CN104998249A - Sip1及其衍生物在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了SIP1及其衍生物在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用。体外SIP1基因转染瘢痕成纤维细胞能抑制成纤维细胞胶原合成。适时、高水平的SIP1干预对抑制皮肤创伤后的增生性瘢痕形成起着积极作用。因此，可以将SIP1及其衍生物或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体应用到预防和治疗增生性瘢痕中，从而为增生性瘢痕的预防和治疗提供了药物选择。

Description

SIP1及其衍生物在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用

技术领域：

本发明属于新药领域，具体涉及Smad结合蛋白1(Smad interacting protein 1，SIP1)及其衍生物在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用。

背景技术：

至今为止，人类对于皮肤创面这一多发病的愈合机制尚未完全阐明，深入探索其分子机制并寻找理想的治疗途径，一直是烧伤外科等领域研究的热点和难点课题。皮肤创伤修复的目标是创面的迅速上皮化及功能外观的恢复。创面上皮化可以使皮肤屏障重建，患者免于体液流失及病原微生物的侵入感染；在功能和外观的恢复过程中，瘢痕的增生程度则是最重要的影响因素。皮肤创面的修复是一个非常复杂的过程，各种不同来源的细胞、分子等相互作用构成了一个复杂的细胞、分子网络，机体如何协同这些细胞及分子，决定了不同的修复结果。由此设想，在皮肤创伤修复的细胞、分子网络中能否找到一类分子，既能在加速创面上皮化中发挥作用，又能抑制瘢痕增生？

SIP1为锌指核转录因子，因其可以和Smad蛋白相互作用而得名，属于ZEB家族成员，分子量为140KDa。其中间为一个同源结构域，N-末端和C-末端各由一个高度保守且相互独立的锌指结构簇构成，N-末端包含4个锌指结构，C-末端包含3个锌指结构，如图14所示。SIP1具有特异性DNA结合活性，每个锌指结构簇能独立结合CACCT序列，完整的SIP1单体对由(C)AGGTG靶点和CACCT(G)靶点构成的二聚体具有高度亲和力并与之紧密结合。SIP1通常是一个转录抑制物，通过和基因上游CACCT序列结合抑制某些基因的转录。既往研究表明，SIP1主要具有以下功能：①SIP1为转录抑制物，通过结合基因上游特定区域抑制表皮细胞粘附分子、胶原等基因的转录；②SIP1可以和Smads蛋白结合，拮抗TGF-β1通路；③SIP1可以诱导基质金属蛋白酶(MMPs)高表达；④细胞对SIP1表达的调控可能通过microRNA来实现。以往对SIP1的研究主要集中在细胞分化及肿瘤侵袭转移过程中。2007年Kato M等在肾纤维化组织中发现SIP1低表达，他们认为TGF-β1介导的肾纤维化与包括SIP1在内的ZEB家族蛋白的缺乏相关。经文献检索，对SIP1和皮肤创面愈合及其纤维化发生的研究鲜有报道，故对其在增生性瘢痕中的功能和作用还需进一步深入研究。

发明内容：

本发明的目的是提供SIP1(Smad interacting protein 1，SIP1)及其衍生物或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用。

本发明经过研究发现，SIP1和细胞粘附分子E-cadherin、I型胶原的表达呈显著负相关，和基质金属蛋白酶1(MMP1)的表达呈显著正相关；体外SIP1基因转染既能促进表皮细胞迁移，又能抑制成纤维细胞胶原合成。

本发明在成人皮肤cDNA文库中筛选得到了携带SIP1基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/SIP1，在此基础上，利用常规基因克隆技术，克隆了携带SIP1编码基因和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组质粒CMV-SIP1-EGFP，然后利用基因同源重组，将SIP1-EGFP重组到腺病毒载体Adeno-X^TM中，获得重组腺病毒表达载体Adeno-X^TM-SIP1-EGFP，并包装成腺病毒颗粒，用于SIP1蛋白功能和SIPI基因功能的鉴定。

本发明分离了正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，并利用TGF-β₁刺激正常皮肤成纤维细胞建立了成纤维细胞的转分化模型。鉴定了SIP1在上述两种细胞中的表达水平，发现SIP1在增生性瘢痕成纤维细胞中低表达。而且，成人正常皮肤成纤维细胞经TGF-β₁刺激后，SIP1的表达也明显降低，表明SIP1的低表达加重了增生性瘢痕的纤维化。

本发明通过在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达SIP1后检测纤维化相关指标I型胶原、III型胶原的表达量。结果表明，在蛋白水平上增加SIP1表达后，纤维化相关的指标I型胶原、III型胶原的表达量显著降低，抑制纤维化。

本发明通过在瘢痕成纤维细胞中增加SIP1的表达，观察该细胞经TGF-β₁刺激后肌成纤维细胞表面标志物α-SMA和纤维化相关的指标I型胶原。结果表明，与对照组相比，在瘢痕成纤维细胞中增加SIP1的表达，肌成纤维细胞表面标志物α-SMA的表达明显降低。

本发明首次证明SIP1在体外细胞培养系统中能抑制增生性瘢痕成纤维细胞、肌成纤维细胞产生I型胶原蛋白。因此，本发明得出以下结论：在纤维化疾病中，SIP1的低表达可能是一个调控成纤维细胞表型转化和功能改变的重要始动因素，SIP1可能是一个具有强烈作用的纤维化形成相关的负性信号。因此SIP1的高表达则是具有明显的抗纤维化作用。因此，SIP1及其基因表达载体可以用于预防和治疗增生性瘢痕等疾病。

由于SIP1基因在真核细胞中的序列高度保守，其以SIP1的结合部位和功能部位发挥生物学作用的天然或基因工程蛋白质衍生物保留了保守功能结构域，具有类似的功能，也可以用于预防和治疗增生性瘢痕等疾病。特别地，具有SIP1的结合部位和功能部分，并且在高表达后能够抑制I型胶原、III型胶原等纤维化相关指标的表达，或抑制肌成纤维细胞表面标志物α-SMA的表达的SIP1衍生物都包括在本发明的范围内。

因此，本发明的第一个目的是提供SIP1及其衍生物或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用。

所述的SIP1衍生物是指具有SIP1的结合部位和功能部分，并且在高表达后能够抑制I型胶原、III型胶原等纤维化相关指标的表达，或抑制肌成纤维细胞表面标志物α-SMA表达的物质。

本发明的第二个目的是提供一种预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒，其特征在于，包括有效量的SIP1或其衍生物、或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体。

所述的预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒还可以含有其他目前已知用于增生性瘢痕病变的抑制剂。

本领域的技术人员应该理解，所述预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒可以局部给药到瘢痕处，也可以通过口服、静脉内注射、肌肉注射等常规使用方式施用。本领域中技术人员通过常规试验能够分别确定SIP1或其衍生物、或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体、以及药物组合物的剂量水平。应该理解，关于任何具体受试者的具体剂量水平依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合和经历治疗的具体疾病的严重性等。在施用所述药物组合物的情形中，SIP1或其衍生物、或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体可以与其他瘢痕病变抑制剂同时、或间隔一定时间进行施用。

所述增生性瘢痕包括但不限于烧伤、烫伤、切割伤、化学损伤、冷冻伤等皮肤外伤。

体外SIP1基因转染瘢痕成纤维细胞能抑制其胶原合成，SIP1在皮肤创伤后的瘢痕形成过程中能起到抑制作用。适时、高水平的SIP1干预对皮肤增生性瘢痕的形成起着积极的抑制作用。因此，可以将SIP1及其衍生物或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体应用到预防和治疗增生性瘢中，从而为增生性瘢的预防和治疗提供了药物选择。

附图说明：

图1是增生性瘢痕组织成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养(第3代细胞，放大×40)

图2是SIP1在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的表达(免疫组织化学染色)

图3是SIP1在增生性瘢痕组织和正常皮肤组织中的表达(组织免疫荧光检测)

图4是SIP1在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达

图5是SIP1、COL I A2及α-SMA在增生性瘢痕组织中的表达

图6是正常皮肤来源的成纤维细胞经TGF-β₁刺激后SIP1、COL I A2及α-SMA的表达

图7是瘢痕成纤维细胞转染SIP1过表达腺病毒后转染效果观察

图8是瘢痕成纤维细胞转染SIP1过表达腺病毒后SIP1的mRNA表达

图9是瘢痕成纤维细胞转染SIP1过表达腺病毒后SIP1、α-SMA、COL I A2、COLIII的表达

图10是瘢痕成纤维细胞转染SIP1过表达腺病毒后磷酸化Smad2和磷酸化Smad3的表达

图11是构建兔耳增生性瘢痕模型

图12是SIP1过表达腺病毒对兔耳增生性瘢痕胶原纤维的影响

图13是SIP1过表达腺病毒对兔耳增生性瘢痕指数的影响

图14是SIP1蛋白结构示意图，其中SID：Smad结合区域，CID：CtBp作用区域。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、SIP1在增生性瘢痕组织及其来源的增生性瘢痕成纤维细胞中的表达特性

标本收集于临床整形手术中切取的增生性瘢痕组织，并取其术中剩余正常全层皮肤组织标本作为自身对照(均征得患者同意，并签署知情同意书)。将瘢痕及其自体正常皮肤标本分成3份，其中一份用4％多聚甲醛固定并石蜡包埋切片后行免疫组织化学实验，另一份用液氮冷冻用于提取组织总蛋白，第三份消毒后用酶消化法常规分离培养原代成纤维细胞。

1、人增生性瘢痕组织成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养

应用组织块法进行人增生性瘢痕组织成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的原代培养。两种细胞形态均呈梭形，增生性瘢痕成纤维细胞生长形态呈明显漩涡状外观，如图1所示。

2、免疫组织化学染色检测SIP1在增生性瘢痕组织中的表达情况

首先为观察SIP1在正常皮肤和增生性瘢痕组织结构中的表达情况，应用免疫组织化学检测，结果显示，与自体正常皮肤组织相比较，SIP1在增生性瘢痕组织中低表达，见图2。

3、组织免疫荧光检测SIP1在增生性瘢痕组织中的表达情况

采用组织免疫荧光检测SIP1在增生性瘢痕组织中的表达，结果显示，与自体正常皮肤组织相比较，SIP1在增生性瘢痕组织中低表达，见图3(A-B)。

4、细胞免疫荧光染色检测SIP1在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达情况

应用原代培养的正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞，采用细胞免疫荧光检测SIP1的表达，结果显示，与自体正常皮肤来源的成纤维细胞相比较，SIP1在增生性瘢痕来源的成纤维细胞中低表达，见图4(A-B)。

5、Western-blot检测增生性瘢痕组织中SIP1、COL I A2及α-SMA的表达情况

为明确SIP1在增生性瘢痕组织中蛋白含量变化，我们对临床整形手术中切除的瘢痕组织中SIP1、COL I A2及α-SMA的表达水平进行检测。Western-blot结果显示，与自体正常皮肤组织相比较，SIP1在增生性瘢痕组织中低表达，而瘢痕纤维化指标COL I A2和α-SMA表达则升高，二者表达与SIP1呈负相关，见图5(A-D)。

以上实验结果表明，SIP1表达的不足可能是瘢痕过度增生的重要原因。

二、SIP1在增生性瘢痕成纤维细胞纤维化中的实验研究

1、TGF-β₁刺激正常皮肤来源的成纤维细胞后SIP1、COL I A2及α-SMA的表达情况

为了观察SIP1的变化与瘢痕纤维化相关因子COL I A2和α-SMA之间的关系，我们应用TGF-β₁刺激正常皮肤来源的成纤维细胞，用Western-blot检测SIP1、COL I A2和α-SMA的蛋白表达水平变化。Western-blot结果显示，经TGF-β₁作用后，正常成纤维细胞中SIP1的表达逐渐降低，在作用12小时后明显降低；而COL I A2和α-SMA的表达则逐渐升高，见图6(A-D)。

2、SIP1过表达腺病毒转染瘢痕成纤维细胞后相关纤维化因子α-SMA、COL I A2、COLIII的表达情况

为了验证SIP1对瘢痕成纤维细胞纤维化形成的影响，我们构建SIP1过表达腺病毒并转染瘢痕成纤维细胞，转染后36小时在荧光显微镜下观察GFP以确定其转染效率，转染48小时后在mRNA水平检测SIP1表达情况，应用Western-blot检测SIP1、α-SMA、COL I A2、COLIII的蛋白表达水平变化。荧光显微镜下见SIP1过表达腺病毒转染效率较高，见图7。转染48小时后在mRNA水平检测到SIP1过表达腺病毒组SIP1表达明显升高，见图8。Western-blot结果显示，在SIP1过表达腺病毒转染瘢痕成纤维细胞后，α-SMA、COL I A2和COLIII的表达较对照组明显下调；当细胞给予TGF-β₁刺激后，各组α-SMA、COL I A2和COLIII的表达均上调，但SIP1过表达+TGF-β₁组蛋白表达水仍低于对照+TGF-β₁组，见图9(A-E)。

①构建SIP1过表达腺病毒

本实验中SIP1过表达腺病毒即腺病毒介导的SIP1(Adenovirus-mediated SIP1，Ad-SIP1)和阴性对照腺病毒即腺病毒介导的空载病毒对照(Adenovirus mediated No-load virus control，Ad-NC)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。主要参数为：人SIP1基因克隆引物序列为F-SIP1：GTGGCTAGCGCCACCATGAAGCAGCCGATCATGG(含Nhe I切点及Kozak序列)；R-SIP1：GTCGGTACCTTACATGCCATCTTCCATATTGTC(含Kpn I切点)。SIP1过表达腺病毒载体为GV282。

②实时荧光定量PCR

登陆GenBank查找SIP1和GAPDH的序列，用Primer Premier 5.0设计Real-time PCR引物，由TaKaRa公司合成。引物序列情况如下：

SIP1上游引物为5’-CCCTTCTGCGACATAAATACGA-3’，下游引物为5’-TGTGATTCATGTGCTGCGAGT-3’。

GAPDH(内参)上游引物为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。

实验用康为世纪生物技术公司的Real SYBR Mixture试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。反应体系如下：

最终反应体系为20μl，每个样品重复3孔，混匀后，采用双标准曲线法进行PCR，其反应条件为：95℃，30秒；随后(95℃，15秒，60℃，20秒)进行40个扩增反应循环。数据采用IQ5^TM实时荧光定量PCR仪进行采集和分析。

3、SIP1过表达腺病毒转染瘢痕成纤维细胞后磷酸化Smad2和磷酸化Smad3的表达情况

为了进一步探讨SIP1过表达腺病毒转染瘢痕成纤维细胞后使α-SMA、COL I A2和COLIII表达下调的机制，我们用Western-blot检测P-Smad2/Smad2和P-Smad3/Smad3的蛋白表达水平变化。Western-blot检测结果，在SIP1过表达腺病毒转染瘢痕成纤维细胞后，P-Smad2和P-Smad3的表达较对照组明显下调；当细胞给予TGF-β₁刺激后，各组P-Smad2和P-Smad3的表达均上调，但SIP1过表达+TGF-β₁组蛋白表达水仍低于对照+TGF-β₁组，见图10(A-C)。

4、SIP1在兔耳增生性瘢痕中的作用

本实验选用新西兰大耳白兔(由第四军医大学实验动物中心提供)12只，清洁级，兔耳健全，雌雄不拘，体重2-2.5Kg，分笼饲养，自由饮食，适应性饲养1周后用于实验，本实验获得第四军医大学西京医院医学伦理委员会的批准。

①构建兔耳增生性瘢痕模型

根据Morris等和我校李荟元等的方法建立兔耳瘢痕模型，并在此基础上加以改良。新西兰大耳白兔12只，适应性饲养1周后用于实验，麻醉前禁食水，称量体重，应用盐酸赛拉嗪(陆眠宁II)注射液(0.2ml/Kg)联合3％戊巴比妥钠(30mg/Kg)予以肌肉注射麻醉，麻醉生效后置兔于舒适的俯卧位，将整个兔耳消毒后，置兔耳于无菌洞巾内，整个操作过程注意无菌操作，在每个兔耳腹侧面设计并切取4个直径为1cm的圆形皮肤缺损创面，并刮除软骨膜，相邻创面间的距离为2cm，双侧耳对称，总共96个创面，彻底止血，术毕后兔耳创面无需包扎，仍单笼饲养，清醒后自由饮食。术后2周，创面基本愈合，并观察到有逐渐凸起的瘢痕形成，在术后21天形成色红，凸起，质硬的瘢痕共计65个(瘢痕形成率约68％)，并按照随机数字表法分为4组，每组16个瘢痕，即分为对照组、PBS处理组、阴性病毒对照组、SIP1过表达腺病毒处理组。瘢痕注射点选在距离瘢痕边缘约3mm处行四点方向皮下注射，SIP1过表达腺病毒处理组(每点注射病毒10μl，其滴度为1.0×10¹⁰Pfu/ml)，阴性病毒对照组(每点注射空载体腺病毒10μl，其滴度为1.0×10¹⁰Pfu/ml)，PBS处理组(每点注射无菌PBS 10ul)，给药时间为每三日一次，在治疗28天后动物予以耳缘静脉注射空气栓塞处死，留取兔耳瘢痕标本进行检测。

②兔耳增生性瘢痕模型大体形态学变化

兔耳腹侧面皮肤缺损创面在第7天已结痂，在第2周时愈合，在21天逐渐形成色红，隆起于皮肤，质硬的瘢痕，见图11。

5、SIP1过表达腺病毒处理兔耳增生性瘢痕后组织学变化

①将兔耳瘢痕组织用4％多聚甲醛固定后，组织标本行常规石蜡包埋，切片(厚度为5μm)，用Masson染液对瘢痕中胶原纤维进行染色。具体操作步骤按照试剂盒说明进行：

A.切片行二甲苯脱蜡：二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟。

B.乙醇梯度水化：100％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，60％乙醇5分钟。

C.温热水漂洗：用37℃温热水漂洗，45秒×3次。

D.核染液染色60秒，倾去，冲洗液冲洗30秒。

E.浆染液染色45秒，倾去，冲洗液冲洗30秒。

F.分色液分色7分钟，倾去(勿冲洗)。

G.复染液染色5分钟，倾去，用100％乙醇冲洗干净。

H.晾干后，中性树胶封片，镜检。

于FSX100智能生物图像导航显微镜下，观察每张组织切片中胶原纤维分布情况并照相。

②应用Masson染色后观察到，正常兔耳皮肤的胶原较浅薄疏松，排列规整；在对照组、PBS注射组、阴性病毒对照组的真皮层较厚，胶原纤维粗大致密，排列方向紊乱；而在SIP1过表达腺病毒处理组的兔耳皮下胶原纤维密度下降，排列方向较规整，见图12(A-E)。光镜下观察Masson染色切片，用显微镜测量标尺测量瘢痕的相对增生厚度值。按照公式计算瘢痕增生指数(Scar elevation index，SEI)：瘢痕中央最凸点至耳软骨表面的厚度取值为a，兔耳瘢痕周边正常皮肤至耳软骨表面间厚度取值为b，SEI＝a/b。结果显示，对照组、PBS处理组、阴性病毒对照组中瘢痕增生指数分别为：2.674±0.4844，2.519±0.4964，2.343±0.5673，三者无明显差异；在SIP1过表达腺病毒处理组中瘢痕增生指数(1.185±0.1507)明显低于对照组。以上结果提示，SIP1在瘢痕组织中过表达的基因治疗可起到抑制其增生的作用，这与我们上述的体外实验结果相类似，见图13。

Claims (6)

1.SIP1及其衍生物或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体在制备预防和治疗增生性瘢痕药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述增生性瘢痕包括但不限于烧伤、烫伤、切割伤、化学损伤或冷冻伤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的SIP1衍生物是指具有SIP1的结合部位和功能部分，并且在高表达后能够抑制I型胶原、CCN2的表达，或抑制肌成纤维细胞表面标志物α-SMA表达的物质。

4.一种预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒，其特征在于，包括有效量的SIP1或其衍生物、或表达SIP1或其衍生物的重组基因表达载体，和药用赋形剂或载体。

5.根据权利要求4所述的预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒，其特征在于，所述的预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒还含有其他目前已知用于增生性瘢痕病变的抑制剂。

6.根据权利要求4所述的预防和治疗增生性瘢痕药物或试剂盒，其特征在于，所述增生性瘢痕包括但不限于烧伤、烫伤、切割伤、化学损伤或冷冻伤。