CN116196334A - 间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用 - Google Patents

间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用 Download PDF

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CN116196334A CN202310146680.7A CN202310146680A CN116196334A CN 116196334 A CN116196334 A CN 116196334A CN 202310146680 A CN202310146680 A CN 202310146680A CN 116196334 A CN116196334 A CN 116196334A
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孙丰田
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Abstract

本发明属于细胞技术领域，具体涉及间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。本发明所述小细胞外囊泡可显著抑制视网膜EMT转变和Müller胶质细胞激活，保护视网膜结构，减少视网膜胶原沉积和纤维化改变，从而实现治疗糖尿病视网膜病变的技术效果。实施例结果表明：本发明的hucMSC‑sEVs治疗可保护视网膜结构，减少胶原沉积和纤维化；抑制视网膜色素上皮细胞的上皮间质转变和纤维化蛋白表达，减少Müller胶质细胞凋亡并抑制其胶质化激活，改善大鼠的视觉功能。

Description

间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病 变的药物中的应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。
背景技术
糖尿病视网膜病变是一种常见的糖尿病微血管并发症，疾病发生时视网膜血管细胞受损，神经细胞发生退行性病变，血-视网膜屏障的破坏和持续的炎症反应引起视网膜的纤维化，给患者带来沉重的经济压力和精神损失。随着糖尿病视网膜病变病程的发展，视网膜色素上皮细胞(RPEs)发生间质转变(EMT)为成纤维细胞，Müller胶质细胞被激活，两者生成大量细胞外基质，在视网膜表面和玻璃体腔内形成纤维化组织并产生牵引力导致视网膜的剥离，最终造成患者失明。尽管新一代的药物和玻璃体视网膜显微手术已被用于糖尿病视网膜病变临床治疗，但糖尿病视网膜病变的患病率仍然迅速增加，且对于糖尿病视网膜病变纤维化的治疗效果并不理想，因此，寻找新的、有效的药物防治糖尿病视网膜病变抑制糖尿病视网膜病变纤维化发生发展是临床迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的提供一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。本发明所述的含有小细胞外囊泡的药物可治疗糖尿病视网膜纤维化。
为了解决上述问题，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜纤维化的药物中的应用。
优选的，所述药物具有抑制视网膜组织纤维化蛋白表达的作用；所述纤维化蛋白包括GFAP和α-SMA。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备修复糖尿病视网膜的药物中的应用。
优选的，所述修复糖尿病视网膜包括保护视网膜结构的完整性和/或增加视网膜厚度。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备减少视网膜胶原沉积的制剂中的应用。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制视网膜间质转化和/或纤维化制剂中的应用。
优选的，所述抑制视网膜间质转化包括抑制上皮细胞间质转化相关蛋白N-cadherin、Snail和vimentin表达和/或细胞迁移；
抑制视网膜纤维化包括降低视网膜色素上皮细胞细胞Fibronectin、COL1A1和α-SMA中的一种或几种纤维化蛋白表达。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制Müller胶质细胞激活和减少Müller细胞凋亡的制剂中的应用，所述抑制Müller胶质细胞激活包括Müller胶质细胞纤维酸性蛋白表达减少。
优选的，所述间充质干细胞来源小细胞外囊泡包括人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡。
本发明的有益效果：本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用。本发明所述小细胞外囊泡可显著抑制视网膜胶质纤维酸性蛋白GFAP和成纤维细胞标志物α-SMA表达，从而实现治疗糖尿病视网膜纤维化的技术效果。实施例结果表明：本发明的hucMSC-sEVs干预后抑制GFAP和α-SMA表达，视网膜的纤维化被抑制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为流式细胞术鉴定hucMSC标记蛋白结果图；
图2为透射电镜hucMSC-sEVs图片；
图3为采用纳米颗粒跟踪分析hucMSC-sEVs的大小分布结果图；
图4为Western blot验证小细胞外囊泡标志物包括CD63、CD9、CD8、Alix和HSP70以及阴性生物标志物calnexin结果图；
图5为SD大鼠视网膜HE染色结果图；
图6为SD大鼠视网膜Masson染色结果图；
图7为SD大鼠视网膜GFAP免疫荧光染色结果图；
图8为SD大鼠视网膜α-SMA免疫荧光染色结果图；
图9为ARPE-19细胞transwell实验结果图；
图10为Westernblot检测ARPE-19细胞EMT相关蛋白结果图；
图11为Westernblot检测ARPE-19细胞纤维化相关蛋白表达结果图；
图12为流式细胞术检测MIO-M1细胞凋亡率结果图；
图13为MIO-M1细胞凋亡率结果图；
图14为免疫荧光检测MIO-M1细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达结果图；
图15为Westernblot检测MIO-M1细胞纤维化相关蛋白表达结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。本发明所述间充质干细胞来源小细胞外囊泡优选包括人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡。本发明所述脐带间充质干细胞小细胞外囊泡优选通过分离培养健康产妇脐带间充质干细胞，采用超离法提取培养后脐带间充质干细胞上清得到。
本发明提供了一种间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜纤维化的药物中的应用。本发明所述的人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡具有抑制纤维化蛋白表达的作用；本发明所述纤维化蛋白包括GFAP和α-SMA。
本发明对人脐带间充质干细胞中的小细胞外囊泡的提取方法没有特殊限定，采用常规的方法即可。本发明优选采用超速差速离心的方法提取人脐带间充质干细胞上清中的小细胞外囊泡。
本发明所述小细胞外囊泡的提取方法优选包括：将所述人脐带间充质干细胞上清液第一离心得到第一离心上清液，对所述第一离心上清液进行第二离心得到第二离心上清液，对所述第二离心上清液进行第三离心得到第三离心上清液，对所述第三离心上清液进行浓缩得到浓缩液，对所述浓缩液进行第四离心得到小细胞外囊泡沉淀，所述小细胞外囊泡沉淀重悬得到小细胞外囊泡。本发明所述重悬优选利用PBS溶液。
本发明所述第一离心的离心力优选为300g，第一离心时间优选为10min；本发明所述第一离心作用为去除人脐带间充质干细胞上清液中的死细胞。
本发明所述所述第二离心的离心力优选为2000g，第二离心时间优选为20min；本发明所述第二离心作用为去除人脐带间充质干细胞上清液中的细胞碎片。
本发明所述所述第三离心的离心力优选为10000g，第三离心时间优选为30min；本发明所述第三离心作用为去除人脐带间充质干细胞上清液中的细胞器。
本发明所述浓缩的离心力优选为2000g，浓缩的离心时间优选为30min；本发明所述浓缩作用为缩小含有小细胞外囊泡的人脐带间充质干细胞上清液体积。本发明所述浓缩离心优选利用超滤离心管。本发明所述浓缩离心的次数优选为多次直至获得体积为40mL的含有小细胞外囊泡的人脐带间充质干细胞上清浓缩液即止。
本发明优选对所述浓缩液进行第四离心得到小细胞外囊泡沉淀，更优选为浓缩液进行第四离心后得到沉淀，所述沉淀利用PBS溶液洗涤后再次进行第四离心，再次得到沉淀后利用PBS溶液重悬后过滤得到人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡hucMSC-sEVs。本发明所述第四离心的离心力优选为100000g，第四离心时间优选为70min。重悬前，本发明优选将所述PBS溶液通过过滤器过滤，所述过滤器的直径优选为0.22μm。本发明所述过滤优选利用无菌滤膜完成，本发明所述无菌滤膜的直径优选为0.22μm。本发明所述hucMSC-sEVs呈典型的双凹圆盘状，NTA分析其平均粒径为140nm。
在本发明中，所述治疗糖尿病视网膜纤维化的药物的有效作用剂量优选为160μg/d-240μg/d，更优选为200μg/d。本发明优选制备大鼠糖尿病视网膜病变模型对人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡(hucMSC-sEVs)的应用效果进行验证。
本发明提供了间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备修复糖尿病视网膜的药物中的应用。本发明所述修复糖尿病视网膜包括保护视网膜结构的完整性和/或增加视网膜厚度。
本发明提供了间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备减少视网膜胶原沉积的制剂中的应用。
目前尚不清楚，人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡是否能通过调节视网膜色素上皮细胞间质转变(EMT)和Müller胶质细胞激活以抑制糖尿病视网膜纤维化。
本发明提供了间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制视网膜间质转化和/或纤维化制剂中的应用。本发明所述抑制视网膜间质转化优选包括抑制上皮细胞间质转化(EMT)相关蛋白N-cadherin、Snail和vimentin表达和/或细胞迁移；本发明抑制视网膜纤维化优选包括降低视网膜色素上皮细胞细胞Fibronectin、COL1A1和α-SMA中的一种或几种纤维化蛋白表达。
本发明提供了间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制Müller胶质细胞激活和减少Müller细胞凋亡的制剂中的应用。本发明所述抑制Müller胶质细胞激活优选包括Müller胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)表达减少。
本发明hucMSC-sEVs能保护高糖刺激下的MIO-M1细胞，减少其凋亡；并且能抑制高糖诱导的细胞胶质化激活，减少GFAP(胶质纤维酸性蛋白)和纤维化蛋白表达。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡(hucMSC-sEVs)的提取和鉴定：在征得产妇及其家人知情同意后，于江苏大学附属四院即时取产妇新鲜脐带(所有临床实验标本采集均经江苏大学医学伦理委员会批准并签定知情同意书)，用无菌密闭方式在2h内运回实验室后按本课题组制定的方法从新鲜脐带中分离hucMSC(人脐带间充质干细胞)体外培养扩增鉴定，收集细胞上清(即首先从健康产妇的脐带组织中分离间充质干细胞(hucMSCs)进行原代培养，收集细胞上清并采用超速差速离心的方法提取细胞上清中的小细胞外囊泡)。
1人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡(hucMSC-sEVs)的提取。将收集的细胞上清液于温度为4℃，300g离心10min，以去除死细胞；再将收集的细胞上清液于温度为4℃，2000g离心20min，以去除细胞碎片；然后收集上清后于温度为4℃，10000g离心30min，以去除细胞器；再将上清转移至100kDa MWCO超滤离心管，在温度为4℃，2000g离心30min进行浓缩；浓缩离心反复多次至体积为40ml。
随后将浓缩液于温度为4℃，100000g离心70min；弃上清，适量PBS溶液洗涤，于温度为4℃，100000g离心70min；最后加入0.22μm滤器过滤后的PBS溶液重悬，最后用0.22μm无菌滤膜过滤除菌，高压灭菌的无菌1.5ml EP管分装后于-80℃保存，得到人脐带间充质干细胞来源的小细胞外囊泡hucMSC-sEVs。
2鉴定
(1)流式细胞术鉴定hucMSC表面标记蛋白：细胞缓冲液(PBS)重悬细胞，调节hucMSC细胞浓度为3×106cells/mL。取1.5mL EP管，标记一抗(来自于OriCell间充质干细胞(人)表面标记检测试剂盒，货号：HUXMX-09011)名称，分装100μL细胞悬液至标记的EP管中。向EP管加入2μL与标记名称对应的一抗，混匀。4℃孵育30min。200μL细胞缓冲液清洗样品两次。250×g，离心5min。弃去上清。每组各加入100μL流式细胞缓冲液。每管各加入2μL荧光二抗(来自于OriCell间充质干细胞(人)表面标记检测试剂盒，货号：HUXMX-09011)，重悬细胞。4℃孵育30min。200μL细胞缓冲液清洗样品两次。250×g，离心5min。弃去上清。400μL流式细胞缓冲液重悬细胞后，立即上机检测，结果见图1，根据图1可知，CD105、CD73、CD29呈强阳性而CD11b、CD34、CD45呈阴性，表明hucMSCs被成功分离培养。
(2)透射电镜观察小细胞外囊泡(sEV)的基本形态：取20μl的hucMSC-sEVs，充分混匀后滴加于直径2mm的载样铜网上，于室温静置5min后，用滤纸吸去铜网边缘残余液体，然后将铜网倒扣于30g/L磷钨酸(pH 6.8)液滴上，室温下负染5min，最后将铜网在白炽灯下烘干，置于透射电镜下观察并拍照。透射电镜下观察到hucMSC-sEVs呈典型的双凹圆盘状，见图2。
(3)NTA测量sEV的粒径分布及浓度：取1μl hucMSC-sEVs用纯净水稀释约500～1000倍(具体稀释比例与小细胞外囊泡浓度相关)用Nanosight检测，测得sEV粒径大小一般在100～200nm，NTA分析其平均粒径为140nm，见图3。
(4)sEV蛋白提取及浓度测定：1)取45μL小细胞外囊泡于EP管中，置于冰上；2)加入等体积45μL的RIPA-PMSF-PIC细胞裂解液(5mL RIPA裂解液(Pierce 89901)+50μl蛋白酶和磷酸酶抑制剂微型片剂(品牌Thermo Scientific Pierce，货号A32961)得到混合溶液；3)用漩涡混合器振荡混合溶液1min后立即将混合溶液置于冰上静置10min进行，重复此步骤5次，得到sEV裂解液。将sEV裂解液通过BCA试剂盒(品牌：Vazyme E112-02)操作说明书测定蛋白浓度为21.3mg/mL，说明提取到的小细胞外囊泡蛋白浓度高。随后在sEV裂解液中加入1/3体积的4×SDS loading buffer混匀，置于沸水中煮10min，分装保存于-20℃冰箱，得到sEV蛋白样品。
(5)小细胞外囊泡的蛋白鉴定：蛋白免疫印迹(westernblot)。
SDS-PAGE分离胶浓度按目的分子大小提前配制。(1)将凝胶板夹好后，拔出凝胶梳，用新鲜配制的1×SDS-PAGE电泳液洗孔，甩净后，在内槽中加满新鲜配制的1×SDS-PAGE电泳液；(2)分别按照按每孔sEV蛋白样品30μg的蛋白上样量，缓慢垂直地上样。在外槽中加入适量的电泳液，使内外存在液面差。积层胶按60V电压，分离胶按80V电压完成电泳；(3)SDS-PAGE凝胶于350mA恒流条件下半干转2h，目的蛋白sEV蛋白转至PVDF膜上；(4)室温下，PVDF膜置于5％脱脂牛奶中封闭至少1h；(5)按分子量大小，将PVDF膜裁成适当的条带，以5％脱脂牛奶稀释一抗后，4℃孵育过夜。一抗稀释比例为：β-actin抗体(稀释质量比1:5000)、CD9小鼠单克隆抗体(稀释质量比1:500)、CD63兔多克隆抗体(稀释质量比1:500)、HSP70(稀释质量比1:500)、Calnexin(稀释质量比1:500)、Alix抗体(稀释质量比1:500)。(6)第二天，将条带取出后恢复至室温后，1×TBS/T清洗5min共4次。二抗用Western一抗稀释液(碧云天P0023A)按质量比1：2000稀释于封闭液中，37℃温箱孵育中孵育1h。1×TBS/T缓冲液清洗8min，共5次。新鲜配制曝光液后进行曝光分析。
hucMSC的Westernblot检测步骤同hucMSC-sEVs。
Westernblot检测发现提取的hucMSC-sEVs与hucMSC相比表达表面标志物蛋白CD9、CD63、CD81、Alix、HSP70，但不表达阴性标志物Calnexin，见图4，证明hucMSC和hucMSC-sEVs被成功分离。
实施例2STZ诱导的SD大鼠DR纤维化模型构建和视网膜组织纤维化状况评价
本实施例中，构建了SD大鼠糖尿病视网膜病变模型，并用同种浓度和剂量的hucMSC-sEVs和HFL1-sEVs进行玻璃体腔内注射(100μg/只)，随后观察大鼠视网膜的恢复情况，以评价相对于人胚肺成纤维细胞来源的sEVs，人脐带间充质干细胞来源的sEVs是否能抑制糖尿病视网膜的纤维化。视网膜HE染色，Masson染色和免疫荧光染色实验结果表明，与HFL1-sEVs相比，hucMSC-sEVs组大鼠能够有效改善视网膜的结构，增加视网膜厚度，减少胶原沉积和纤维化蛋白表达。
1.STZ诱导的SD大鼠糖尿病视网膜病变(DR)纤维化模型构建
选择200～220g雄性清洁级SD大鼠18只，用45％高脂饲料喂养5周后空腹过夜(禁食不禁水)，随后尾静脉注射STZ(品牌为Sigma，30mg/kg)1次，并换成普通饲料喂养。STZ注射后每3天测大鼠血糖值，采用以下指标评价造模是否成功：①大鼠精神萎靡，多饮多食多尿，体重减轻；②随机血糖≥16.7mmol/L。在STZ处理后8周后，对大鼠进行分组，分成处理组、对照组、DR组，每组6只大鼠。
2.选择200～220g雄性清洁级SD大鼠6只，正常喂养作为Normal组。
3各组小鼠处理
(1)处理组DR+hucMSC-sEVs：在STZ注射后第八周向糖尿病视网膜病变(DR)纤维化大鼠玻璃体腔内注射实施例1得到的hucMSC-sEVs进行干预，每只大鼠的每个眼睛各注射100μg/次，干预1次。
(2)对照组DR+HFL1-sEVs：在STZ注射后第八周向糖尿病视网膜病变(DR)纤维化大鼠玻璃体腔内注射HFL1-sEVs(人胚肺成纤维细胞-sEVs)，每只大鼠的每个眼睛各注射100μg/次，干预1次。
(3)DR组：在STZ注射后第八周向糖尿病视网膜病变(DR)纤维化大鼠注射PBS溶液(Bionid 02-024-1ACS)进行干预，每只大鼠的每个眼睛各注射100μg/次，干预1次。
(4)Normal组：在STZ注射后第八周向正常大鼠体内注射PBS溶液(Bionid02-024-1ACS)，每只大鼠的每个眼睛各注射100μg/次，干预1次。
常规饲养16周后收集处理组和对照组大鼠视网膜组织，制备对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片。通过HE染色石蜡切片观察对照组和处理组大鼠视网膜的形态结构，统计分析不同组别视网膜厚度变化；采用Masson染色、免疫组化染色方法，检测对照组和处理组大鼠视网膜组织胶原沉积程度和纤维化相关蛋白表达情况，综合比较hucMSC-sEVs对DR纤维化模型干预的有效性。
3结果分析
(1)HE染色方法及结果：取出待染色的对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片，整个HE染色过程中包括固定、脱水及染色。染色的主要过程如下：将对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片按照顺序经过二甲苯、梯度的乙醇溶液和水，将切片上的盖玻片及树胶洗脱完全。洗脱之后对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片进行苏木紫染色4min后水洗，待细胞核染成蓝色后，停止水洗过程。水洗之后，对照组切片和处理组切片依次在伊红染色液每次染色3min，染色两次、95％乙醇每次染色2min染两次以及无水乙醇每次染色2min染两次。染色后，对照组切片和处理组切片采用苯酚二甲苯处理4min与二甲苯处理4min。采用树胶以盖片封片。染色结果见图5，根据图5结果可知，hucMSC-sEVs能够增加DR大鼠视网膜的厚度，保护视网膜结构。
(2)Masson染色方法根据Masson染色试剂盒(品牌：Solarbio，货号：G1346)中的说明书进行，染色后的对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片进行显微镜镜检，染色结果见图6，根据染色结果可知：胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色；细胞核呈蓝黑色。图6显示hucMSC-sEVs干预后的大鼠视网膜组织中减少视网膜胶原沉积。
(3)石蜡切片免疫荧光染色步骤及结果：对照组大鼠视网膜组织石蜡切片和处理组大鼠视网膜组织石蜡切片均脱蜡至水：蒸馏水洗共2次，每次5min(置于摇床)。抗原修复：用塑料切片架，置于塑料或耐温玻璃容器内，利用枸橼酸钠缓冲液淹没脱蜡后的对照组大鼠视网膜组织切片和处理组大鼠视网膜组织切片，100℃加热5min；取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再高温加热5min，PBS溶液清洗2次，每次5min。正常血清封闭：取出抗原修复后的对照组大鼠视网膜组织切片和处理组大鼠视网膜组织切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分，滴加正常山羊或兔血清处理，37℃，15min用滤纸吸去封闭血清后直接滴加第一抗体(GFAP(品牌Bioworld，货号：BS6460)、α-SMA(品牌：abcam，货号：ab124964))，置于4℃冰箱过夜。次日于摇床用PBS清洗2次，每次清洗5min，滴加对应的荧光二抗(Goat anti-Rabbit IgG，FITC conjugated(绿色)，(品牌SAB，货号L3202))，在温度为37℃条件下，40min。置于摇床PBS清洗2次，每次清洗5min。之后再利用DAPI(1:400稀释，稀释的溶剂为Western一抗稀释液(碧云天P0023A))进行室温染核5min，组化PBS清洗。PBS清洗后封片，使用激光共聚焦显微镜捕捉拍摄。免疫荧光结果见图7和图8，根据图7和图8可知，DR大鼠视网膜胶质纤维酸性蛋白GFAP和成纤维细胞标志物α-SMA表达增加，hucMSC-sEVs干预后抑制GFAP和α-SMA表达，表明视网膜的纤维化被抑制。
实施例3视网膜色素上皮细胞纤维化评价
普通(5mM)细胞培养基：DMEM低糖培养液(Bioind 01-051-1ACS)；
高糖(30mM)细胞培养基：在DMEM低糖培养液的基础上添加葡萄糖粉末，葡萄糖粉末为D(+)葡萄糖，沪试，14431-43-7。
5mM组：视网膜色素上皮细胞(ARPE-19，来自于中科院细胞库)在含10％胎牛血清的普通(5mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM组：ARPE-19细胞在含有10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM+hucMSC-sEVs组：ARPE-19细胞在含有10％胎牛血清和hucMSC-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM+HFL1-sEVs组(对照组)：ARPE-19细胞在含有10％胎牛血清和HFL1-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
4个处理组组刺激48h后采用transwell迁移实验评价ARPE-19细胞的迁移能力，使用免疫荧光染色、Western blot等方法检测ARPE-19的EMT转化情况及纤维化相关蛋白的表达情况。
1、Transwell观察细胞迁移：将在5mM组、30mM组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组培养48h后处于对数生长期的ARPE-19细胞分别用质量浓度为0.3％的胰酶消化收集细胞，弃上清，用PBS洗涤2次，800r/min离心5min，再加入无血清培养基DMEM低糖培养液(Bioind 01-051-1ACS)吹打混匀，重悬细胞，并使用血细胞计数板计数，将细胞浓度稀释至6×105/mL。
之后在24孔板中每孔加入500μL含10％胎牛血清的DMEM低糖培养液(Bioind 01-051-1ACS)，放入Transwell小室，向Transwell上室分别加入200μL的5mM组、30mM组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组稀释后的细胞悬液，置于温度为37℃、CO2含量为5％条件的细胞培养箱培养18h。取出Transwell小室并用PBS清理，使用质量浓度为4％多聚甲醛固定细胞1h，然后用0.5％的结晶紫染液染色，染色后室温放置20min。使用PBS洗涤后将Transwell上室一侧未迁移的细胞用无菌棉球擦净，显微镜下观察拍照。
在每个小室随机挑选3个视野，对对照组和处理组迁移的细胞进行计数统计，见图9和表1。图9结果表明，高糖(30mM)环境下ARPE-19细胞迁移增加，hucMSC-sEVs抑制了ARPE-19细胞迁移，表1中的30mM+hucMSC-Ex组的ARPE-19相对细胞数量，说明hucMSC-sEVs抑制了ARPE-19细胞迁移。
表1各组3个视野ARPE-19相对细胞数量
组别 5.5mM 30mM 30mM+hucMSC-Ex 30mM+HFL1-Ex
视野1 1.03092784 1.67525773 1.05154639 2.88659794
视野2 0.82474227 1.80412371 1.28865979 3.09278351
视野3 1.1443299 1.5257732 1.10824742 3.40206186
2、ARPE-19细胞纤维化相关蛋白表达和EMT相关蛋白表达采用western blot方法，western blot实验步骤同实施例1。
图3中B为Western blot检测ARPE-19细胞EMT相关蛋白。图3中C为Western blot检测ARPE-19细胞纤维化相关蛋白表达。根据图3中B可知，在β-actin即内参蛋白表达量基本一致的前提下，相对于30mM高糖组，hucMSC-sEVs处理后细胞EMT相关蛋白N-cadherin、Snail和vimentin表达减少，可见，hucMSC-sEVs干预后抑制了EMT进程，根据图3中C可知，hucMSC-sEVs干预后ARPE-19细胞纤维化相关蛋白Fibronectin、COL1A1和α-SMA的表达减少，各组β-actin表达基本一致。
综上，细胞蛋白Western blot检测与免疫荧光实验结果表明：hucMSC-sEVs处理抑制了ARPE-19细胞迁移以及EMT进程，同时减少了高糖刺激后ARPE-19细胞Fibronectin、COL1A1和α-SMA等纤维化相关蛋白的表达。
实施例4视网膜Müller细胞纤维化评价
1、流式细胞术检测MIO-M1细胞凋亡情况
胶质细胞Müllers(MIO-M1，购于深圳华拓生物公司(货号：HTX1998))在含10％胎牛血清的普通(5mM)细胞培养基、含10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基、含10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基+hucMSC-sEVs、含10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基+HFL1-sEVs环境下刺激48h后作为5mM处理组、30mM处理组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组(对照组)。
用不含EDTA的胰酶消化5mM处理组、30mM处理组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组的MIO-M1细胞，在转速为1800rpm、温度为4℃条件下离心5min，弃上清收集各组MIO-M1细胞。用预冷的PBS洗涤各组细胞两次，每次均在转速为1800rpm、温度为4℃的条件下离心5min。离心后的5mM处理组、30mM处理组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组细胞沉淀中加入100μl 1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液。样品染色：各组单细胞悬液中加入5μlAnnexinV-FITC和5μl PI Staining Solution，轻轻吹匀；避光、室温(20～25℃)条件下孵育10min；加入400μl 1×Binding Buffer，轻轻混匀。染色各组MIO-M1细胞样品在1h内用流式细胞仪检测。流式细胞术检测结果表明相对于高糖30mM处理组，hucMSC-sEVs处理后MIO-M1凋亡细胞的比例减少，提示hucMSC-sEVs能保护高糖刺激下的MIO-M1细胞，见图12和图13和表2。图13中的“***”代表在0.05水平差异显著。
表2各个处理组视网膜Müller细胞的凋亡比例
组别 5.5mM 30mM 30mM+HucMSC-sEVs 30mM+HFL1-sEVs
平行1 4.64 7.13 5.11 5.78
平行2 4.7 7.5 5.2 5.82
平行3 5 7.83 5.46 6.11
2、MIO-M1细胞免疫荧光染色：
5mM组：MIO-M1细胞在含10％胎牛血清的普通(5mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM组：MIO-M1细胞在含有10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM+hucMSC-sEVs组：MIO-M1细胞在含有10％胎牛血清和hucMSC-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
30mM+HFL1-sEVs组(对照组)：MIO-M1细胞在含有10％胎牛血清和HFL1-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基中刺激48h。
将在5mM组、30mM组、30mM+hucMSC-sEVs组、30mM+HFL1-sEVs组培养48h后处于对数生长期的MIO-M1细胞分别用质量浓度为0.3％的胰酶消化收集细胞，弃上清，用PBS洗涤2次，800r/min离心5min，再加入含10％胎牛血清的普通(5mM)细胞培养基吹打混匀重悬细胞，即得到单细胞悬液。
5mM处理组:在12孔板里加入1ml含10％胎牛血清的普通(5mM)细胞培养基，放入爬片，并从用胰酶消化后MIO-M1单细胞悬液中取5×104个细胞分别接种于12孔中，在37℃、CO2含量为5％的条件下培养24h。
30mM处理组：在12孔板里加入1ml含10％胎牛血清的高糖(30mM)细胞培养基，放入爬片，并从用胰酶消化后MIO-M1单细胞悬液中取5×104个细胞分别接种于12孔中，在37℃、CO2含量为5％的条件下培养24h。
30mM+hucMSC-sEVs组：在12孔板里加入1ml含10％胎牛血清和hucMSC-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基，放入爬片，并从用胰酶消化后MIO-M1单细胞悬液中取5×104个细胞分别接种于12孔中，在37℃、CO2含量为5％的条件下培养24h。hucMSC-sEVs添加的原始体积为25μl。
30mM+HFL1-sEVs组：在12孔板里加入1ml含10％胎牛血清和HFL1-sEVs的高糖(30mM)细胞培养基，放入爬片，并从用胰酶消化后MIO-M1单细胞悬液中取5×104个细胞分别接种于12孔中，在37℃、CO2含量为5％的条件下培养24h。HFL1-sEVs添加的原始体积为25μl。
取出12孔板中各组已经爬好细胞的玻片，弃去营养液，用无菌PBS浸洗三次，每次5min。接着用质量浓度4％的多聚甲醛室温下固定爬片10min，浸洗爬片3次，每次5min。然后向爬片上滴加0.1％TritonX-100(10mlPBS+10μl Triton X-100)室温下通透20min，再次用PBS溶液清洗玻片3次，每次5min。用吸水纸轻轻吸干爬片上多余的液体，并向玻片上滴加5％牛血清白蛋白(BSA)，室温下封闭30min。用吸水纸吸干封闭液，向爬片上滴加足量的一抗并放入湿盒中，4℃孵育过夜。次日取出玻片，PBS溶液清洗3次，每次5min，吸干多余液体后滴加荧光二抗，温度为37℃环境下避光孵育45min，用PBS清洗玻片3次，每次5min。滴加0.5μg/ml的DAPI避光条件下染核15min，PBS溶液清洗爬片3次，每次5min。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像，见图14，MIO-M1细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达减少，蓝色代表细胞核，绿色代表GFAP(胶质纤维酸性蛋白)，Merge是两张图片的叠加，结果表明相对于高糖处理组，hucMSC-sEVs处理后MIO-M1细胞的GFAP减少。实验结果提示hucMSC-sEVs能抑制高糖诱导的MIO-M1细胞胶质化激活。
3、MIO-M1细胞纤维化相关蛋白表达采用western blot方法，western blot实验步骤同实施例1。
图15为Westernblot检测MIO-M1细胞纤维化相关蛋白表达，根据图15可知减少纤维化相关蛋白GFAP、Fibronectin和COL1A1表达。实验结果提示hucMSC-sEVs能抑制高糖诱导的细胞胶质化激活，减少GFAP和纤维化蛋白表达。
本发明通过流式细胞术和Western blot检测了Müller细胞(MIO-M1)凋亡以及胶质化激活情况。实验结果提示hucMSC-sEVs能保护高糖刺激下的MIO-M1细胞，减少其凋亡；并且能抑制高糖诱导的细胞胶质化激活，减少GFAP和纤维化蛋白表达。
综上，本发明所述的人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡能够抑制视网膜色素上皮细胞的EMT和Müller细胞的胶质激活，减少两种细胞的纤维化蛋白表达，从而维护糖尿病大鼠视网膜结构的完整性，减少视网膜的胶原沉积和纤维化蛋白表达，改善大鼠的视觉功能。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜病变药物中的应用。
2.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备治疗糖尿病视网膜纤维化的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述药物具有抑制视网膜组织纤维化蛋白表达的作用；所述纤维化蛋白包括GFAP和α-SMA。
4.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备修复糖尿病视网膜的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述修复糖尿病视网膜包括保护视网膜结构的完整性和/或增加视网膜厚度。
6.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备减少视网膜胶原沉积的制剂中的应用。
7.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制视网膜间质转化和/或纤维化制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制视网膜间质转化包括抑制上皮细胞间质转化相关蛋白N-cadherin、Snail和vimentin表达和/或细胞迁移；
抑制视网膜纤维化包括降低视网膜色素上皮细胞细胞Fibronectin、COL1A1和α-SMA中的一种或几种纤维化蛋白表达。
9.间充质干细胞来源小细胞外囊泡在制备抑制Müller胶质细胞激活和减少Müller细胞凋亡的制剂中的应用，其特征在于，所述抑制Müller胶质细胞激活包括Müller胶质细胞纤维酸性蛋白表达减少。
10.根据权利要求1～9任一项所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源小细胞外囊泡包括人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡。
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