CN108969518A - 蟛蜞菊内酯在制备用于治疗特发性肺纤维化药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蟛蜞菊内酯在制备用于治疗特发性肺纤维化药物中的应用。本发明采用TGF‑β1诱导的人肺上皮细胞A549向间质细胞转化模型和人胚肺成纤维细胞MRC‑5向肌成纤维细胞转分化模型为研究对象，发现蟛蜞菊内酯通过抑制TGF‑β1诱导的Smad和非Smad信号通路，起到抑制TGF‑β1诱导的上皮细胞向间质细胞转化(EMT)过程和成纤维细胞转分化过程的作用。蟛蜞菊内酯通过改善肺纤维化相关病理变化、减少细胞外基质蛋白(ECM)沉积、调节Smad信号通路关键蛋白表达、抑制炎症细胞积累，提高呼吸功能和小鼠的存活率，起到抑制博来霉素所致肺纤维化病理过程的治疗作用。

Description

蟛蜞菊内酯在制备用于治疗特发性肺纤维化药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及蟛蜞菊内酯在制备用于治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种特殊类型、原因不明的慢性进行性纤维化型间质性肺炎。该病多发于老年患者，病变局限于肺，组织病理学和高分辨CT检查往往呈普通型间质性肺炎特征。世界范围内，IPF发病率约2-29例/10万人，现有逐年上升趋势。IPF临床预后差，患者确诊后平均存活时间3-5年。2014年10月，FDA批准吡非尼酮为世界上首个特发性肺纤维化的治疗药物，此前IPF的缓解与治疗一直缺乏任何有效药物。

目前认为，TGF-β1是导致IPF的一种关键细胞因子。有报道显示，在博来霉素建立的IPF模型小鼠和IPF患者肺组织中，均可检测到过量TGF-β1表达。关于IPF的分子发病机制，有一种较公认的假说认为，过表达的TGF-β1诱导肺上皮细胞向间质细胞转化(EMT)及成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化，EMT及转分化后的间质型细胞进而转变成IPF病理过程中起重要作用的肌成纤维细胞，后者通过分泌过量细胞外基质蛋白，沉积在肺组织中，最终导致肺纤维化型病变的发生。此过程中，肺上皮细胞失去上皮特异性表征蛋白E-cadherin，获得间质型细胞表征蛋白α-SMA、Fibronectin等。细胞形态上，TGF-β1诱导的上皮细胞失去卵圆外形，获得肌成纤维细胞样梭形或纺锤形表型，同时，上皮细胞丧失黏附特性，细胞骨架重排，细胞间隙变大，细胞紧密连接破坏，细胞的迁移变得活跃。

细胞信号传导研究显示，TGF-β1具有激活经典Smad信号通路的作用。首先，TGF-β1结合于TGF-βII型受体，促II型受体和I型受体二聚化，继而磷酸化Smad 2/3；随后磷酸化的Smad 2/3和Smad 4形成异聚复合体，共同转移入细胞核；Smad 2/3/4入核后与一系列转录因子结合，激活下游靶基因的转录和表达。组织纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)是Smad3/4的特异性下游靶基因，入核的Smad 3/4可结合于PAI-1启动子上的CAGA序列激活PAI-1转录，而Smad 1和Smad 2无此作用。另外，Smad信号通路中存在一个抑制性的Smad 7，可诱导TGF-βI型受体和Smad 2/3泛素化降解，负反馈调节TGF-β1信号通路。同时，Smad 7也可直接干扰核内Smad与染色体DNA的结合，抑制信号通路传导。

TGF-β1还具有激活非Smad信号通路的活性，如PI3K-AKT通路和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路。MAPK通路又包括细胞外信号调节蛋白激酶1/2(Extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK1/2)、c-jun氨基末端(c-junN-terminal kinase，JNK)、p38MAPK激酶三条信号通路。在IPF发生发展过程中，ERK信号通路负责DNA的合成和细胞增殖；JNK信号通路调控成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化过程中细胞表型的转化；p38信号通路调控PDGF的表达，该信号通路的抑制剂可抑制细胞迁移和EMT过程。IPF患者的肺成纤维细胞中，PI3K-AKT信号通路往往异常激活，促细胞增殖，抑制凋亡。因此，非Smad信号通路在IPF病理过程中也发挥着重要作用。

药物对IPF的临床前治疗研究中，普遍采用博来霉素诱导的IPF病理模型。该病理模型的基本过程是：博来霉素入肺，产生过量活性氧自由基致肺泡上皮细胞损伤；受损肺组织侵润大量炎症细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性中性粒细胞等，同时伴有大量炎症介质产生；炎症介质进而促进肌成纤维细胞的产生，诱导ECM过量表达，沉积于肺组织间隙，使肺泡壁增厚，肺结构破坏，最终导致IPF样肺纤维化发生。因该模型与人类IPF病理过程相似度高、间质性肺炎特征典型、稳定性好、性价比良好，故在IPF药物筛选与评价等研究中，是一种理想的选择。

蟛蜞菊内酯是一种呋喃香豆素类化合物，属植物雌激素类黄酮。1956年首次报道从植物蟛蜞菊和旱墨莲中提取获得。在近40年的研究中，已报道其具有抗炎、抗肿瘤、保肝、抗骨质疏松、抗蛇毒等药理活性，具备一定药用潜力。鉴于蟛蜞菊内酯的多种药理活性，本发明主要探讨在体外条件下，蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的肺上皮细胞向间质细胞转化过程(EMT)和成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化过程的抑制效应，重点关注其对TGF-β1诱导的Smad和非Smad信号通路的抑制作用；在体内条件下，蟛蜞菊内酯对博来霉素诱导的IPF模型小鼠肺组织病理变化、肺纤维化评分、上皮/间质表征和Smad信号通路相关蛋白、炎症细胞浸润、肺呼吸功能和存活率的影响。

发明内容

本发明的目的是提供蟛蜞菊内酯在制备用于治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于治疗特发性肺纤维化的药物，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转化和人胚肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化中的应用。

本发明所述人肺泡上皮细胞为A549，人胚肺成纤维细胞MRC-5。

本发明还提供一种用于抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞转分化的抑制剂，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在抑制肺纤维化TGF-β1诱导的Smad和非Smad信号通路中的应用。

本发明还提供一种用于抑制肺纤维化TGF-β1诱导的Smad以及非Smad信号通路的抑制剂，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在抑制博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠肺组织中Smad信号通路关键蛋白中的应用。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在抑制博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型炎症细胞积累中的应用。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在改善博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠的肺呼吸功能衰竭中的应用。

本发明还提供蟛蜞菊内酯在提高博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠的存活率中的应用。

本发明首次提出在体内和体外条件下，蟛蜞菊内酯对特发性肺纤维化的治疗作用。在体外条件下，采用TGF-β1诱导人上皮细胞A549向间质细胞转化和人胚肺成纤维细胞MRC-5向肌成纤维细胞转分化模型，研究了细胞表征蛋白表达的情况，细胞表型状态和细胞迁移运动的情况。在体内条件下，采用博来霉素建立C57BL/6小鼠IPF模型，研究了蟛蜞菊内酯对IPF模型小鼠肺组织病理变化、肺纤维化评分、上皮/间质表征蛋白以及Smad信号通路相关蛋白的表达、炎症细胞浸润、肺呼吸功能和存活率的影响，从而探讨蟛蜞菊内酯治疗IPF的潜在作用机制。具体方案如下：

蟛蜞菊内酯预处理人上皮细胞A549和人胚肺成纤维细胞MRC-52h，5ng/mL TGF-β1再处理48h，检测上皮细胞表征蛋白E-cadherin和肌成纤维细胞表征蛋白α-SMA和fibronectin表达；检测A549细胞的迁移运动能力。

蟛蜞菊内酯预处理肺泡上皮细胞A549 2h，5ng/mL TGF-β1处理A549细胞30min，用Western Blot检测Smad 2/3、ERK、p38、JNK、AKT磷酸化水平，细胞免疫荧光检测p-Smad 2/3入细胞核的情况，双荧光素酶报告基因检测Smad 3和Smad 4对下游基因转录活化的情况，染色质免疫共沉淀实验检测Smad 4与目的基因启动子结合的情况，RT-PCR检测下游基因转录的情况。

经过蟛蜞菊内酯预给药处理，对TGF-β1诱导的人肺上皮细胞A549和人胚肺成纤维细胞MRC-5进行Western Blot和细胞免疫荧光检测，结果显示可明显促进上皮细胞表征蛋白E-cadherin表达，降低肌成纤维细胞表征蛋白Fibronectin和α-SMA表达，并抑制细胞迁移相关蛋白MMP-2表达；Transwell实验和划痕实验结果显示，蟛蜞菊内酯可明显抑制TGF-β1活化的人上皮细胞A549迁移运动能力。

蟛蜞菊内酯可通过抑制TGF-β1/Smad和非Smad通路，进而抑制TGF-β1诱导的肺上皮细胞EMT和成纤维细胞转分化过程。对于蟛蜞菊内酯抑制TGF-β1/Smad通路的机制，通过细胞免疫荧光进一步检测p-Smad 2/3入核情况，双荧光素酶报告基因检测p-Smad 2/3与启动子结合作用，以及染色质免疫共沉淀实验检测Smad 4和DNA的结合能力。本发明首次提出蟛蜞菊内酯可抑制TGF-β1诱导的靶细胞p-Smad2/3生成，入核以及与转录因子启动子区结合。

附图说明

图1为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞表征蛋白表达的影响；其中，A：Western blot检测蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导A549细胞表征蛋白表达的影响，B：细胞免疫荧光检测蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导A549细胞表征蛋白表达的影响。

图2为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的MRC-5细胞表征蛋白表达的影响；其中，A：Western blot检测蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导MRC-5细胞表征蛋白表达的影响，B：细胞免疫荧光检测蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导MRC-5细胞表征蛋白表达的影响。

图3为本发明蟛蜞菊内酯对A549细胞划痕的影响。

图4为本发明蟛蜞菊内酯对A549细胞穿膜的影响。

图5为本发明蟛蜞菊内酯对A549细胞TGF-β1诱导的Smad和非Smad信号通路蛋白的影响。

图6为本发明蟛蜞菊内酯对MRC-5细胞TGF-β1诱导的Smad和非Smad信号通路蛋白的影响。

图7为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞p-Smad2/3入核的影响。

图8为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞Smad 3，Smad 4与启动子结合的影响。

图9为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞Smad 4和DNA结合的影响。

图10为本发明蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞Fibronectin基因转录的影响。

图11为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织HE病理染色结果(100×显微镜下)。

图12为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织Masson病理染色结果(100×显微镜下)。

图13为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺纤维化评分。与对照组比较，##P<0.01，###P<0.001；与博来霉素模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。

图14为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织α-SMA的免疫组织化学结果(100×显微镜下)。

图15为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织表征蛋白表达结果。

图16为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织羟脯氨酸检测结果。与对照组比较，##P<0.01，###P<0.01；与博来霉素模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。

图17为本发明特发性肺纤维化模型小鼠肺泡灌洗液炎症细胞的检测结果。肺泡灌洗液浸润的细胞包括总白细胞数量(A)，淋巴细胞(B)，中性粒细胞(C)，单核细胞(D)，嗜碱性粒细胞(E)，嗜酸性粒细胞(F)。与对照组比较，##P<0.01，###P<0.01；与博来霉素模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。

图18为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的呼吸功能的检测结果。肺功能参数，(A)呼吸容量(IC)，(B)K值，(C)准静态弹性系数(Est)，(D)组织呼吸阻力(G)，(E)呼吸系统阻力(Rrs)和(F)弹性系数(Ers)进行检测。与对照组比较，##P<0.01，###P<0.01；与博来霉素模型组比较，**P<0.01，***P<0.001vs.BLM。

图19为本发明特发性肺纤维化模型小鼠的存活率的监测结果。与对照组比较，##P<0.01，###P<0.01；与博来霉素模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。其中，1为对照；2为博来霉素，3为博来霉素+蟛蜞菊内酯(50mg/kg)，4为博来霉素+吡非尼酮(400mg/kg)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1蟛蜞菊内酯抑制TGF-β1诱导的肺上皮细胞向间质细胞转化(EMT)过程和成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化过程，细胞迁移运动，以及TGF-β1诱导的Smad和非Smad信号通路

1.实验材料

1.1实验药品：蟛蜞菊内酯(购自宝鸡市辰光生物科技有限公司)

1.2实验细胞：人肺癌上皮细胞A549，MRC-5人胚肺成纤维细胞(中国医学科学院基础学院细胞中心)

1.3实验试剂和耗材：DMEM培养基，MEM培养液，FBS和PenStrep(Gbico公司)

2.实验方法

2.1蟛蜞菊内酯预处理对TGF-β1诱导的A549细胞和MRC-5细胞表征蛋白的影响

选取对数期A549细胞和MRC-5细胞，取3mL(2×10⁵个/mL)细胞接种于6cm直径细胞培养皿中。37℃，5％CO₂培养过夜后，倾出培养液，加入含0.1％血清培养液3mL，培养24h。蟛蜞菊内酯终浓度分别为10μM、20μM、40μM预处理细胞2h，加入5ng/mL TGF-β1处理24h；倾出细胞培养液，用预冷的PBS清洗三次，加入120μL RIPA裂解液。用细胞刮刀将细胞刮下，收集至1.5mL EP管中，4℃颠倒10min，让细胞充分裂解。12000rpm，4℃离心10min。吸取上清于新的EP管中，用BCA蛋白定量方法对蛋白定量，然后加入5×Loadingbuffer，沸水煮5min，-80℃保存，用western blot实验进行检测。

2.2用细胞免疫荧光检测表征蛋白表达情况

选取对数期的A549细胞和MRC-5细胞，取2mL(1×10⁵个/mL)细胞接种于打孔皿中。37℃，5％CO₂培养过夜后，吸出培养液，加入含0.1％FBS的低血清培养液2mL，培养24h。加入蟛蜞菊内酯(40μM)预处理细胞2h，然后加入TGF-β1处理48h；用PBS清洗细胞三次，4％多聚甲醛固定细胞20min，然后用0.5％Triton X-100通透细胞5min。封闭：用PBS清洗细胞三次，将打孔皿放于湿盒中，滴加2％山羊血清在打孔皿中，37℃孵育1h。孵育一抗：按照说明书用山羊血清稀释一抗，取50μL稀释后的一抗加入到打孔皿中，4℃缓慢摇晃过夜。孵育二抗：用PBS清洗细胞三次，按照说明书用PBS稀释二抗，取50μL稀释后的二抗加入打孔皿中，将打孔皿置于湿盒中，37℃孵育30min。用PBS清洗细胞三次，滴1-2滴DAPI于打孔皿中。细胞置于激光共聚焦显微镜下成像，拍照和保存。

2.3 Transwell法检测A549细胞的迁移能力

选取对数生长期的A549细胞，悬浮在无FBS的培养液中，取200μL(5×10⁴个/mL)细胞接种于Transwell小室中，在小室中分别加入10μM、20μM和40μM的蟛蜞菊内酯。然后将小室放在600μL加入TGF-β1的培养液的24孔板中，注意下层培养液和小室间不能有气泡。24h后，用棉签擦去Transwell小室上层细胞，并用PBS清洗Transwell小室。下层细胞用乙醇固定5min，结晶紫染色10min。用倒置显微镜观察，拍照和保存。

2.4划痕法检测A549细胞的迁移能力

先用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。选取对数生长期的A549细胞接种到6孔板中，细胞长满后，用10μL枪头在单层细胞上划横线，枪头垂直，用力均匀，保证横线的宽度一致。用PBS清洗细胞3次，去除划下的细胞，加入含TGF-β1(5ng/mL)和蟛蜞菊内酯(10μM、20μM、40μM)的低血清培养基，每组平行3个复孔，同时设空白对照组。将6孔板培养于37℃，5％CO₂的细胞培养箱。培养24h和48h后，倒置显微镜观察并拍照，测量划痕宽度。

2.5双荧光素酶报告基因检测

取A549细胞(细胞密度为2×10⁵个/mL)100μL铺板过夜，每孔设置4个平行。第2天用opti-MEM饥饿处理24h。细胞转染：分别配置25μL的转染试剂lipofectamine 2000，25μL的带有12×CAGA启动子的质粒(由英国伦敦癌症研究所Caroline S Hill赠送，以下简称12×CAGA质粒)和海肾荧光素酶质粒，混合静置30min，96孔板中每孔加入50μL，转染6h后，加入蟛蜞菊内酯(40μM)预处理细胞2h，然后加入TGF-β1处理24h后，进行检测。荧光素酶检测：倾去细胞培养液，加入PBS清洗3次，每孔中加入配置好的1×Universal lysis buffer，在微型振荡器上震荡5min；期间，开启发光测定仪，设置测定参数，测定时间设定为10s，注入体积为50μL。将裂解后的细胞，直接放入仪器中测定，得到的数据进行分析。

2.6染色质免疫共沉淀

选取对数期A549细胞，取20mL(2×10⁵个/mL)细胞接种于15cm直径细胞培养皿中。37℃，5％CO₂培养过夜后，倾出培养液，加入含0.1％血清培养液20mL，培养24h。40μM的蟛蜞菊内酯预处理细胞2h，再加入5ng/mL TGF-β1处理3h；倾出细胞培养液，用加入甲醛的培养液处理细胞10min，之后用含有甘氨酸的PBS溶液处理细胞5min，将细胞刮下，用酶解切割染色体；片段化后的染色体加入Smad4蛋白抗体，磁珠等混合物，4℃旋转孵育过夜，获得Smad4和DNA的复合物，解交联后，得到DNA片段，进行PCR分析。

3.实验结果

3.1蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞和MRC-5细胞表征蛋白表达的影响

3.1.1蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞EMT相关表征蛋白表达的影响

如图1A所示，Western Blot实验表明，5ng/mL TGF-β1处理A549细胞48h后，肺上皮细胞表征蛋白E-cadherin表达量显著降低，间质细胞表征蛋白N-cadherin、Fibronectin、ɑ-SMA表达量显著升高，与细胞迁移相关的表征蛋白MMP-2表达量也明显增加。但蟛蜞菊内酯预处理2h，再加入TGF-β1处理48h，蟛蜞菊内酯能显著抑制TGF-β1诱导的E-cadherin表达降低和N-cadherin，Fibronectin、ɑ-SMA蛋白表达上升，且呈浓度依赖性效应。如图1B所示，细胞免疫荧光实验也表明，在细胞水平，对TGF-β1诱导的A549细胞相关E-cadherin表达降低和ɑ-SMA表达升高，蟛蜞菊内酯均有显著抑制作用

3.1.2蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的MRC-5细胞转分化相关细胞表征蛋白表达的影响

如图2A所示，Western Blot实验表明，5ng/mL TGF-β1处理MRC-5细胞48h后，肌成纤维细胞表征蛋白表达量显著增加，细胞迁移相关表征蛋白MMP-2表达量也明显增加。但蟛蜞菊内酯预处理2h，再加入TGF-β1处理48h后，Fibronectin和ɑ-SMA表达上升受蟛蜞菊内酯明显抑制，且抑制效应呈浓度依赖性。如图2B所示，细胞免疫荧光实验也表明，在细胞水平，蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的Fibronectin和ɑ-SMA表达上升有显著抑制作用。

3.2蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞迁移能力的影响

3.2.1蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞划痕的影响

如图3所示，观察0h、24h、48h三个不同时间点的划痕宽度，可以判断，随时间推移，各组细胞划痕均呈闭合趋势。其中，5ng/mLTGF-β1处理组细胞的划痕闭合速度明显快于其他各组，单用蟛蜞菊内酯处理组细胞划痕闭合速度与对照组类似，而蟛蜞菊内酯(10μM、20μM、40μM)不同浓度预处理组细胞划痕闭合速度明显慢于TGF-β1处理组，且蟛蜞菊内酯抑制细胞迁移的能力呈一定浓度依赖性。总体而言，对于TGF-β1诱导的A549细胞运动能力上升，蟛蜞菊内酯具有明显抑制作用。

3.2.2蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞穿膜的影响

如图4所示，将A549细胞铺于小室上层，蟛蜞菊内酯加至上层培养基中，预处理2h，再加入TGF-β1，处理24h后，Transwell小室下层穿过膜的A549细胞经结晶紫染色观察。与对照组比较，TGF-β1处理细胞明显增加穿膜数量，而蟛蜞菊内酯单处理，对细胞穿膜能力影响不明显。与TGF-β1处理组比较，蟛蜞菊内酯预处理各剂量组穿膜细胞数量明显降低，且抑制细胞穿膜的效应呈浓度依赖性，蟛蜞菊内酯浓度越高，穿膜细胞数越接近对照组细胞。本实验再次证明蟛蜞菊内酯可抑制TGF-β1诱导的A549细胞运动能力。

3.3蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞和MRC-5细胞Smad和非Smad信号通路蛋白的影响

3.3.1蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞Smad和非Smad信号通路蛋白的影响

如图5所示，5ng/mL TGF-β1处理30min的A549细胞，Smad 2/3的磷酸化水平明显升高。而细胞经40μM蟛蜞菊内酯预处理2h后再加入5ng/mL TGF-β1，可见30min时，较TGF-β1处理细胞，Smad 2/3磷酸化水平有所降低。其中TGF-β受体抑制剂SB431542预处理细胞的Smad2/3磷酸化水平和对照组类似。

3.3.2蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的MRC-5细胞Smad和非Smad信号通路蛋白的影响

如图6所示，与对照细胞比较，经TGF-β1处理30min的MRC-5细胞，Smad 2/3的磷酸化水平明显升高。同时，细胞AKT、ERK、JNK的磷酸化水平明显升高。而蟛蜞菊内酯预处理2h后再用TGF-β1处理30min，细胞Smad 2/3的磷酸化水平，较TGF-β1处理细胞明显降低。其中TGF-β受体抑制剂SB431542预处理细胞的Smad 2/3磷酸化水平比对照组略低。另外，与TGF-β1处理细胞比较，蟛蜞菊内酯预处理细胞的AKT、JNK、p38、ERK磷酸化水平显著降低。

3.3.3蟛蜞菊内酯对TGF-β1诱导的A549细胞Smad信号通路的影响

如图7所示，5ng/mL TGF-β1处理A549细胞30min，促使p-Smad2/3转移到细胞核中，细胞质中几乎不存在。但是40μM蟛蜞菊内酯预处理2h，再加入TGF-β1(5ng/mL)，显著的抑制p-Smad 2/3在细胞核中的分布，其中p-Smad 2/3在细胞质中也有较多分布。

经TGF-β1诱导入核的Smad 3/4，通常结合于下游目的基因启动子的CAGA序列，调节目的基因的转录。为进一步探索蟛蜞菊内酯是否直接抑制Smad 3/4与CAGA序列的结合，将含有12×CAGA的荧光素酶报告质粒转染细胞，细胞经TGF-β1、蟛蜞菊内酯预处理+TGF-β1、TGF-β受体抑制剂SB431542+TGF-β1处理，37℃5％CO₂培养24h后裂解细胞，检测各处理组细胞中荧光素酶的表达情况。如图8所示，与对照组比较，TGF-β1显著诱导12×CAGA启动子序列下游荧光素酶的表达。阳性药SB431542显著抑制TGF-β1诱导作用，细胞裂解液中几乎无荧光素酶表达。蟛蜞菊内酯的作用虽不及SB431542，但也可显著抑制TGF-β1诱导的荧光素酶表达。因此可断定蟛蜞菊内酯具有抑制Smad 3/4入核与CAGA序列结合的能力。并且进一步通过染色质免疫共沉淀实验，观察到蟛蜞菊内酯抑制Smad 4和DNA直接结合(图9)。

上述研究中，我们已观察到蟛蜞菊内酯对TGF-β1/Smad信号通路的抑制作用。为进一步验证蟛蜞菊内酯对染色体DNA上Smad所介导靶基因转录活性的影响，选取Smad调控的Fibronectin编码基因(fn1)，通过RT-PCR，在mRNA水平检测蟛蜞菊内酯对TGF-β1/Smad信号通路活化的fn1转录抑制。如图10所示，不同浓度蟛蜞菊内酯预处理2h，经TGF-β1诱导升高的A549细胞fn1转录水平显著降低，且蟛蜞菊内酯浓度越高，fn1转录水平降低越明显。

实施例2蟛蜞菊内酯对博来霉素诱导的特发性肺纤维化(IPF)模型小鼠的治疗

1.博来霉素诱导的IPF模型小鼠模型的建立

取SPF级C57BL/6小鼠(18-20g/只)，用10％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠放于超净工作台中，固定头部和四肢，用酒精棉消毒颈部皮肤。在颈部正中切一尽量小的切口，钝性手术器械逐层分离组织，暴露气管，用微量进样器注射博来霉素(3U/kg)于气管中，注射后迅速将小鼠直立并旋转，使药液在肺内均匀分布，对照组在气管内注射等容量生理盐水。

2.分组及给药

所有动物随机分为4组，每组40只：(1)正常对照组(Ctrl组)；(2)模型组(Blm组)；(3)蟛蜞菊内酯组(Wdl组)；(4)吡非尼酮组(Pirf组)。以造模当天为第0天，24h后，溶解于0.5％CMC的蟛蜞菊内酯(50mg/kg/d)和吡非尼酮(400mg/kg/d)每天灌胃给药，对照组每天灌胃等量的0.5％CMC，连续给药28天。

3.统计小鼠死亡率

从造模当天为第0天开始计算，直到博来霉素给药后的28天，每天统计各组小鼠死亡情况，最后用GraphPad Prism5统计和分析小鼠的死亡率。

4.羟脯氨酸的检测

称取小鼠肺组织，用生理盐水制成10％匀浆，加入水解液500μL，在100℃水浴40min；将pH调至6.0-6.8之间，然后加双蒸水至10mL，混匀，取4mL加活性炭，混匀，3500转/分离心10min，取上清1mL进行如下检测：

其中，试剂一、二、三均来自于试剂盒，试剂盒购自南京建成生物科技有限公司，产品编号为A030-2。

混匀，60℃水浴15min，冷却后，3500转/分离心10min，取上清于550nm，1cm光径，双蒸水调零，测各管吸光度。根据如下公式计算:

羟脯氨酸含量(μg/mg湿重)＝(测定OD值-空白OD值)/(标准OD-空白OD)×标准管浓度(5μg/mL)×(水解液总体积/组织湿重)

5.Western blot

取小鼠肺组织，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液，在冰上进行组织匀浆，4℃上下颠倒混匀30min。4℃、12000rpm，离心10min。取上清，BCA法测定蛋白浓度，并调节蛋白浓度至相同，然后进行Western blot分析。

6.肺纤维化评分

将HE染色后的片子，交由有经验的病理专家进行盲评，按照Ashcroft评分标准进行肺纤维化程度半定量测评。

7.免疫组织化学检测

(1)脱蜡：将切片放于60℃烘箱中2h。依次放入二甲苯Ⅰ脱蜡30min，二甲苯Ⅱ脱蜡10min，100％酒精5min，95％酒精5min，75％酒精5min，蒸馏水5min，PBS 5min。

(2)抗原修复：将切片置于0.01mol/L，pH6.0枸橼酸液修复液中，用微波炉最高档加热3min至微微沸腾，再用中间档加热10min，停止加热后自然冷却至室温。

(3)阻断内源性过氧化物酶的活性：用PBS冲洗切片两次，每次3min。在组织上加入2-3滴H₂O₂维持10min。PBS冲洗2次，每次3min。

(4)封闭：用滤纸擦去标本外的PBS，滴加10％山羊血清于标本上(每个切片约需要50μL)，置于湿盒中，在37℃的细胞培养箱中封闭30min，倾去勿洗。

(5)抗体孵育：滴加50μL一抗α-SMA(1:200)，4℃孵育过夜。第二天，PBS溶液冲洗两次，每次3min。滴加1-2滴反应增强剂，37℃孵育20min，PBS溶液冲洗。滴加50μL HRP抗兔IgG(1:100)，37℃孵育20min，PBS溶液冲洗3次，每次2min。

(6)DAB显色：滴加50μL配制好的DAB显色剂，3-10min室温孵育，注意观察，显色后立即用自来水冲洗。苏木精复染10-30s，自来水冲洗返蓝。脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察并拍照。

(7)脱水透明：将切片依次置于75％酒精、95％酒精、100％酒精、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各5min。

(8)封片拍照：滴加中性树脂于组织上，用盖玻片封片。显微镜下观察，拍照并保存。

8.小鼠肺功能测定

博来霉素滴注后第28天，各组C57BL/6小鼠经戊巴比妥钠麻醉。剪开小鼠颈部皮肤，暴露气管，在气管上剪一开口，插入气管插管，气管插管另一端连接SCRIEQ动物肺功能分析系统。按照仪器上设定好的参数，分别测定呼吸容量(IC)、顺应性(K)、组织呼吸阻力(G)、呼吸系统的阻力(Rrs)、弹性参数(Ers)等指标，并进行后续数据分析。

9.小鼠肺泡灌洗液(BALF)的收集

测定肺功能参数后的小鼠，脱颈处死，在气管插入接头，用线绳固定，接头的另一端连接1mL注射器。缓慢注射1mL生理盐水，并轻柔的按压小鼠的胸部，保持液体均匀的分布在小鼠肺部，再将液体吸出置于1.5mL EP管中，放于冰上，重复三次。3500rpm，4℃离心10min，第一次上清用于检测细胞因子，将两次的细胞合并，用无菌生理盐水重悬细胞，血细胞技术仪测定细胞种类和数量。

10.测定炎症细胞

肺泡灌洗液4℃，2500rpm，离心10min，上清置于新的1.5mL EP管中，将两次离心后的细胞收集在300μL的无菌生理盐水中，用血细胞计数仪进行测定，并进行后续的数据分析。

实验结果：

(1)蟛蜞菊内酯治疗IPF模型小鼠HE染色肺组织切片镜下观察

HE染色肺组织切片镜下观察显示(图11)，正常对照组小鼠肺组织结构完整，肺泡壁清晰，未见炎症细胞浸润和纤维组织增生。模型组小鼠肺组织发生严重的炎症细胞浸润，肺泡结构破坏，肺泡壁明显增厚，肺组织结构严重紊乱。蟛蜞菊内酯灌胃给药组与博来霉素组比较，小鼠肺部组织炎症表现明显减轻，与阳性药吡非尼酮治疗组有相似的治疗结果，提示蟛蜞菊内酯明显改善博来霉素所致肺损伤。

(2)蟛蜞菊内酯治疗IPF模型小鼠Masson染色肺组织切片镜下观察

Masson染色肺组织切片镜下观察显示(图12)，正常对照组小鼠支气管壁胶原层较薄，肺泡区和血管壁有少量染成浅蓝色的胶原纤维分布。模型组小鼠肺泡间隔明显增宽，支气管、血管周边和肺泡腔观察到染成蓝色的纤维蛋白，肺组织内可观察到大量蓝色片状胶原纤维沉积。蟛蜞菊内酯灌胃给药组小鼠，仅观察到少量胶原蛋白沉积，肺组织纤维化程度明显较轻，与吡非尼酮组小鼠的观察结果相似，提示蟛蜞菊内酯明显抑制博来霉素诱导的胶原蛋白的沉积。

(3)蟛蜞菊内酯降低肺纤维化病理学评分

如图13所示，与正常对照组比较，模型组小鼠肺纤维化评分显著增高。与模型组小鼠比较，蟛蜞菊内酯灌胃治疗组动物的肺纤维化评分显著降低(p<0.001)，与吡非尼酮治疗组动物比较无显著性差异。

(4)蟛蜞菊内酯抑制细胞外基质蛋白沉积

①蟛蜞菊内酯抑制表征蛋白的表达

通过免疫组织化学(图14)和Western blot检测，我们观察到蟛蜞菊内酯能明显抑制IPF模型小鼠肺组织中纤维化表征蛋白Fibronectin和α-SMA的表达，显著增强肺上皮细胞表征蛋白E-cadherin的表达。同时，我们观察到蟛蜞菊内酯对小鼠肺组织中TGF-β1/Smad信号通路活化呈明显抑制作用。如图15所示，蟛蜞菊内酯能抑制Smad 2/3的磷酸化和Smad4蛋白的表达，增加Smad 7蛋白的表达，提示在小鼠体内蟛蜞菊内酯能通过调节TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白，抑制肺纤维化的发生。

②蟛蜞菊内酯抑制胶原蛋白沉积

测定组织羟脯氨酸的含量能反映肺组织疾病中胶原蛋白代谢情况，通过碱水解法，我们观察到给予博来霉素28天后，小鼠肺组织羟脯氨酸含量显著增加，但是蟛蜞菊内酯和吡非尼酮分别灌胃治疗28天，小鼠肺组织羟脯氨酸显著降低，与模型组比较有统计学差异(P<0.001)(图16)。

(5)蟛蜞菊内酯减少博来霉素诱导的肺组织炎症细胞浸润

如图17所示，博来霉素处理28天后，模型组动物BALF中总白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞均显著高于正常对照组动物。而蟛蜞菊内酯灌胃治疗组动物BALF中各类炎症细胞均显著减少(P<0.001)，其降低炎症细胞侵润的疗效与阳性药吡非尼酮治疗组相当或更佳。

(6)蟛蜞菊内酯改善博来霉素诱导IPF模型鼠的肺呼吸功能衰竭

采用Flexivent系统评测各组动物肺功能。如图18所示，博来霉素模型组小鼠，与正常对照组小鼠比较，肺功能明显衰竭，反映在肺呼吸容量(IC)和顺应性(K)显著降低，组织呼吸阻力(G)、呼吸系统的阻力(Rrs)、弹性参数(Ers)显著增加。蟛蜞菊内酯治疗组和吡非尼酮治疗治疗组动物均能显著改善模型小鼠的各项肺功能指标，治疗结果具有统计学意义(P<0.01)。

(7)蟛蜞菊内酯增加IPF模型小鼠存活率

监测各组小鼠28天中的存活情况，其中，模型组小鼠大量死亡。蟛蜞菊内酯治疗组和吡非尼酮治疗组小鼠死亡数显著降低，各组小鼠生存曲线如图19所示。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于治疗特发性肺纤维化的药物，其特征在于，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

2.蟛蜞菊内酯在抑制TGF-β1诱导的人肺泡上皮细胞向间质细胞转化和人胚肺成纤维细胞转分化中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述人肺泡上皮细胞为A549，人胚肺成纤维细胞为MRC-5。

4.一种用于抑制TGF-β1诱导的肺泡上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞转分化的抑制剂，其特征在于，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

5.蟛蜞菊内酯在抑制肺纤维化TGF-β1诱导的Smad以及非Smad信号通路中的应用。

6.一种用于抑制肺纤维化TGF-β1诱导的Smad以及非Smad信号通路的抑制剂，其特征在于，其活性成分为蟛蜞菊内酯。

7.蟛蜞菊内酯在抑制博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠的肺组织中Smad信号通路关键蛋白中的应用。

8.蟛蜞菊内酯在抑制博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠炎症细胞积累中的应用。

9.蟛蜞菊内酯在减轻博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠的肺呼吸功能衰竭中的应用。

10.蟛蜞菊内酯在提高博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型小鼠的存活率中的应用。