CN117503764A - 姜黄素类似物ef24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明姜黄素类似物EF24在制备治疗特发性肺纤维化(IPF)药物中的用途，属于医药领域。本研究首次发现姜黄素类似物EF24能通过上调PTEN抑制其下游AKT/mTOR/NF‑κB信号通路和降低损伤线粒体的累积，进而抑制肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AEC)的衰老，最终抑制肺成纤维细胞的活化；EF24能够减少IPF小鼠肺组织中衰老细胞的数量，并且体内研究结果进一步确定了EF24能抑制博来霉素(BLM)诱导的IPF小鼠肺组织的细胞衰老并改善小鼠的肺纤维化，为靶向衰老细胞的抗IPF药物治疗提供了新的方向和策略。本发明还证明EF24抗IPF的效果优于阳性药物达沙替尼和L48H37，且不会对正常细胞活性造成影响。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，涉及姜黄素类似物EF24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途。
背景技术
特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病理机制尚未明确的肺部疾病。IPF是由遗传、环境风险因素、老龄化相关过程和表观遗传重编程等复杂的相互作用造成的一种慢性、进行性、不可逆性且通常致死性的肺实质疾病，它的组织病理学特征是胸膜下的纤维化、上皮下成纤维细胞病灶以及显微镜下肺部的蜂窝状结构的变化。IPF的发病率和死亡率是现今面临的最主要原因，患者被确诊后中位生存期只有3-5年，并且随着人口老龄化的到来，预计在不久的将来，IPF疾病带来的经济负担将会持续上升。
目前广泛的认为IPF的发生是由于持续的肺上皮损伤和随后的成纤维细胞激活和肌成纤维细胞分化引起的。持久的肌成纤维细胞活化使得ECM过度沉积，肺修复异常，导致组织瘢痕形成，肺泡结构扭曲，肺功能不可逆的丧失。而现今除肺移植外，FDA批准治疗IPF的药物仅有吡非尼酮(Pirfenidone)和尼达尼布(Nintedanib)，但二者仅能缓解IPF的症状，延缓病情的进展，并不能从根本上逆转病情或者治愈疾病，且在应用过程中均存在轻度至中度不良事件，导致IPF患者的预后极差。百时美施贵宝申报的1类新药BMS-986278-01片在中国获批两项临床试验，适应症为特发性肺纤维化，目前还在III期临床试验中。IPF缺乏有效的治疗药物，其原因可能在于对IPF的发病机制以及疾病进程中的核心靶点尚未有明确的研究进展。因此开发和研究减慢甚至逆转IPF疾病进程的新靶点和靶向药物是特发性肺纤维化治疗的重要目标。
姜黄素是一种从姜黄属植物姜黄、郁金等块茎中提取出的一种天然多酚化合物，其毒性低，具有抗炎、抗菌、抗氧化、调血脂、抗癌等广泛的药理活性。据报道姜黄素可以减少肺泡上皮细胞的凋亡、抑制TGF-β分泌及其信号通路发挥抗肺纤维化作用。但是由于姜黄素吸收率低的缺点限制了它的临床应用潜力。而姜黄素类似物(3E,5E)-3,5-双[(2-氟苯基)亚甲基]-4-哌啶酮-EF24是对姜黄素进行结构调整和修饰后发现的一个比姜黄素具有更多生物学活性和更高生物利用度，且不增加其药物毒性的化合物。目前关于EF24报道最多的是其抗肿瘤活性，包括调控NF-κB、MAPK和HIF-1α等抑制肿瘤细胞增殖或促进其凋亡。除此之外，还报道EF24具有清除衰老细胞的“senolytic”活性且能够上调恶性黑色素瘤细胞中PTEN的表达诱导其凋亡。
申请号为202080079524.8发明名称为“姜黄素类组合物及其处理肺纤维化的治疗潜力”的专利公开了包含70％-80％w/w四氢姜黄素类、10％-20％w/w六姜黄素类和5％-10％w/w八氢姜黄素类的组合物在治疗性处理间质性肺病或肺纤维化中的用途。
专利号2014106620794公开了一种姜黄素衍生物的制备方法及在防治肺纤维化中的应用。其通过化学合成的方法将酰基引入到姜黄素分子中获得姜黄素酰基衍生物，并证明其有防治肺纤维化的用途，但是EF24并不涉及酰基。
随着细胞衰老在各种衰老相关疾病中的研究，研究人员发现肺泡上皮细胞(alveolar pithelial cells，AEC)的衰老和积累是导致IPF发生和发展的关键因素。经检索，还没有相关EF24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途的报道。
发明内容
针对以上技术问题，本发明拟提供一种姜黄素类似物EF24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途。
首先，本发明保护姜黄素类似物EF24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途。
进一步地，所述的姜黄素类似物EF24通过上调PTEN抑制其下游AKT/mTOR/NF-κB信号通路和损伤线粒体的累积进而抑制AEC的衰老最终抑制肺成纤维细胞的活化。
进一步地，所述的特发性肺纤维化包括急性特发性肺纤维化和慢性特发性肺纤维化。
进一步地，所述的药物包含姜黄素类似物EF24，并制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸。
进一步地，所述药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。
本研究首次发现姜黄素类似物EF24能通过上调PTEN抑制其下游AKT/mTOR/NF-κB信号通路和损伤线粒体的累积进而抑制AEC的衰老最终抑制肺成纤维细胞的活化；EF24能够减少IPF小鼠肺组织中衰老细胞的数量，并且体内实验研究结果进一步确定了EF24能抑制BLM诱导的IPF小鼠肺组织的细胞衰老并改善小鼠的肺纤维化，为靶向衰老细胞的抗IPF药物治疗提供了新的方向和策略。
本发明通过比较几种抗IPF阳性药物以及姜黄素类似物对衰老细胞活力的影响，发现：EF24对衰老细胞A549和ATⅡ细胞并没有显著的杀伤作用，对正常细胞也没有杀伤作用，却能明显地降低SA-β-gal阳性细胞数。
因此，本发明证明EF24可以用于抗IPF，且EF24抗IPF的效果优于阳性药物达沙替尼和L48H37，且不会对正常细胞造成影响。
附图说明
图1为EF24减少BLM诱导的AEC中SA-β-gal阳性细胞数量，其中(A)为SA-β-gal染色检测BLM诱导A549细胞衰老的最适浓度；(B和C)为SA-β-gal染色检测EF24处理衰老AEC的SA-β-gal阳性细胞的数量，(B)为A549细胞，(C)为ATⅡ细胞；(D)为MTT检测EF24对衰老AEC的细胞活力的影响，左为A549细胞，右为ATⅡ细胞。
图2为EF24抑制BLM诱导的A549细胞的衰老表型，其中(A和B)为Western Blot检测不同浓度的EF24处理衰老AEC后衰老相关蛋白的变化，(A)为A549细胞，(B)为ATⅡ细胞；(C和D)为Real-time PCR技术检测EF24处理衰老AEC后SASP的mRNA的变化，C为A549细胞，D为ATⅡ细胞；(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001)。
图3为EF24抑制AEC衰老诱导的肺成纤维细胞活化，其中(A)为EF24处理的衰老AEC条件培养基培养HELF细胞，Western Blot检测纤维化相关蛋白的表达的影响；(B)为WesternBlot检测TGF-β1诱导HELF细胞纤维化的最适浓度；(C)为WesternBlot检测EF24处理对TGF-β1诱导HELF细胞纤维化的影响；(D)为Western Blot检测EF24处理对TGF-β1诱导ATⅡ细胞纤维化的影响。
图4为IPF小鼠肺组织形态和胶原表达图，其中(A)为体内实验流程示意图，以及HE染色检测IPF小鼠肺组织形态(左)和Masson染色检测IPF小鼠肺组织胶原表达(右)；(B)为Masson染色统计结果；(C)为IPF小鼠肺组织HYP含量。(**p＜0.01；***p＜0.001，n＝6)；
图5为EF24改善BLM诱导的急性期IPF小鼠的肺损伤图，其中(A)为体内实验流程示意图；(B)为EF24对IPF小鼠体重的影响；(C)为EF24对IPF小鼠器官系数；(D)为EF24对IPF小鼠生存期的影响；(E)为Micro-CT检测EF24对IPF小鼠肺部影像的影响；(F)为EF24对IPF小鼠肺组织形态(HE，左)和胶原表达(Masson，右)的影响；(G)为Masson染色统计结果；(H)为EF24对IPF小鼠肺组织HYP含量的影响；(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；n＝8)。
图6为EF24改善BLM诱导的急性期IPF小鼠的肺损伤图，(A)为体内实验流程示意图；(B)为EF24对慢性IPF小鼠肺泡灌洗液中细胞总数的影响；(C)为EF24对慢性IPF小鼠肺组织形态(HE，左)和胶原表达(Masson，右)的影响；(D)为Masson染色统计结果。(E)为EF24对慢性IPF小鼠肺组织HYP含量的影响；(*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001；n＝8)。
图7为EF24抑制BLM诱导的IPF小鼠肺组织的衰老表型，其中(A)为SA-β-gal染色检测EF24对IPF小鼠肺组织SA-β-gal阳性率的影响；(B)为Western Blot检测EF24对IPF小鼠肺组织PTEN、纤维化相关蛋白以及衰老相关蛋白的影响；(C)为(B)图的统计图。
图8为EF24上调衰老AEC中PTEN的表达水平，其中(A)为Real-time PCR技术检测EF24对衰老AEC中PTEN mRNA的影响，左为A549细胞，右为ATⅡ细胞；(B和C)为Western Blot检测EF24对衰老ATⅡ细胞PTEN表达的影响，(B)为A549细胞，(C)为ATⅡ细胞；(D)为分子对接预测PTEN与EF24的结合能力，左为EF24(P60484)-PTEN(70674488)对接能量-8.34KJ，右为EF24(2kyl)-PTEN(70674488)对接能量-7.10KJ；(E)为SA-β-gal染色检测EF24与Bpv联用对衰老A549细胞中SA-β-gal阳性率的影响；(F和G)为Western Blot检测EF24与PTEN抑制剂Bpv的联用对衰老AEC中PTEN以及PAI-1的影响，(F)为A549细胞，(G)为ATⅡ细胞；(*p＜0.05；**p＜0.01)。
图9为EF24对衰老AEC中PTEN/AKT/mTOR/NF-κB/TGF-β信号通路的影响，其中(A和B)为Western Blot检测EF24对衰老AEC中PTEN下游AKT/mTOR/NF-κB信号通路的影响，(A)为A549细胞，(B)为ATⅡ细胞；(C和D)为Western Blot检测EF24对衰老AEC中TGF-β1的影响，(C)为A549细胞，(D)为ATⅡ细胞。
图10为EF24减少线粒体损伤数量，其中(A和B)为Real-time PCR技术检测EF24对衰老AEC中mtDNA数量的影响，(A)为A549细胞，(B)为ATⅡ细胞中。(C和D)为WesternBlot检测EF24对衰老AEC中TOM20的影响，(C)为A549细胞，(D)为ATⅡ细胞。(*p＜0.05；**p＜0.01)。
图11为姜黄素类似物或者抗IPF阳性药物对衰老A549细胞的细胞活力的影响图，其中A-K分别表示2HBA、姜黄素、二甲基姜黄素、槲皮素、达沙替尼、pentagamavunon-1、尼达尼布、吡菲尼酮、TML-6、L48H37、HO3857对衰老A549细胞的细胞活力的影响图；
图12为姜黄素类似物对衰老A549细胞SA-β-gal阳性细胞数的影响图；
图13为姜黄素类似物或者抗IPF阳性药物对衰老ATⅡ细胞的细胞活力的影响图，其中A-K分别表示2HBA、姜黄素、二甲基姜黄素、槲皮素、达沙替尼、pentagamavunon-1、尼达尼布、吡菲尼酮、TML-6、L48H37、HO3857对衰老ATII细胞的细胞活力的影响图；
图14为姜黄素类似物对衰老ATII细胞SA-β-gal阳性细胞数的影响图。
具体实施方式
一、实验所用材料、仪器、试剂
1.实验材料小鼠品系为C57BL/6、肺泡上皮细胞替代株A549，二型肺泡上皮细胞ATⅡ，以及人胚肺成纤维细胞HELF
2.实验仪器qRT-PCR仪(ABI)、纯水仪(Millipore)、生物安全柜(Thermo)、二气培养箱、电动移液器15ml、正置荧光显微镜Nikon、倒置荧光显微镜Nikon、PCR仪(ABI)、显微镜(Nikon)、磁力搅拌器、-80℃超低温冰箱、4℃层析柜、冰箱、微波炉、60℃烘箱、37℃水浴锅、电子天平、电子分析天平、多功能酶标仪、高压灭菌锅、37℃恒温培养摇床、化学发光成像系统、摇床、杂交炉、低温高速离心机、凝胶紫外成像系统、台式PH计、台式高速离心机、微型离心机、液氮储存罐、水平电泳槽、凝胶成像系统、微量移液器、制冰机、蛋白电泳仪、静音混合仪磁性分离器、真空吸液泵、磁力搅拌器、超声波细胞破碎仪、-20℃卧式冰柜、立式冰柜、石蜡包埋机、冰冻切片机
3.实验耗材实验耗材
胰蛋白酶、DMEM细胞培养基、DMEM培养基(无丙酮酸钠)、L转染试剂、澳洲胎牛血清FBS、中美胎牛血清FBS、KCl、甲醇、异丙醇、甲醛、异丙醇、Na2HPO4固体粉末、95％乙醇、无水乙醇、DMSO、NaHCO3、KH2PO4、氯甲烷、BCA蛋白定量试剂盒、β-巯基乙醇、琼脂糖AG、丙烯酰胺、氯化钠、Tween-20、KH2PO4、96孔细胞培养板、液管10mL、RIPA裂解液、逆转录试剂盒、β-gal染色液、Green、二甲苯、苏木素、伊红、蔗糖、石蜡、中性树脂、15mL/50mL离心管、丁腈橡胶手套、移液器枪头、细胞冻存管、TGF-β1、EF24、硫酸博来霉素、Real Time-PCR引物
二、实验方法
2.1小鼠肺纤维化模型的构建
本发明采用BLM来诱导小鼠的IPF模型，采用C57Bl/6的雄性小鼠，气管滴入的方式给药，使药物均匀的分布于肺组织，使肺部特异性的损伤。不同小鼠的敏感性不同，而C57BL/6小鼠对药物的敏感度高于BALB/c小鼠，并且IPF的发病率男性略高于女性。
1)挑选3个月左右健康的雄性C57BL/6小鼠，随机分组。
2)每隔两天鼻滴BLM(3.5mg/kg)，对照组滴注PBS，滴注三次，每隔两天一次，滴注完成后再饲养7天。
2.2小鼠衰老模型的建立
采用全身辐射诱导(Total-Body Irradiation，TBI)的衰老小鼠模型。将3月龄雄性C57BL/6小鼠采用全身X射线照射，照射剂量为5Gy，辐射后正常养殖6个月之后出现明显的衰老表型，例如佝偻、毛发灰白，体重增加等症状认为是衰老小鼠。
2.3小鼠组织取样
1)将小鼠放置于解剖台上，断颈处死小鼠，75％酒精消毒。
2)固定小鼠四肢，用解剖器械对小鼠进行解剖，取出肺部。
3)将小鼠肺组织迅速取出，用PBS清洗血迹，用滤纸吸干水分，置于天平中称取肺组织的质量，记录数值。
4)将肺组织分为：放入4％多聚甲醛一份用于冰冻切片，一份放于RNA Later中用于提蛋白以及提RNA，一份置于4％甲醛中用于石蜡切片，一份放于冻存管中放入液氮速冻。
(注：这些操作都置于冰上)
5)用于冰冻切片的组织在多聚甲醛中固定4h左右即可放入20％、30％的蔗糖中依次脱水，脱水之后立刻进行OCT(Optimal cuttingtemperature compound)包埋之后，立即冰冻切片。
6)用于石蜡切片的组织，4％甲醛固定过夜之后，使用流水冲洗12h左右，放入70％乙醇中永久保存。
2.4石蜡切片
1)脱水：在70％乙醇中保存的组织，依次75％、85％、90％、95％；无水乙醇I、无水乙醇II各大约30min脱水(脱水时间根据组织的大小调节)。
2)无水乙醇-二甲苯缓冲液5min，二甲苯I、二甲苯II 5-10min透明(透明时间根据组织的大小调节，若没有透明完全则可增加透明时间)。
3)之后二甲苯-石蜡(1:1)5min、蜡I、蜡II、蜡III各1h浸蜡。
4)包埋。
①提前打开组织包埋机预热，并提前半个小时打开冷冻台。
②将浸完石蜡的组织放置于已融化的石蜡包埋仪的浸蜡槽中。10min后，用镊子将小鼠组织置于冷台的包埋具中进行包埋。
③将带有模具的组织放在4℃冷台上放置1-2h使组织蜡块完全凝固。将包埋好的石蜡组织与石蜡模具分离开。
2.5H&E染色
1)脱蜡复水：将准备好的石蜡切片烘烤1-2h。分别经过二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ10-15min，无水乙醇-二甲苯缓冲液、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95％、90％、80％、70％各5min之后转移进无菌水1min准备染色。
2)核质染色：苏木精中5min左右，用自来水洗净，转移入1％盐酸-乙醇中分化，浸入后立马取出用自来水冲洗，再放入0.5％氨水中约5s，取出用自来水冲洗，显微镜观察，如果颜色较淡可重复再次进行苏木精染色，如果颜色较好即可用伊红进行染色，约30s。
3)脱水透明：伊红染完后将样本移入95％乙醇Ⅰ进行漂洗，移入95％乙醇Ⅱ漂洗，漂洗结束即可开始进入梯度乙醇脱水分别经过70％，80％，90％，95％，无水乙醇Ⅰ，无水乙醇Ⅱ，各10s，最后进行透明，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ各3min。
4)封片：透明结束后，进行封片，在载玻片有样本的一面滴一滴中性树胶(如果树胶过于黏稠可用二甲苯稀释)，盖上盖玻片。(注：盖盖玻片时注意不要产生气泡，避免样本保存不当干片)
2.6MASSON染色
结缔组织染色中最常用的方法是Masson三色染色，又称为马松染色。三色染色是指将细胞核、肌纤维、胶原纤维染成不同的颜色。实验步骤为(索莱宝，G1340)：
1)片子的准备与石蜡切片相同，步骤参照2.2.10.2。
2)按照说明书配置Weigert铁苏木素染液染色5min-10min。
3)分化液分化15s，水洗。
4)Masson蓝化液返蓝3-5min，水洗，蒸馏水洗1min。
5)丽春品红染色10min，按说明书比例配置弱酸工作液。
6)染色结束后用配置好的弱酸工作液清洗1min。
7)磷钼酸溶液洗1-2min，用配置好的弱酸工作液洗1min。
8)苯胺蓝染1-2min，用配置好的弱酸工作液洗1min。
9)95％乙醇快速脱水2-3s，无水乙醇脱水5-10s/次，3次。
10)二甲苯透明2min/次，3次，中性树脂封片。
2.7组织半乳糖苷酶染色
1)冰冻切片准备组织样本，肺组织大约切6-8μm的厚度。
2)片子准备好之后，使用1×PBS轻柔的清洗片子，将OCT清洗干净，避免影响染色结果。
3)清洗结束之后，加入按照试剂盒配置好的染色剂。
4)置于37℃中染色过夜(大致18h左右)。注意避光以及防止空气中的CO2与衰老染色液结合，降低其PH值而出现假阳性。
2.8HYP检测
羟脯氨酸(HYP)是机体胶原蛋白主要成分之一，因此HYP的含量可以代表纤维化的程度。实验原理为：样本可通过酸水解产生游离的HYP，可被氯胺T氧化，产物与对二甲氨基苯甲醛可发生反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。根据OD值可计算HYP含量。
所用试剂盒为索莱宝，BC0255，实验步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
称取于玻璃管中，将组织尽量剪碎以便消化，盖子稍松不密闭。加入1mL的提取液，煮沸至没有大块的组织。冷却后用10mol/L NaOH调节pH值至6-8范围(不可过酸或过碱)，再蒸馏水定容至3mL。最后16000rpm，25℃，离心20min，取上清待测。(过程中可能有黑色物质生成，可能为碳化的物质，不影响)
二、测定步骤
1)
三、羟脯氨酸含量计算公式
1)标准曲线的绘制：
以标准溶液的浓度为x轴，ΔA标准(ΔA标准＝A标准管-A空白管)为y轴，绘制标准曲线，得到方程y＝kx+b。将ΔA测定(ΔA测定＝A测定管-A空白管)带入方程得到x(μg/mL)。
2)羟脯氨酸含量的计算：
(1)按样本质量计算：组织羟脯氨酸含量(μg/g质量)＝x×V样本÷(W×V样本÷V组提)＝3x÷W
V样本：加入的样本体积，0.06mL；
V组提：组织提取液体积，3mL；
W：样本质量。
2.9肺泡灌洗液
支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)是应用纤维支气管镜对支气管以下肺段进行灌洗，采集肺泡表面液体获得的肺泡灌洗液，对其进行过微生物学及化学方法对肺泡灌洗液进行分析并获得检验结果，可为临床诊断、鉴别诊断、治疗效果评价和判断预后提供参考。肺泡灌洗液检验可用于评价间质性肺疾病的炎症反应分期，诊断肺部疾病。IPF时肺泡灌洗液以中性粒细胞增多为主，并伴有嗜酸性粒细胞增多。
小鼠的肺泡灌洗液一般分为单侧灌洗和双侧灌洗。我们采用双侧灌洗，进行颈部解剖，暴露气管进行插管。
1)PBS灌洗量增高到0.8-1mL灌洗次数同上，我们选择的是双侧灌洗。
2)将小鼠短颈处死置于解剖台上，将颈部解剖暴露出气管。
3)2.5mL的注射器针头用导管包住，插入气管当中，注意不要刺穿气管。
4)将含有0.1％5mM EDTA的1×PBS吸入1mL的注射器中；插入注射器针头中，灌洗肺部。
5)灌洗回收的灌洗液4℃，1500r，10分钟，取沉淀，用200μL的1×PBS重悬。计数。
6)灌洗液4℃，1500r离心10分钟。
7)使用同体积的PBS重悬收集到的细胞沉淀(一般200μL)，计数。统计差异。
2.10Mico-CT分析
IPF的诊断有多种方法，常见的包括CT或外科肺活检模式对最终诊断至关重要。对于IPF患者，CT扫描结果可预测疾病的发生并指导治疗，CT上常见的间质性肺炎表现为网状阴影，常与牵引性支气管扩张症相关，很少或没有磨玻璃样阴影。蜂窝征是常见的，表现为胸膜下成簇的囊性腔，管壁清晰(通常直径为3-10毫米)，对明确诊断非常重要[86]。
1)提前将室内温度调至24℃作用，打开Micro-CT机子进行预热处理。
2)将小鼠麻醉之后，放入Micro-CT机子中，提前试用主备好麻醉剂，每只小鼠保证20min左右无知觉。
3)待预热完成后，打开LathetaV3.56软件，在标准模式下安装校准holder进行校准。
4)按照肺组织的区域进行选取扫描区域，先进行肺组织全扫描，接着对所在区域进行断层扫描。
5)扫描结束后保存，之后使用Sante DICOM Viewer Free导出TIF格式的图片
6)关电脑关仪器等操作。
2.11统计学分析
采用Image J对Westernblot以及Masson染色进行灰度分析以及统计胶原面积分析，数据采用GraphPadPrism 8.0进行统计分析，并对数据进行平均值±标准差(SD)保证数据平行性，两组数据之间的比较采用双尾Student’t检验，多组数据间的差异使用单因素方差分析及双因素方差分析，P<0.05认为具有统计学意义。
实施例1EF24对BLM诱导的AEC衰老的影响(体外实验)
目前研究证实衰老相关的刺激因素均能导致肺泡上皮细胞AEC和(或)成纤维细胞的衰老，这些衰老细胞具有抗凋亡特性，同时能够分泌大量SASP向邻近细胞传递衰老信号，导致干细胞耗竭和持续性炎症，最终促进IPF的发生和发展。因此，靶向衰老的AEC在IPF治疗中具有潜在价值。
1.1EF24减少BLM诱导的AEC中SA-β-gal阳性细胞数量
为了研究EF24是否能抑制AEC的衰老，本发明选用A549和ATⅡ两株AEC，通过采用不同浓度的BLM处理AEC建立细胞衰老模型，结果显示3.5μM的BLM处理72h后A549细胞中SA-β-gal阳性细胞数的数量达到70％左右，提示衰老细胞模型构建成功(图1A)。在此基础上，采用1μM、5μM和10μM的EF24处理衰老的A549细胞48h后，检测SA-β-gal阳性细胞的数量，结果显示EF24能减少BLM诱导的AEC中SA-β-gal阳性的细胞数量(图1B和1C)。有研究报道EF24具有清除衰老细胞的“senolytic”活性，为了探究EF24抑制AEC是否与其“senolytic”活性有关，本发明进一步采用MTT检测EF24对衰老AEC活力的影响。结果显示，EF24对衰老的A549细胞并没有显著的杀伤作用(图1D)，说明衰老AEC数量的减少与EF24的“senolytic”特性无关。
1.2EF24抑制BLM诱导的衰老AEC中衰老相关蛋白和SASP的表达
为了进一步研究EF24对AEC衰老表型的影响，选取1、5和10μM的EF24处理衰老的AEC，采用WesternBlot检测衰老相关蛋白PAI-1、p21和p16的表达，结果显示，BLM处理的AEC中PAI-1、p21等衰老相关蛋白的表达均显著增加，而EF24能下调衰老AEC中PAI-1、p21和p16的表达，且具有浓度依赖性(图2A和2B)，进一步说明EF24能抑制BLM诱导的衰老表型。同时，SASP的大量分泌是衰老细胞的特征之一，其通过旁分泌的方式促进周围细胞的衰老最终导致衰老相关疾病的发生。
为了研究EF24对衰老AEC中SASP表达水平的影响。采用Real-time PCR技术检测EF24处理衰老AEC中的IL-6和TGF-β等IPF特征性的SASP表达水平的变化。结果显示，BLM诱导的衰老AEC中TGF-β等SASP的mRNA表达水平显著升高，而1μM EF24对SASP的表达均具有显著的抑制作用(图2C和2D)，进一步证明EF24能抑制BLM诱导的AEC的衰老表型。
1.3EF24抑制衰老AEC和TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的活化
研究表明，衰老的AEC可以通过增加SASP的表达诱导肺成纤维细胞的活化(肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞细胞)，进而促进ECM的大量释放和沉积导致IPF的发生。因此，为了探究EF24对衰老AEC中SASP的抑制作用是否能影响肺成纤维细胞的活化，将BLM诱导衰老AEC的培养基与新鲜培养基按1:1比例培养HELF细胞，再选取1、5和10μM的EF24处理衰老的AEC 48h后，收集条件培养基，按照与新鲜培养基1:1的比例培养HELF细胞，采用Westernblot检测肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA和Vimentin以及迁移相关蛋白Snail的表达水平。结果显示，衰老细胞的条件培养基处理的HELF细胞中α-SMA等蛋白的表达水平显著上调，提示衰老AEC的确能通过分泌大量的SASP诱导肺成纤维细胞的活化，而EF24处理的衰老AEC的条件培养基培养的HELF细胞中肌成纤维细胞标志蛋的表达显著下调，提示EF24能抑制AEC的衰老进而抑制肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化(图3A)。
同时，采用TGF-β诱导HELF以及细胞建立IPF细胞模型进一步研究EF24对肺成纤维细胞活化是否具有直接的抑制作用。首先，将HELF细胞饥饿处理12h后，加入5和10ng/mL的TGF-β处理24h，检测肌成纤维细胞标志蛋白的变化建立IPF细胞模型。结果显示5和10ng/mL的TGF-β处理HELF细胞都使肌成纤维细胞标志蛋白α-SMA和Vimentin的表达水平上调，说明IPF细胞模型构建成功(图3B)。在此基础上，采用5ng/mL的TGF-β预处理HELF细胞和ATⅡ细胞24h后，直接加入不同浓度的EF24处理，结果显示，在HELF细胞中，1μM的EF24能直接抑制TGF-β诱导的α-SMA和Vimentin等肌成纤维细胞标志蛋白以及FN和MM9等ECM相关蛋白的表达(图3C)。同时，在ATⅡ细胞中，随着EF24浓度的增加，肌成纤维细胞标志蛋白和ECM相关蛋白的表达也显著下调(图3D)。以上结果表明，EF24对肺成纤维细胞的活化也具有直接的抑制作用。
实施例2IPF小鼠模型建立
本发明首先建立BLM诱导的小鼠IPF模型，采用每隔两天经气管滴注BLM(3.5mg/kg)，滴注3次后再饲养7天，建立IPF小鼠模型，对照组滴注等体积的生理盐水。在第14天处死小鼠取出小鼠肺组织，采用HE染色和Masson染色检测小鼠肺组织的形态变化和胶原表达的变化(图4A)。HE染色结果显示，与对照组相比，BLM组小鼠肺组织结构严重受损，肺间质明显增厚，肺泡塌陷，肺实变严重；同时，Masson染色结果显示BLM组胶原纤维表达明显升高(图4B)。另外，胶原蛋白主要成分羟脯氨酸(HYP)的含量也显著提高(图4C)，说明IPF小鼠模型构建成功。
实施例3EF24能够改善BLM诱导的急性期IPF小鼠的肺纤维化
每隔一天腹腔注射20mg/kg的EF24，给药14天后正常饲养7天。同时，小鼠活体肺部Micro-CT影像结果显示，与对照组相比，IPF小鼠的肺组织明显呈现网状影和蜂窝状影的增加，以两肺中、下肺显著，提示两肺纤维化的发生，而给予EF24的IPF小鼠肺组织的肺部影像呈现出网状影和蜂窝的减少，进一步说明EF24能够改善BLM诱导的IPF小鼠的肺纤维化(图5E)。为检测EF24对IPF小鼠病理结构影响，本发明对小鼠肺组织进行HE染色，结果显示EF24明显改善了IPF小鼠肺组织结构受损，肺间质增厚，肺泡塌陷，肺实质的现象(图5F)；同时，Masson染色结果和HYP含量的检测结果显示，EF24明显降低了IPF小鼠胶原纤维增加的现象(图5G和5H)。以上结果证明EF24具有抗IPF的体内活性。处死小鼠取出肺组织(图5A)。从造模开始每隔两天监测一次小鼠的体重，结果显示，与IPF模型组相比，20mg/kg EF24给药能够改善BLM导致的小鼠体重下降和肺组织器官系数的增加，并且降低其死亡率(图5B-5D)。
实施例4EF24能够改善BLM诱导的慢性期IPF小鼠的肺纤维化
有研究报道，衰老小鼠(18月龄)肺组织的修复能力低于年轻小鼠(3月龄)肺组织的修复能力，并且衰老小鼠肺组织对于外界的刺激更加敏感，使用BLM诱导将会导致更严峻的IPF。因此我们想探究EF24对于衰老IPF小鼠是否也具有抗肺纤维化的活性。本发明首先采用全身辐照(Total Body Irradiation,TBI)建立衰老小鼠模型，在此基础上通过BLM诱导IPF模型，通过EF24腹腔注射给药后评价其抗IPF活性(图6A)。
目前的研究表明肺泡上皮细胞损伤时，会召集炎症细胞以及细胞外基质的沉积来修复受损细胞，可用肺组织周围炎症细胞的数量来判断IPF的严重程度。因此，检测了小鼠肺组织小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)中的细胞总数的变化。结果显示，BLM诱导的IPF小鼠的肺泡灌洗液的细胞总数，不管年轻IPF小鼠还是衰老IPF小鼠，都明显高于对照小鼠；而EF24组的IPF小鼠BALF中的细胞总数都下降了(图6B)，提示EF24在IPF模型中可能具有抗炎活性。
为检测EF24对慢性期IPF小鼠病理结构影响，对小鼠肺组织进行HE染色，结果显示，不管对于年轻慢性IPF小鼠还是衰老慢性IPF小鼠，EF24都明显改善了慢性IPF小鼠肺组织结构受损，肺间质增厚，肺泡塌陷，肺实质的现象。同时，Masson染色结果显示，EF24可以缓解慢性IPF小鼠胶原沉积以及减少HYP的含量。说明EF24对衰老小鼠中的慢性期IPF也具有改善作用(图6C-6E)，并且衰老小鼠的肺损伤以及胶原沉积的病理情况都较年轻小鼠严重，进一步说明衰老与IPF相关。
实施例5EF24抑制IPF小鼠肺组织的衰老表型
为了研究EF24的体内抗IPF活性是否与抑制细胞衰老表型相关，本发明采用SA-β-gal染色检测小鼠肺组织中SA-β-gal阳性细胞的数量，结果显示，EF24降低了IPF小鼠肺组织中SA-β-gal阳性细胞的数量(图7A)。进一步的WesternBlot结果显示，与对照组相比IPF模型组小鼠中PTEN的表达显著降低，而EF24给药后的小鼠肺组织中PTEN表达水平有所提高，并下调α-SMA和p21的表达(图7B和7C)，提示EF24的体内抗IPF活性与上调PTEN抑制细胞衰老相关。
实施例6EF24抑制AEC衰老的机制
6.1EF24对AEC衰老的抑制作用依赖于PTEN表达水平的上调
研究表明，PTEN表达缺失是促进AEC衰老和肺成纤维细胞活化的关键因素。为了探究EF24对AEC衰老的抑制作用是否与PTEN相关，首先，采用Real-time PCR技术检测EF24处理后衰老AEC中PTENmRNA的表达水平的变化，结果显示在衰老AEC中PTEN mRNA的表达水平低于正常AEC，而1μM的EF24即可上调衰老AEC中PTENmRNA的表达水平(图8A)。同时，采用Westernblot技术检测EF24对衰老AEC中PTEN表达水平的影响。结果显示，与非衰老的AEC相比，衰老AEC中PTEN蛋白表达水平显著降低，而EF24能上调衰老AEC中PTEN的表达，且具有浓度依赖性。提示EF-24可能通过调控PTEN抑制AEC的衰老(图8B和8C)。
为了进一步探究EF24抑制AEC衰老是否依赖于PTEN，我们首先采用分子对接技术初步预测EF24与PTEN是否有相互作用。结果发现EF24与的PTEN的结合自由能为-8.34KJ和-7.10KJ，说明EF24可能与PTEN有直接结合(图8D)。在此基础上，我们采用PTEN的磷酸酶抑制剂Bpv预处理后，再采用EF24处理衰老AEC 48h，检测衰老细胞数量和相关蛋白的改变。结果显示，EF24与Bpv共同作用较EF24单独处理组衰老细胞的数量有所增加(图8E)，PTEN的表达量显著降低，且衰老相关蛋白PAI-1的表达也增加，提示下调PTEN能减弱EF24的抗AEC衰老活性，说明EF24抑制AEC衰老的作用依赖于PTEN表达水平的上调(图8F和8G)。
6.2EF24抑制衰老AEC中PTEN下游信号通路AKT/mTOR/NF-κB的激活
研究表明，PTEN的缺失可通过激活其下游的AKT和NF-κB加速AEC衰老并促进SASP的分泌。因此，本发明进一步检测了EF24处理后PTEN下游AKT/NF-κB/mTOR信号通路的变化。结果显示，与非衰老的AEC相比，BLM诱导的衰老AEC中p-AKT、p-mTOR和p-NF-κB的表达显著升高，而EF24能抑制p-AKT、p-NF-κB和p-mTOR的蛋白表达水(图9A和9B)。同时，本发明进一步检测了AKT/mTOR/NF-κB的下游效应因子和IPF的诱导因子TGF-β的变化。结果显示在衰老的AEC中TGF-β显著提高，而EF24能够显著降低TGF-β的表达(图9C和9D)。以上结果表明，EF24抑制衰老AEC中PTEN下游的AKT/mTOR/NF-κB信号通路。
6.3EF24减少衰老AEC中的损伤线粒体累积
研究报道，在IPF患者的AEC中有大量功能失调的线粒体的累积，而PTEN的缺失会可能会抑制PINK1介导的线粒体自噬，使得大量功能受损的线粒体在细胞中不断累积，最终导致细胞衰老。因此，我们初步检测了EF24对衰老AEC中线粒体数量的影响，结果显示，BLM诱导的衰老AEC中mtDNA的含量和线粒体膜蛋白TOM20的表达水平均明显增加，表明衰老AEC中的确出现线粒体数量增多和累积的现象，而EF24能够减少mtDNA的含量并下调TOM20的表达水平，且具有浓度依赖性(图10A-10D)。提示EF24能够减少衰老AEC中线粒体的累积。
实施例7EF24与其它抗IPF药物或姜黄素类似物的效果对比7.1姜黄素类似物对衰老A549细胞的细胞活力的影响
此实验结果使用MTT法检测得到，与EF24检测方式相同。首先采用3.5μM的BLM处理3天诱导衰老，种细胞至96孔板中，加入1，5，10μM的姜黄素类似物处理48h之后，MTT检测细胞活力得到图11。
如图11从结果看出：姜黄素、达沙替尼、pentagamavunon-1、尼达尼布、吡菲尼酮、TML-6、L48H37这几个姜黄素类似物或者抗IPF阳性药物对正常的A549细胞具有一定的杀伤作用，同时，还可以看出达沙替尼以及L48H37对衰老的的A549具有一定的杀伤作用；2HBA、槲皮素、HO3867、二甲基姜黄素对正常的A549细胞以及衰老A549细胞都没有杀伤作用；而EF24对正常的A549细胞没有杀伤作用。从实施例1可知，EF24对衰老的A549细胞并没有显著的杀伤作用(图1D)。可见阳性药物达沙替尼在治疗IPF的同时，也会对正常细胞造成伤害，产生副作用。因此，本实施例证明了EF24对正常的A549细胞没有杀伤作用，优于阳性药物达沙替尼。
7.2姜黄素类似物对衰老A549细胞SA-β-gal阳性细胞数的影响
首先采用3.5μM的BLM处理3天诱导衰老，加入1，5，10μM的姜黄素类似物处理48h，SA-β-gal染色做出，结果如图12所示。
如图12所示：可以看出EF24可以明显的降低SA-β-gal阳性细胞数，L48H37以及尼达尼布可以降低部分的SA-β-gal阳性细胞数，但是MTT的结果显示这两个药物对正常A549细胞具有杀伤作用。而其余的姜黄素类似物对SA-β-gal阳性细胞数都没有降低，说明其余的姜黄素类似物无抗IPF活性。
同时，本发明实施例5证明EF24降低了IPF小鼠肺组织中SA-β-gal阳性细胞的数量(图7A)。结合上述实验结果，说明EF24抗IPF的效果优于阳性药物尼达尼布和L48H37。7.3姜黄素类似物对衰老ATⅡ细胞的细胞活力的影响
此实验结果使用MTT法检测得到，与EF24检测方式相同。首先采用3.5μM的BLM处理ATⅡ细胞3天诱导细胞衰老。种细胞至96孔板中，加入1，5，10μM的姜黄素类似物处理48h之后，MTT检测细胞活力得到图13。
如图13所示，姜黄素、达沙替尼、pentagamavunon-1、尼达尼布、吡菲尼酮、TML-6、L48H37这几个姜黄素类似物对正常的ATⅡ细胞具有一定的杀伤作用，达沙替尼、二甲基姜黄素、吡菲尼酮以及L48H37对衰老的ATⅡ细胞具有一定的杀伤作用。而EF24对正常的ATⅡ细胞没有杀伤作用，可见EF24在保持优于这些姜黄素类似物。2HBA、槲皮素、HO3867、二甲基姜黄素对正常的ATⅡ细胞以及衰老ATⅡ细胞都没有杀伤作用。
7.4姜黄素类似物对衰老ATⅡ细胞SA-β-gal阳性细胞数的影响
首先采用3.5μM的BLM处理3天诱导衰老，加入1，5，10μM的姜黄素类似物处理48h，SA-β-gal染色得到如图14所示。
如图14所示，从结果可以看出：EF24可以明显地降低SA-β-gal阳性细胞数，L48H37可以降低部分的SA-β-gal阳性细胞数，但是上述MTT的结果也显示L48H37对正常ATⅡ细胞具有杀伤作用，说明该药物在抗衰老的同时也会对正常的ATⅡ细胞有副作用。而其余的化合物对SA-β-gal阳性细胞数都没有明显降低，说明其余的姜黄素类似物无抗IPF活性。
同时，本发明实施例5证明EF24降低了IPF小鼠肺组织中SA-β-gal阳性细胞的数量(图7A)，结合上述实验结果，说明EF24抗IPF的效果优于L48H37。
综上，本发明实施例证明：EF24能通过上调PTEN抑制其下游AKT/mTOR/NF-κB信号通路和损伤线粒体的累积进而抑制AEC的衰老最终抑制肺成纤维细胞的活化；EF24能够减少IPF小鼠肺组织中衰老细胞的数量，并且体内实验研究结果进一步确定了EF24能抑制BLM诱导的IPF小鼠肺组织的细胞衰老并改善小鼠的肺纤维化。说明EF24可以用于抗IPF，且EF24抗IPF的效果优于阳性药物达沙替尼和L48H37，且不会对正常细胞造成影响。
Claims (5)
1.姜黄素类似物EF24在制备治疗特发性肺纤维化药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的姜黄素类似物EF24通过上调PTEN抑制其下游AKT/mTOR/NF-κB信号通路和损伤线粒体的累积进而抑制肺泡上皮细胞AEC的衰老最终抑制肺成纤维细胞的活化。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的特发性肺纤维化包括急性特发性肺纤维化和慢性特发性肺纤维化。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物包含姜黄素类似物EF24，并制成临床上或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂、滴丸。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。
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