CN111909167B - 一种哌啶并噻吩衍生物及其在制备治疗银屑病的药物中的应用 - Google Patents

一种哌啶并噻吩衍生物及其在制备治疗银屑病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种哌啶并噻吩衍生物，式(I)所示的化合物WB518或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物或前药。本发明还提出了包含式(I)化合物的药物组合物。本发明还提出了所述哌啶并噻吩衍生物在制备治疗银屑病的药物中的应用，在制备用于治疗STAT3高表达相关炎症疾病的药物中的应用。

Description

一种哌啶并噻吩衍生物及其在制备治疗银屑病的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种哌啶并噻吩衍生物及其在制备治疗银屑病的药物中的应用。
背景技术
银屑病(Psoriasis)，俗称牛皮癣，是一种常见的慢性和复杂性免疫介导的炎性皮肤病。全球发病率大概在2％-3％左右，影响约2亿1千500万人口，中国银屑病患者超过600万，且发病率逐年上升。银屑病不仅是一种皮肤病，而是全身的系统性疾病。银屑病患者心血管疾病、类风湿、癌症的发病率高于正常人数倍，超过30％的银屑病患者会发展为银屑病关节炎，超过60％的银屑病患有不同程度的抑郁症。虽然银屑病一般不危及生命，但是银屑病对患者生活质量的影响，已超过糖尿病、心肌缺血和慢性阻塞性肺病。市场研究报告表明，2010年全球银屑病市场价值为42亿美元，2014年为74.9亿美元，预计2019年达到90.2亿美元。
目前，银屑病致病机制尚不十分明确，且没有治疗方式可以完全治愈，目前治疗方式包括常规治疗和生物治疗，主要用于缓解症状和预防疾病的演变，以改善患者的生活质量。常规治疗包括局部治疗、光疗和全身治疗；轻度至中度银屑病通常接受局部治疗。主要局部用药包括皮质类固醇、类维生素A(如他扎罗汀)，钙调神经磷酸酶抑制剂(如他克莫司)、维生素D类似物(如卡泊三烯或骨化三醇)，以及组合如卡泊三醇加倍他米松二丙酸酯。对于更严重的牛皮癣，通常需要光疗和全身性口服药物如甲氨蝶呤，阿曲汀或环孢菌素。常规治疗方式(局部和全身治疗)由于副作用而使使用受到限制。生物治疗的疗效优于常规治疗，短期副作用小，但是价格昂贵，且长期副作用未知，可能与感染、癌症的风险有关，因此，很有必要研发抗银屑病新药。
已有研究显示STAT3信号途径与银屑病进展密切相关，STAT3是银屑病的分子靶点。结合银屑病的最新基础研究成果，筛选和鉴定靶向STAT3小分子药物，研发具有我国自主知识产权的银屑病治疗的潜在新药,并阐明其作用的分子机制，为后续新药研发奠定基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。
发明内容
本发明公开了一种哌啶并噻吩衍生物WB518，可用于治疗银屑病，其包括式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅰ)所示化合物的药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物或前药；
Figure GDA0003202671480000021
式(Ⅰ)化合物即WB518是一种小分子化合物，其分子式为C20H16BrN5O5S，分子量为518.31，其化合物名称为：2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-4-甲氧基酰基-6-(5-溴呋喃-2-羰基)-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻吩。
本发明还提出了一种药物组合物，其包括如上所述的哌啶并噻吩衍生物或其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、代谢产物或前药，以及药学上可接受的载体。
本发明还提出了所述哌啶并噻吩衍生物在制备用于治疗STAT3高表达相关炎症疾病的药物中的应用。其中，所述STAT3高表达相关炎症疾病包括银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和心肌炎等；所述哌啶并噻吩衍生物包括式(Ⅰ)化合物或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)化合物WB518在体外和体内具有如下作用：所述式(Ⅰ)化合物WB518，在体内外均可抑制STAT3活性，降低磷酸化STAT3(P-Tyr705)蛋白的表达；所述STAT3活性是指具有Tyr705磷酸化的STAT3(P-Tyr705)；并且能够下调银屑病关键促炎因子的表达，通过抑制IL-17A/IL-22/STAT3信号通路下调K17(Keratin 17)的表达；并且毒性较低。在银屑病小鼠模型中，所述式(Ⅰ)化合物WB518，抑制STAT3活性，下调促炎因子的表达，减少皮损处中免疫细胞的浸润。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在体外下调角质形成细胞促炎因子的表达；其中，角质形成细胞是指人永生化角质形成细胞HacaT。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在体外人正常角质形成细胞中毒性较低。其中，所述人正常角质形成细胞株为HacaT。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在体外银屑病细胞炎症模型上抑制促炎因子的表达。其中，促炎因子指的是IL-6和IL-17A。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在体外可抑制K17(Keratin 17)的表达。其中，是通过抑制IL-17A/STAT3和IL-22/STAT3信号通路下调K17(Keratin 17)的表达。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中明显抑制银屑病面积和严重程度指数(PASI)。其中，银屑病面积和严重指数(PASI)(银屑病表型)包括红斑、鳞屑和棘皮三个要素。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型中明显抑制VEGFA、ICAM-1和E-selectin的表达，很大程度上改善银屑病损伤处红斑表型。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中促进角质形成细胞正常分化角蛋白的表达，并且抑制银屑病标志分化角蛋白的表达。其中，正常分化角蛋白包括K1(Keratin 1)、K10(Keratin 10)、Loricrin和Involucrin；银屑病标志分化角蛋白包括K16(Keratin 16)和K17(Keratin 17)。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中抑制表皮增生。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中抑制Ki67的表达。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中抑制免疫细胞的浸润。其中，免疫细胞包括CD45+和CD3+细胞。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中明显抑制磷酸化STAT3(P-Tyr705)的水平，并且对STAT3总蛋白没有影响。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中明显抑制标志角蛋白K16(Keratin 16)和K17(Keratin 17)蛋白的表达。
本发明应用中，所述式(I)所示的WB518化合物在体外下调银屑病标志角蛋白K17(Keratin 17)的表达是通过IL-17A/STAT3/K17和IL-22/STAT3/K17信号通路。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中明显抑制银屑病关键促炎因子的表达。其中，促炎因子包括IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23p19和IL-23p40。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518，在体外抑制髓样树突状细胞(CD11c+)(骨髓来源的树突状细胞CD11c+)的IL-23p19、IL-23p40和TNF-α表达，在骨髓来源的树突状细胞CD11c+中抑制细胞上清中IL-23蛋白的表达。
本发明应用中，所述式(Ⅰ)WB518的水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体等同样具有与式(Ⅰ)WB518相同的效果。
本发明还提出了所述式(Ⅰ)WB518在体外和/或体内抑制促炎因子的应用及方法。如式(Ⅰ)WB518可以抑制角质形成细胞表达促炎因子，并在银屑病小鼠模型中抑制促炎因子的产生。
本发明还提出了所述式(Ⅰ)WB518在体外和/或体内抑制K17(Keratin 17)表达的应用及方法。如式(Ⅰ)WB518可以抑制角质形成细胞HacaT中K17(Keratin 17)的表达，并在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中抑制K17(Keratin 17)的表达。
本发明提出所述式(Ⅰ)WB518减少免疫细胞浸润的应用及方法。如式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病小鼠模型中减少免疫细胞的浸润。
本发明提出所述式(Ⅰ)WB518抑制表皮增生的应用及方法。如式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中抑制表皮增生。
本发明提出所述式(Ⅰ)WB518抑制髓样树突状细胞(CD11c+)促炎因子表达的应用及方法。本发明提出了所述式(Ⅰ)WB518抑制在脂多糖(LPS)刺激条件下，髓样树突状细胞(CD11c+)促炎因子IL-23p19、IL-23p40和TNF-α的表达。
本发明中，银屑病是与免疫系统相关的慢性皮肤病，反复发作，临床症状以红斑、鳞屑和棘皮为主，可伴随多种合并症，严重影响患者身心健康和生活质量。
本发明还提出了一种药物组合物，包括所述式(Ⅰ)WB518化合物或其水合物或药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
本发明还提出了式(Ⅰ)WB518或其水合物或药学上可接受的盐或药学上可接受的载体、以及含有式(Ⅰ)WB518的组合物在制备治疗STAT3高表达相关疾病的药物中的应用。其中，所述STAT3高表达相关疾病,包括银屑病、银屑病关节炎等。
在具体实施方案中，式(Ⅰ)化合物WB518在体外和体内抑制STAT3活性、减少促炎因子和银屑病标志角蛋白的表达。在体外，该化合物能抑制K17(Keratin17)的表达，且对正常人皮肤角质形成细胞毒性较小；在体内，WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中显著减轻银屑病进展：减少红斑、鳞屑和棘皮的产生；降低银屑病皮损处免疫细胞的浸润；并且抑制骨髓来源的树突状细胞CD11c+表达IL-23p19/p40和TNF-α。可见WB518具有治疗银屑病的应用前景。
本发明通过荧光素酶报告基因法筛选得到所述式(Ⅰ)化合物WB518，该化合物在体外和体内均能显著抑制促炎因子的合成，并且能够下调K17(Keratin 17)的表达。
本发明中，所述荧光素酶报告基因检测(Luciferase assay)是指，荧光素酶(Luciferase,LUC)报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。本发明构建出了一个筛选抑制STAT3转录活性的荧光素酶(Luciferase)报告基因筛选系统，STAT3与DNA结合序列结合后可以启动该质粒表达出荧光素酶，荧光素酶可以催化其底物荧光素发出荧光，通过检测荧光的强度便能检测STAT3激活的程度；Renilla内参报告基因带有海肾荧光素酶，能表达海肾荧光素酶，通过该质粒可以确定每组细胞的转染效率是否一致，IL-6对Renilla内参报告基因质粒没有影响。
在一具体实施方案中，本发明通过高通量的荧光素酶报告基因法实验进行筛选，从多种小分子化合物中筛选得到了小分子化合物WB518。在细胞水平，式(Ⅰ)WB518能够抑制角质形成细胞和髓样树突状细胞CD11c+促炎因子的表达。随后的动物实验结果表明，式(Ⅰ)WB518能够在银屑病小鼠模型中显著抑制促炎因子的合成，并且有效下调K17(Keratin 17)的表达，并且在发挥功效的药物浓度下表现出较低的毒性。本发明在银屑病新药研发方面取得了新突破，成功填补了国内该领域的空白，具有较强的开发前景。
附图说明
图1所示为式(Ⅰ)WB518在体外细胞实验抑制STAT3活性和促炎因子表达的结果。
图1(A)表示式(Ⅰ)WB518在STAT3-报告基因筛选体系中的结果。
图1(B)表示式(Ⅰ)WB518在人永生化角质形成细胞HacaT的细胞毒性结果。
图1(C)表示式(Ⅰ)WB518抑制IL-17A刺激条件下STAT3(P-Tyr705)表达的结果。
图1(D)表示式(Ⅰ)WB518抑制IL-17A刺激下K17(Keratin17)基因表达的结果。
图1(E)表示式(Ⅰ)WB518抑制IL-22刺激条件下STAT3(P-Tyr705)表达的结果。
图1(F)表示式(Ⅰ)WB518抑制IL-22刺激条件下K17(Keratin17)基因表达的结果。
图1(G)表示式(Ⅰ)WB518抑制咪喹莫特(IMQ)刺激下IL-6基因表达的结果。
图1(Ⅰ)表示式(Ⅰ)WB518抑制咪喹莫特(IMQ)刺激下IL-17A基因表达的结果。
图2所示为式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病小鼠模型中的表型改善的结果。
图2(A)表示式(Ⅰ)WB518对小鼠银屑病表观改善的效果。
图2(B)表示式(Ⅰ)WB518治疗效果的PASI统计图。
图2(C)表示式(Ⅰ)WB518对STAT3(P-Tyr705)、STAT3、K10(Keratin 10)和K17(Keratin17)蛋白影响的结果。
图2(D)表示式(Ⅰ)各组小鼠H&E(上)、Ki67免疫组化与CD3免疫荧光结果。
图2(E)为图2(D)统计结果。
图3所示为式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病小鼠模型中的治疗效果。
图3(A)表示式(Ⅰ)WB518对血管炎症因子VEGF、ICAM-1和E-selectin基因表达影响的结果。
图3(B)表示式(Ⅰ)WB518对皮肤角质层正常分化蛋白和银屑病标志分化蛋白基因表达的影响。
图3(C)表示式(Ⅰ)WB518对CD45+和CD3+免疫细胞数量的影响(上方三幅图中，横坐标为0、102、103、104、105，纵坐标为0、50K、100K、150K、200K、250K；下方三幅图中，横坐标为0、102、103、104、105，纵坐标为0、102、103、104、105)。
图4所示为式(Ⅰ)WB518对主要促炎因子的影响。
图5所示为式(Ⅰ)WB518在骨髓来源的树突状细胞CD11c+中抑制炎症因子表达的结果。
图5(A和B)表示式(Ⅰ)WB518在不同浓度下对IL-23亚基基因表达的影响。
图5(C)表示式(Ⅰ)WB518在不同浓度下对上清中IL-23蛋白分泌的影响。
图5(D)表示式(Ⅰ)WB518在不同浓度下对TNF-α基因表达的影响。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：式(Ⅰ)WB518在体外抑制STAT3活化并对正常细胞毒性较低。
技术方法：
1、细胞的培养
人永生化角质形成细胞HacaT培养于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，培养在37℃恒温培养箱(湿度95％，CO2浓度5％)中。
2、荧光素酶报告基因
实验所用质粒为STAT3-luciferase和Renilla(内参报告基因)。其中，当细胞内的IL-6升高，磷酸化转录因子STAT3，形成二聚体，进入细胞核，与目的基因启动子结合，启动基因转录。并由于STAT3具有的转录活性而起始下游荧光素酶基因的表达，而荧光素酶可以催化其底物荧光素发出荧光，通过检测荧光的强度便能检测雄激素受体激活的程度；Renilla内参报告基因带有海肾荧光素酶，能表达海肾荧光素酶，通过该质粒可以确定每组细胞的转染效率是否一致。
实验结果如图1(A)所示，式(Ⅰ)WB518能显著抑制STAT3转录活性(图1A中，横坐标数字所代表的含义为待筛选的化合物代号；纵坐标为STAT3-luci报告基因相对活性)。
3、MTS法测定细胞增殖实验
MTS是一种运用比色法间接测定活细胞数量的方法。MTS是一种新合成的四唑类化合物，通过被活细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒，在490nm处测量还原产物的吸光值与活细胞的数量呈正比，从而反映细胞活力情况。此实验可以用于评价化合物对人正常细胞增殖的影响，从而判断化合物对人正常细胞增殖的抑制作用并计算IC50。
各细胞以1-10×103个/孔的密度，每孔100μL均匀接种到96孔板，放在恒温培养箱中待细胞贴壁后，对照组加入相应的培养基，实验组给予不同浓度的化合物，药物处理24-96h后取出在显微镜下观察细胞状态，在避光条件下，加入MTS，混合均匀后避光放置在恒温培养箱，用酶标仪490nm处测定读取光吸收值，实验重复三次，IC50用GraphPad5 Prism软件计算得到。
实验结果如图1(B)所示，式(Ⅰ)WB518在人永生化角质形成细胞HacaT中毒性较低(图1B中，横坐标数字所代表的含义为WB518加入的终摩尔浓度)。
4、免疫印迹(Western Blot)
细胞经不同浓度WB518处理12-24h后，用PBS清洗细胞，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂裂解细胞，再将细胞裂解液离心、定量、煮沸变性，用聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上，经BSA封闭液封闭1h后，分别用STAT3、STAT3(P-Tyr705)、β-actin的一抗在4℃孵育过夜，再用带有荧光标记的二抗孵育1h，最后用Odyssey扫膜仪检测蛋白的表达水平。
实验结果如图1所示，图(C)(E)为人永生化角质形成细胞HacaT中磷酸化STAT3(P-Tyr705)的蛋白水平在IL-17A和IL-22的刺激下明显增加，可以看到(Ⅰ)WB518可以明显抑制STAT3(P-Tyr705)蛋白的表达。
5、荧光定量PCR实验
细胞经不同浓度药物处理后，用Trizol分离提取RNA，RNA经反转录后得到cDNA，用K17(Keratin17)的特异性引物，通过实时定量PCR(Q-PCR)检测其mRNA的表达水平。
实验结果如图1(D、F、G、I)所示，式(Ⅰ)WB518能够抑制人永生化角质形成细胞HacaT中K17(Keratin17)、IL-6和IL-17A的基因表达(图1D、F、G、I中，横坐标数字所代表的含义为WB518加入的不同终摩尔浓度)。
实施例2：式(Ⅰ)WB518明显改善咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病小鼠模型的表型。
技术方法：
1、咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型的构建
技术方法：
对于体重合适的6-8周雌性C57BL/6小鼠进行随机分组，每组6-8只；分别设置组：空白对照组(DMSO)、咪喹莫特(IMQ)造模组、阳性药组(地塞米松DX)、WB518低浓度组(17.5μg)、WB518高浓度组(35μg)。在小鼠麻醉的前提下，使用小鼠毛发剔除器去除小鼠背部毛发，随后用小鼠脱毛膏涂抹于剃毛处，涂抹均匀，反应1-2分钟，迅速用75％无水乙醇清洗掉脱毛膏；处理结束的小鼠放置于40℃烤台上进行热苏醒，考虑到小鼠充分休息，第二天后再进行下面的步骤。在小鼠背部量取2.5cm x2.5cm位置，涂抹62.5mg咪喹莫特乳膏，每日一次，连续涂抹5天；空白处涂抹同量的凡士林，阳性药组和给药组的药物与咪喹莫特提前完全混匀。
实验结果如图2A所示，式(Ⅰ)WB518能够显著改善了咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型的表型，包括红斑、鳞屑、棘皮增生。此外，如图2B所示,式(Ⅰ)WB518能够明显降低银屑病面积和严重程度指数(PASI)(图2B中，横坐标数字所代表的含义为咪喹莫特银屑病小鼠模型诱导和给药天数，纵坐标为PASI统计分数，共12分，红斑4分、鳞屑4分、棘皮4分)。
2、免疫印迹(Western blot)实验
小鼠经不同浓度药物处理后，组织细胞经破碎裂解提取蛋白，蛋白经煮沸变性后用聚丙烯酰胺凝胶PAGE电泳分离蛋白质样品，然后转移到硝酸纤维素薄膜上。首先用STAT3、p-STAT3(Y-705)、β-actin、K17(Keratin17)的抗体(一抗)4℃孵育过夜，再用带有荧光标记的二抗体孵育一小时，最后用扫膜仪Odyssey检测该蛋白的表达水平。
实验结果如图2(C)所示，在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中，WB518可以明显抑制STAT3(P-Tyr705)和K17(Keratin17)的蛋白水平，并且促进K10(Keratin 10)的表达。
3、H&E、免疫组化与免疫荧光实验
将各组小鼠的背部皮肤剥离，用4％的多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片后，再经脱蜡、抗原修复、封闭抗原位点、孵Ki67抗体、CD3抗体、二抗、显色、苏木精染色、脱水封片后，在显微镜下观察并拍照，检测各组小鼠背部皮损处中Ki67和CD3的表达含量。
实验结果如图2所示，图D上为各组小鼠剥离的银屑病背部皮损处皮肤的H&E图，从图中可以看出WB518皮肤外敷给药35μg/只的银屑病皮损处背部皮肤厚度近似于正常皮肤，说明式(Ⅰ)WB518能够显著抑制银屑病皮损处皮肤的异常增生；图D中为各组小鼠剥离的背部皮肤的免疫组化图，Ki67为细胞增殖的标志物，表达量随着皮损增生程度的增加而上升，从图中可以看出WB518组小鼠的褐色较浅且少与阳性药地塞米松(DX)组相近，而咪喹莫特(IMQ)组褐色较多且深，说明式(Ⅰ)WB518可以抑制银屑病小鼠背部皮肤的恶性增长。图D下为各组小鼠剥离的背部皮肤的免疫荧光图，CD3为T淋巴细胞的标志物，从图中可以看出WB518组荧光染色较少且浅与阳性药地塞米松(DX)组相近，而咪喹莫特(IMQ)组荧光染色明亮且密集分布，说明(Ⅰ)WB518可以抑制银屑病小鼠背部皮损处T淋巴细胞的免疫浸润。图(E)为图(D)的数据统计(图2E中，横坐标所代表的含义是不同给药处理组：DMSO对照组、IMQ造模组、DX(200微克)阳性对照组和WB518(35微克)给药组)。
实施例3：式(Ⅰ)WB518明显改善咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病小鼠的红斑与鳞屑。
技术方法：
1、荧光定量PCR
细胞经不同浓度药物处理后，用Trizol分离提取RNA，RNA经反转录后得到cDNA，用VEGFA、ICAM-1、E-selectin、K1(Keratin1)、K10(Keratin10)、Loricrin、Involucrin、K16(Keratin16)、K17(Keratin17)的特异性引物，通过实时定量PCR(Q-PCR)检测其mRNA的表达水平。
实验结果如图3A所示，其中VEGF、ICAM-1和E-selectin为血管炎症因子标志物，表达量随着血管炎症严重程度而增加，并且银屑病红斑表型与真皮内血管增生程度和炎症相关；从图中可以看出WB518可以显著抑制血管炎症因子的表达，说明式(Ⅰ)WB518能够抑制银屑病小鼠红斑的形成。图3B为各组小鼠银屑病皮损处角质层分化相关基因的表达量，其中K1(Keratin1)、K10(Keratin10)、Loricrin、Involucrin为正常皮肤角质层形成过程中必须的分化蛋白，角质形成细胞的不完全分化是鳞屑产生的原因，K16(Keratin16)和K17(Keratin17)为在银屑病皮损处异常高表达的蛋白，而在正常皮肤中几乎不表达的。从图中可以看出WB518不仅可以促进皮肤正常分化所需的角蛋白的表达，而且可以抑制银屑病标志角蛋白的基因的表达。说明式(Ⅰ)WB518能够抑制银屑病小鼠鳞屑的产生(图3A、B中，横坐标所代表的含义为不同给药处理组：DMSO对照组、IMQ造模组、IMQ+WB518(35)给药组，其中35是指给药量μg)。
2、细胞流式术
咪喹莫特(IMQ)造模后，在减少实验小鼠痛苦的前提下，颈部猝死小鼠，尽量取全部小鼠背部皮肤，用于下一步实验；提前配制好皮肤消化完全酶，实验过程中使用为1x消化酶。使用剪刀和镊子剪取小鼠背部皮肤；放置于10cm培养皿中，剪碎皮肤组织。将剪碎的皮肤组织放置于5mL离心管中，按照比例(一只小鼠背部皮肤+3mL完全消化酶)，并用封口膜封闭管口；在37℃摇床上进行消化处理，220RPM/分钟条件消化3小时。将上一步消化完成的皮肤组织倒入40μm过滤网，使用2mL注射器缓慢研磨，保证皮肤组织尽量过滤完全。研磨完全的皮肤组织液体，滴加1640培养基配平后，2000RPM离心15分钟；随后缓缓加入小鼠淋巴细胞分离液；水平离心，1500RPM离心20分钟，在见到明显的液面分层后，使用移液器吸取中间白色絮状液层。最后，2000RPM离心15分钟，去除上清杂质，并用1mL1640培养基重悬淋巴细胞；滴加流式抗体进行孵育，按照比例(1x106个细胞/1μL抗体)，4℃孵育30分钟。
实验结果如图3C所示，CD45+为白细胞的标志物，CD3+为T淋巴细胞的标志物，从图中可以看出WB518组与咪喹莫特(IMQ)组相比，白细胞与T淋巴细胞的比例明显下降；说明式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中能够显著减少淋巴细胞的浸润(图3C中，横坐标数字所代表的含义为不同给药处理组(DMSO对照组(Control)、IMQ造模组和WB518(35μg)给药组)中CD45阳性细胞数量。
实施例4：式(Ⅰ)WB518抑制咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠促炎因子的表达技术方法：
荧光定量PCR细胞经不同浓度药物处理后，用Trizol分离提取RNA，RNA经反转录后得到cDNA，用IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23p19、IL-23p40的特异性引物，通过实时定量PCR(Q-PCR)检测其mRNA的表达水平。
实验结果如图4所示，通过实时定量PCR(Q-PCR)实验表明，与空白组相比，造模组银屑病相关的促炎因子关键基因IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23p19、IL-23p40出现明显增高，进一步证明咪喹莫特(IMQ)诱导造模的成功。从图中可以看出WB518明显抑制银屑病小鼠体内促炎因子基因的表达。说明式(Ⅰ)WB518在咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型中具有明显抑炎活性(图4中，横坐标数字所代表的含义为不同给药处理组：DMSO对照组、IMQ造模组、DX(200μg)阳性对照组、WB518(17.5μg)给药组和WB518(35μg)给药组的给药量)。
实施例5：式(Ⅰ)WB518在骨髓来源的树突状细胞CD11c+中抑制IL-23和TNF-α的表达。
技术方法：
1、小鼠骨髓来源树突状细胞CD11c+的分离与诱导
准备7-8周雄性C57BL/6小鼠，在减少试验小鼠痛苦的前提下，颈部处死小鼠，75％的无水乙醇消毒处理5分钟；取股骨和胫骨，剔除所有肌肉组织。无菌的条件，剪开股骨和胫骨两端，1mL注射器吸取1640培养基反复吹洗，尽量将骨髓完全吹出；移液器吸取并转移至新的离心管中，1500RPM离心5分钟，弃上清。使用1640培养基重悬沉淀，加入红细胞裂解液，室温条件下裂解2-3分钟；随后加入完全培养基进行终止反应，1500RPM离心5分钟，弃除上清。使用完全培养基重悬，吹打均匀后移液器吸取并平均转移至6孔板中，每孔加入3mL完全培养基，轻轻拍打6孔板使细胞均匀分布，水平放置于37℃细胞培养箱中进行培养。细胞培养48小时后，移液器滴状吹打细胞，弃上清，加入3mL新鲜完全培养基，继续培养48小时；48小时后，更换新鲜培养基，继续培养48小时或72小时，收集悬浮细胞即为树突状细胞。
2、荧光定量PCR实验
细胞经不同浓度药物处理后，用Trizol分离提取RNA，RNA经反转录后得到cDNA，用IL-23p19、IL-23p40、TNF-α的特异性引物，通过实时定量PCR(Q-PCR)检测其mRNA的表达水平。
实验结果如图5(A)(B)(D)所示，通过实时定量PCR(Q-PCR)实验表明，与空白组相比，LPS刺激组的IL-23p19、IL-23p40、TNF-α基因的表达量出现明显增高。从图中可以看出WB518明显梯度抑制骨髓来源的树突状细胞CD11c+中炎症因子基因的表达。说明式(Ⅰ)WB518可以抑制骨髓来源树突状细胞CD11c+炎症因子基因的表达(图5A、B、D中，横坐标数字所代表的含义为髓样树突状细胞中WB518不同摩尔浓度给药处理组)。
3、酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay，ELISA)
ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。在测定时，样品中的IL-23与固相载体表面的IL-23抗体反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的复合物与样品中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
实验结果如图5(C)所示，骨髓来源的树突状细胞在LPS的刺激下IL-23过度表达，提前12小时加入WB518(低浓度)和WB518(高浓度)能够梯度下调上清中IL-23蛋白的表达。说明式(Ⅰ)WB518能抑制骨髓来源的树突状细胞CD11c+表达IL-23蛋白(图5C中，横坐标数字所代表的含义为髓样树突状细胞中WB518不同终摩尔浓度给药处理组)。
上述实施例仅为了说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本领域技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所作出的等效变化或修饰，都涵盖在本发明保护范围内。

Claims (12)

1.一种哌啶并噻吩衍生物，其特征在于，其选自如式(I)所示的WB518化合物或如式(I)化合物药学上可接受的盐；
Figure FDA0003202671470000011
2-(1-甲基-4-吡唑)-甲酰胺基-3-氰基-6-(5-溴呋喃-2-羰基)-4,5,6,7-四氢[2,3-c]哌啶并噻吩。
2.一种药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的哌啶并噻吩衍生物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
3.如权利要求1所述的哌啶并噻吩衍生物或其药学上可接受的盐、或如权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗STAT3高表达相关炎症疾病的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述STAT3高表达相关炎症疾病选自银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和心肌炎。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在体外和/或体内能够抑制STAT3活性；所述STAT3活性是指具有Tyr705磷酸化的STAT3(P-Tyr705)。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在体外和/或体内下调角质形成细胞促炎因子的表达；其中，角质形成细胞是指人永生化角质形成细胞HacaT。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在体外和/或体内对人正常细胞毒性低；所述人正常细胞是指人永生化角质形成细胞HacaT。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在体外和/或体内下调银屑病促炎因子和银屑病标志角蛋白的表达；所述促炎因子是指IL-6和IL-17A，所述标志角蛋白是指K17(Keratin 17)。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在体外和/或体内下调银屑病标志角蛋白K17(Keratin 17)的表达是通过IL-17A/STAT3/K17和IL-22/STAT3/K17信号通路。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物用于改善银屑病表型，所述银屑病表型选自红斑、鳞屑、棘皮。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物用于下调促炎因子和标志角蛋白的表达；所述促炎因子是指IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-22、IL-23p19、IL-23p40，所述标志角蛋白是指K16(Keratin 16)和K17(Keratin 17)。
12.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述式(I)所示的WB518化合物在骨髓来源的树突状细胞CD11c+中抑制IL-23p19、IL-23p40和TNF-α基因的表达、在骨髓来源的树突状细胞CD11c+中抑制细胞上清中IL-23蛋白的表达。
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