CN116492469A - 一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明涉及苯妥英钠的一种新用途。本发明在细胞水平上证明苯妥英钠可通过调控自噬从而影响肝星状细胞的活化而改善肝纤维化。同时，本发明还通过建立疾病模型的方式，动物水平上验证苯妥英钠对肝纤维化的疗效，可用于制备治疗和/或预防肝纤维化的药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用。
背景技术
慢性肝病是严重影响人们生活质量的一个世界性难题，肝硬化和原发性肝细胞癌的发病率及死亡率都很高，而肝纤维化则是这些慢性肝病的病理学基础，也是肝硬化、肝癌的发病机制。大量研究证实，肝纤维化可能由多种原因导致，包括酒精、病毒、药物、毒素、免疫及代谢障碍等，这些物质的持续刺激可能会导致严重的肝脏损伤。肝纤维化的发生机制也与多种因素有关，肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化则是其发病机制中的关键性因素之一。受多种因素的影响，肝脏实质细胞发生持久性的炎性坏死，HSCs受到激活，进而大量增殖，同时释放出大量的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，这些物质促进了纤维结缔组织的大量增生，最终形成纤维瘢痕，进而损害了肝脏的结构和功能，最终导致肝纤维化。因此，抑制活化的HSCs在肝纤维化的治疗中具有重要意义。
目前，肝纤维化的治疗仍然处于萌芽阶段，虽然目前已经发现了一些有效的药物，但大多是病因治疗，存在治疗疗程长、治疗效果欠佳、不良反应多等缺点，其治疗困扰着全球医学界，早期发现导致肝纤维化的因素，并及时予以干预和抑制其进一步向慢性肝病发展是目前的主要任务之一。因此研究肝纤维化的发病机制，寻找新的治疗靶点，以及开发出能够有效治疗肝纤维化、安全可靠、价格实惠的药物，具有十分重要的社会和医学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用。
优选的是，所述通道阻滞剂为钠通道阻滞剂。
优选的是，所述钠通道阻滞剂包括苯妥英钠。
优选的是，所述肝纤维疾病包括四氯化碳诱导的肝纤维疾病。
优选的是，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
优选的是，所述药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。
优选的是，所述药物的剂型包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。
本发明还提供苯妥英钠在制备抑制肝组织自噬的药物中的应用。
本发明还提供苯妥英钠在制备抑制肝星状细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供苯妥英钠在制备下调肝细胞α-SMA的药物中的应用。
本发明还提供苯妥英钠在制备下调肝细胞LC3的药物中的应用。
本发明还提供苯妥英钠在制备上调肝细胞P62的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明在细胞水平上证明苯妥英钠可通过调控自噬从而影响肝星状细胞的活化而改善肝纤维化。同时，本发明还通过建立疾病模型的方式，动物水平上验证苯妥英钠对肝纤维化的疗效，可用于制备治疗和/或预防肝纤维化的药物。
附图说明
图1为小鼠肝纤维化模型及苯妥英钠治疗后对小鼠肝功能的影响；其中，A：各组小鼠肝脏大体形态；B：各实验组小鼠ALT统计图；C：各实验组小鼠AST统计图；
图2为HE、Masson、天狼星红染色观察各组小鼠肝纤维化情况；其中，A：HE染色；B：Masson染色；C：天狼星红染色；
图3为免疫组化技术检测α-SMA在各实验组中的表达情况(A)及统计图(B)；
图4为Western blot检测各组实验小鼠肝组织中肝纤维化指标及自噬相关指标的表达及统计图；其中，A、D：各组实验小鼠肝组织中α-SMA的表达情况及统计图；B、E：各组实验小鼠肝组织中LC3的表达情况及统计图；C、F：各组实验小鼠肝组织中P62的表达情况及统计图；
图5为CCK8法检测苯妥英钠对肝星状细胞HSC增殖的影响；
图6为CCK8法检测TGF-β1对HSCs增殖的影响及苯妥英钠对TGF-β1诱导的HSCs增殖的影响；
图7为Western blot检测不同实验组细胞中α-SMA，LC3，P62的表达及统计图；其中，A、D：各实验组HSC细胞中α-SMA的表达情况及统计图；B、E：各实验组HSCs中LC3的表达情况及统计图；C、F：各实验组HSCs中P62的表达情况及统计图；
图8为Western blot实验技术检测加用雷帕霉素后HSCs的α-SMA及自噬相关蛋白LC3、P62的表达及统计图；其中，A、D：HSCs中α-SMA的表达情况及统计图；B、E：HSCs中LC3的表达情况及统计图；C、F：HSCs中P62的表达情况及统计图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
实施例1苯妥英钠的动物实验
1.肝纤维化小鼠模型的构建及治疗：
1.1实验步骤与方法：
(1)实验分组：模型组、治疗组、正常组及药物组，每15只健康雄性C57小鼠(购自重庆腾鑫生物技术有限公司)一组，共60只小鼠。
(2)肝纤维化小鼠模型构建：正常饲养的雄性C57小鼠体重达20g时开始造模。模型组、治疗组的小鼠给予灌胃20％ CCl4橄榄油溶液，5mL/kg，每周2次，共灌胃8周。所有小鼠均正常饲养。
(3)苯妥英按的防治：在造模第二周后开始给治疗组及药物组腹腔注射苯妥英钠(1mM)，10mL/kg，每天腹腔注射1次，直至模型组造模成功后停止注射。正常组及模型组小鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。
(4)取材：建模成功后解剖各组小鼠，取眼球学测血清学指标；取肝脏肉眼观察肝脏外观，并拍照记录，取肝组织2块于福尔马林中固定、石蜡包埋，最终制作成石蜡切片用于HE、苦味酸天狼猩红、Masson三色染色及免疫组化，其余组织于-80℃冻存备用。
(5)肝脏切片HE染色：将小鼠肝组织用福尔马林进行固定，并将其包埋于石蜡之内，使用粘附载玻片将其制成石蜡切片，将其放入70℃的恒温箱内，经过1-2小时的烘烤，将其进行常规的脱蜡处理(将其浸泡于二甲苯Ⅰ液10分钟，二甲苯Ⅱ液10分钟，无水乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，80％乙醇5分钟，75％乙醇5分钟，50％乙醇5分钟，最后使用PBS缓冲液洗涤三次，每次持续10分钟)，然后进行染色(用苏木素染色5分钟后，用盐酸酒精分化10秒，然后用自来水流水冲洗10分钟，直到反蓝，接着用0.5％伊红液染色3分钟，再用流水冲洗5分钟)，最后，将样品进行脱水(50％乙醇1分钟，75％乙醇1分钟，80％乙醇1分钟，95％乙醇1分钟，无水乙醇1分钟)，中性树胶封片，最后显微镜下观察，拍照保存。
(6)肝脏切片Masson三色染色：将肝脏的石蜡切片经过脱蜡处理，把配制好的Weigert铁苏木素染料滴在组织上染色在5-10分钟，接着使用酸性乙醇分化液分化5-15秒，水洗，再用Masson蓝化液对其进行返蓝3-5分钟，蒸馏水洗1分钟，丽春红品红染色液染色5-10分钟，然后将蒸馏水与弱酸溶液按照2:1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1分钟。磷钼酸溶液洗1-2分钟，弱酸工作液洗1分钟，苯胺蓝染色液染色1-2分钟，弱酸工作液洗1分钟，95％乙醇快速脱水，无水乙醇脱水3次，每次5-10秒，二甲苯透明3次，每次1-2分钟，中性树胶封固，显微镜下拍照记录。
(7)肝脏切片苦味酸天狼猩红染色：在清洁的环境中，将肝脏的石蜡切片经过脱蜡处理，然后放入苏木精溶液中浸泡2分钟，再经过10分钟的自来水冲洗，最后在1％的盐酸乙醇中分化5秒，再经过10分钟的自来水冲洗，最后在苦味酸天狼星红染液中浸染20分钟，再经过5分钟的自来水冲洗。最后脱水、封片，在显微镜下拍摄并记录。
(8)免疫组化：将肝脏的石蜡切片经过脱蜡处理，将石蜡切片浸泡在3％H2O2溶液中，持续孵育5-10分钟，然后用蒸馏水洗涤，再用PBS洗涤5分钟，重复2次，柠檬酸钠修复抗原，PBS洗5分钟。滴加α-SMA抗体，4℃过夜。复温30min后用PBS冲洗，每次5分钟，重复3次，滴加酶标单抗鼠兔IgG，37℃孵育30分钟后再用PBS冲洗。显色剂显色1分钟(DAB)，然后用清水彻底冲洗，再次染色，脱水，透明，最后将其封片，在显微镜下拍摄照片并进行分析。
(9)蛋白质免疫印迹实验(Western-Blot)：
1)蛋白原液的提取
组织蛋白的提取：取各组实验小鼠肝组织分别置于EP管中，并以适当的比例添加裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂，混匀，超声裂解细胞及核酸，使溶液变得清澈透明。在4℃的环境下，以12000rpm的速度离心30min，取出上清液进行蛋白定量分析。
细胞蛋白的提取：从孵育箱中取出需要提取蛋白的细胞，将其用配制好的PBS溶液洗涤两次，放在干净的滤纸上，待其残留的PBS晾干，然后根据细胞的生长情况加入一定量的RIPA蛋白裂解液，静置30分钟左右使蛋白质裂解。然后用细胞刮刮下裂解好的蛋白原液，放入备好的EP管中，再放入高速离心机中，于4℃条件下以12000rpm离心30min，离心完成之后，取上清进行后续蛋白定量。
2)蛋白定量
取一EP管，向其中加入标准蛋白BSA 25μL及PBS 75μL，配备成0.5mg/mL的BSA标准蛋白溶液。然后拿一个96孔板，在孔中分别加入一定量的PBS及BSA设置成标准曲线，接着稀释蛋白原液，在EP管中加入PBS溶液87μL，然后加入3μL离心好的蛋白原液(稀释30倍)。接着A液及B液按照50:1的浓度配比配成BCA工作液，向96孔板中每个孔加200μL，放入恒温箱中30分钟，温度设为37℃。最后用酶标仪检测蛋白原液浓度，计算好浓度配比后将RIPA蛋白酶裂解液加入蛋白原液中，调整蛋白原液为相同浓度后，向每个EP管中加入等量的5乘的上样缓冲液，沸水中煮5分钟，待冷却后放入-20℃冰箱。
3)Western-Blot实验步骤
①配电泳凝胶。
②上样跑胶：将配好的电泳凝胶放入电泳槽内，加入电泳液，拔出上样梳，从冰箱内取出蛋白Marker，取4μL加入孔内，其余孔加入目的蛋白，盖上盖子，调节电压80V开始跑胶，待蛋白Marker条带被分开成多个条带时，调整电压为120V，直至所需目的蛋白的位置跑出来时可终止电泳。
③转膜：取出PVDF膜，裁剪成所需大小后放置于甲醇溶液中浸泡5-10分钟，取出电泳槽内的胶，根据目的蛋白分子量对照Marker条带切取所需的胶，将标记好的PVDF膜覆盖在对应的胶上，按顺序放滤纸海绵，然后将其放入电转槽内，加入电转液，调节电压为90V，据目的蛋白分子量设置电转时间。
④封闭：电转完成后取出PVDF膜，用TBST洗5min，然后倒掉TBST，加入配置好的5％蛋白封闭液，摇床上摇晃1.5小时。
⑤孵育一抗：将封闭好的PVDF膜用TBST洗三次，每次10分钟，然后将膜转移至配好的一抗中过夜。
⑥孵育二抗：从一抗中取出PVDF膜，用TBST洗三次，每次10分钟，然后放入二抗中摇晃2小时，取出PVDF膜，再用TBST洗三次，每次10分钟。
⑦显色：将显影剂滴加膜上进行曝光。
⑧结果分析：将曝光结果用软件Image J进行条带的灰度值分析统计。
1.2实验结果：
(1)造模过程中，模型组小鼠精神状态逐渐变差，活动减少，进食量和饮水减少，说明CCl4的存在会导致肝脏的损伤，从而影响小鼠的健康生长。而治疗组与模型组相比较，虽皮毛仍够不顺滑，但活动明显增强，而正常组和药物组的小鼠皮毛光滑，活动活跃，进食量和饮水量也都保持正常。
(2)建模成功后，解剖小鼠，肉眼观察肝脏外观，并拍照记录。如图1中A所示，可以明显看出各组小鼠肝脏外观的区别及变化。正常组与药物组与小鼠肝脏无明显差异，肝脏质地软，表面光滑；模型组小鼠肝脏质地硬光泽度低，表面粗糙，整个肝脏发黄；治疗组小鼠肝脏质地比模型组软，但仍比正常组硬，光泽度低。
(3)肝功能检测(ALT、AST)：各组小鼠取眼球血，离心取血清送医院检验科用仪器测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。如图1中B、C所示，模型组的转氨酶高于正常组，说明肝纤维化模型建立成功；治疗组转氨酶较模型组降低，其差异具有统计学意义(p<0.05)，提示苯妥英钠能改善肝纤维化；药物组与与正常组转氨酶无明显差异，提示该药物对肝脏无损伤。
(4)肝脏切片HE、Masson三色、苦味酸天狼猩红染色：正常组及药物组小鼠肝组织肝小叶完整，结构正常；而模型组小鼠肝组织汇管区周围见大量胶原沉积，汇管区和中央静脉之间见纤维间隔形成，肝小叶结构紊乱，相比之下，治疗组肝纤维化程度较模型减轻，如图2所示。表明苯妥英钠可降低小鼠肝脏中的胶原含量，减轻肝纤维化程度。
(5)肝脏切片通过免疫组化检测不同实验组组织中α-SMA的表达：如图3所示，正常组及药物组仅在肝门静脉和少量中央静脉边缘存在少量阳性表达，模型组汇管区及小叶内炎症坏死区周围及肝血窦壁内可见大量阳性表达，治疗组较模型组阳性表达量下降，其结果具有统计学意义(p<0.05)。
(6)利用Western blot检测不同实验组组织中α-SMA、LC3、P62的表达：与正常组相比，模型组肝组织中肝纤维化指标α-SMA和自噬相关指标LC3的表达升高，而P62的表达下降，治疗组较模型组比较肝纤维化指标α-SMA和自噬相关指标LC3的表达减低，而P62的表达升高，其差异具有统计学意义(p<0.05)，如图4所示。以上结果表明苯妥英钠可改善肝纤维化病变，其可能与自噬途径有关。
实施例2苯妥英钠的细胞实验
1.细胞水平验证苯妥英钠对肝纤维化的影响
1.1实验方法
(1)细胞培养：
1)复苏细胞：超净台用紫外灯照射30分钟后打开白光灯及循环气流，取一离心管，向其加入3mL培养基，迅速从-80℃冰箱中取出冻存的细胞，放入37℃恒温水浴锅中解冻，随后在超净台内吸出细胞加入准备好的离心管中，封口后放入离心机中离心5分钟(转速：1000rpm)，然后准备一培养瓶，标记好细胞名称及日期，离心完成后倒掉上清液，加入新的培养基吹得混匀，最后将混匀的细胞加入标记好的培养瓶中，用75％的酒精喷洒瓶身后放入恒温培养箱中培养。
2)细胞传代：将DMEM完全培养基、胰酶和无菌PBS放入超净台中，复温30分钟，打开白光灯和循环气流，点燃酒精灯，从培养箱中取出需要传代的细胞，倒掉培养基，加入无菌PBS清洗2次，然后弃去PBS，在瓶中加入1mL胰酶，放置在显微镜下观察，当细胞之间的间隔变大，细胞变圆时，立即倒掉胰酶，将3-5mL培养基加入瓶中使其停止消化，然后使用移液管吹打细胞，将其均匀地分装到新的培养瓶中，并在瓶子上标注出细胞的名称、传代次数和传代时间。最后用75％的酒精喷洒瓶身后放入恒温培养箱中继续培养。
3)细胞冻存：将所需试剂进行复温，从孵育箱中拿出需要冻存的细胞，加入无菌PBS清洗2次，然后弃去PBS，加入胰酶消化细胞，到一定程度时，将3-5mL培养基加入瓶中使其停止消化，然后使用移液管吹打细胞，将其转移至新的离心管内，进行离心，离心结束后，倒掉上清液，向离心管内加入0.5-1mL冻存液吹得混匀，最后将混匀液加入标记好的冻存管内，封口后放入-80℃冰箱内冻存。
(2)CCK-8实验
将状态良好的细胞进行消化，然后进行细胞计数，计数好浓度配比后取相应体积的细胞悬液及培养基制成实验所需的细胞浓度，将其充分混匀后加入96孔板中，根据实验要求给给予细胞不同的干预，48小时后在每个孔加入10％CCK8溶液(培养基与CCK8之间的比例为10:1)，放入孵育箱中继续培养1-4小时后，用酶标仪检测吸光度，最后将结果进行分析统计。
(3)Western-Blot实验：同实施例1动物实验。
1.2实验结果
(1)CCK8法检测苯妥英钠对肝星状细胞HSC增殖的影响，并计算IC50值：用CCK8法检测了苯妥英钠对肝星状细胞HSC增殖的影响，计算不同浓度的苯妥英钠对HCS细胞的增殖抑制率，最后计算出苯妥英钠对肝星状细胞的IC50值为234μM，如图5所示。
(2)CCK-8法检测苯妥英钠对TGF-β1诱导的HSCs的增殖影响：根据IC50值确定药物的浓度，选定PHT的浓度为200μM进行细胞水平的相关实验。用CCK8检测TGF-β1对HSCs增殖的影响，结果显示与正常组相比，TGF-β1刺激后促进了HSCs的增殖，而加入苯妥英钠后，TGF-β1促使的HSCs增殖受到了抑制，结果具有统计学意义(p<0.05)，如图6所示。
(3)利用Western blot检测不同实验组细胞中α-SMA、LC3、P62的表达：如图7所示，TGF-β1与苯妥英钠共同刺激组，与单独TGF-β1刺激组相比，共刺激组的α-SMA表达明显降低，且差异具有显著的统计学意义(p<0.05)。同时，Western-Blot实验的结果显示，较单独的TGF-β1刺激组相比，苯妥英钠和TGF-β1共同刺激下，自噬相关蛋白LC3的表达量显著下降，而自噬底物蛋白p62的表达量则显著上升，其差异具有显著的统计学意义(p<0.05)。这些结果表明TGF-β1可以促进HSC活化过程中自噬的发生，而苯妥英钠与TGF-β1的共培养可能阻碍HSC活化过程中的自噬发生，抑制HSC的活化，从而影响肝纤维化的发生发展。
(4)Western blot证实苯妥英钠逆转HSCs的活化是通过抑制自噬的发生：如图8所示，苯妥英钠与TGF-β1共培养HSCs后的α-SMA及自噬相关蛋白LC3的表达降低，P62的表达升高，而加入自噬激动剂雷帕霉素后，与加苯妥英钠及TGF-β1组相比，加雷帕霉素、苯妥英钠及TGF-β1组α-SMA及自噬相关蛋白LC3表达升高，而自噬底物蛋白P62的表达降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。表明加入自噬激动剂之后结果得到了恢复，说明苯妥英钠确实是通过调控自噬途径而影响肝星状细胞的活化，进而发挥改善肝纤维化的作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种通道阻滞剂在制备治疗和/或预防肝纤维疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述通道阻滞剂为钠通道阻滞剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述钠通道阻滞剂包括苯妥英钠。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝纤维疾病包括四氯化碳诱导的肝纤维疾病。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括粉剂、注射液、胶囊、片剂、口服液。
8.苯妥英钠在制备抑制肝组织自噬的药物中的应用。
9.苯妥英钠在制备抑制肝星状细胞增殖的药物中的应用。
10.苯妥英钠在制备下调肝细胞α-SMA的药物中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024041596A1 (zh) * | 2022-08-25 | 2024-02-29 | 杭州天玑济世生物科技有限公司 | 苯妥英钠作为线粒体自噬诱导剂的用途 |
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2023
- 2023-05-22 CN CN202310583492.0A patent/CN116492469A/zh active Pending
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