CN118178379A - 三亚油酸甘油酯在预防和治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用 - Google Patents
三亚油酸甘油酯在预防和治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及三亚油酸甘油酯在制备预防和/或治疗AhR‑Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用。所述的药物是减少表皮层厚度的药物。所述的药物是减少鳞屑含量的药物。所述的相关疾病为特应性皮炎、湿疹或银屑病。所述的三亚油酸甘油酯剂型为三亚油酸甘油酯乳膏，浓度为5％‑20％。本发明采用分子对接验证了Trilinolein与AhR的结合亲和力。Trilinolein干预后，AhR、CYP1A1和NRF2蛋白表达水平以剂量依赖方式显著增加，与模型组相比，屏障相关蛋白dsp、cdsn和loricrin的mRNA表达水平显著升高，氧化应激的关键介质nox2的mRNA表达水平降低；当加入AhR抑制剂后，Trilinolein对角质形成终末分化蛋白和ROS的调控作用被阻断，证实了Trilinolein可通过激活AhR‑Nrf2途径，发挥皮肤屏障修复和抗氧化作用，为AD提供了一种前景广阔的防治药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是关于三亚油酸甘油酯在预防和治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用。
背景技术
特应性皮炎(Atopic Dermatitis，AD)是临床皮肤科最为常见的慢性炎症性疾病，以皮肤剧烈瘙痒、干燥、湿疹样皮损为特异性表现，可发展为其他系统性、过敏性疾病，给患者日常生活带来沉重负担。虽然国内外学者在AD治疗领域取得了巨大进展，以度普利尤单抗、JAKi抑制剂等新型靶向药物的问世，使中重度AD患者的临床治疗模式发生了历史性的转变，极大的提升了临床疗效和缓解率，但仍不能解决其停药后复发的棘手难题！流行病学调查显示，中重度AD患者平均每年复发9.2次，每次复发平均14.8天，全年136.2天受AD复发困扰。因此，深入探讨天然药物在预防和治疗AD方面的作用对社会具有重要的社会意义和广泛的经济效益。
国内外诊疗指南均指出，外用糖皮质激素是指南公认的AD一线治疗方法，可快速有效控制炎症，减轻皮损症状，但越来越多的证据表明长期使用激素会导致皮肤变薄、萎缩、屏障功能受损，甚至继发感染。更重要的是，外用糖皮质激素停药后极易复发，尤其在不规范、长时间使用强效激素导致AD加重，甚至转化为激素依赖性皮炎(红脸综合征)的报道已经屡见不鲜。近年来，生物制剂和小分子药物在治疗AD方面取得重大突破，IL-4Ra抑制剂Dupilumab、抗IL-13抑制剂Tralokinumab以及JAK1/2抑制剂Baricitinib的问世，将AD带入精准治疗时代。新型靶向药物虽然能够控制病情严重、常规治疗无效的中重度AD，但其治疗成本高昂，许多患者无法负担其长期治疗。由于AD是一种慢性疾病，病程可能持续数年，长远的管理策略是必须要考虑的，近年来中外专家亦不断强调和推行AD的全程管理理念。特别是在激素、靶向治疗停药间期、皮损得到控制后，如何“预防和减少AD复发、提高患者生活质量”，已成为临床亟需解决的关键问题。
目前，皮肤屏障功能障碍被认为是是导致疾病反复迁延的主要原因。表皮屏障的损伤使过敏原、刺激物和微生物等环境危险因素更易渗透到皮肤微环境中，诱导角质形成细胞释放胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等警报素分子，触发免疫级联反应，产生以Th2型炎症为核心的免疫应答失调。这种炎症模式进一步激活角质细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶系统，引发活性氧(ROS)过度积累，导致皮肤氧化应激损伤和慢性炎症状态。因此，即使在AD缓解期，皮损清除区域仍然有亚临床炎症的存在，表现为皮肤瘙痒、干燥和苔藓样改变，不仅影响患者皮肤正常功能，还与失眠、焦虑、抑郁等负面健康问题相关联。
AhR是配体调节的转录因子，在皮肤中广泛表达，可以识别并结合多种环境污染物和内源性配体，从而触发一系列下游信号转导事件。激活的AhR能够与特定的DNA序列结合，发挥维持皮肤屏障、表皮稳态、免疫调节和抗氧化等作用。靶向AhR的特应性皮炎外用药Tapinarof乳膏已进入III期临床试验，突显了AhR靶点的治疗潜力。作为一种化学传感器，AhR在表皮角质形成细胞中大量表达，氧化AhR配体诱导活性氧的产生，而抗氧化AhR配体通过激活Nrf2抑制ROS产生。Nrf2是抗氧化信号传导的的关键调节因子，在正常情况下，Nrf2在细胞质中与Keap1结合，处于抑制状态；但在氧化应激或炎症反应的刺激下，Nrf2与Keap1解离，进入细胞核，激活抗氧化和抗炎基因的表达。
AhR和Nrf2之间的相互作用在炎症性疾病中尤为重要。一方面，AhR的激活可能通过影响Nrf2的稳定性或核转位来调节其活性。另一方面，Nrf2也可以通过直接或间接的方式影响AhR的信号通路。这种相互作用可能有助于细胞在炎症环境中维持适当的氧化还原平衡和抗炎状态。一些AhR激动剂，包括各种来源于植物的天然化合物，通过激活AhR-Nrf2通路发挥抗炎和抗氧化的作用。考虑到炎症性疾病中氧化应激会增加，AhR-Nrf2信号通路激动剂在药物中的开发前景巨大，其可以通过调节抗氧化应激和炎症反应来维护细胞的稳态和组织的健康。针对这一通路的研究可能为炎症性疾病的治疗提供新的策略和方法。而目前关于三亚油酸甘油酯在预防和治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供三亚油酸甘油酯的新用途。
第一方面，本发明提供了三亚油酸甘油酯在制备预防和/或治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用。
作为一个优选例，所述的药物是减少表皮层厚度的药物。
作为另一优选例，所述的药物是减少鳞屑含量的药物。
作为另一优选例，所述的相关疾病为特应性皮炎、湿疹或银屑病。
作为另一优选例，所述的三亚油酸甘油酯剂型为三亚油酸甘油酯乳膏，浓度为5％-20％。
作为另一优选例，所述的三亚油酸甘油酯乳膏中的油相为单硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、凡士林和三亚油酸甘油酯；水相为三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、甘油、蒸馏水和尼铂金乙酯。
本发明优点在于：发明人通过大量实验发现局部应用Trilinolein可以作为特应性皮炎患者缓解期修复皮肤屏障和改善过氧化损伤的有效策略。AhR-Nrf2信号通路在皮肤炎症微环境的免疫调节和稳态中发挥着重要作用，是特应性皮炎的潜在药物治疗靶点。本发明采用分子对接验证了Trilinolein与AhR的结合亲和力。Trilinolein干预后，AhR、CYP1A1和NRF2蛋白表达水平以剂量依赖方式显著增加，与模型组相比，屏障相关蛋白dsp、cdsn和loricrin的mRNA表达水平显著升高，氧化应激的关键介质nox2的mRNA表达水平降低；当加入AhR抑制剂后，Trilinolein对角质形成终末分化蛋白和ROS的调控作用被阻断，证实了Trilinolein可通过激活AhR-Nrf2途径，发挥皮肤屏障修复和抗氧化作用，为AD提供了一种前景广阔的防治药物。
附图说明
图1.三亚油酸甘油酯预防DNCB诱导的小鼠AD样皮损(A)动物实验流程图；(B)各组小鼠实验过程中的体重变化曲线；(C)不同组别小鼠在实验第2、6、10、14天时背部皮损的典型图片及SCORAD皮损严重度评分；(D)小鼠皮肤自发荧光(NADPH)物质检测显示，三亚油酸甘油酯组干预后抗氧化物质NADPH荧光强度增加；(E)各组小鼠实验第14天时皮肤瘙痒行为学统计(记录30分钟内小鼠后爪搔抓次数)；(F)各组小鼠实验结束的免疫器官指数，三亚油酸甘油酯与正常组相比未见免疫器官指数改变，证明药物外用的安全性。
图2.三亚油酸甘油酯预防DNCB诱导的AD样皮肤病理改变和2型炎症(A)H&E染色和(B)甲苯胺蓝染色显示DNCB造模后小鼠表皮增厚(C)，细胞间水肿，真皮浅层血管周围嗜酸性粒细胞聚集(D)，肥大细胞浸润(E)，出现近似人的AD病理特征。三亚油酸甘油酯干预后有效预防了DNCB诱导的AD样皮肤病理改变。采用ELISA法检测各组小鼠皮肤和血清样本的IgE和Th2细胞因子表达情况，三亚油酸甘油酯干预后血清IgE水平(F)、血清和皮损区域的IL-4、TSLP分泌水平较模型组均有明显下降(G)，表明三亚油酸甘油酯可抑制AD的局部和系统性炎症反应。
图3.三亚油酸甘油酯对DNCB诱导的皮肤组织蛋白表达的影响(A-C)对各组小鼠皮肤组织的蛋白组学分析显示，角质细胞终末分化和NADPH氧化酶依赖途径为三亚油酸甘油酯核心调控环节；(D-E)采用免疫荧光半定量分析小鼠皮肤屏障相关蛋白表达情况，发现与造模组相比，三亚油酸甘油酯组皮损区域表皮终末分化相关蛋白DSP、CDSN、LOR表达显著升高；(F-H)采用Western blot分析小鼠皮肤组织NOX2蛋白表达情况，发现与造模组相比，三亚油酸甘油酯组皮损区域NOX2表达显著降低，证实了三亚油酸甘油酯通过抑制NOX2激活，清除细胞内ROS，从而预防DNCB诱导的氧化应激损伤。
图4.三亚油酸甘油酯缓解IL-4、TNF-α诱导的HaCaT细胞终末分化异常和氧化损伤(A)CCK8测定显示，当浓度低于500μM时，三油酸甘油酯对Hacat细胞增殖无明显抑制作用，(B)Hoechst染色证实了三油酸甘油酯在该浓度范围内没有细胞毒性作用。(C-D)在IL-4和TNF-α的干预下，Hacat细胞终末分化蛋白DSP、CDSN和LOR的mRNA和蛋白表达水平显著降低；氧化应激的关键介质NOX2的mRNA和蛋白表达水平明显升高；在三油酸甘油酯干预后，IL-4和TNF-α诱导的皮肤屏障破坏和NOX2依赖性氧化应激明显改善。(E)细胞荧光染色显示，IL-4和TNF-α干预后，Hacat细胞的DCFH-DA荧光强度增加，线粒体膜电位下降，表明氧化应激和线粒体功能障碍加剧，三油酸甘油酯可有效缓解IL-4和TNF-α炎症介质诱导的角质细胞分化异常，减轻氧化应激损伤。
图5.三亚油酸甘油酯靶向AhR-Nrf2信号通路发挥维持细胞稳态和抗氧化作用
(A)三亚油酸甘油酯与AhR的结合能为-6.8Kcal/mol，在PHE239、CYS222形成氢键作用，其他均为疏水键，证实了蛋白质-配体组合之间的结合亲和力。(B-C)采用IL-4和TNF-α诱导HaCaT细胞炎症模型，三亚油酸甘油酯共培养48h后，AhR、CYP1A1和Nrf2蛋白表达水平以剂量依赖方式显著增加，屏障相关蛋白dsp、cdsn和loricrin的mRNA表达水平显著升高，氧化应激的关键介质NOX2的mRNA表达水平降低。(C-F)当加入10μM CH-223191抑制剂(阻止AhR入核，抑制AhR靶基因转录激活)后，三亚油酸甘油酯对屏障蛋白和ROS的调控作用被阻断，证实了三亚油酸甘油酯通过激活AhR-Nrf2信号通路发挥作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一、实验材料及方法
1.动物实验
1.1实验动物
36只SPF级雄性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证编号：20220004000535；实验动物生产许可证编号：SCXK(沪)2022-0004]，体重25±2g，6周龄，在实验动物中心SPF级动物房饲养[实验动物使用许可证编号：SYXK(沪)2018-0040]，饲养环境为12h昼夜节律变换，室温控制在20～24℃，湿度控制在50％～60％，自由进食与饮水。本实验通过了医院伦理委员会认证[伦理编号：YYLAC-2022-154]，所有实验遵循国家有关实验动物的使用、福利和伦理要求等规定。
1.2三亚油酸甘油酯乳膏的配置
1)油相：单硬脂酸30g，单硬脂酸甘油酯15g，液体石蜡45g，凡士林15g，三亚油酸甘油酯15-60mL
2)水相：三乙醇胺0.6g，十二烷基硫酸钠0.6g，甘油30g，蒸馏水135mL，尼铂金乙酯0.3g
3)油相除三亚油酸甘油酯以外的所有成分水浴熔融后，加入三亚油酸甘油酯，冷却至70℃，水相直火加热至沸腾，冷却至70℃，在搅拌下，将油相缓慢加入水相，搅拌至冷。三亚油酸甘油酯在软膏中占比为5％、10％和20％。
1.3DNCB溶液配制
每日将20mg DNCB(二硝基甲苯是特应性皮炎或湿疹的造模药物)干粉13000rpm离心3min后加入2000μL丙酮和橄榄油(3：1)载体溶液，配制成2mL 1％ DNCB造模液。
1.4动物分组及干预
选用6周龄SPF级的BALB/c雄性小鼠，在12h明/暗周期、温度25℃，湿度55％的恒温恒湿环境下按标准条件饲养。适应性饲养4天后，将36只雄性小鼠随机分为正常对照组、DNCB模型组、5％三亚油酸甘油酯组、10％三亚油酸甘油酯组、20％三亚油酸甘油酯组、克立硼罗软膏阳性药物组，每组各6只。用电动剃毛器将小鼠颈背部正中皮肤剃至完全显露，面积约为2cm x 2cm。2小时后，将200mg基质乳膏或等量药物涂抹于各组小鼠备皮区域，每日外用一次，直至实验结束。
预防性用药4天后，将DNCB溶液应用于给药区域造模。用移液枪吸取200μL DNCB溶液均匀涂抹在BALB/c小鼠的背部(空白对照组小鼠给予等量丙酮橄榄油载体溶液)，待致敏部位皮肤完全干燥后放回笼中。每四天激发一次，DNCB溶液首次致敏浓度为1％，后3次激发浓度为0.5％，每次干预后记录小鼠体重、背部皮损SCORAD评分，末次激发时记录各组小鼠瘙痒行为。
BALB/c小鼠背部皮肤造模处理4次后，使用气麻机异氟烷吸入麻醉小鼠，摘眼球留取0.6-1ml血液样本。将小鼠颈部脱臼处死，立即使用无菌手术器械取得每只小鼠背部皮肤标本并平均分成3份，一份置于10倍皮肤样本体积的PFA中进行固定，24小时后石蜡包埋，切片，常规苏木素&伊红染色(H&E)染色；另2份置于冻存管中液氮低温保存，用于后续分子生物学指标检测。
1.5观察指标
(1)肉眼观察：本研究首先进行了肉眼观察，以评估小鼠的一般状况及背部脱毛区的形态变化。一般状况的观察包括小鼠的精神状态、反应灵敏性、性格倾向(好斗或喜静)、体重变化、被毛的密度与紧贴度，以及是否存在脱落现象。同时，对小鼠的饮食与排泄情况也进行了详细记录。针对背部脱毛区，特别关注了局部皮肤的红斑、出血、结垢、干燥、水肿及渗出等病理表现。
(2)皮损SCORAD评分记录：为了量化评估皮损的严重程度，本研究采用了SCORAD评分系统。该系统涵盖了四个主要症状维度：红斑/出血、结垢/干燥、水肿/渗出以及擦伤/侵蚀。每个症状维度的评分范围为0(无)至3(重度)，共划分为四个等级。通过累加各症状维度的分数，得出皮损的总得分，该得分范围在0至12分之间。
(3)后爪搔抓频次测试：为了评估小鼠的瘙痒程度，本研究进行了后爪搔抓频次测试。测试前，将小鼠置于透明鼠笼中，使其适应环境1小时。随后，对小鼠的行为进行录像，并回放视频以计算每30分钟的搔抓次数。搔抓行为的定义包括小鼠伸展后爪朝向瘙痒处，快速移动爪子，然后放下落回地面的动作。通过这一测试，能够客观地量化小鼠的瘙痒反应。
1.6苏木素&伊红染色、甲苯胺蓝染色
(1)样本采集处理
经过14日的背部皮肤造模处理后，BALB/c小鼠通过颈部脱臼法处死。随后，使用无菌手术器械迅速取得每只小鼠的背部皮肤标本，并将其均匀分为三份。其中一份标本立即置于含有10倍体积PFA的溶液中固定，固定时间为24小时，之后进行石蜡包埋、切片，并采用常规苏木素&伊红染色(H&E)法进行染色处理。另外两份标本则存放于冻存管中，并在液氮条件下低温保存，以备后续用于分子生物学指标的检测。
(2)样本包埋
新鲜获取的皮肤组织样本被浸没于含有10倍体积PFA的溶液中，固定过程中每12小时更换一次等体积的新鲜固定液，确保总固定时长不少于24小时。固定完成后，将皮肤样本从固定液中取出，并在生物安全柜内进行精细的整修处理。整修后的样本被置于脱水盒中，以便进行后续的包埋操作。包埋过程中，样本依次经过梯度乙醇脱水、浸蜡等步骤，然后置于包埋机内完成包埋。包埋后的样本按照实验要求放入包埋框内，并贴上相应标签以避免混淆。最后，样本被置于冻台上冷却，使蜡块充分凝固。
(3)切片
采用石蜡切片机对包埋后的组织样本蜡块进行切片，切片厚度控制在4μm左右。切片过程中使用载玻片将组织平稳捞起，确保切片表面平整无皱褶。切片完成后，将其置于恒温箱内进行恒温烘烤，以去除多余水分。烘烤完成后，将切片取出并在常温下保存备用。
(4)石蜡切片脱蜡至水
切片依次经过二甲苯与梯度乙醇的浸泡处理，以去除切片中的蜡质成分，实现脱蜡至水的转换。脱蜡完成后，使用自来水对切片进行短暂的冲洗。
(5)染色
对于苏木素&伊红染色，切片首先用苏木素染色4分钟，随后使用盐酸水溶液进行分化处理，再用氨水水溶液进行返蓝处理，最后使用自来水冲洗。染色完成后，切片经过梯度乙醇脱水处理，再进行伊红染色，染色时间为5分钟。对于甲苯胺蓝染色，切片则使用甲苯胺蓝溶液染色3-5分钟，并使用蒸馏水进行洗涤。
(6)脱水封片
经过染色处理的切片依次通过梯度乙醇和二甲苯进行脱水处理，以去除切片中多余的水分。脱水完成后，使用200μL枪头蘸取少量中性树胶进行封片，以确保切片的稳定性和观察的清晰度。
(7)观察
在荧光倒置显微镜下观察切片的染色情况，并进行图像采集。采集的图像采用Image J软件进行信号统计和分析，以获取准确的实验结果。
1.7ELISA
(1)配液
将洗涤液进行30倍体积的稀释；抗体则需进行100倍体积的稀释。样品则按照体积比为1:2的比例进行稀释。对于标准品，起始浓度为500pg/mL，随后依次进行梯度稀释，得到250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.25pg/mL和15.6pg/mL的浓度梯度。
(2)加样孵育
根据实验需求，选取适量的酶标板条。在板条上分别设置零孔、标准孔和待测样本孔。零孔中加入100μL的样本稀释液，其余孔则分别加入100μL的梯度稀释标准品或待测样本。每个样本设置三个复孔，而标准品则使用单孔。覆盖酶标板后，将其置于37℃烘箱内孵育2小时。
(3)洗涤
轻轻揭去封板膜，避免液体溢出或串孔。弃去液体并拍干板条。随后，加入洗涤液，每孔约350-400μL，洗涤后甩掉液体并再次拍干。此洗涤步骤需重复四次，以确保板孔内无异物残留，同时避免板条过于干燥。
(4)抗体孵育
向每孔中加入100μL的检测抗体，然后覆盖封板膜，置于37℃下孵育1小时。孵育完成后，重复上述洗涤步骤。
(5)二抗孵育
向每孔中加入100μL的HRP标记二抗，覆盖封板膜后，在37℃下孵育40分钟。孵育结束后，再次执行洗涤步骤。
(6)显色
向每孔中加入100μL的TMB显色液，并在37℃下避光显色15-20分钟。若显色偏浅，可适当延长显色时间，但不超过30分钟。显色完成后，向每孔中加入100μL的终止液，此时溶液颜色由蓝色变为黄色。终止液与TMB显色液的添加顺序保持一致。
(7)读数
使用酶标仪在450nm波长下测量各孔的光密度(OD值)，同时以570nm作为校正波长。加入终止液后，应在5分钟内完成读数。
1.8蛋白组学检测
(1)蛋白提取
自-80℃冰箱中取出所需样品，精确称取适量组织样本，并置放于预冷处理的研钵之中。随后，加入液氮进行充分研磨，直至样本变为粉末状。紧接着，向每个样品组中加入裂解缓冲液，其体积为粉末体积的四倍，该缓冲液包含1％SDS及1％的蛋白酶抑制剂。完成添加后，对样品进行超声裂解处理。裂解完成后，在4℃条件下，通过12000g的离心力作用，离心处理10分钟，以去除其中的组织碎片。随后，将离心后的上清液转移至洁净的离心管中，并利用BCA试剂盒，对样本中的蛋白浓度进行精确测定。
(2)蛋白浓度测定
取5μL的蛋白样品，使用BCA试剂盒进行浓度测定。同时，将标准品按照不同体积加入酶标条的样品孔中，并用样品稀释液补充至20μL，每个浓度设置三个复孔。对于待测蛋白样品，同样取5μL加入酶标条样品孔中，并用样品稀释液补充至20μL，设置三个复孔。接着，按照50:1比例分别加入A液：B液配置BCA工作液，向各孔中加入200μL，并在37℃条件下静置反应30分钟。室温冷却后，使用酶标仪在A562 nm波长下进行测定。最后，根据标准曲线和使用的样品体积，计算出样品的蛋白浓度。
(3)胰酶酶解
首先，使用裂解液对样品体积进行标准化调整，以确保各样品间的一致性。接着，向样品中加入一倍体积的预冷丙酮，并通过涡旋混匀使其充分混合。随后，再次加入4倍体积的预冷丙酮，将混合物在-20℃条件下静置沉淀2小时。沉淀完成后，通过以4500g的离心力离心5分钟，弃去上清液，并用预冷的丙酮对沉淀进行两次洗涤，以去除杂质。待沉淀自然晾干后，加入终浓度为200mM的TEAB溶液，并通过超声处理打散沉淀，使其均匀分散。接下来，按照蛋白酶与蛋白质量比为1:50(m/m)的比例，向样品中加入胰蛋白酶，以启动酶解反应。酶解过程需过夜进行，以确保充分反应。随后，向酶解后的样品中加入硫苏糖醇(DTT)，使其终浓度为5mM，并在56℃条件下进行还原反应30分钟。最后，加入碘乙酰胺(IAM)至终浓度为11mM，在室温下避光孵育15分钟，以完成样品的酶解处理。
(4)液相色谱-质谱联用分析
肽段经液相色谱流动相A相溶解后，利用Vanquish neo超高效液相系统进行精细分离。在此过程中，流动相A由含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液组成，而流动相B则由含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液构成。这一步骤确保了肽段的有效分离，为后续分析提供了高质量的样品。液相梯度设置：0-68分钟，B相比例从6％增加到23％；68.0-82.0分钟，B相比例从23％增加到32％；82.0-86.0分钟，B相比例从32％增加到80％；86.0-90.0分钟，维持80％的B相比例。在整个实验过程中，流速被精确控制在500nL/min。随后，经过分离的肽段通过NSI离子源进行电离处理，并导入Orbitrap ExplorisTM480质谱仪进行深度分析。为确保电离效果，离子源电压设定为2.3kV，而FAIMS补偿电压(CV)则分别设定为-45V和-65V。一级质谱扫描的设定范围为400-1200m/z，扫描分辨率高达60000；对于二级质谱扫描，固定扫描的起始点为110m/z，扫描分辨率设为15000，并关闭了TurboTMT功能。在数据采集方面，采用数据依赖型扫描(DDA)程序。在一级扫描完成后，选择信号强度最强的前25个肽段母离子，依次送入HCD碰撞池进行碎裂处理，碎裂能量设定为27％。随后，这些碎裂后的肽段将依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，设定了自动增益控制(AGC)为1E5，信号阈值为5E4 ions/s，并设置了自动最大注入时间。此外，为避免对母离子的重复扫描，设定了串联质谱扫描的动态排除时间为20秒，以确保了实验的准确性和效率。
1.9免疫荧光染色
(1)样本处理
采集的新鲜皮肤样本首先浸没于10倍体积的10％中性福尔马林溶液中，固定48小时。随后，样本在通风良好的生物安全柜内经过精细整修，之后置于专用的脱水盒内，以备后续处理。
(2)包埋
将含有皮肤样本的脱水盒放入吊篮中，并在脱水机内依次进行梯度乙醇脱水与浸蜡处理。浸蜡完成后，样本组织被置于包埋机内进行包埋，并标记清晰。接着，通过置于冻台冷却，确保蜡块完全凝固。
(3)切片
石蜡切片厚度设定为4μm，切片后，利用载玻片轻轻捞起组织，并在恒温箱内恒温烘烤。烘烤完成后，切片被放置在常温下，以备后续使用。
(4)脱蜡
切片依次通过环保型脱蜡液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，以及无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行脱蜡处理，每个步骤均严格控制时间。最后，通过蒸馏水洗涤，确保切片清洁。
(5)抗原修复
使用柠檬酸(pH6.0)抗原修复液，通过微波加热的方式开始抗原修复，完成后室温冷却。随后，玻片在PBS(PH7.4)中洗涤，以去除多余的修复液。
(6)封闭与抗体孵育
切片甩干后，用组化笔在组织周围画圈，并滴加3％BSA进行封闭。接着，滴加配好的一抗，切片在湿盒内4℃孵育过夜。之后，玻片经过PBS洗涤，再加对应的二抗进行孵育。
(7)细胞核复染与自发荧光处理
通过DAPI染液对细胞核进行复染，并控制孵育时间。随后，根据实验需求，对组织自发荧光进行淬灭处理。
(8)封片与图像采集
使用抗荧光淬灭封片剂进行封片，确保样本的稳定性。最后，通过特定的激发波长与发射波长采集图像，以获得清晰的荧光信号。
2.0Western Blot
(1)总蛋白提取
预先在冰盒中准备适量RIPA裂解液，并按照比例加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合液，混合均匀后置于冰上备用。对皮肤样本进行无菌PBS洗涤后，加入适量RIPA裂解液，利用组织匀浆机进行研磨以破碎组织细胞。随后，通过离心收集上清液作为蛋白原液。
(2)BCA测定蛋白浓度
按照一定比例混合BCA试剂A液和B液，配制成BCA工作液。在96孔板中加入BCA工作液和待测样本或标准品蛋白，于37℃孵育一定时间后，利用酶标仪在特定波长下测定吸光度。根据标准品蛋白的浓度和吸光度绘制标准曲线，并据此计算各样本的蛋白浓度。
(3)蛋白质变性
为了破坏蛋白质的二级和三级结构，暴露抗体结合位点，需要对蛋白质进行变性处理。通过加入上样缓冲液和调整蛋白样品浓度，然后在高温条件下进行加热处理，使蛋白质变性。变性后的蛋白样品可用于后续的凝胶电泳和免疫印迹实验。
(4)凝胶制备
在玻璃板上安装好制胶架，按照配方配制下层胶溶液，并加入适量的促凝剂。将混合液加入玻璃板中，并用无水乙醇封顶。待下层胶凝固后，倒去无水乙醇，并制备上层胶。将上层胶加入玻璃板中，并插入梳子。待凝胶完全凝固后，即可用于电泳实验。
(5)电泳
在电泳槽中加入电泳缓冲液，将制备好的凝胶放入电泳槽中，并加入待测样本和分子量标准品。接通电源，设置合适的电压和时间参数，开始电泳。电泳过程中，蛋白质在电场作用下在凝胶中迁移，按照分子量大小进行分离。
(6)转印
电泳完成后，将凝胶取出，并准备好PVDF膜和转膜液。按照一定顺序将凝胶、PVDF膜和滤纸等放置在转印夹中，排除气泡后合拢夹子。将转印夹放入转印槽中，加入转膜液，并接通电源进行转印。转印过程中，蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。
(7)封闭
转印完成后，将PVDF膜放入含有封闭液的容器中，进行室温慢速摇床封闭处理，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭完成后，用洗涤液洗涤PVDF膜，去除未结合的封闭液。
(8)抗体孵育
将特异性抗体(NOX2：1:2000，Proteintech，19013-1-AP)加入含有PVDF膜的容器中，进行抗体孵育。抗体与PVDF膜上的目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。孵育完成后，用洗涤液洗涤PVDF膜，之后加入相应的二抗进行孵育。
(9)成像
在凝胶成像系统中，利用化学发光底物对PVDF膜进行发光处理，使抗原-抗体复合物发出荧光信号。通过调整成像参数，捕捉荧光信号并进行图像分析。根据荧光信号的强度和分布，可以判断目标蛋白的表达水平和定位情况。
(10)洗脱
成像分析完成后，对PVDF膜进行洗脱处理，以去除结合的抗体和荧光底物。洗脱后的PVDF膜可以进一步用于其他免疫印迹实验或进行其他分析方法的处理。
2.细胞实验
2.1细胞系来源
细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)。收到细胞后，在培养瓶外部均匀喷洒75％的酒精进行消毒，随后将培养瓶放入培养箱中培养3小时。之后，吸去多余的培养基，确保瓶内保留约10mL的培养基，以维持细胞的适宜生长环境。在显微镜下，我们仔细观察细胞的形态和汇合度，确保细胞的健康生长。在前三天，我们每天拍摄细胞照片，详细记录细胞的生长状态。一旦细胞的汇合度达到90％至100％，我们立即进行传代操作，以确保细胞的持续增殖和实验的顺利进行。
2.2细胞常规培养
(1)常规培养
实验前，所有所需物品均提前1小时置于生物安全柜内，进行紫外消毒处理。在生物安全柜内完成培养基的配置，将DMEM不完全高糖培养基与10％胎牛血清和1％青链霉素混合液按比例混合，制得完全培养基。配置完成后，分装至50mL离心管中，并贴上封口膜，以备后续使用。
细胞培养条件设定为37℃，5％二氧化碳浓度。每日通过显微镜观察细胞生长情况，包括细胞汇合度和漂浮细胞数量。当漂浮细胞过多时，及时更换新鲜培养基。待细胞汇合度达到90％-100％时，进行细胞传代操作。
(2)传代
移除旧的培养基后，使用1mL无菌PBS洗涤细胞两次，以去除残留的培养基和杂质。吸去PBS后，加入适量的胰蛋白酶液，放入培养箱中消化约15分钟，以使细胞从培养瓶壁上脱离。消化完成后，加入胰蛋白酶液体积三倍的完全培养基，以中止消化反应。随后，将细胞悬液转移至预冷的台式离心机中，以1000RPM的转速离心5分钟。离心结束后，倒去上清液，使用完全培养基重新悬浮细胞。通过细胞计数器测定细胞密度，并将细胞接种至预先加入新鲜培养基的无菌培养容器中。
(3)冻存
细胞离心完成后，倒去上清液，使用每冻存管900μL的胎牛血清重新悬浮细胞。通过细胞计数器测定细胞密度后，将细胞悬液转移至预先加入100μL DMSO的无菌冻存管中，轻轻摇匀，并贴上封口膜。随后，依次将冻存管放入冰箱中1小时、低温冰箱中3小时进行梯度降温。降温完成后，将冻存管转移至超低温冰箱或液氮罐中，进行长期保存。
(4)复苏
为每个需要复苏的冻存管准备含9mL完全培养基的15mL离心管。同时，开启水浴锅，将温度设定为37℃。从冻存处取出细胞冻存管，迅速放入水浴锅中加热，待仅剩少量冰柱时取出。用酒精对冻存管外表面进行消毒处理后，打开冻存管，将细胞悬液吸出并加入预先准备好的离心管中。轻轻摇匀后，将离心管放入预冷的台式离心机中，以1000RPM的转速离心5分钟。离心结束后，倒去上清液，使用完全培养基重新悬浮细胞，并进行细胞培养。
2.3IL-4、TNF-α共培养模拟特应性皮炎细胞环境
在细胞传代过程中，按照每孔5×105的密度将HaCaT细胞接种于6孔板中，并加入2mL的完全培养基。待细胞生长至汇合度达到约70％时，加入含有50ng/mL的IL-4和TNF-α的完全培养基，以模拟特定的细胞培养环境。培养24小时后收取样本进行CCK8检测、Hoechst染色观察细胞增殖情况。留取细胞上清，并使用RIPA或RNAiso试剂收集细胞样本，以备后续检测。
2.4三亚油酸甘油酯共培养
在配置好的含浓度为50ng/mL IL-4、TNF-α的完全培养基中，进一步添加了500μM的三亚油酸甘油酯溶液(使用0.02％DMSO溶解)，随后向6孔板的各孔分别加入0mL、1mL、1.5mL、2mL的含三亚油酸甘油酯及IL-4、TNF-α完全培养基，再向6孔板的各孔分别加入2mL、0.5mL、1mL、0mL的含IL-4、TNF-α完全培养基。共培养24小时后收取上清及细胞RNA、蛋白样本进行检测。
2.5线粒体提取
(1)收集细胞
采用胰酶细胞消化液对细胞进行消化处理，并在室温下以100-200g的离心力离心5-10分钟，以收集细胞。
(2)洗涤细胞
将收集到的细胞使用预冷的PBS进行轻轻重悬，以去除残余的消化液和杂质。随后，取少量细胞进行计数，剩余细胞则在4℃下以600g的离心力离心5分钟，以进一步沉淀细胞。离心后，弃去上清液，得到较为纯净的细胞沉淀。
(3)预处理
向2000-5000万细胞中加入1-2.5ml含有PMSF的线粒体分离试剂，轻轻悬浮细胞后，将其置于冰浴中静置10-15分钟，以确保试剂充分作用于细胞。
(4)匀浆
将预处理后的细胞悬液转移至适当大小的玻璃匀浆器中，进行匀浆操作，约匀浆15次。匀浆后，取少量细胞匀浆与台盼蓝染色液混合，显微镜下观察染色阳性细胞的比例。若阳性细胞比例不足50％，则增加匀浆次数，直至阳性比例超过50％，方可进入下一步操作。
(5)线粒体分离
将细胞匀浆在4℃下以600g的离心力离心10分钟，小心将上清液转移至另一离心管中。随后，在11,000g的离心力下再次离心10分钟，所得沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
(6)去除线粒体的细胞浆蛋白分离
收集上一步离心后的上清液，并在4℃下以12,000g的离心力离心10分钟。离心后，取上清液即为去除线粒体的细胞浆蛋白。使用BCA法对细胞浆蛋白浓度进行测定，以确保后续实验的准确性。
2.6Western Blot
预先准备一个冰盒，并在15mL离心管中加入适量的RIPA液。按照RIPA液体积与磷酸酶蛋白酶抑制剂混合液体积100:1的比例，向其中加入抑制剂混合液，混合均匀后置于冰上备用。从培养箱中取出细胞培养板，置于冰上，吸去培养液。使用无菌PBS洗涤细胞两次后，加入适量RIPA液(根据培养板类型调整加入量，如6孔板每孔加入200μL)。使用细胞刮子轻轻刮下细胞，并将细胞悬液收集至预冷的1.5mL离心管中。在4℃下以12000RPM的离心力离心15分钟，离心后收集上清液至新的1.5mL离心管中，作为Western Blot实验的蛋白原液。后续实验步骤参照动物实验的Western Blot具体操作进行。
2.7qRT-PCR
(1)RNA提取
从超低温冰箱中取出细胞样本，经超声处理后，置于室温环境下，使其与RNAiso反应5分钟。随后，按照RNAiso体积比例5:1(即40μL)向每个样本中加入预冷的氯仿，通过颠倒混匀后，将其置于冰上静置5分钟。接下来，利用超速离心机进行离心处理，设定转速为12000RPM，离心时间为15分钟，离心温度保持在4℃。离心完成后，小心吸取上清液，并将其转移至另一个预冷且无菌无酶的1.5mL离心管中。然后，在离心管中按照1:1的比例加入预冷后的异丙醇，再次通过颠倒混匀后，置于冰上静置5分钟。随后，再次使用超速离心机进行离心，转速设定为7500RPM，离心时间为15分钟，同样保持离心温度为4℃。离心结束后，倒去上清液体，将离心管倒置，在滤纸上晾干约10分钟，直至管底沉淀物周围无明显液滴。最后，向离心管中加入由DPEC水配置的200μL 75％酒精，通过震荡使沉淀物重新悬浮。接着，再次进行离心处理，转速为7500RPM，离心时间为10分钟，离心温度仍为4℃。离心后，倒去上清液，并再次晾干离心管。最终，所剩余的沉淀物即为提取的总RNA。
(2)浓度测定
每个样本中加入逆转录试剂盒中的RNase-free水20μL，通过充分溶解与震荡后，将其置于冰上以备后续使用。随后，启动微量分光光度计与荧光分光光度计，并使用DEPC水对设备进行清洗与调零操作，以确保测量结果的准确性。接着，逐一滴加RNA样本至设备中，测定其浓度，并详细记录浓度值以及A260/A28的数值。若测定的A260/A28比值低于1.6或高于2.2，则表明样本可能存在污染或降解，需重新进行洗涤处理，直至比值符合要求。
(3)逆转录反应
根据已测定的RNA浓度，在新的RNase-free离心管中精准加入6μL的逆转录混合物，随后加入1500ng的RNA溶液。为确保反应体系的体积准确，使用RNase-free水将总体积补足至30μL。接下来，将金属加热器设定为37℃，进行逆转录反应，持续时间为15分钟。反应完成后，将加热器的温度迅速提升至85℃，进行5秒的失活处理。完成了RNA的逆转录过程后，将所得的cDNA妥善保存在低温冰箱中，以备后续实验使用。
(4)PCR
在冰上避光配置PCR反应体系时，依次向预先放置在冰上的RNase-free离心管中加入TB Green液、正向引物、逆向引物、ROX Reference DyeⅠ以及适量的DEPC水。配置完成后，进行顺离操作，并通过震荡使其充分混匀。随后再次进行顺离，以确保反应体系的均匀性。接下来，将离心后的反应体系分装至预冷的PCR用96孔板内，每孔滴加18μL，并加入2μL的cDNA样本。将96孔板离心处理后，放入PCR仪中，设定相应的反应参数。具体参数如下：阶段1为95℃30秒，循环1次；阶段2为95℃5秒，60℃31秒，循环40次；阶段3为熔解阶段。PCR反应完成后，观察并记录熔解曲线，并测定了扩增的CT值，以便后续分析。
2.8分子对接
在进行分子对接时，采用AutoDock Vina软件(通过http://vina.scripps.edu/访问)来准备所需的配体和蛋白质。对于目标蛋白，首先从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取其晶体结构，并进行了一系列预处理步骤，包括去除加氢、修饰氨基酸、优化能量以及调整力场参数。随后，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载了配体结构，并确保其满足低能量构象的要求。接下来，利用pyrx软件(可通过https://pyrx.sourceforge.io/访问)内部的vina模块，将预处理后的靶点结构与活性成分结构进行分子对接。通过对接计算，得到了Affinity值(单位：kcal/mol)，该值代表了配体与受体之间的结合能力。一般而言，Affinity值越低，表明配体与受体之间的结合越稳定。
为了更直观地展示对接结果，使用Pymol软件(https://pymol.org/2/)进行了三维可视化分析。同时，为了获得更全面的结构信息，采用了Discovery Studio2020Client(通过https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download访问)进行了二维可视化分析。
二、实验结果
1.动物实验
在本研究中，我们发现外用Trilinolein(三亚油酸甘油酯)可预防AD皮损发生(图1)，改善背部皮肤表皮厚度、真皮嗜酸性粒细胞、肥大细胞浸润情况，修复DNCB诱导的AD样病理改变，同时降低血清IgE水平、血清和皮损区域的IL-4、TSLP分泌水平，发挥广泛的局部和系统炎症抑制作用(图2)。通过对小鼠皮损区域蛋白进行蛋白质组学分析，我们发现角质细胞终末分化和NADPH氧化酶依赖途径为有效组分Trilinolein核心调控环节(图3A-C)。与造模组相比，Trilinolein组皮损区域角质形成细胞终末分化蛋白DSP、CDSN和LOR表达显著升高，证实了Trilinolein对表皮屏障的修复作用(图3D-E)。此外，Trilinolein组皮损处NOX2表达较造模组显著降低，提示了Trilinolein通过抑制NOX2激活预防DNCB诱导的氧化应激损伤(图3F-H)。值得关注的是，高等剂量Trilinolein(20％)的治疗效果与阳性药物2％Crisaborole(克立硼罗软膏)相当。综上所述，我们发现局部应用Trilinolein可以作为特应性皮炎患者缓解期修复皮肤屏障和改善过氧化损伤的有效策略。
2.细胞实验
角质形成细胞是表皮的主要组成部分，提供了身体和外部环境之间的保护屏障。在AD的发病机制中，角质形成细胞接受Th2和Th1型淋巴细胞产生的IL-4、TNF-α等刺激信号协同启动免疫应答，分泌炎症趋化因子和细胞因子维持皮肤稳态。既往研究表明，IL-4是角质形成细胞最有效的激活剂，通过诱导信号转导器和转录激活剂(AhR-Nrf2)信号调节角质形成细胞终末分化来控制表皮屏障功能。TNF-α细胞因子还会激活角质形成细胞中NF-kB信号通路，增加其促炎趋化因子的产生，从而招募淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞浸润至表皮，引起与AD的发展和严重程度相关的皮肤病变。此外，慢性皮肤炎症与活性氧(ROS)的过度生产有关，当细胞内ROS的积累最终超过了抗氧化系统(AOS)的防御能力，就会产生氧化应激损伤，引起皮损的复发。IL-4、TNF-α均能诱导氧化应激，在特应性皮炎中发挥重要致病作用。因此，我们研究了Trilinolein是否可以改善IL-4、TNF-α共同刺激的人角质形成细胞分化改变和氧化应激损伤。
在IL-4和TNF-α处理后，我们注意到HaCaT细胞中角质形成细胞终末分化基因dsp、cdsn和loricrin的mRNA和蛋白表达水平显著降低；相反，氧化应激的关键介质NOX2的mRNA和蛋白表达水平明显升高。值得注意的是，与模型组相比，Trilinolein干预后HaCaT细胞屏障相关蛋白dsp、cdsn和loricrin的mRNA和蛋白表达水平降低，氧化应激的关键介质NOX2的mRNA和蛋白表达水平明显升高，细胞内ROS荧光强度下降，线粒体形态、膜电位恢复，线粒体和胞质内氧化DNA损伤和修复的标志物尿8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)减少，表明Trilinolein可减轻IL-4和TNF-α炎症介质诱导的线粒体功能障碍和氧化应激损伤(图4)。
既往研究表明，AhR-Nrf2信号通路在皮肤炎症微环境的免疫调节和稳态中发挥着重要作用，是特应性皮炎的潜在药物治疗靶点。我们采用分子对接验证了Trilinolein与AhR的结合亲和力。Trilinolein干预后，AhR、CYP1A1和NRF2蛋白表达水平以剂量依赖方式显著增加，与模型组相比，屏障相关蛋白dsp、cdsn和loricrin的mRNA表达水平显著升高，氧化应激的关键介质nox2的mRNA表达水平降低；当加入AhR抑制剂后，Trilinolein对角质形成终末分化蛋白和ROS的调控作用被阻断，证实了Trilinolein可通过激活AhR-Nrf2途径，发挥皮肤屏障修复和抗氧化作用，为AD提供了一种前景广阔的防治药物(图5)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.三亚油酸甘油酯在制备预防和/或治疗AhR-Nrf2信号通路介导的相关疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是减少表皮层厚度的药物。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物是减少鳞屑含量的药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的相关疾病为特应性皮炎、湿疹或银屑病。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的三亚油酸甘油酯剂型为三亚油酸甘油酯乳膏，浓度为5％-20％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的三亚油酸甘油酯乳膏中的油相为单硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、凡士林和三亚油酸甘油酯；水相为三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、甘油、蒸馏水和尼铂金乙酯。
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