CN118203620A - 陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，同时还提供了陈皮水提物在制备胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。实验表明陈皮水提物具有良好的抗胃癌的作用，为临床上胃癌的治疗提供一个新手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用。
背景技术
胃癌是全球五大常见肿瘤之一，其致死率位列全球第三。临床上多以手术，放、化疗、分子靶向治疗等为主要治疗手段，但存在早期发现困难、副作用大、耐药和治疗费用昂贵等问题，因此需要寻找安全有效、副作用少的药物用于胃癌的治疗。
陈皮酵素浓缩汁是由陈皮、新会柑果肉、红枣、灵芝等成分发酵制得，将陈皮酵素浓缩汁离心后取上清，并用0.2μm的滤膜过滤，得到陈皮水提物。其中富含总黄酮、多糖、蛋白质、氨基酸等活性成分。大量研究表明，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗炎、心血管保护等生物活性。但关于陈皮水提物在抗胃癌中的应用还未见报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用。
本发明提供了陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
优选的，所述药物具有抑制胃癌细胞生长和/或迁移的药效。
优选的，所述抑制胃癌细胞生长包括抑制胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡；
优选的，所述促进胃癌细胞凋亡还包括诱导胃癌细胞早期凋亡。
本发明提供了陈皮水提物在制备胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
优选的，所述胃癌细胞生长抑制包括抑制胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡；
优选的，所述促进胃癌细胞凋亡还包括促进胃癌细胞早期凋亡。
优选的，所述胃癌细胞包括人胃癌细胞系BGC-823和/或SGC-7901细胞。
优选的，所述陈皮水提取物的分离方法，将所述陈皮酵素浓缩汁进行离心，收集上清液。
优选的，所述离心的转速为7500～8500rpm；所述离心的时间为8～12min；
所述离心的温度为3～5℃。
优选的，所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂包括含陈皮水提物的DMEM高糖培养基。
优选的，所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中陈皮水提物的体积百分含量为1％～5％。
本发明提供了陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。本发明以两种人胃癌细胞系(BGC-823和SGC-7901)为实验对象，分别测定了陈皮水提物对胃癌细胞的增殖、迁移和凋亡以及早期凋亡方面的影响，结果表明，所述陈皮水提物以剂量依赖性表现出抑制胃癌细胞的增殖、抑制胃癌细胞的侵袭和促进胃癌的凋亡，通过检测凋亡相关蛋白的表达量，陈皮水提物可以通过促进促凋亡蛋白的表达、线粒体内源性凋亡相关基因的表达来促进胃癌细胞系的凋亡。可见，所述陈皮水提物具有良好的抗胃癌的作用，为临床上胃癌的治疗提供一个新手段。
附图说明
图1为陈皮水提物抑制胃癌细胞增殖能力结果；
图2为陈皮水提物抑制胃癌细胞侵袭能力结果；其中，A：细胞侵袭能力检测结果；B：侵袭能力量化分析结果；
图3为陈皮水提物促进胃癌细胞凋亡结果；
图4为陈皮水提物促进胃癌细胞早期凋亡结果；
图5为陈皮水提物影响内源性凋亡途径相关蛋白表达，其中A：Western blot检测蛋白表达情况；B：BGC-823细胞蛋白结果量化分析；C：SGC-7901细胞蛋白结果量化分析。
具体实施方式
本发明提供了陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
在本发明中，所述陈皮水提取物的分离方法，优选将所述陈皮酵素浓缩汁进行离心，收集上清液。
在本发明中，所述陈皮酵素浓缩汁购自广东新宝堂生物科技有限公司。所述离心的转速优选为7500～8500rpm，更优选为8000rpm。所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min。所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。
在本发明中，所述药物具有抑制胃癌细胞生长和/或迁移的药效。所述抑制胃癌细胞生长优选包括抑制胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡。所述促进胃癌细胞凋亡还优选包括促进胃癌细胞早期凋亡。在本发明实施例中，在细胞水平上验证了陈皮水提物的抗胃癌的功效。具体的，用无血清基础培养基作为溶剂稀释陈皮水提物，得到1％、3％、5％的陈皮水提物溶液。所述无血清基础培养基为DMEM高糖培养基，购自Gibco。在细胞增殖测试实验中，与对照组比，1％～5％陈皮水提物溶液能显著抑制BGC-823和SGC-7901的增殖。在细胞侵袭能力测试实验中，与对照组比，1％～5％陈皮水提物溶液能显著抑制SGC-7901和BGC-823的侵袭能力。细胞凋亡测试实验中，陈皮水提物处理之后，细胞中凋亡小体数目增多，1％～5％陈皮水提物溶液能显著促进SGC-7901和BGC-823的凋亡。此外，本发明还采用Tunel染色法检测陈皮提取物对细胞早期凋亡的影响，结果表明随着陈皮水提物浓度(1％～5％)的增大，棕褐色颗粒逐渐增多，说明陈皮水提物可以促进胃癌细胞的早期凋亡。本发明通过Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达情况，结果表明1％～5％陈皮水提物溶液处理之后，抗凋亡蛋白BCL-2表达水平下调、,Active caspase-3/9、Caspase-8、cleaved PARP表达水平均显著上调，这也表明陈皮水提物可以通过线粒体内源性凋亡途径来促进胃癌细胞系的凋亡。
在本发明中，所述药物还包括医学上可接受的辅料。所述辅料包括填充剂、赋形剂、粘合剂和稳定剂等中的一种或几种。本发明对所述填充剂、赋形剂、粘合剂和稳定剂的种类不做特殊限制，采用本领域所熟知的辅料种类即可。
鉴于陈皮水提物具有良好的抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和早期凋亡以及抑制细胞侵袭的能力，本发明提供了陈皮水提物在制备胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
在本发明中，所述陈皮水提物的分离方法同上述技术方案，在此不做赘述。
在本发明中，所述胃癌细胞生长抑制优选包括以下至少一种：胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡和诱导胃癌细胞早期凋亡。所述胃癌细胞凋亡优选包括早期凋亡。所述细胞凋亡是指细胞主动死亡的过程，按照不同的分类方式可以分为坏死性凋亡、早期凋亡、细胞周期性凋亡、免疫性凋亡。其中早期凋亡是一种类似于自杀的死亡方式。所述胃癌细胞优选包括人胃癌细胞系BGC-823和/或SGC-7901细胞。
在本发明中，所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂优选包括含陈皮水提物的DMEM高糖培养基。所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中陈皮水提物的体积百分含量优选为1％～5％，更优选为3％。
下面结合实施例对本发明提供的陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人胃癌细胞系BGC(BGC-823)、SGC(SGC-7901)生长到对数生长期，胰酶消化下来离心，用血细胞计数板对细胞进行计数，调整细胞浓度，将BGC-823、SGC-7901分别按照2×103个、3×103个/孔接种于6孔板中。培养至贴壁后，用不同浓度的陈皮水提物(1％、3％、5％)处理，空白组更换新的完全培养基。第三天换液，共培养7天。7天后，弃去培养液，PBS洗2遍，4％多聚甲醛室温固定30min，PBS洗3遍，0.3％结晶紫4℃染色30min。PBS洗至无浮色，荧光显微镜观察并拍照。
实验结果如图1所示，1％、3％、5％处理BGC、SGC 24h可以明显抑制细胞的增殖，因此，陈皮水提物具有良好的抗胃癌细胞的作用。
实施例2
Transwell实验检测细胞侵袭能力
取对数生长期人胃癌细胞系BGC(BGC-823)、SGC(SGC-7901)经过消化离心制得细胞悬液，分别按照75万、50万/孔接种到6孔板，24h后加药处理，培养箱中培养一天后，消化得到细胞悬液，洗两次后用无血清培养基(含10％牛血清白蛋白)重悬细胞并计数，使细胞的密度为4×105/ml，取200μl接种于上室，在下室加入约600μl配制好的含10％FBS的完全培养基，然后将上室置于24孔板上，继续放入培养箱中培养约24h。用镊子小心取出上室，吸净上室残留液，用棉签轻轻擦拭上室内的细胞，转移到提前准备好的每孔约含600μl 4％多聚甲醛的的24孔板中，室温固定约30min。取出上室，吸净上室的残存液，转移至预先准备好含600μl 0.5％结晶紫的孔内，室温染色15～30min。轻轻用PBS缓冲液冲洗浸泡3次，除去未与细胞结合的结晶紫染液，取出小室，吸净上室液体，用湿棉签轻轻擦去上室，将非特异性结合于小室上表面的染料擦掉，以便后续镜检。适当风干后，荧光显微镜下随机选取6个位置拍照、观察细胞情况并统计结果。
结果如图2所示，陈皮水提物处理之后胃癌细胞侵袭能力明显降低。
实施例3
DAPI染色检测细胞凋亡
将人胃癌细胞系BGC(BGC-823)、SGC(SGC-7901)以20万个/孔的密度接种于6孔板，培养于24孔内。分别用不同浓度(1％、3％、5％)陈皮水提物处理细胞24h。吸出培养基，PBS清洗细胞，洗涤3次，每次5min。4％多聚甲醛，4℃固定30min。PBS清洗，洗涤3次，每次5min。每孔加入600μl的DAPI(1μg/ml)，室温孵育5min，避光。PBS清洗，洗涤2次，每次5min，用荧光显微镜观察。
结果如图3所示，陈皮水提物处理之后，细胞中凋亡小体数目增多，说明陈皮水提物可以促进胃癌细胞BGC、SGC凋亡。
实施例4
Tunel染色检测细胞早期凋亡
按实施例3记载的方法进行铺板，用不同浓度(1％、3％、5％)陈皮水提物处理24h，1ml PBS/孔洗细胞两次，4％多聚甲醛，4℃固定30min。PBS清洗，洗涤3次，每次5min。加入含0.3％TritonX-100的PBS，室温孵育5min，PBS洗两次。PBS配置的0.3％过氧化氢溶液室温处理20min，PBS洗三次。加入生物素标记液，37℃避光孵育60min。PBS洗一次，滴加200μl标记反应终止液，室温孵育10min，PBS洗三次。样品上加上50ul streptavidin-HRP工作液室温30min，PBS洗三次。滴加200μl DAB显色液，室温30min，PBS洗三次，荧光显微镜观察结果。
结果如图4所示，随着陈皮水提物浓度的增大，棕褐色颗粒逐渐增多，说明陈皮水提物可以促进胃癌细胞的早期凋亡。
实施例5
Westernblot检测细胞凋亡相关蛋白表达情况
按照240万/皿的接种量接种人胃癌细胞系BGC(BGC-823)、SGC(SGC-7901)，培养24h后用不同浓度(1％、3％、5％)陈皮水提物处理24h，按照细胞蛋白质提取方法进行蛋白质提取，并测量蛋白质浓度，用细胞裂解液调整细胞浓度，使同一细胞不同组之间蛋白浓度相同，加入6×loading buffer之后100℃金属浴变性10min，降至室温后冷冻保藏。按照WB方法进行蛋白质电泳，每孔上样量为12μl，80V电泳20min，120V电泳1h，利用湿转法进行转膜，脱脂奶粉封闭2h，TBST洗三次，孵育一抗，4℃过夜，TBST洗涤三次，孵育二抗，室温1h，TBST洗涤三次，加入显色液进行显影，用显影仪观察并拍照。
结果如图5所示，陈皮水提物处理之后，抗凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下调，Active caspase-3/9、Cleaved PARPcaspase8表达水平上调。由此可知，陈皮水提物可以通过促进促凋亡蛋白的表达、线粒体内源性凋亡相关基因的表达来促进胃癌细胞系的凋亡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.陈皮水提物在制备预防和/或治疗胃癌的药物中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物具有抑制胃癌细胞生长和/或迁移的药效。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述抑制胃癌细胞生长包括抑制胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡；
优选的，所述促进胃癌细胞凋亡还包括诱导胃癌细胞早期凋亡。
4.陈皮水提物在制备胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中的应用，所述陈皮水提取物是从陈皮酵素浓缩汁中分离得到。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述胃癌细胞生长抑制包括抑制胃癌细胞增殖和/或促进胃癌细胞凋亡；
优选的，所述促进胃癌细胞凋亡还包括诱导胃癌细胞早期凋亡。
6.根据权利要求2～5中任意一项所述应用，其特征在于，所述胃癌细胞包括人胃癌细胞系BGC-823和/或SGC-7901细胞。
7.根据权利要求1或4所述应用，其特征在于，所述陈皮水提取物的分离方法，将所述陈皮酵素浓缩汁进行离心，收集上清液。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述离心的转速为7500～8500rpm；所述离心的时间为8～12min；
所述离心的温度为3～5℃。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂包括含陈皮水提物的DMEM高糖培养基。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述胃癌细胞生长抑制剂和/或胃癌细胞凋亡诱导剂中陈皮水提物的体积百分含量为1％～5％。
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