CN107880143A

CN107880143A - 一种铁皮石斛多糖及其抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的新用途

Info

Publication number: CN107880143A
Application number: CN201710318425.0A
Authority: CN
Inventors: 刘京晶; 孙桂波; 张静宜; 郭英; 斯金平; 孙晓波
Original assignee: Zhejiang Senyu Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang A&F University ZAFU; Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Zhejiang Senyu Pharmaceutical Co ltd; Zhejiang A&F University ZAFU; Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-05-08
Filing date: 2017-05-08
Publication date: 2018-04-06

Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛多糖及其抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的新用途，包括以下将铁皮石斛提取、分离、纯化过程，其特征在于该多糖重均分子量（Weight‑average Molecular Weight，简写Mw）为951 kDa，数均分子量（Number‑average Molecular Weight，简写Mn）为789.0 kDa，分子量分散指数Mw/Mn为1.21，系均一多糖；该多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖按摩尔比2.13:1.34:1.00组成；该多糖对氧化应激引起的心肌细胞凋亡具有保护作用，具有潜在的抗心肌缺血再灌注活性，是一种具有心血管保护活性的多糖。由于本发明通过利用水提醇沉法制备铁皮石斛中的粗多糖，并应用DEAE‑纤维素和Sephadex G‑200进行精制和纯化，使所得的铁皮石斛多糖具有良好的活性效果，具有良好的新药开发和保健应用前景。

Description

一种铁皮石斛多糖及其抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的新用途

技术领域

本发明涉及一种铁皮石斛多糖及其在作为制备抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的用途，属于生物制药领域。

背景技术

心血管疾病具有高发病率和死亡率的特点，在全球各地都备受关注。最近研究表明心肌细胞凋亡参与各种心血管疾病的病理进程，此类心血管疾病包括冠心病、糖尿病性心肌病、动脉粥样硬化、心力衰竭等。研究表明氧化应激是导致心肌细胞凋亡的一种关键性的因素，所谓氧化应激即是活性氧（ROS）或者自由基生成过多而造成心肌细胞的毒性效应。ROS指一系列含氧的活性基团，包括超氧阴离子（O^{2 -}）、羟基自由基（OH·）和过氧化氢（H₂O₂）。细胞内异常积累的ROS可能会攻击细胞膜，细胞器以及一些诸如脂质、蛋白质和DNA的生物大分子，从而导致氧化应激损伤甚至细胞死亡。因此，寻求一种天然的抗氧化剂来调节细胞内产生的ROS以及抑制细胞凋亡可能对于心血管疾病是一个有效的治疗方案。

石斛（Dendrobium SW.）属作为兰科（Orchidaceae）最大的属，约有1200种植物，中国有63种，其中39种可以入药。早在2000多年前，我国已采用石斛治病，《神农本草经》、《本草纲目》等著作均有记载。石斛多分布于热带，亚热带，在中国的台湾，西南，华南地区均可发现石斛属的踪迹。铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)多产自浙江、云南等地，因表皮是铁绿色而得名，被称为石斛中的极品，由于其独特的生存环境以及极佳的滋补功能而成为“中华九大仙草”之首。铁皮石斛含有多糖、生物碱等多种活性成分，具有清热滋阴、延缓衰老、益胃生津等功效，现代药理研究显示它具有免疫增强、抗肿瘤和抗衰老等功效。近年来，对铁皮石斛多糖的研究逐渐增多，对其认识也逐渐深入，在植物化学成分分析及药理学方面的研究表明多糖类是铁皮石斛中含量、活性均较高的成分，铁皮石斛的药效，如抗肿瘤，抗衰老，降血糖以及免疫调节等均与多糖类成分有着密不可分的关系。

很长一段时间内，传统化学和药理对中药的研究重点主要集中在中药的醇溶性小分子化合物，其实水溶性的多糖也是中药的有效组成部分。自1970年以来，已有大量关于多糖生物功能的研究。有研究证明多糖除了具有较高的营养价值还有许多药理特性，抗氧化作用便是其中最主要的生物活性之一，多糖因其低毒性具有巨大的发展潜力。然而铁皮石斛中均一多糖用于减弱H₂O₂诱导的氧化损伤来减少心肌细胞凋亡的研究尚未见报道。研究铁皮石斛在抗心肌缺血再灌注损伤及抗心肌细胞凋亡方面的应用，可进一步开拓在抗心肌缺血再灌注损伤方面的药物来源。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种铁皮石斛多糖及其在抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的新用途。

本发明是通过下述方式实现的：一种铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖的Mw为951 kDa，Mn为789.0 kDa，Mw/Mn为1.21；由葡萄糖、半乳糖、甘露糖按摩尔比2.13:1.34:1.00组成。

所述的铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖来源于铁皮石斛的干燥茎。

所述的铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖是一种铁皮石斛经水煮后用乙醇纯化的提取物。

一种铁皮石斛多糖作为制备抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的用途。

所述的铁皮石斛多糖通过对内源性PI3K/AKT、MAPK信号通路的有益调控作用，成为抗心肌缺血再灌注损伤保护的潜在药物。

铁皮石斛多糖通过对内源性PI3K/AKT、MAPK信号通路的有益调控作用，对氧化应激引起的心肌细胞凋亡发挥保护作用，具有成为抗心肌缺血再灌注损伤保护的潜在药物。为实现适度、可控的抗氧化治疗开辟了新途径，并成为从抗氧化应激角度探寻抗心肌缺血再灌注损伤保护药物的新靶标。

附图说明

图1、铁皮石斛多糖对细胞活力的影响；

图2、铁皮石斛多糖在H9c2心肌细胞LDH水平的影响；

图3、铁皮石斛多糖对H9C2细胞ROS水平的影响；

图4、铁皮石斛多糖对 MDA表达水平的影响；

图5、铁皮石斛多糖对GSH-Px表达水平的影响；

图6、铁皮石斛多糖对SOD H9c2细胞表达水平的影响；

图7、铁皮石斛多糖对CAT表达水平的影响；

图8、铁皮石斛多糖对线粒体膜电位 JC-1染色的影响；

图9、铁皮石斛多糖对半胱天冬酶活性的影响；

图10、铁皮石斛多糖预处理对细胞凋亡相关蛋白表达的影响；

图11、铁皮石斛多糖和H₂O₂对PI3K/Akt信号的影响。

具体实施方式

铁皮石斛多糖提取：铁皮石斛植株的干燥茎粉碎后，称取一定量工业乙醇浸泡后的铁皮石斛粗粉，加入10倍量水煎煮（2.5 h×4次），纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至适当体积。用4倍体积乙醇沉淀，离心后弃去上清液，沉淀用去离子水溶解，再用4倍体积乙醇沉淀，反复3次，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥。

脱蛋白：配置浓度为1%的粗多糖水溶液，将粗多糖溶液和Sevag试剂[氯仿：正丁醇=4:1（V/V）]，按体积比4:1混合，变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处，离心去除上清液，直至液面交界处无胶状物，透析，冷冻干燥得粗多糖。

DEAE-纤维素柱色谱分离、Sephadex G-200柱色谱纯化：将粗多糖溶于水，过DEAE-纤维素柱色谱，用水洗脱，用苯酚硫酸法检测馏分的吸光度值，绘制洗脱曲线，收集吸光度值高且集中的馏分，合并、浓缩、冷冻干燥；将该组分溶于水，过Sephadex G-200柱色谱，用水洗脱，绘制洗脱曲线，合并高峰部分，浓缩、透析、冷冻干燥，得铁皮石斛多糖，简称为DOP-GY。

铁皮石斛多糖的初分离，采用DEAE-纤维素柱色谱法。合并收集DEAE-纤维素柱色谱洗脱馏分24-52（图1）。

铁皮石斛多糖结构的单糖组成分析，结果为葡萄糖、半乳糖、甘露糖的摩尔比为2.13:1.34:1.00（图2）。

细胞试验材料：铁皮石斛多糖直接以DMEM配制成需要浓度。

细胞株：大鼠心肌细胞H9c2，购于中国科学院细胞库。

主要溶液的配制：DMEM 培养基：按照说明书，一份培养基应加入加入600ml三蒸水，3.7g NaHCO3 ，终浓度为100U/ml的青霉素和链霉素，然后充分搅拌溶解，并定容至1L，将pH值调为7.0-7.2，最后用0.22 µm 滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用。

胎牛血清：应放于-20℃保存备用，每次临用前解冻加入DMEM 培养基，分装操作都需在无菌条件下进行。

PBS 溶液：1000mlPBS溶液的配方为：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4•12H2O 3.48g、KH₂PO₄ 0.2g，溶于三蒸水，用0.22pm滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用。

0.125% 胰酶溶液：100ml 0.125% 胰酶溶液的配方为：胰酶 0.125g、NaCl 0.8g、KCl 0.04g、NaHCO30.058g、EDTA 0.02g、葡萄糖 0.1g，溶于三蒸水并充分搅拌，0.22pm 滤器过滤除菌，置于4℃冰箱备用。

MTT溶液：现用现配，用PBS配成5 mg/ml的储存液，4℃冰箱避光保存，备用 1 周。

过氧化氢：向DMEM 培养基加入l3%的过氧化氢，使终浓度为200µM。

细胞试验方法

心肌细胞培养：

取出冻存在液氮罐中的H9c2心肌细胞，将其放入预热至37 ℃的水浴锅中快速解冻，然后在无菌条件下将H9c2心肌细胞转移到含有4mL培养液（含15%胎牛血清）的离心管中，1000rmp离心5min。弃去上清，用新培养基将细胞重悬，并移至培养瓶中培养，存放条件为 37℃，含5% CO 2的细胞培养箱，24h后更换培养基。

当细胞贴壁生长达80%-90%，将上层培养液弃去，加PBS冲洗一遍，然后用2ml0.125%的胰酶消化贴壁的细胞，时间为2min，期间不断观察细胞状态，细胞变圆便可终止消化，即加入2 ml DMEM完全培养液，并将细胞吹打成单个细胞悬液，移至离心管中，1000 rmp离心5min。弃去上清，加入新培养基将细胞重悬，按1：2 的比例分配，将细胞移入细胞培养瓶中，并置于37℃，CO2培养箱中培养。

冻存前24h应换液，选择对数期的细胞，将上层培养液弃去，加PBS冲洗一遍，然后用0.125%的胰酶消化贴壁的细胞，时间为2min。离心弃去上层酶液，加入1mL配好的冻存液（10%DMSO+90%完全培养液），做好标记密封，4℃条件放置10 min，-20℃条件放置30 min，然后-80℃冰箱过夜，最后转移至液氮中，可以长久保存。

将消化后的细胞悬液稀释一定倍数后滴加到细胞计数板上（确保细胞密度高于10 4 个/mL，若细胞数少，应离心并重悬于少量培养液中增大细胞密度，再重新计数），将细胞计数板插入计数仪直接进行计数即可，然后重新选择计数区域如此操作3-4次并取均值。按以下公式计算细胞密度：

细胞悬液的细胞数/mL＝细胞均数×稀释倍数。

实验分组：空白对照组：用无血清培养液处理14h。

过氧化氢模型组：在无血清培养基中培养12h后，加入终浓度为200 µM H₂O₂作用2h。

铁皮石斛多糖单加药组：在含有铁皮石斛多糖终浓度为25µg/mL 的DMEM 培养液中处理12h后,在无血清培养基中培养2 h。

铁皮石斛多糖低剂量处理组：含有铁皮石斛多糖终浓度为6.25µg/mL 的DMEM 培养液中预处理12h后，小心除去上层含药培养液，加入终浓度为200 µM H₂O₂作用2 h。

铁皮石斛多糖中剂量处理组：在含有铁皮石斛多糖终浓度为12.5µg/mL 的DMEM培养液中预处理12h后，小心除去上层含药培养液，加入终浓度为200 µM H₂O₂作用2 h。

铁皮石斛多糖高剂量处理组：在含有铁皮石斛多糖终浓度为25µg/mL 的DMEM 培养液中预处理12h后，小心除去上层含药培养液，加入终浓度为200 µM H2O2作用2 h。

MTT法检测细胞活力：取对数生长期的细胞稀释成1×10 4 个/孔的密度，将其接种于96 孔板中，在37℃、5% CO₂的培养箱中培养 36 h 后，进行以上实验处理。处理结束后，每孔加入20 µl 5 mg/ml MTT溶液，在37℃条件下孵育4 h后小心移去上层培养液，然后每孔中加入100µl DMSO，放于微孔板震荡器上震荡10min，最后在微孔板扫描酶标仪测560nm处吸光度值（OD值）。将各测试孔OD值减去本底OD值（无血清培养基加 MTT，无细胞），根据各孔OD值计算平均值±SD：

细胞存活率%=（加药细胞OD值—本底OD值）/（对照细胞OD值—本底OD值）×100% 。

LDH活性的测定：H9c2细胞按分组要求处理结束后，收集细胞培养液及细胞，然后根据试剂盒说明书检测LDH活性。

MDA含量的测定：H9c2细胞按分组要求处理结束后，收集细胞培养液及细胞，然后根据试剂盒说明书检测MAD活性。

SOD活性的测定：H9c2细胞按分组要求处理结束后，收集细胞培养液及细胞，然后根据试剂盒说明书检测SOD活性。

GSH-Px活性的测定： H9c2细胞按分组要求处理结束后，收集细胞培养液及细胞，然后根据试剂盒说明书检测GSH-Px活性。

CAT活性的测定：H9c2细胞按分组要求处理结束后，收集细胞培养液及细胞，然后根据试剂盒说明书检测CAT活性。

流式细胞术检测铁皮石斛多糖对H₂O₂致心肌细胞凋亡的影响：按上述实验分组进行操作，接种细胞生长36 h后接受各种处理。实验结束后，用胰酶消化并收集细胞，用冷PBS洗细胞。配制1×Annexin V-FITC结合缓冲液，100 µg/ml PI工作液。1000 rpm离心5 min，弃上清，将细胞重悬于1×Annexin V-FITC结合缓冲液（细胞计数，将细胞密度用1×Annexin V-FITC 结合缓冲液调整至 1×106个/ml）。加5µlAnnexin V-FITC 和 1µl 100 µg/ml PI 工作液至每 100 µl 细胞悬液中，室温孵育15min，加 400 µl1×Annexin V-FITC结合缓冲液，轻轻混匀。300目筛网过滤即可上机检测。

流式细胞术检测铁皮石斛多糖对线粒体膜电位变化的影响：按上述同样方法进行细胞处理后，用胰酶消化并收集细胞。1000 rpm离心5 min，用 1 ml DMEM 培养液洗细胞一次，重新加入1 ml DMEM培养液，进行细胞计数。加入JC-1染料使终浓度为2 µM，37℃避光染色30 min。1000 rpm离心5 min去除多余染料，加入2 ml PBS 清洗细胞一次。重悬于500µl PBS，300目筛网过滤后上机检测。

流式细胞术检测铁皮石斛多糖对细胞内 ROS 水平的影响：按上述同样方法进行细胞处理后，将培养液弃掉，用清洗液洗细胞两次，弃上清。加500 µl胰酶消化1 min，加含血清DMEM 使消化终止。1000 rpm离心5 min，加 1ml 清洗液洗细胞。配制ROS检测溶液，将各管细胞重悬至500 µl检测溶液中。37℃避光染色30 min，检测前不需要洗细胞，300目筛网过滤后上机检测。

流式细胞术检测铁皮石斛多糖对 Caspase-3 活性的影响：按上述同样方法进行细胞处理后，用胰酶消化并收集细胞。加入 1 ml PBS，细胞计数，将细胞重悬至 DMEM 使细胞密度为 1×106个/ml，各样本取 300µl 至新管中。加入 1µl FITC-DEVD-FMK，37℃避光染色 1 h，3000 rpm离心5 min，弃上清。用500µl 清洗缓冲液洗细胞两次，3000 rpm离心5min，弃上清，将细胞重悬至 500µl 清洗缓冲液中，冰上放置，300目筛网过滤后上机检测。

荧光分光光度法检测铁皮石斛多糖对 Caspase-9活性的影响。细胞处理同前。实验结束后，用胰酶消化并收集细胞。将细胞重悬至 5 ml EP 管中，加入 1ml PBS，细胞计数。每组取出1×105 个细胞，转移至 1.5 ml EP 管中，1000 rpm离心5 min。每管加入50 µl 细胞裂解液，冰上孵育 10 min。每管中加入 50 µl 含有 DTT 的 2×缓冲液（3 µl DTT加至 300µl 2×缓冲液中），加入 5 µl LEHD-AFC，37℃孵育 1.5 h。将各管中的液体转移至 microtiter 中，上机检测。

Western blot检测铁皮石斛多糖对凋亡相关蛋白表达的影响：细胞处理同前。实验结束后，用胰酶消化并收集细胞，使每组1×10 6个细胞。在蛋白抽提试剂中加入适量蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF），使其终浓度为 1 mM。在细胞中加入适量蛋白抽提试剂，吹打均匀后，冰上放置 20 min，让细胞充分裂解。14000rpm 离心 15 min。转移上清至预冷的EP管中，-80℃备用。根据试剂盒说明书操作，提取细胞总蛋白及进行BCA定量。

线粒体蛋白及细胞浆蛋白的分离：细胞处理同前。实验结束后，用胰酶消化并收集细胞。用预冷的PBS重悬细胞，4℃600rpm 离心5 min，弃上清。加入 1-2.5 ml 临用前加入了PMSF的线粒体分离试剂至细胞中，轻轻悬浮细胞，冰上放置10-15 min。把细胞悬液转移至玻璃匀浆器中，匀浆10-30下。细胞匀浆4℃600rpm 离心5 min。小心将上清转移至另一离心管中，4℃1100rpm 离心10 min，小心去除上清，沉淀部分即为分离得到的细胞线粒体。在分离的线粒体中加入临用前添加了 PMSF 的线粒体裂解液裂解线粒体。用BCA法测定蛋白浓度后用于Western blot分析。

电泳：参照常规电泳方法进行。电泳结束后，将凝胶取出，裁成合适的大小，放置在转膜缓冲液中平衡。

转膜：按照胶的大小裁NC膜和滤纸并将其浸在转膜缓冲液中平衡5 min以上。

将样品胶与膜装入标有正负极的转膜夹板中：由阴极开始，依次放置海绵垫片、三层滤纸、样品胶、NC 膜、三层滤纸、海绵垫片。操作时应不断赶去出现的气泡，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转膜电泳槽中，电泳槽周围放置冰块保持低温。

恒压状态下，100 v 转膜 1 h。

转膜结束后，取出NC膜，在1×TBST液中漂洗两次。将膜放入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST溶液）中，室温封闭2 h。

一抗孵育：一抗用封闭液稀释相应倍数，将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃过夜。

二抗孵育：将膜放入平皿中，用1×TBST漂洗三次，每次10 min。随后将膜放入按比例稀释好的二抗工作液中，室温孵育2h。

显影：二抗孵育结束后，用1×TBST 漂洗三次，每次10 min。将增强型化学发光检测底物工作液（增强型发光剂和稳定剂1:1等体积混合）滴加在膜上，室温孵育5 min。显色后进行扫描。

统计学分析：所有计数资料均采用均数±标准差（mean±SD）表示，使用统计软件SPSS11.5进行统计分析，以单因素方差分析（One-WayANOVA ）方法进行比较，以 P<0.05为有统计学显著性差别。

实验结果：H9c2细胞经不同浓度铁皮石斛多糖预孵12h后在200 µM H₂O₂下作用2h，然后通过MTT试验检测铁皮石斛多糖对H₂O₂引起H9c2心肌细胞损伤的保护作用。由图1明显可以看出，200 µM H₂O₂作用2 h后H9c2心肌细胞的存活率明显下降，然而在铁皮石斛多糖低剂量（6.25μg/mL），中剂量（12.5 μg/mL）和高剂量（25 μg/mL）的作用下，H9c2心肌细胞的存活率依次提高了76.0±4.6%，81.7±4.6%，83.0±5.4%。表明铁皮石斛多糖预孵育对H₂O₂致H9c2心肌细胞损伤有一定的保护作用。

LDH会因细胞膜的破裂而漏出，所以LDH漏出可作为细胞损伤的一种检测指标。由图2所示，200 µM H₂O₂作用2 h后造成大量LDH漏出，但是经不同浓度铁皮石斛多糖预孵育，LDH漏出显著降低。由此表明，铁皮石斛多糖可以保护由氧化应激诱导的H9c2心肌细胞的死亡。

流式细胞术可对细胞内ROS水平的变化进行分析。由图3明显可以看出，200 µMH₂O₂作用2 h后使细胞内ROS水平增加，经铁皮石斛多糖预孵育则可显著降低由H₂O₂诱导产生的ROS。因此，铁皮石斛多糖可通过抑制H₂O₂诱导H9c2心肌细胞内ROS水平的增高来保护H9c2心肌细胞。

MDA是细胞膜脂质过氧化过程中的一种降解产物，即可通过检测MDA的含量来判断氧化性损伤的程度。由图3所示，200 µM H₂O₂作用2 h后MDA的含量明显升高，而经不同浓度铁皮石斛多糖预孵育则可使MAD的含量降低。此外，SOD，CAT和GSH-Px即内源性抗氧化酶的活性在H₂O₂作用下显著降低（图5至图7），但经铁皮石斛多糖预孵育则可使内源性抗氧化酶活性得以提高。由此表明，铁皮石斛多糖可以减轻氧化性损伤，增强内源性抗氧化酶的活性。

线粒体膜电位的下降在氧化应激引起的细胞凋亡中起着至关重要的作用，JC-1是一种检测线粒体膜电位的荧光探针，常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体膜电位变化的比例。与之前的结果一致，铁皮石斛多糖预孵可以升高由H₂O₂诱导的线粒体膜电位的下降，（见图8至图9）。因此，铁皮石斛多糖的抗凋亡作用可能与其稳定线粒体功能有关。

一系列与凋亡相关的细胞和生化改变的事件的调节都与Caspase密切相关，尤其是 caspase-3被视为诸如H₂O₂的氧化剂诱导细胞凋亡的引发剂。由图11表明，H₂O₂作用后活化的 caspase-3，-9 水平显著提高，然而铁皮石斛多糖预孵育可以降低caspase-3,-9的催化活性，说明铁皮石斛多糖降低H₂O₂诱导产生的凋亡可能与caspases 级联反应有着紧密的联系。

为了更好地理解与铁皮石斛多糖抗凋亡功能相关潜在的信号通路，我们通过蛋白质印迹分析来检测凋亡相关蛋白的表达。正如图10中显示，H₂O₂作用导致抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax的表达增加，这两种蛋白是Bcl-2家族中用于调节线粒体外膜通透性的常见的蛋白，铁皮石斛多糖预孵育则可以升高 Bcl-2/Bax 比例。此外，与凋亡相关的另一蛋白pro-caspase-3的表达水平因H₂O₂作用降低，铁皮石斛多糖预孵育后使其得以一定的恢复。Bcl-2家族中另一重要的抗凋亡蛋白Bcl-xl较于H₂O₂的作用，在铁皮石斛多糖的预孵育条件下表达水平也得以提高。

PI3K/AKT信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态,在细胞内发挥着抑制凋亡、促进生存的关键作用。本研宄通过wstem blot蛋白印记法分析了铁皮石斛多糖对PI3K/AKT信号通路的影响，实验结果如图6所示，心肌细胞H₂O₂处理后可引起PI3K、p-AKT的显著减低，铁皮石斛多糖预孵育则使PI3K、p-AKT的表达呈浓度依赖性增加，这一结果表明铁皮石斛多糖能够引起AKT生存通路的激活。

MAPK家族包括ERK1/2，JNK和P38三个主要亚家族，为了确定MAPK信号通路是否在H/R损伤过程中被激活，我们首先采用Western blot蛋白印记法检测了ERK1/2，JNK和P38的磷酸化水平。实验结果如图11所示，H₂O₂处理后可引起ERK磷酸化水平显著下降，相反，H₂O₂处理后能够引起缺氧诱导的JNK和P38磷酸化的进一步增强。而铁皮石斛多糖预孵育则翻转这种趋势。此结果表明铁皮石斛多糖能够引起MAPK通路的激活。

铁皮石斛多糖具有明显的心脏保护作用。对于经H₂O₂作用的H9c2心肌细胞，铁皮石斛多糖的预处理能有效的中和ROS的产生，增加MDA， GSK-PX 和CAT抗氧化酶的活性。此外，它还阻止了LDH泄漏和MDA生成，这两项内容是氧化应激损伤中的重要指标。基于以上结果，铁皮石斛多糖的心脏保护作用可能是通过其活性氧清除剂的作用来上调抗氧化酶活性来实现的。

相关研究表明，过度ROS的表达引起线粒体膜去极化，线粒体膜电位下降，从而改变线粒体通透，释放线粒体内部促凋亡蛋白，最终导致内源性（线粒体）通路引起的细胞凋亡。研究显示H₂O₂导致的 H9c2 心肌细胞的死亡属于凋亡性死亡。细胞凋亡的启动依赖于caspases的激活，caspases即一类天冬氨酸-特异性的半胱氨酸蛋白酶，在调节由一些刺激因素如氧化应激引发的细胞凋亡的两种信号通路中起着至关重要的作用。caspases-3被认为是细胞凋亡的推动者，据报道，caspases-3可能由线粒体通路中的caspases-9激活。相关报道显示，在H₂O₂作用后的H9c2心肌细胞中caspases-9活性明显提高，这表明线粒体通路在H₂O₂诱导的细胞凋亡中发挥了重要的作用。

在我们的研究中，H₂O₂会引起线粒体膜的去极化以及线粒体膜电位的下降，然而皮石斛多糖的预处理减轻了线粒体的损伤，抑制了由H₂O₂引起的caspases-3和caspases-9活性的升高。我们发现铁皮石斛多糖可以影响具有线粒体通透性调节作用的Bcl-2家族蛋白的表达，比如，抗凋亡蛋白Bax以及促凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL。众所周知，Bcl-2家族蛋白与caspases级联反应激活有着密切的联系，更重要的是细胞凋亡的阈值可能与 Bcl-2 /Bax的比值具有相关性。实验结果表明，与单独作用H₂O₂相比，铁皮石斛多糖与H₂O₂联合使用增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，减少了促凋亡蛋白Bax的表达。基于以上结果，我们猜测铁皮石斛多糖的心脏保护作用与调节线粒体功能，维持Bcl-2和Bax平衡以及抑制caspases级联反应相关，从而抑制促凋亡因子从线粒体膜间隙释放到细胞质中。

许多研究认为PI3K/Akt和MAPK通路的激活可以抑制H9c2细胞凋亡，增强心肌细胞的存活率。研究还显示，PI3K/Akt通路在减少凋亡性损伤以及ROS产生中发挥了重要作用。Akt可以直接使磷酸化Bad，它能刺激目标蛋白质释放Bad。我们通过免疫印迹分析可得，AKT的磷酸化水平和PI3K表达由于H₂O₂的作用明显减少，而较之H₂O₂组铁皮石斛多糖预孵育能显著地增加PI3K水平，激活AKT的磷酸化。以上结果表明，铁皮石斛多糖的抗凋亡作用与PI3K/Akt通路的激活相关。

此外，MAPK信号通路被氧化应激作用诱导，在细胞增殖、分化和死亡中发挥着重要的功能。MAPK通路包括三种主要的信号因子：ERK1/2，p38 MAPK，JNK/ SAPK。先前的研究表明，H₂O₂作用会引起H9c2细胞中ERK，JNK和 p38的激活。我们的实验数据表明，铁皮石斛多糖可以减少由于H₂O₂作用引起的p38和JNK

的磷酸化，增强p-ERK1/2的活性。因此，铁皮石斛多糖抑制了由于H₂O₂作用引起的细胞凋亡，至少部分通过MAPK信号通路的调节。

综上所述，实验结果表明铁皮石斛多糖这种从铁皮石斛中提取的多糖成分，通过减少ROS生成，强化抗氧化酶系统，维持线粒体功能和调节凋亡蛋白表达如caspase-3，Bax和Bcl-2，PI3K/Akt和MAPK信号通路激活途径保护H9c2心肌细胞免受氧化应激损伤。

Claims

1.一种铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖的Mw为951 kDa，Mn为789.0kDa，Mw/Mn为1.21；由葡萄糖、半乳糖、甘露糖按摩尔比2.13:1.34:1.00组成。

2.如权利要求1所述的铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖来源于铁皮石斛的干燥茎。

3.如权利要求1所述的铁皮石斛多糖，其特征在于所述的铁皮石斛多糖是一种铁皮石斛经水煮后用乙醇纯化的提取物。

4.一种铁皮石斛多糖作为制备抗心肌缺血再灌注的药物制备方面的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的铁皮石斛多糖通过对内源性PI3K/AKT、MAPK信号通路的有益调控作用，成为抗心肌缺血再灌注损伤保护的潜在药物。