盖在载玻片上。利用倒置荧光显微镜，在明场、绿色荧光与蓝色荧光通道下拍取照片。

4、CCK-8(Cell counting kit-8)细胞增殖毒性实验

4.1、细胞铺板

在96孔板中均匀铺入足细胞分化培养基稀释的细胞悬液(4000个细胞/孔)，并在所有细胞外围的孔内填满无菌1X PBS，防止蒸发。将96孔板置于33℃CO₂培养箱培养至细胞回合度约60％。随后更换细胞分化培养基，置于37℃CO₂培养箱。

4.2、细胞给药

培养至细胞回合度为90％后，吸走培养基并加入含有待测物质溶液，置于37℃CO₂培养箱处理12h。同时设置无药物有细胞的对照组与无药物无细胞的空白组，每组3个以上重复。

4.3、CCK-8处理

吸走待测物质溶液，加入含有10％CCK-8的足细胞分化培养基，置于37℃CO₂培养箱处理约2h。

4.4、测定吸光度

打开96孔板的盖子，尽可能地赶走气泡。将96孔板放入酶标仪，在450nm条件下测定吸光度。

4.5、数据处理

利用Excel收集和处理每孔吸光度，统计细胞生存率。细胞生存率(％)＝(样品吸光度-空白吸光度平均值)/(对照组吸光度-空白吸光度平均值)平均值。利用GraphPad绘图并做统计学分析，两组之间的比较方法使用t检验法。

5、Western Blot蛋白质免疫印迹法

5.1、蛋白提取

吸走培养基，加入预冷的1X PBS浸洗细胞一次。随后弃去1X PBS，每孔加入1X LDS并使其覆盖孔底。利用微型震荡仪震荡5分钟，随后收集蛋白裂解液到EP管中。每管加入5％巯基还原剂后，混匀蛋白裂解液并瞬离数秒，放入95℃金属浴煮样10分钟。瞬离蛋白样品，即刻放入-20℃冰箱保存。使用前将蛋白样品提前放入4℃冰箱解冻。

5.2、SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis)凝胶电泳

1)制胶：正确安装制胶玻璃板，按说明书配置分离胶与浓缩胶。首先，向制胶板中加入大于2/3体积的分离胶，并在2分钟内加入上层浓缩胶至制胶板最顶部，插入胶束等待20分钟。

2)上样：正确安装胶板到电泳槽中，并倒入1X电泳缓冲液使其覆盖胶板最上沿处。向上小心地拔掉胶束，将解冻的蛋白样品充分涡旋瞬离再上样，并加入蛋白marker。

3)电泳：补充电泳液至完全覆盖电泳槽，以70V恒压电泳至蛋白marker分离，随即切换100V电压继续电泳1.5小时。

5.3、转膜

将转膜夹置于不含甲醇的1X转膜缓冲液中，在转膜夹中依次叠放海绵、滤纸、甲醇活化的PVDF膜、PAGE胶、滤纸与海绵。夹上转膜夹放入转膜槽，利用湿法转膜，在转膜槽中倒入1X(含20％甲醇)转膜液，以300mA恒流冰浴转膜90分钟。

5.4、封闭

将转膜后的条带缓缓地按照蛋白marker裁开，放入封闭液(含有5％脱脂奶粉的1XTBST)。利用摇床室温孵育50分钟，随即用1X TBST浸洗三遍。

5.5、孵育一抗、二抗

将条带的蛋白面朝上，迅速放入一抗稀释液中。置于摇床上4℃孵育过夜。将条带蛋白面朝上放入在洗膜盒中，立即加入1X TBST，置于摇床上清洗3遍，每遍10分钟。弃去1XTBST，立即加入二抗稀释液，置于摇床上孵育1h。弃去二抗，立即加入1X TBST，置于摇床上清洗条带3遍，每遍10分钟。

5.6、显影

将条带放置于培养皿中，均匀地滴加显影液。随后调整条带在照相机下的位置，使其正处于视野中央(水平放置)，使用Bio-Rad化学发光仪软件显影拍照。

5.7、数据处理

使用Image Lab软件截取条带图像，再用Image-J软件将条带转化为8-bit的图像，量化各条带的灰度值(ID)。目的条带的蛋白表达量＝目的条带ID/其所对应的内参ID。利用Excel软件统计ID并且计算平均值，两组之间的比较方法使用t检验法。

6、丝状肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin)染色

6.1、细胞固定

弃去培养基，小心地将1X PBS滴加在细胞爬片上，浸洗细胞爬片数次。将多聚甲醛固定液缓缓地滴加在细胞爬片上，固定细胞15分钟。随后更换1X PBS于4℃保存。

6.2、F-actin染色

由塞维尔公司利用荧光标记的鬼笔环肽对F-actin进行染色，并复染DAPI。

7、研究结果

7.1人足细胞分化状态观察

将步骤2.3分化前与分化7天之后的人足细胞置于明场下，对其细胞形态进行了观察(图1)。可以看到：分化前的足细胞呈梭形与鹅卵形；分化后的足细胞的体积增大，同时由胞体向外衍生出初级突起(白色箭头所示)，初级突起又分裂为足突(黑色箭头所示)。部分足突之间相互重合，构成足细胞之间的连接(双向白色箭头所示)，初步表明了人足细胞的分化。

对分化前和分化7天后人足细胞的Podocin蛋白进行免疫荧光染色，结果如图2所示。观察图2的染色结果可以发现：分化7天后的足细胞胞体与足突中存在大量Podocin表达；而分化前的足细胞胞质中仅存在微量Podocin表达。鉴于足突与Podocin蛋白仅存在于分化后的足细胞内，上述结果表明：获得了已分化的人足细胞。

7.2、建立ADR诱导的人足细胞损伤

本发明验证了FBS浓度并不会影响足细胞的生存能力，并且在不同浓度FBS情况下，0.1％DMSO均不会对人足细胞产生细胞毒性，低浓度(指＜10％)FBS条件下，ADR对人足细胞Nephrin蛋白的下调作用更为可观。

所以，在8％FBS培养人足细胞条件下，使用1μg/mL ADR在37℃处理足细胞12h，每1μg/mL ADR溶液中含有0.1％DMSO作为模型组(ADR组)；并将0.1％DMSO在37℃处理足细胞12h作为对照组(con组)，将Nephrin表达量变化的情况作为判断足细胞损伤的指标，结果如图3、图4和图5所示。图3表示Nephrin表达量变化情况，左侧为Western Blot蛋白条带，右侧为三次样品的平均蛋白表达量。图4和图5表示Cleaved caspase 3表达量变化情况，其中，图4为Western Blot蛋白条带，图5为三次样品的平均蛋白表达量。图3中损伤后Nephrin表达量显著下降、图5中Cleaved caspase 3表达量显著上升。表明：8％FBS条件下，1μg/mLADR诱导了人足细胞的损伤与凋亡。***P＜0.001；****P＜0.0001；ns无显著差异；。

7.3、杜仲组合物对人足细胞生存状态的影响

利用CCK-8实验测定50μM杜仲组合物对人足细胞的细胞毒性，发现本发明实施例1-3和对比例1-6的杜仲组合物处理后人足细胞的生存率均无下降，说明50μM杜仲组合物对人足细胞没有细胞毒性。

7.3.1、杜仲组合物对人足细胞内Akt信号通路的影响

实施例1-3和对比例1-4、对比例6杜仲组合物处理后的人足细胞内p-Akt(Ser473)/Akt表达量与对照组(不含杜仲组合物)相比存在上升趋势，对比例5变化不大。并且实施例1-3与对比例2表达量显著上升，明显优于其他组，说明桃叶珊瑚苷与松脂醇二葡萄糖苷可以激活胞内Akt信号通路，并且桃叶珊瑚苷与松脂醇二葡萄糖苷协同作用显著。

7.4、杜仲组合物对ADR损伤的人足细胞的保护能力

7.4.1、杜仲组合物对ADR损伤的人足细胞的生存率的影响

利用CCK-8实验测定50μM杜仲组合物对ADR损伤情况下人足细胞(参照步骤7.2利用ADR处理人足细胞造成损伤)生存率的影响。其中：实验组：50μM杜仲组合物+1μg/mL ADR(含0.1％DMSO)处理人足细胞12h；对照组：0.1％DMSO处理人足细胞12h；模型组：1μg/mLADR(含0.1％DMSO)处理人足细胞12h。结果如表8所示。

表8各组人足细胞生存率统计结果(n＝3)

注：与模型组相比，^*P＜0.05；^**P＜0.01。与实施例3组相比，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

7.4.2、杜仲组合物对ADR损伤情况下足细胞Nephrin、Cleaved caspase 3表达量的影响

实验组：50μM杜仲组合物+1μg/mL ADR(含0.1％DMSO)处理人足细胞12h；对照组：0.1％DMSO处理人足细胞12h；模型组：1μg/mL ADR(含0.1％DMSO)处理人足细胞12h。Nephrin、Cleaved caspase 3表达量如表9所示。

表9各组人足细胞Nephrin、Cleaved caspase 3表达量统计结果(n＝3)

组别	Nephrin表达量	Cleaved caspase 3表达量
			对照组	1.0	1.0
模型组	0.55±0.029	1.62±0.31
			实施例1	0.79±0.037*	1.15±0.28*
实施例2	0.80±0.043*	1.14±0.15*
			实施例3	0.82±0.035*	1.12±0.19*
对比例1	0.69±0.021*#	1.46±0.36*#
			对比例2	0.72±0.048*#	1.26±0.23*#
对比例3	0.61±0.026#	1.35±0.27*#
			对比例4	0.73±0.034*#	1.40±0.34*#
对比例5	0.57±0.030#	1.59±0.25#
			对比例6	0.65±0.038*#	1.28±0.16*#

注：与模型组相比，^*P＜0.05。与实施例3组相比，^#P＜0.05。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种用于治疗阿霉素诱导的足细胞损伤的杜仲组合物，其特征在于，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷1-5份、京尼平苷酸1-5份和松脂醇二葡萄糖苷1-5份。

2.根据权利要求1所述的杜仲组合物，其特征在于，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷3-5份、京尼平苷酸2.5-5份和松脂醇二葡萄糖苷3-5份。

3.根据权利要求1所述的杜仲组合物，其特征在于，按照重量份数计，由如下组分组成：桃叶珊瑚苷4-5份、京尼平苷酸2.5-5份和松脂醇二葡萄糖苷4-5份。

4.一种用于治疗阿霉素诱导的足细胞损伤的制剂，其特征在于，以权利要求1-3任一所述的杜仲组合物为活性成分。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂还包括药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为缓释剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂或润滑剂中的任意一种或多种。

7.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂为外用制剂、口服制剂或注射制剂中的任意一种。

8.权利要求1-3任一所述的杜仲组合物或权利要求4-7任一所述的制剂在制备治疗阿霉素诱导的足细胞损伤的药物中的应用。