CN117886788B - 新型稳态化锦葵花色苷衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型稳态化锦葵花色苷衍生物，其具有所示结构，其中，R的结构式为、或中的任意一种。本发明采用锦葵花色苷粉末和绿原酸粉末在超声波的作用下反应生成三种结构新颖的锦葵花色苷衍生物。本发明还公开了一种衍生混合物，是通过三种结构新颖的锦葵花色苷衍生物混合得到，在保护视网膜药物、治疗脏器衰老药物、提高肠道菌群多样性药物均有良好的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域。更具体地说，本发明涉及一种新型稳态化锦葵花色苷衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
锦葵花色苷（MV）属于黄酮类化合物，是一种天然抗氧化剂，可根据其清除自由基，调节抗氧化酶，激活或抑制蛋白质表达以及调节体内各种信号通路的能力来预防氧化应激，尤其是花色苷对于眼部的治疗引起国内外学者极大的兴趣。
最近研究发现花色苷可以改善夜视力、刺激杆外段膜中视红紫质的再生从而改善视力、抑制晶状体混浊、减少视网膜色素上皮细胞(RPE)凋亡和抑制血-视网膜屏障破坏。但现有的花色苷均是从蓝莓、葡萄、血橙、紫甘薯、红球甘蓝、茄子皮、樱桃、红橙、红莓、草莓、桑葚、山楂皮、紫苏、黑(红)米、牵牛花等天然植物中提取出来的，其结构有限，且稳定性不高，不利于后期用于制备改善视力的药物。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种新型稳态化锦葵花色苷衍生物，其具有通式I所示结构：
通式I
其中，R的结构式、/>或/>中的任意一种。
提供一种所述的新型稳态化锦葵花色苷衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将锦葵花色苷粉末和绿原酸粉末混合，加入磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液后，在超声波条件下反应，反应结束后的液体，经柱层析分离得到化合物1、化合物2和化合物3；
其中，化合物1的结构式为，化合物2的结构式为，化合物3的结构式为/>。
优选的是，所述锦葵花色苷粉末与所述绿原酸粉末的质量比为1:2.5~6.5。
优选的是，所述超声波反应器设置的反应时间为2~6 min，反应功率为200~400 W。
优选的是，所述磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液的pH值为3，所述磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液的用量为每毫克锦葵花色苷粉末5~10 mL。
优选的是，所述磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液的用量为每毫克锦葵花色苷粉末10mL。
提供一种衍生混合物，基于所述的新型稳态化锦葵花色苷衍生物的制备方法制备得到的化合物1、化合物2和化合物3以质量比为1~1.5:1:1混合得到。
提供一种所述的衍生混合物在制备保护视网膜药物中的应用。
提供一种所述的衍生混合物在制备治疗脏器衰老药物中的应用。
提供一种所述的衍生混合物在制备提高肠道菌群多样性药物中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明采用锦葵花色苷粉末和绿原酸粉末在超声波的作用下反应生成三种结构新颖的锦葵花色苷衍生物。
第二、本发明通过化合物1、化合物2和化合物3以质量比为1.5~1:1:1混合制备得到衍生混合物，其稳定性强，且在保护视网膜药物、治疗脏器衰老药物、提高肠道菌群多样性药物均有应用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为发明其中一个实施例中的锦葵花色苷与绿原酸的质量比对衍生混合物的辅色率的影响图；
图2为发明其中一个实施例中的超声功率对衍生混合物的辅色率的影响图；
图3为发明其中一个实施例中的超声时间对衍生混合物的辅色率的影响图；
图4为发明其中一个实施例中的化合物1的质谱图；
图5为发明其中一个实施例中的化合物2的质谱图；
图6为发明其中一个实施例中的化合物3的质谱图；
图7为发明其中一个实施例中的各组小鼠的食物摄取量；
图8为发明其中一个实施例中的各组小鼠生化指标的SOD含量值；
图9为发明其中一个实施例中的各组小鼠生化指标的GSH-Px含量值；
图10为发明其中一个实施例中的各组小鼠生化指标的MDA含量值；
图11为发明其中一个实施例中的各组小鼠的视网膜组织切片图；
图12为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肝组织切片图；
图13为发明其中一个实施例中的各组小鼠的心脏组织切片图；
图14为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肾脏组织切片图；
图15为发明其中一个实施例中的各组小鼠的脑组织切片图；
图16为发明其中一个实施例中的各组小鼠的视网膜总厚度；
图17为发明其中一个实施例中的各组小鼠的视网膜外层厚度；
图18为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的Chao1指数；
图19为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的Observed species指数；
图20为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的Faith’s PD指数；
图21为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的Shannon指数；
图22为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的距离矩阵与PCoA分析；
图23为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的门水平的物种组成分析；
图24为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的属水平的物种组成分析；
图25为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的属水平的物种组成热图；
图26为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的LEfSe分析的分支图；
图27为发明其中一个实施例中的各组小鼠的肠道菌群的LEfSe分析的直方图；
图28为发明其中一个实施例中的空白组与模型组对比的肠道菌群的PICRUSt2推断的KEGG通路相对丰度值差异显示图；
图29为发明其中一个实施例中的模型组与低剂量组对比的肠道菌群的PICRUSt2推断的KEGG通路相对丰度值差异显示图；
图30为发明其中一个实施例中的模型组与高剂量组对比的肠道菌群的PICRUSt2推断的KEGG通路相对丰度值差异显示图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒、蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
<衍生混合物稳态化条件筛选>
1.1锦葵花色苷与绿原酸的质量比对衍生混合物稳态化的影响
分别在250 mg、350 mg、450 mg、550mg、650 mg的绿原酸粉末中加入100 mg的锦葵花色苷粉末且混合后即锦葵花色苷与绿原酸的质量比分别为1:2.5、1:3.5、1:4.5、1:5.5、1:6.5，分别加入1 L pH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液，于超声波反应器的条件设置为300 W的条件下反应4 min，反应结束后的液体经后采用D101大孔树脂和8倍柱子体积的蒸馏水纯化，洗去多余的酸，得到衍生混合；
将不同组别的衍生混合物对其辅色率进行检测，以评估其稳定性。衍生混合物的辅色率计算公式为，其中，A0为锦葵花色苷粉末在λ=521 nm处测量的吸光度值，A1为衍生混合物λ=521 nm处测量的吸光度值，其结果如下图1所示。
据图1显示，随着锦葵花色苷与绿原酸质量比值的减小，锦葵花色苷的辅色率逐渐增加，且呈剂量依赖性，当质量比为1:4.5时，衍生混合物的辅色率达到最大，且在1:4.5以后衍生混合物的辅色率开始下降，可能是由于绿原酸与锦葵花色苷的结合位点达到饱和。
1.2不同超声波功率对衍生混合物稳态化的影响
称取多组100 mg的锦葵花色苷粉末和450 mg的绿原酸粉末且混合后，分别加入1L pH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液，分别在200 W、250 W、300 W、350 W、400 W的功率下超声波反应器的条件下反应4 min，反应结束后的液体经后采用D101大孔树脂和8倍柱子体积的蒸馏水纯化，洗去多余的酸，得到对应的衍生混合物；
对不同组别的衍生混合物的辅色率进行检测，其结果如下图2所示。
据图2显示，随着超声波功率的增加，衍生混合物的辅色率呈现逐步增加的趋势，但在250 W后开始呈现下降的趋势，可能是由于随着超声功率由小到大的增加，绿原酸与锦葵花色苷呈先结合后分离的现象。
1.3 不同超声波时间对衍生混合物稳态化的影响
称取多组100 mg的锦葵花色苷粉末和450 mg的绿原酸粉末且混合后，分别加入1L pH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液，分别于超声波反应器的条件设置为300 W的条件下反应2 min、3 min、4 min、5 min、6 min，反应结束后的液体经后采用D101大孔树脂和8倍柱子体积的蒸馏水纯化，洗去多余的酸，得到对应的衍生混合物；
对不同组别的衍生混合物的辅色率进行检测，其结果如下图3所示。
据图3显示，随着时间的延长，衍生混合物的辅色率呈现先增加后减少的趋势，且在4 min后开始呈现下降的趋势，在5 min和6 min时与2 min和3 min时具有相似的辅色率效果，可能是由于随着超声时间的延长，锦葵花色苷分子与绿原酸分子先键合后分离的过程。
利用Design-Expert软件拟合分析，得出衍生混合物辅色率的方程模型，如下表1所示。采用响应面优化拟合出的方程（Y=24.24+1.71A+2.18B+1.08C+0.24AB+1.28AC+2.33BC-1.78A2-2.78B2-6.52C2）回归项模型的p(0.0022)<0.01，且失拟项p(0.2882)>0.05，衍生混合物的辅色率与3个变量的二次回归方程显著，且拟合得到的回归模型的方程相关系数R2=0.9351，表明该模型拟合度良好。通过响应面分析优化最佳实验条件的时间为4.60min，锦葵花色苷与绿原酸的质量比为1:5.01(w/w)，超声波功率为261.67 W，辅色率为25.4378%。按照优化最佳条件（4.6min、1:5.01(w/w)、260 W）重复3次试验，理论值与实际辅色率（24.67±0.67%）差异不显著。
表1 超声波条件下锦葵花色苷粉末与绿原酸粉末的Box-Behnken 响应面试验结果
<实施例>
采用上述最优的条件制备得到衍生混合物，衍生混合物的制备方法包括以下步骤：
步骤一、分别称取100 mg的锦葵花色苷粉末和500 mg的绿原酸粉末后，加入1 LpH=3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸混合溶液（由0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L柠檬酸溶液混合配制而成），于超声波反应器条件设置为261.67 W的条件下反应4.6 min，反应结束后的液体经后采用D101大孔树脂和8倍柱子体积的蒸馏水纯化，洗去多余的酸，避光冷冻干燥，得到有化合物1、化合物2和化合物3，其中，化合物1的结构式为，其质谱图如图4所示；化合物2的结构式为，其质谱图如图5所示；化合物3的结构式为/>，其质谱图如图6所示；
步骤二、化合物1、化合物2和化合物3以质量比为1.5:1:1混合制备得到衍生混合物。
<衍生混合物的性能测试>
2.1实验材料
采用雄性ICR小鼠（20±2 g），小鼠引入前符合国标接受动物标准（由吉林农业大学动物试验中心提供），具体操作过程符合动物伦理委员会要求。
将实施例制备得到的衍生混合物采用无菌生理盐水配置成不同浓度的衍生混合物溶液(现用现配)，用于后续小鼠灌胃。
2.2试验动物的模型及给药方法
将小鼠随机分为空白组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组10只，其中，模型组每天腹腔注射D-半乳糖溶液（浓度为500 mg/kg），按500 mg D-半乳糖/kg体重计算，低剂量组在除每天注射与模型组等量等浓度的D-半乳糖溶液外，灌胃与生理盐水等量的衍生混合物溶液（浓度为50 mg/kg），高剂量组在除每天注射与模型组等量等浓度的按照D-半乳糖溶液外，灌胃与生理盐水等量的衍生混合物溶液（浓度为100 mg/kg），空白组灌胃与模型组、低剂量组和高剂量组液体等量的生理盐水。
2.3 小鼠体重、摄食量及脏器指数检测
小鼠饲养周期为35天，在饲养期间天记录各组小鼠的毛发色泽、精神状态以及摄食量，并且每间隔4天对各组小鼠称重并记录小鼠体重变化，食量变化如图7所示，体重变化如下表2所示。
表2 各组小鼠的体重变化
| 时间 | 空白组 | 模型组 | 低剂量组 | 高剂量组 |
| 0天 | 24.04±0.9663a | 24.30±0.7540a | 24.62±1.4470a | 24.49±0.6496a |
| 1天 | 29.32±1.2540a | 29.77±1.6850a | 30.50±0.8448a | 29.44±1.5920a |
| 5天 | 30.93±1.5830a | 30.53±2.0920a | 31.75±1.0630a | 30.76±1.5160a |
| 10天 | 32.46±1.7430a | 32.25±2.3720a | 32.91±1.0740a | 32.34±1.804a |
| 15天 | 34.74±1.885a | 34.03±2.5680a | 34.07±1.2680a | 33.27±2.0290a |
| 20天 | 35.87±2.0630a | 35.54±1.0680a | 35.22±1.1240a | 34.31±1.890a |
| 25天 | 36.89±2.1150a | 34.27±1.3360b | 36.21±0.8318ac | 36.33±2.6330ac |
| 30天 | 37.57±1.8350a | 34.8±2.2710b | 37.15±0.5648ac | 37.20±1.2880ac |
| 35天 | 38.49±2.1740a | 35.61±2.5520b | 38.08±0.8173ac | 38.46±2.6270ac |
其中，a、b、c表示差异显著性
据图7显示，试验期间，小鼠皮毛有光泽，眼睛正常无分泌物，口腔健康，无耳壳曲折和炎症，四肢无外伤及关节炎症，精神状态和食欲良好，姿势和步态正常，且每天的模型组、低剂量组和高剂量组摄食量差异不显著（p>0.05）。
根据表2数据可知，随着时间的延长空白组、模型组、低剂量组和高剂量组的小鼠体重整体呈现增加的趋势。在第25天后，与空白组比较，模型组中随着给药时间的延长小鼠体重逐渐减少（p<0.01），说明建模成功。
小鼠在第35天时，前12 h禁食禁水，随后眼球取血，摘取心、肝、脾、肺、胸腺、肾和脑称重，计算脏器指数公式为脏器指数（%）=脏器重量/小鼠体重*100，结果如下表3所示。
表3 各组小鼠的心、肝、脾、肺、胸腺、肾和脑脏器指数
| 组别 | 肺(%) | 肝脏(%) | 脾脏(%) | 心脏(%) | 脑(%) | 肾脏(%) | 胸腺(%) |
| 空白组 | 0.5804±0.08689a | 5.2310±0.5177a | 0.3522±0.05645a | 0.5861±0.08388a | 1.3260±0.1316a | 1.2230±0.1453a | 0.1828±0.03685a |
| 模型组 | 0.4497±0.04324b | 4.2260±0.4831b | 0.2916±0.02919b | 0.4519±0.07191b | 1.0990±0.1071b | 1.0830±0.1285b | 0.1462±0.01111b |
| 低剂量组 | 0.5386±0.05442ac | 4.8220±0.1259ac | 0.3154±0.01219ac | 0.5438±0.05465ac | 1.2450±0.04288ac | 1.2060±0.1126ac | 0.1769±0.04018ac |
| 高剂量组 | 0.5704±0.06908ac | 4.8620±0.4948ac | 0.3595± 0.06329acd | 0.5854±0.0664ac | 1.2860±0.08011ac | 1.2160±0.08006ac | 0.1801±0.04282ac |
其中，a、b、c表示差异显著性
根据表3数据可知，与空白组比较，模型组中的小鼠肺、肝、脾、心、脑、肾和胸腺脏器指数显著降低（p<0.01）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组小鼠的肺、肝、脾、心、脑、肾和胸腺脏器指数均显著增加（p<0.05或p<0.01），且呈剂量依赖性增加，说明衍生混合物对机体氧化应激的保护作用。
2.4小鼠血清中生化指标的检测
小鼠在第35天眼球取血后（每只小鼠取200 µL）将血液在4℃下以4000g离心10min取上清液备用。使用超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒检测空白组、模型组、低剂量组和高剂量组中血清中的生化指标，结果如图8~图10所示。
据如图8~图10显示，与空白组比较，模型组中的SOD和GSH-Px含量减少（p<0.01）MDA含量增加（p<0.01），说明D-半乳糖可以引起小鼠的氧化应激；而与模型组比较，低剂量组干预治疗小鼠后，血清中的SOD和GSH-Px含量则增加（p<0.05），MDA含量减少（p<0.01）；高剂量组干预小鼠后，SOD和GSH-Px含量增加（p<0.01），MDA含量减少（p<0.01）；与低剂量组比较，高剂量组的SOD含量（p<0.05）增加，MDA含量（p<0.05）减少，说明浓度为100 mg/kg的衍生混合物具有更好的抗氧化效果。因此，衍生混合物可以参与调节机体的一道抗氧化酶系统从而达到抗氧化的目的，且高剂量衍生混合物的抗氧化效果较好。
2.5小鼠脏器组织切片及HE染色
将空白组、模型组、低剂量组和高剂量组的小鼠颈椎处死后，分别将每组小鼠的眼球、心、肝、肾、脑全部摘除，切勿破坏组织，且不残留有脂肪，后用生理盐水冲洗后滤纸擦干，用4%的多聚甲醛固定48 h后对组织进行以下处理，首先将组织用石蜡包埋切片，后HE染色，最后采用显微镜观察组织切片，图像采集，每组进行三次重复检测，且图片放大40倍、200倍和400倍。
组织石蜡包埋切片：（1）在通风厨内，取出在4%多聚甲醛固定液里固定的组织，将组织修平放入脱水盒中；（2）将脱水盒放入脱水机中按照以下顺序脱水：首先75%乙醇脱水4h，85%乙醇脱水2 h，90%乙醇脱水2 h，95%乙醇脱水1 h，后用无水乙醇脱水30 min，重复2次，醇苯脱水5~10 min，二甲苯脱水10 min，重复2次，蜡脱水3 h；（3）将蜡溶解后，组织放入蜡中包埋，放入-20℃冻台冷却；（4）采用石蜡切片机将包埋好的石蜡切片成4 μm切片，后在40℃摊片机内将组织展平，置于60℃烘箱中烘干备用。
HE染色：（1）将石蜡切片依次加入到二甲苯20 min，重复一次，后放入无水乙醇10min，重复一次，95%乙醇5 min，90%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min，蒸馏水洗；（2）将石蜡切片放入（Harris）苏木素染色8 min，蒸馏水冲洗，无水乙醇（含1%的盐酸）分化5 s，蒸馏水冲洗，0.6%氨水，蒸馏水冲洗，伊红染液中染色3 min；（3）将石蜡切片依次放入95%乙醇5 min，重复2次，无水乙醇5 min，重复2次，二甲苯5 min，重复2次，中性树胶封片。
小鼠的视网膜组织形态结果如图11所示，空白组中视网膜结构排列整齐，然而在模型组中出现视网膜层混乱和水肿，且细胞形态改变视网膜色素上皮细胞减少，细胞核固缩，细胞形态异常，然而在低剂量组和高剂量组中能明显缓解此类现象，说明衍生混合物对于缓解氧化应激从而具有保护视网膜的功能特性。
小鼠的肝组织形态结果如图12所示，空白组中小鼠肝脏细胞形态正常、排列整齐、未发现脂滴。然而模型组中，肝细胞形态不规则，细胞核固缩，数量减少，出现细胞凋亡现象，肝索排列杂乱出现脂滴且空泡化。然而在低剂量组和高剂量组中发现此类现象明显缓解，说明衍生混合物对于缓解氧化应激从而具有保护肝脏的功能特性。
小鼠的心脏组织形态结果如图13所示，空白组中小鼠心脏细胞形态正常且心脏肌纤维排列规范，在模型组中发现小鼠的心脏肌纤维无规则杂乱，且细胞核皱缩，细胞凋亡数量增多，而在低剂量组和高剂量组中能明显缓解此类现象，说明衍生混合物对于缓解氧化应激从而具有保护心脏的功能特性。
小鼠的肾脏组织形态结果如图14所示，空白组中小鼠的肾脏小球组织形态正常且细胞形态正常。在模型组中发现小鼠的肾小球组织皱缩且数目增多，细胞核固缩，且发现炎性细胞浸入现象。然而在低剂量组和高剂量组中能明显缓解此类现象，说明衍生混合物对于缓解氧化应激从而具有保护肾的功能特性。
小鼠的脑组织形态结果如图15所示，空白组中小鼠的脑组织细胞形态正常，然而在模型组中发现小鼠脑细胞变松散，神经元结构紊乱细胞核固缩，结构改变等，但在低剂量组和高剂量组中能明显缓解此类现象，说明衍生混合物对于缓解氧化应激从而具有保护脑组织的功能特性。
2.6视网膜厚度检测
将HE染色后眼球进行切片，每张切片挑选200倍视野进行拍照，采用Image-ProPlus 6.0软件对每张切片分别测量视网膜总厚度（µm）和视网膜外层厚度（µm），结果如图16~图17所示。
据图16~图17显示，与空白组比较，模型组视网膜总厚度和外层厚度显著减少（p<0.05），与模型组比较，低剂量组和高剂量组视网膜总厚度和外层厚度显著增加（p<0.05），说明衍生混合物能够减缓视网膜病。
2.7肠道菌群检测
收集各组小鼠的盲肠内容物3~5g，并将其放置在无菌实验室的无酶无菌冷冻管中，然后将其密封并放置在液氮中，进行肠道菌菌群检测，结果如图18~图30所示。
对各组小鼠的肠道菌群进行α多样性分析，以反映小鼠肠道菌群的丰富度和多样性，结果如图18~21所示，图中的丰富度估计量（Chao1）指数和观察物种（Observedspecies）指数反映物种的总数，其数值越大说明该菌群的丰富度越大；信仰多样性（Faith’s pd）指数和香浓（Shannon）指数用来表示肠道菌群的物种多样性，其数值越大，肠道菌群的多样性越高；据图18~图21显示，与模型组相比，高剂量组的丰富度估计量指数、观察物种指数、信仰多样性指数和香浓指数上升，表明衍生物混合物可以提高肠道微生物群的丰富度和多样性。
对各组小鼠的肠道菌群进行距离矩阵与PCoA分析，结果如图22所示，空白组和模型组在主坐标分析中出现明显差异，表明这两组之间肠道菌群结构不同，而低剂量组和高剂量组肠道微生物组成与空白组出现明显聚类，表明这三组肠道菌群结构相似，并且高剂量组和空白组之间的聚集多于低剂量组和空白的聚集。说明D-半乳糖处理影响小鼠的肠道微生物的多样性和微生物组成成分，衍生物混合物可以使肠道微生物群的多样性和微生物组成成分恢复正常，高浓度优于低浓度。
对各组小鼠的门水平的肠道菌群进行相对丰度分析，结果如图23所示，其中，肠道菌群门水平物种组成上，主要菌为拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes），厚壁菌门和拟杆菌门在肠道菌群中参与能量代谢，厚壁菌门与拟杆菌门的比值（F/B）是反应肠道菌群紊乱的重要指标，比值增加表明体内出现炎症。据图23显示，与空白组相比，模型组厚壁菌门/拟杆菌门的比值增加，与模型组相比，低剂量组和高剂量组厚壁菌门/拟杆菌门的比值降低，在物种分类学分析结果中，衍生物混合物在门水平上干预调节了肠道微生物组成，低剂量组和高剂量组在门水平上均降低了厚壁菌门的数量，增加了拟杆菌门的数量。
对各组小鼠的属水平的肠道菌群进行相对丰度分析，结果如图24所示，其中，肠道菌群属水平物种组成上，优势菌分别为未知的_S24-7、乳酸杆菌属和未知的_毛螺菌属。据图24显示，与空白组相比，模型组的未知的_S24-7和乳酸杆菌属比例减少，未知的_毛螺菌属比例增加。与模型组相比，低剂量、高剂量组的未知的_S24-7和乳酸杆菌属（Lactobacillus）比例增加，未知的_毛螺菌属比例减少。
对各组小鼠的肠道菌群属的相对丰度值构建热图，结果如图25所示。据图25显示，与空白组相比，模型组的瘤胃球菌、阿克曼氏菌、普雷沃氏菌相对丰度较高，乳杆菌相对丰度较低，与模型组相比，低剂量组的乳杆菌和拟杆菌相对丰度较高，颤螺菌和AF12相对丰度较低。与模型组相比，高剂量组的双歧杆菌和梭菌相对丰度较高，与模型组相比，高剂量组的双歧杆菌和梭菌相对丰度较高，瘤胃球菌相对丰度较低。其中，瘤胃球菌（Ruminococcus）代谢后产生丁酸盐，可促进调节性T淋巴细胞的分化，降低免疫细胞中IL-6的表达，增加IL-10的产生，从而抑制肠道炎症，维持肠道健康；阿克曼氏菌属（Akkermanni）可以降低与小鼠高脂肪饮食相关的内毒素水平，并通过降解肠道中的黏蛋白，调节肠道内粘液厚度和维持肠道屏障完整性进而调节机体代谢，因此，阿克曼菌属在调节肠道代谢功能和改善免疫反应方面都起着重要作用，一些普雷沃氏菌（Prevotella）可能是临床上重要的致病菌，会促进慢性炎症；双歧杆菌（Bifidobacterium）可粘附于肠上皮细胞作为肠道粘膜屏障稳定剂，具有抗炎作用，可调节Th1/Th2平衡并诱导调节性T淋巴细胞，改善肠道微环境，增强肠道屏障。
对各组小鼠的肠道菌群进行LEfSe分析，结果如图26~图27所示，其中，LDA评分是通过对不同组肠道微生物群LEfSe分析获得，LDA评分越高，比较中差异物种越显著。图26的LDA评分阈值为3，其中，从内圈到外圈的彩色节点代表了所有分类群从门到属的层次关系，空白组富集的类群以蓝色显示，模型组富集的类群以红色显示，高剂量组富集的类群以绿色显示，无明显变化的类群以白色显示。每个小圆圈的直径代表了肠道微生物分类群的丰度。图27显示LDA评分＞3的富集类群，发现在门到属水平上，与空白组相比，模型组的毛螺菌科（Lachnospiraceae）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）差异显著；与模型组相比，高剂量组的双歧杆菌属（Bifidobacterium）差异显著，表明衍生物混合物处理改变了D-半乳糖处理的小鼠肠道微生物群。
对各组小鼠的肠道微生物进行PICRUSt2推断的KEGG通路相对丰度值差异分析，结果如图28~图30所示，发现，在95%置信区间下，模型组与低剂量、高剂量组肠道微生物群的预测功能丰度存在显着差异。与模型相比，低剂量、高剂量组的“脂肪酸的生物合成”相对丰度值呈现显著降低的水平（p<0.05），“次生胆汁酸生物合成”和“胆汁酸生物合成”相对丰度值均呈现显著升高的水平（p<0.05）。其中，“脂肪酸的生物合成”通路可能受拟杆菌（Bacteroidetes）和厚壁菌（Firmicutes）的影响，拟杆菌在碳水化合物的代谢中起着重要作用，可能参与食物中脂肪的分解，可能通过其代谢产物影响宿主的脂肪酸代谢。厚壁菌包括多种属如乳酸杆菌（Lactobacillus）和毛螺菌（Lachnospiraceae），可能通过发酵食物中的复杂多糖，产生短链脂肪酸（SCFAs），从而影响宿主的能量代谢和脂肪酸合成；“次生胆汁酸生物合成”通路和“胆汁酸生物合成”通路可能受梭菌（Clostridium）和拟杆菌（Bacteroides）的影响，胆汁酸主要由肝脏合成，然后由肠道细菌在结肠中进行发酵和转化，生成次生胆汁酸；梭菌通过在胆汁酸分子中引入羟基或进行脱氧等反应，影响胆汁酸的结构；拟杆菌参与羟化、脱氧和其他反应，导致形成不同的胆汁酸分子。
综合上述结果分析，可知模型组的肠道微生物群多样性和丰富度增高，衍生物混合物可以提高肠道微生物群的丰富。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (1)
1.衍生混合物的用途，其特征在于，衍生混合物在制备提高肠道菌群多样性药物中的应用，所述衍生混合物是由化合物1、化合物2和化合物3以质量比为1~1.5:1:1混合得到，其中，化合物1的结构式为，化合物2的结构式/>，化合物3的结构式为。
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