CN109498644A - 中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用。本发明通过研究发现，硫酸化党参多糖能够保证H2O2刺激后巨噬细胞的生长形态和及其各项检测指标与正常情况无明显差异，特别是巨噬细胞中的丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧物酶含量在正常水平，对于由H2O2刺激引发的哺乳动物应激性氧化损伤具有很好的预防和/或治疗作用，在兽医临床应用上具有重要的价值。

Description

中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用
技术领域
本发明涉及动物抗氧化药物技术领域，更具体地，中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用。
背景技术
氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子自由基产生过多，氧化程度超出氧化物清除能力，氧化系统和抗氧化系统动态失衡，从而导致组织损伤。在畜牧业生产链条中，因集约化养殖、营养不良、饲料发酵、长途运输及极端环境等因素引起的氧化应激，影响养殖业的发展，造成巨大的经济损失。为了解决氧化应激导致的生产问题，外源抗氧化剂的研究得到广泛开展。
中药多糖因具有改善机体免疫功能、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗衰老等广泛的生物活性，且具有绿色天然、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，受到国内外学者的广泛研究，成为兽医领域研究的热点。
大量研究表明，许多中药及其有效成分具有一定的抗氧化作用，但是由于成分复杂，质量难以控制，因此中药的抗氧化作用较弱，此效果并不理想。由此，现有的研究表示可以通过分离具有活性作用的多糖进行使用，且在此基础上，还可以通过多种方式提高分离得到的多糖的活性，以便充分发挥中药多糖的应用和价值。党参多糖因具有改善机体免疫功能、抗病毒、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗衰老等广泛的生物活性，且具有绿色天然、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，受到国内外学者的广泛研究。而最近的研究证实，硫酸化修饰多糖有助于提高多糖的活性。但目前还未有关于硫酸化党参多糖用于抑制和/或修复H2O2导致的氧化损伤的报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用。本发明通过中药硫酸化党参多糖对H2O2刺激下的巨噬细胞氧化损伤后的抗氧化相关指标的一系列检测，发现硫酸化党参多糖对于H2O2导致的巨噬细胞氧化损伤具有很好的预防和/或修复作用，由此筛选出一种安全、有效、质量可控、在兽医临床有应用前景的抗氧化中药硫酸化党参多糖。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
本发明提供了中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用。
优选地，所述中药硫酸化党参多糖在抑制和/或修复H2O2导致的氧化损伤中的应用。
优选地，所述中药硫酸化党参多糖在抑制和/或修复H2O2导致的巨噬细胞氧化损伤中的应用。
优选地，所述中药硫酸化党参多糖可降低经H2O2刺激后巨噬细胞中丙二醛的含量。
优选地，所述中药硫酸化党参多糖可维持经H2O2刺激后巨噬细胞中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧物酶酶活在正常水平。
优选地，所述抗氧化剂的剂型为粉剂、丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或糖浆剂。
更优选地，所述丸剂为大蜜丸、小蜜丸、水丸、浓缩丸或微丸。
优选地，所述硫酸化党参多糖是先将党参中提取的多糖经sevage法纯化，再经氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰得到。
更优选地，所述硫酸化党参多糖的制备过程如下：
采用水煎醇沉法从党参饮片中提取党参总多糖，再采用sevage法去除多糖中的蛋白质、DEAE-52纤维素柱纯化，冷冻干燥，得到纯化多糖；采用氯磺酸-吡啶法对纯化多糖进行硫酸化修饰，并优化修饰工艺条件，修饰后的多糖经透析纯化，冷冻干燥，制得硫酸化党参多糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现，硫酸化党参多糖能够保证H2O2刺激后巨噬细胞的生长形态和及其各项检测指标与正常情况无明显差异，特别是巨噬细胞中的丙二醛、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧物酶含量在正常水平，对于由H2O2刺激引发的哺乳动物应激性氧化损伤具有很好的预防和/或治疗作用，在兽医临床应用上具有重要的价值。
附图说明
图1为实施例3中空白对照组、模型对照和VC对照组的细胞状态观察图。
图2为实施例3中CPL、CPM和CPH处理组的细胞状态观察图。
图3为实施例3中SCPL、SCPM、SCPH处理组的细胞状态观察图。
图4为实施例3中各处理组中细胞中ROS百分比的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
硫酸化党参多糖的制备过程如下：
采用水煎醇沉法从党参饮片中提取党参总多糖，再采用sevage法去除多糖中的蛋白质、DEAE-52纤维素柱纯化，冷冻干燥，得到纯化多糖。采用氯磺酸-吡啶法对纯化党参多糖进行硫酸化修饰，并优化修饰工艺条件，修饰后的多糖经透析纯化，冷冻干燥，制得硫酸化党参多糖，用苯酚-硫酸法和超声酸性铬酸钡法进行测定，制备得到的党参多糖中多糖质量占比为66.30%，硫酸根质量占比为34.48%。
实施例2
1、试验方法
测试细胞：巨噬细胞。
将处于对数生长期的细胞浓度调至5×104个/mL加入96孔板，每孔100 μL，贴壁培养24 h后加入不同浓度的党参多糖（党参多糖处理组）及硫酸化党参多糖（硫酸化党参多糖处理组）100 μL，另设空白对照组、模型对照组及阳性对照组（VC对照组），继续培养24 h后，然后各组分别加入终浓度为12.5 mmol/L的H2O2培养1 h，加入MTT 30 μL继续培养4 h，去上清液，加入DMSO 100 mL，摇匀，酶联免疫仪检测A 570 值进行筛选药物对于巨噬细胞的安全浓度范围。
其中空白对照组为添加10%胎牛血清的DMEM培养液，不添加H2O2溶液；模型对照组为仅添加终浓度为12.5 mmol/L的H2O2溶液；阳性对照组为添加100μL 的VC。
通过检测结果的比较，发现党参多糖处理组中，当党参多糖的添加浓度在2-5～2-3mg/mL时，对巨噬细胞H2O2氧化刺激损伤保护作用最优；同样地，硫酸化党参多糖处理组中，当硫酸化党参多糖的添加浓度在2-7～2-5 mg/mL时，对巨噬细胞H2O2氧化刺激损伤保护作用最优；因此，选择这一浓度范围进行进一步的研究。
实施例3
以实施例2测试的浓度范围进一步研究硫酸化党参多糖对于在H2O2刺激下巨噬细胞的生长状态观察。
测试方法：
将处于对数生长期的细胞浓度调至5×104个/mL加入96孔板，每孔100 μL，贴壁培养24h后加入不同浓度的硫酸化党参多糖（硫酸化党参多糖处理组），另设空白对照组、模型对照组、党参多糖对照组、阳性对照组（VC对照组），继续培养24 h后，加入终浓度为12.5 mmol/L的H2O2培养1 h，置于倒置显微镜下，分别于250×及400×倍下观察细胞的生长状态。
其中空白对照组为添加10%胎牛血清的DMEM培养液，不添加H2O2溶液；模型对照组为仅添加终浓度为12.5 mmol/L的H2O2溶液；阳性对照组为添加100 μL的VC；党参多糖对照组分为高、中、低浓度组，即CPH、CPM和CPL对照组，其党参多糖添加的浓度分别为2-3、2-4及2-5mg/mL；硫酸化党参多糖处理组分为高、中、低浓度组，即SCPH、SCPM、SCPL处理组，其硫酸化党参多糖添加的浓度分别为2-5、2-6及2-7mg/mL。
各处理组的巨噬细胞的生长状态图如图1～3所示，其中图1为空白对照组、模型对照和VC对照组的观察结果；图2为CPL、CPM和CPH处理组的观察结果；图3为SCPL、SCPM、SCPH处理组的观察结果。从图1中可知空白对照组细胞生长状态良好，贴壁性好，个别细胞有轻微分化，细胞密度大，局部细胞发生叠层；模型对照组细胞贴壁不良，大部分细胞发生完全分化，细胞密度低，培养液中略微存在细胞碎片漂浮，表明H2O2对于巨噬细胞进行了氧化刺激，产生了明显的氧化损伤。除模型对照组及CPL对照组之外，其余各组生长状态均与空白对照组相似，表明党参多糖、硫酸化党参多糖和VC对于巨噬细胞的氧化损伤均有抗氧化保护作用，其中显微镜观察下，硫酸化党参多糖及VC抗氧化作用较好。
实施例4 硫酸化党参多糖对巨噬细胞损伤的抗氧化指标测定
测试方法：
将处于对数生长期的细胞浓度调至5×104个/mL加入96孔板，每孔100 μL，贴壁培养24h后加入不同浓度的硫酸化党参多糖（硫酸化党参多糖处理组），另设空白对照组、模型对照组、党参多糖对照组、阳性对照组（VC对照组），继续培养24 h后，加入终浓度为12.5 mmol/L的H2O2培养1 h，收集细胞后反复冻融，离心取上清液，按照南京建成试剂盒说明书，应用分光光度法，检测SOD、GSH-Px活性及MDA含量。
通过流式细胞技术，用DCF法检测ROS含量。DCFH-DA是活性氧的特异探针，它本身不发荧光，可自由穿过细胞膜进入细胞内，被胞内的酯酶分解为 DCFH 而保留在胞内，各类ROS 会氧化DCFH为发强绿色荧光的DCF，利用流式细胞仪检测胞内的DCF荧光强度即可反映细胞的ROS水平。
收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μL/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为1×106~2×108/mL，37℃细胞培养箱内孵育20 min；每隔5 min颠倒混匀一次，使探针和细胞充分接触；用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；收集细胞后，由于波长的设置与FITC检测时的波长设置非常接近，所以直接用流式细胞仪检测。
SOD、GSH-Px活性及MDA含量的检测结果如表1所示。
表1 巨噬细胞中抗氧化指标
注：肩标不同小写字母者表示差异显著，即P＜0.05；有相同小写字母者差异不显著，即，P≥0.05。
从表1中可知，各组SOD活力测定结果显示，模型对照组SOD活力显著低于除SCPH组以外的各组的SOD活力（P<0.05），SCPH处理组与模型对照组差异不显著（P>0.05），SOD作为一种代表性抗氧化酶在清除自由基和减少氧化损伤方面有重要作用，模型对照组的SOD受到氧化应激后显著降低，除SCPH组外其余各组SOD均保持正常水平；各组MDA含量测定结果显示，模型对照组MDA含量显著高于其他各组（P<0.05），经过硫酸化党参多糖、党参多糖和VC处理后，细胞中的MDA含量明显下降，与空白对照组之间无明显差异，其中，SCPH组的MDA含量最低，MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在抗衰老、抗氧化研究中MDA含量是一个常用指标，模型组MDA显著升高说明巨噬细胞氧化损伤明显，其余各组均保持正常水平，其中SCPH组MDA含量最低；各组GSH-Px活性测定结果显示，模型对照组的GSH-Px活性显著低于空白对照组（P<0.05），CPM、CPH、SCPL、SCPM和SCPH处理组细胞中的GSH-Px酶活与空白对照组之间无明显差异，而VC对照组细胞中的GSH-Px酶活显著高于空白对照组，GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，结果表明VC对照组对于GSH-Px的酶活提高效果最佳，CPM、CPH、SCPL、SCPM和SCPH处理组细胞中的GSH-Px酶活均保持正常水平。
各组细胞中ROS水平检测结如图4所示。其中，模型对照组细胞中ROS的百分比显著性的高于其他处理组，而VC对照组、CPL和SCPM处理组细胞中ROS的百分比与空白对照组无显著性差异，表明VC对照组、CPL和SCPM处理组细胞ROS水平均保持正常水平；而CPM、CPH、SCPL和SCPH处理组细胞中ROS的百分比与空白对照组呈显著性差异，也与模型对照组呈显著性差异，其细胞中ROS的百分比介于空白对照组和模型对照组之间，表明CPM、CPH、SCPL和SCPH处理组细胞ROS水平优于空白对照组。
综上所述，对比党参多糖，硫酸化修饰党参多糖实际应用浓度低于党参多糖浓度的情况下，抗氧化效果依然显著，与高浓度党参多糖的效果相当甚至优于高浓度党参多糖对照组；上述试验结果表明对于H2O2刺激下导致的巨噬细胞氧化损伤，硫酸化党参多糖具有很好的预防和/或修复作用，尤其是能够降巨噬细胞中丙二醛的含量，维持超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧物酶的酶活在正常水平，不受H2O2的刺激而降低，同时可以显著降低细胞中活性氧的含量，还能够保证细胞的正常生长形态，其推荐浓度为2-6 及2-5 mg/mL。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.中药硫酸化党参多糖作为抗氧化剂的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述中药硫酸化党参多糖在抑制和/或修复H2O2导致的氧化损伤中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述中药硫酸化党参多糖在抑制和/或修复H2O2导致的巨噬细胞氧化损伤中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述中药硫酸化党参多糖可降低经H2O2刺激后巨噬细胞中丙二醛的含量。
5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述中药硫酸化党参多糖可维持经H2O2刺激后巨噬细胞中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧物酶酶活在正常水平。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗氧化剂的剂型为粉剂、丸剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或糖浆剂。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述丸剂为大蜜丸、小蜜丸、水丸、浓缩丸或微丸。
8.根据权利要求1～7任一所述应用，其特征在于，所述硫酸化党参多糖是先将党参中提取的多糖经sevage法纯化，再经氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰得到。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述硫酸化党参多糖的制备过程如下：采用水煎醇沉法从党参饮片中提取党参总多糖，再采用sevage法去除多糖中的蛋白质、DEAE-52纤维素柱纯化，冷冻干燥，得到纯化多糖；采用氯磺酸-吡啶法对纯化多糖进行硫酸化修饰，并优化修饰工艺条件，修饰后的多糖经透析纯化，冷冻干燥，制得硫酸化党参多糖。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110776579A (zh) * 2019-11-14 2020-02-11 济宁医学院 一种利用响应曲面法优化玄参多糖硫酸酯化的工艺

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