CN110143986A - 一种稳态化锦葵3-o-葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种稳态化锦葵3-o-葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种稳态化锦葵3‑O‑葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用。将山葡萄经过打浆、提取、大孔树脂纯化、制备型高效液相色谱纯化得到锦葵3‑O‑葡萄糖苷，其与咖啡酸经过超高压稳态化处理得到稳态化锦葵3‑O‑葡萄糖苷衍生物。本发明的有益效果：高压脉冲电场提取，保护花青素不受破坏；优化纯化条件，制得的锦葵3‑O‑葡萄糖苷纯度达到95％；将锦葵3‑O‑葡萄糖苷与咖啡酸进行超高压稳态化处理，使其有更好的光热稳定性和抗氧化作用。

Description

一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及花青素稳态化技术领域，更具体的说是涉及一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用。
背景技术
花青素是水溶性黄酮类化合物，基本结构为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃，广泛存在于自然界植物中，尤以葡萄、越橘、桑葚中含量更为丰富。山葡萄在我国东北集安、柳河等地种植历史已有50余年，栽培面积大，年产量高，东北地区山葡萄中花青素含量丰富，个别品种高达400mg/(100g.FW)，其中锦葵类花青素含量最高，占总花青素的55％以上，可作为天然花青素的良好来源。天然花青素具有很好的抗氧化作用，在食品加工领域应用潜力大，可在饮料、果酒、冰淇淋等产品的生产中代替合成红色素做着色剂使用，安全且营养。
但是天然花青素存在稳定性差，易受温度、光照、pH、氧等影响，易出现褪色、变色、沉淀现象等缺点，很大程度上限制了其应用，因此提高天然花青素的稳定性十分必要。目前，传统稳态化技术是花青素与有机酸、蛋白质、多酚等辅色剂通过共价键、氢键、范德华力等形式结合，产生自发性交互作用来提高天然花青素稳定性。但这种自发性稳态化反应速度慢，效率低，无法满足生产需要。而超高压由于较高的压力，具有瞬时压缩、作用均匀、操作安全、生态友好等优点，可最大程度地对物质进行提取；但是超高压技术用于促进色素稳定的相关研究甚少，且超高压促锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸稳态化处理及其机理未见报道；锦葵3-O-葡萄糖苷经超高压稳态化处理后，衍生为其衍生物，而这种衍生物性质稳定，抗氧化功效优于锦葵3-O-葡萄糖苷，在抗氧化应激产品开发领域可广泛应用。
因此，如何提供一种利用锦葵3-O-葡萄糖苷制备稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的方法与应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物，其结构如式Ⅰ所示：
一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)预处理：将山葡萄经过筛选、去柄、清洗、打浆，得到山葡萄浆液，备用；
(2)提取：按照液料比为5～9:1(w/w)将提取溶剂加入山葡萄浆液中，再采用高压脉冲电场提取花青素，得到花青素提取液；
花青素常用的提取方法有有机溶剂提取法、酶法提取、超声辅助提取法、微波辅助提取法，但这些方法存在成本高、效率低、提取缓慢、花青素破坏严重等缺点。高压脉冲电场是把液态食品作为电解质置于容器内，与容器边缘的两个放电电极通过高压电流，产生电脉冲进行加工的方法，可在瞬间使被处理细胞的细胞壁和细胞膜电位混乱，改变其通透性，甚至可击穿细胞壁和细胞膜，使其发生不可逆转破坏，使细胞中组分流出。高压脉冲电场提取具有非热、连续可操作性强等优点，提取过程中最大程度的保护花青素不受破坏。
(3)离心浓缩：将上述花青素提取液做离心处理，取上清液，将上清液减压浓缩至密度为1.0×103～1.1×103kg/m3，得到花青素浓缩液；
(4)D101大孔树脂纯化：将上述花青素浓缩液上样于D101大孔树脂柱中，静置，然后进行梯度洗脱，收集洗脱峰得洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得花青素纯化物膏体，备用；
由于提取的花青素中还含有多糖、蛋白质等其他杂质，为了获得纯度较高的花青素样品，需对其进行纯化处理。大孔树脂是吸附性和分子筛原理相结合的分离材料，其吸附性是范德华力或氢键作用的结果，其分子筛性是由其本身多孔结构决定的。大孔树脂纯化花青素的原理为：花青素的结构特点容易被大孔树脂吸附，而多糖、蛋白质、核酸等生物大分子不被吸附，小分子量的糖、氨基酸等虽有一定吸附，但容易从树脂上解吸。大孔树脂吸附样品后，先用去离子水洗脱除去盐离子、多糖等杂质，后用有机溶剂洗脱得到纯化的花青素。
(5)制备型高效液相色谱分离：用含0.5～1％(v/v)HCl甲醇溶液将花青素纯化物膏体稀释10～20倍得稀释液，将稀释液使用制备型高效液相色谱分离，收集洗脱峰，冷冻干燥得锦葵3-O-葡萄糖苷；
花青素常用的干燥方式有热风干燥和真空干燥，但这两种方式均经过加热过程，在一定程度上破坏了花青素的稳定性。冷冻干燥的方式是直接通过升华方式去除掉水分，不经过加热过程，从而保护了花青素的稳定性。
(6)使用无水乙醇溶解咖啡酸，咖啡酸与无水乙醇的质量比为1:3～8，之后加入锦葵3-O-葡萄糖苷，制得混合液，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸的质量份数比为1:3～5；
(7)使用pH值3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上述混合液，使锦葵3-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mg/mL，避光水浴30～60min，水浴温度50～60℃；
(8)避光水浴后进行超高压稳态化处理，稳定压力200～400MPa，稳定时间1～15min，得到处理液；
(9)将上述处理液离心后取上清液，经D101大孔树脂柱纯化后，经减压浓缩和冷冻干燥，得到稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的形成机理为：锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸键合，脱去一分子H2O得锦葵-3-O-(6″-O-咖啡酰基)-葡萄糖苷，反应过程如下：
优选的，步骤(1)打浆步骤为使用胶体磨2000～4000r/min研磨10～20min。
优选的，步骤(2)中所述提取溶剂为0.1～0.5％盐酸—55～75％乙醇溶液(v/v，即100mL溶液中含有0.1～0.5mL的HCl和55～75mL的乙醇，其余为去离子水)；电场强度为10～20kV/cm，脉冲数为4～10。
优选的，步骤(3)与步骤(9)的离心条件为3000～5000r/min离心5～10min。
优选的，步骤(3)、步骤(4)与步骤(9)减压浓缩的条件为：45～55℃，40～60r/min，真空度0.08～0.1Mpa。
优选的，步骤(4)与步骤(9)D101大孔树脂纯化按如下方法进行操作：
在4～10℃条件下，上样于处理好的D101大孔树脂柱中(2cm×40cm)，上样速率为1～2BV/h，上样后静置15～35min后进行梯度洗脱，先用4～6倍柱体积去离子水进行第一次洗脱，之后用4～6倍柱体积的0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)进行第二次洗脱，洗脱至大孔树脂柱无色，洗脱速率为1～2BV/h，收集第二次洗脱峰，得洗脱液，将洗脱液减压浓缩至密度为1.0×103～1.1×103kg/m3，得花青素纯化物膏体。
优选的，步骤(5)中制备型高效液相色谱分离条件如下：
固定相为SunFire Prep C18柱(10mm×250mm,5μm)；检测柱温25℃；检测波长530nm；进样量2mL；洗脱流速2mL/min；流动相为5％(v/v)甲酸水溶液和甲醇溶液，进行梯度洗脱；0～5min时甲醇溶液体积比由8％上升至10％，5～50min时甲醇溶液体积比维持10％，50～55min时甲醇溶液体积比由10％上升至15％，55～60min时甲醇溶液体积比由15％上升至20％，60～80min时甲醇溶液体积比由20％上升至25％，80～100min时甲醇溶液体积比由25％上升至35％，100～105min时甲醇溶液体积比由35％上升至70％，洗脱结束；收集出峰时间为90～92min时的洗脱液，冷冻干燥得到锦葵-3-O-葡萄糖苷。
优选的，步骤(5)及步骤(9)冷冻干燥条件为在冷阱温度-40℃，真空度50～100Pa条件下冻干8～10h。
一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物在抗氧化应激作用中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)采用高压脉冲电场提取花青素，最大程度保护花青素不受破坏；(2)优化大孔树脂和制备型高效液相色谱纯化条件，制得的锦葵3-O-葡萄糖苷纯度达到95％以上；(3)将锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸进行超高压稳态化处理，其结构较未稳定化处理的锦葵3-O-葡萄糖苷稳定，有更好的光热稳定性和抗氧化应激作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为制备型HPLC图谱
图2为制备型HPLC收集图谱
图3为锦葵3-O-葡萄糖苷的HPLC图谱
图4为稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的HPLC图谱
图5为稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的MS/MS图谱
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)山葡萄预处理：将山葡萄经过筛选、去柄、清洗后，使用胶体磨2000r/min研磨20min，得到山葡萄浆液，备用；
(2)提取：按照液料比为5:1(w/w)将0.1％盐酸—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)加入山葡萄研磨浆中，采用高压脉冲电场提取，电场强度为10kV/cm，脉冲数为10，得到花青素提取液；
(3)离心浓缩：将上述花青素提取液3000r/min条件下离心15min，弃滤渣，取上清液，45℃，40r/min，真空度0.08Mpa条件下减压浓缩至密度为1.0×103kg/m3，得到花青素浓缩液；
(4)D101大孔树脂纯化：将花青素浓缩液用去离子水稀释5倍，在4℃条件下，上样于处理好的D101大孔树脂柱中，上样速率为1BV/h，上样后静置15min后进行梯度洗脱，先用4倍柱体积去离子水进行一次洗脱，之后用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)进行二次洗脱，洗脱洗脱4倍柱体积至大孔树脂柱无色，洗脱速率为1BV/h，从0.1％HCl—75％乙醇洗脱的1/2柱体积开始收集第二次洗脱液将洗脱液于45℃，40r/min，真空度0.08Mpa条件下减压浓缩密度为1.0×103kg/m3，得花青素纯化物膏体，备用；
(5)制备型高效液相色谱分离：用含0.5％(v/v)HCl甲醇溶液将花青素纯化物膏体稀释10倍得稀释液，将稀释液使用制备型高效液相色谱分离，固定相为SunFire Prep C18柱(10mm×250mm,5μm)；检测柱温25℃；检测波长530nm；进样量2mL；洗脱流速2mL/min；流动相为5％(v/v)甲酸水溶液和甲醇溶液，进行梯度洗脱；0～5min时甲醇溶液体积比由8％上升至10％，5～50min时甲醇溶液体积比维持10％，50～55min时甲醇溶液体积比由10％上升至15％，55～60min时甲醇溶液体积比由15％上升至20％，60～80min时甲醇溶液体积比由20％上升至25％，80～100min时甲醇溶液体积比由25％上升至35％，100～105min时甲醇溶液体积比由35％上升至70％，洗脱结束。收集出峰时间为90～92min时的洗脱液，获得锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷溶液；然后对锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷溶液在冷阱温度-40℃，真空度50Pa条件下冷冻干燥8h，冻干得锦葵3-O-葡萄糖苷(HPLC测定纯度＞95％)；制备型HPLC图谱如图1所示，收集图谱如图2所示。
(6)使用3倍咖啡酸质量的无水乙醇溶解咖啡酸，加入锦葵3-O-葡萄糖苷，制得混合液，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸的质量份数比为1:3；
(7)使用pH值3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上述混合液，使锦葵3-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mg/mL，避光水浴30min，水浴温度60℃；
(8)避光水浴后进行超高压稳态化处理，稳定压力200MPa，稳定时间15min，得到处理液；
(9)将上述处理液离心后取上清液，经D101大孔树脂纯化后在4℃条件下，以1BV/h的上样速率上样至D101大孔树脂柱中，然后静置15min；接着以1BV/h洗脱速率先用4倍柱体积去离子水洗脱、再用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)洗脱4倍柱体积至无色，合并洗脱液，将洗脱液在45℃，40r/min，真空度0.08Mpa条件下减压浓缩至密度为1.0×103kg/m3，然后在冷阱温度-40℃，真空度50Pa条件下冷冻干燥8h，得到稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
实施例2
(1)山葡萄预处理：将山葡萄经过筛选、去柄、清洗后，使用胶体磨4000r/min研磨10min，得到山葡萄浆液，备用；
(2)提取：按照液(提取液)料(上述山葡萄浆液)比为9:1(w/w)将0.5％盐酸—55％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.5mL的HCl和55mL的乙醇，其余为去离子水)提取液加入山葡萄研磨浆中，采用高压脉冲电场提取，电场强度为20kV/cm，脉冲数为4，得到花青素提取液；
(3)离心浓缩：将上述花青素提取液5000r/min条件下离心5min，弃滤渣，取上清液，55℃，60r/min，真空度0.1Mpa条件下减压浓缩至密度为1.1×103kg/m3，得到花青素浓缩液；
(4)D101大孔树脂纯化：将花青素浓缩液用蒸馏水稀释10倍，在10℃条件下，上样于处理好的D101大孔树脂柱中，上样速率为2BV/h，上样后静置35min后进行梯度洗脱，先用6倍柱体积去离子水进行第一次洗脱，之后用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)进行第二次洗脱，洗脱6倍柱体积至大孔树脂柱无色，洗脱速率为2BV/h，收集第二次洗脱液，将洗脱液于55℃，60r/min，真空度0.1Mpa条件下减压浓缩1.1×103kg/m3，得花青素纯化物膏体，备用；
(5)制备型高效液相色谱分离：用含1％(v/v)HCl的甲醇溶液将花青素纯化物膏体稀释20倍得稀释液，将稀释液使用制备型高效液相色谱分离，固定相为SunFire Prep C18柱(10mm×250mm,5μm)；检测柱温25℃；检测波长530nm；进样量2mL；洗脱流速2mL/min；流动相为5％(v/v)甲酸水溶液和甲醇溶液，进行梯度洗脱；0～5min时甲醇溶液体积比由8％上升至10％，5～50min时甲醇溶液体积比维持10％，50～55min时甲醇溶液体积比由10％上升至15％，55～60min时甲醇溶液体积比由15％上升至20％，60～80min时甲醇溶液体积比由20％上升至25％，80～100min时甲醇溶液体积比由25％上升至35％，100～105min时甲醇溶液体积比由35％上升至70％，洗脱结束。收集洗脱峰为90～92min时的洗脱液，获得锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷溶液；然后对锦葵-3,5-O-二葡萄糖苷溶液在冷阱温度-40℃，真空度50Pa条件下冷冻干燥8h，获得高纯度山葡萄锦葵3-O-葡萄糖苷(纯度＞95％)；
(6)使用8倍咖啡酸质量的无水乙醇溶解咖啡酸，加入锦葵3-O-葡萄糖苷，制得混合液，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸的质量份数比为1:5；
(7)使用pH值3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上述混合液，使锦葵3-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mg/mL，避光水浴60min，水浴温度50℃；
(8)避光水浴后进行超高压稳态化处理，稳定压力400MPa，稳定时间1min，得到处理液；
(9)将上述处理液离心后取上清液，经D101大孔树脂纯化后[在10℃条件下，以2BV/h的上样速率上样至D101大孔树脂柱中，然后静置35min；接着以2BV/h洗脱速率先用6倍柱体积去离子水洗脱、再用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为蒸馏水)洗脱6倍柱体积至无色，合并洗脱液]，将洗脱液在55℃，60r/min，真空度0.1Mpa条件下减压浓缩至密度为1.1×103kg/m3，然后在冷阱温度-40℃，真空度100Pa条件下冷冻干燥10h，得到稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
实施例3
(1)山葡萄预处理：将山葡萄经过筛选、去柄、清洗后，使用胶体磨3500r/min研磨15min，得到山葡萄浆液，备用；
(2)提取：按照液(提取液)料(上述山葡萄浆液)比为8.5:1(w/w)将0.1％盐酸—65％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和65mL的乙醇，其余为去离子水)提取液加入山葡萄研磨浆中，采用高压脉冲电场提取，电场强度为15kV/cm，脉冲数为6，得到花青素提取液；
(3)离心浓缩：将上述花青素提取液4500r/min条件下离心10min，弃滤渣，取上清液，50℃，50r/min，真空度0.09Mpa条件下减压浓缩至密度为1.05×103kg/m3，得到花青素浓缩液；
(4)D101大孔树脂纯化：将花青素浓缩液用去离子水稀释5倍，在6℃条件下，上样于处理好的D101大孔树脂柱中，上样速率为1.5BV/h，上样后静置20min后进行梯度洗脱，先用5倍柱体积去离子水进行第一次洗脱，之后用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)进行第二次洗脱，洗脱5倍柱体积至大孔树脂柱无色，洗脱速率为1.5BV/h，收集第二次洗脱液，将洗脱液于50℃，50r/min，真空度0.09Mpa条件下减压浓缩至密度为1.05×103kg/m3，，得花青素纯化物膏体，备用；
(5)制备型高效液相色谱分离：用含1％(v/v)HCl甲醇溶液将花青素纯化物膏体稀释15倍得稀释液，将稀释液使用制备型高效液相色谱分离，固定相为SunFire Prep C18柱(10mm×250mm,5μm)；检测柱温25℃；检测波长530nm；进样量2mL；洗脱流速2mL/min；流动相为5％(v/v)甲酸水溶液和甲醇溶液，进行梯度洗脱；0～5min时甲醇溶液体积比由8％上升至10％，5～50min时甲醇溶液体积比维持10％，50～55min时甲醇溶液体积比由10％上升至15％，55～60min时甲醇溶液体积比由15％上升至20％，60～80min时甲醇溶液体积比由20％上升至25％，80～100min时甲醇溶液体积比由25％上升至35％，100～105min时甲醇溶液体积比由35％上升至70％，洗脱结束。收集出峰时间为90～92min时的洗脱液，获得锦葵-3-O-葡萄糖苷溶液；收集然后对锦葵-3-O-葡萄糖苷溶液在冷阱温度-40℃，真空度75Pa条件下冷冻干燥9h，获得高纯度山葡萄锦葵3-O-葡萄糖苷(HPLC测定纯度＞95％)；
(6)使用5倍咖啡酸质量的无水乙醇溶解咖啡酸，加入锦葵3-O-葡萄糖苷，制得混合液，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸的质量份数比为1:4.5；
(7)使用pH值3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上述混合液，使锦葵3-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mg/mL，避光水浴45min，水浴温度55℃；
(8)避光水浴后进行超高压稳态化处理，稳定压力300MPa，稳定时间5min，得到处理液；
(9)将上述处理液以4500r/min转速离心10min后取上清液，经D101大孔树脂纯化后[在6℃条件下，以1.5BV/h的上样速率上样至D101大孔树脂柱中，然后静置20min；接着以1.5BV/h洗脱速率先用5倍柱体积去离子水洗脱、再用0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为蒸馏水)洗脱5倍柱体积至无色，合并洗脱液]，将洗脱液在50℃，50r/min，真空度0.09Mpa条件下减压浓缩至密度为1.05×103kg/m3，然后在冷阱温度-40℃，真空度75Pa条件下冷冻干燥9h，得到稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
对比例1
采用实施例3步骤(1)-步骤(5)制得锦葵3-O-葡萄糖苷。
实验1花青素与咖啡酸比例筛选实验
采用实施例1的步骤进行实验，不同之处在于花青素与咖啡酸的比例选择，测定在521nm处的吸光度值，实验结果如表1所示。
表1花青素与咖啡酸比例选择结果(花青素浓度0.1mg/mL)
以吸光值为指标确定，花青素浓度为0.1mg/mL时，花青素与咖啡酸的比例为1:3～5，吸光值增加至平缓，说明此时的花青素与咖啡酸的比例为最优。
实验2稳态化方法比较实验
①实验设计：
实验组：0.3mg/mL咖啡酸和0.1mg/mL花青素纯化物的反应液，在压力300MPa，加压时间5min的条件下进行键合处理；
对照组1：0.3mg/mL咖啡酸和0.1mg/mL花青素纯化物的反应液，混合2min；
对照组2：0.3mg/mL咖啡酸和0.1mg/mL花青素纯化物的反应液，采用传统方法，在30℃条件下，以50r/min速度，振荡30min，避光反应2h；
空白组：0.1mg/mL花青素纯化物，不做任何处理。
②评价方法：
辅色作用是指花青素通过与有机酸等辅色剂相互作用而提高其颜色强度和稳定性，使天然花青素达到稳态化的有效途径，其效果用辅色率表示。
在最大吸收波长处测定各组吸光值，计算辅色后的辅色率(C)，计算公式如下：
C(％)＝[(A-A0)/A0]×100
式中：A为稳态化处理后花青素溶液的吸光度；A 0为稳定前花青素溶液的吸光度。
结果如表2所示。
表2稳态化方法比较实验结果
组别 A A<sub>0</sub> C(％)
实验组 0.781±0.005 0.549±0.004 42.26
对照组1 0.642±0.005 0.549±0.004 16.94
对照组2 0.712±0.006 0.549±0.004 29.69
空白组 0.549±0.004 0.549±0.004 \
由表2可知，采用超高压辅助有机酸键合花青素的反应效果最好，而且时间仅有5min，效率高，较比传统方法有更广泛的应用前景。
实验3稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物结构鉴定
采用液相色谱-串联质谱法对实施例3制得的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物进行结构鉴定，仪器参数如下：
液相色谱条件：Thermo Syncronis C18色谱柱(100mm×3mm，1.7μm)；流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱：0～2min，8～10％B；2～11min，10％B；11～19min，10～15％B；19～24min，15～20％B；24～27min，20～25％B；27～33min，25～35％B；33～36min，35～45％B；36～38min，45～55％B；38～45min，55～80％B；柱温30℃；流速0.2mL/min；进样量10μL。
质谱条件：采用电喷雾正离子扫描模式(ESI+)，干燥气温度350℃，雾化气流速35arb，辅助气流速10arb，质量扫描范围m/z 50～1000。
锦葵3-O-葡萄糖苷的HPLC图谱如图3所示，稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的HPLC结果如图4所示。
由图3和图4可知，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸在超高压条件下发生反应生成稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
图5为稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的MS/MS图谱，稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的MS/MS数据如表3所示。
表3稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的MS/MS数据
在正离子模式下，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸键合后生成的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物存在准分子离子峰m/z 655.16632，在二级串联质谱中可见碎片离子m/z493.17451，331.14216，150.38797。其中，碎片离子m/z 493.17451是由分子离子m/z655.16632失去1分子质量数为162的咖啡酰基产生的，碎片离子m/z 331.14216是由碎片离子m/z493.17451继续丢失1分子质量数为162的葡萄糖残基产生的；m/z 150.33725是由花青素C环发生0/2位C-C键断裂而产生的0,2A+·自由基正离子。根据结果分析，鉴定锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸键合后的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物为：锦葵-3-O-(6″-O-咖啡酰基)-葡萄糖苷(Malvidin-3-O-(6″-O-caffeoyl)-glucoside)，分子式为C32H31O15，分子量655。
实验4超高压稳态化反应效果评估
以实施例3的方法制备的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物为实验组，以对比例1方法制得的锦葵3-O-葡萄糖苷为对照组，分别测定其在λ521nm处的吸光值，并计算稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的辅色率(C)，计算公式如下：
C(％)＝[(A-A0)/A0]×100
式中：A为实验组的吸光度；A0为对照组的吸光度。
计算结果如表4所示。
表4超高压稳态化反应效果评价
组别 A A<sub>0</sub> C(％)
平行1 0.709 0.477 48.64
平行2 0.703 0.475 48.00
平行3 0.701 0.469 49.47
平均值 48.70±0.74
由表4结果可知，实验组的辅色率为48.70±0.74％。
实验5热稳定性评价
以实施例3的方法制备的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物为实验组，以对比例1方法制得的锦葵3-O-葡萄糖苷为对照组，将样品在100℃条件下处理2h，处理前后分别测定其在λ521nm处的吸光值，计算保存率(R)，计算公式如下：
R(％)＝(At/A)×100
式中：At为热处理后吸光度值；A为热处理前吸光度值。
实验结果见表5。
表5热稳定性评价结果
由表5结果可知，实验组热稳定性明显优于对照组。
实验6光稳定性评价
以实施例3的方法制备的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物为实验组，以对比例1方法制得的锦葵3-O-葡萄糖苷为对照组，将样品在室温自然光条件下处理20d，处理前后分别测定测定其在λ521nm处的吸光值，计算保存率(R)，计算公式如下：
R(％)＝(At/A)×100
式中：At为光处理后吸光度值；A为光处理前吸光度值。
实验结果见表6。
表6光稳定性评价结果
由表6结果可知，实验组光稳定性明显优于对照组。
实验7稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物细胞水平上抗氧化应激作用评价
(1)HUVEC细胞培养
①培养基配置
取F12K、10％FBS及1％Penicillin-Streptomycin溶液(v/v/v，8.9:1:0.1)，配成细胞培养基。
②细胞复苏
取出HUVEC细胞，37℃水浴溶解；转移到5mL细胞培养基中，室温1000～1200rpm/min离心5～10min，弃上清；用含10％胎牛血清的细胞培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，混匀，细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。
③细胞传代
细胞密度达80％时，对细胞进行传代。弃去培养基，用PBS洗一遍；加1～2mL0.25％胰蛋白酶消化1～3min，显微镜下观察，细胞相互分离变圆，即消化完成；弃去胰蛋白酶，加入完全培养基，制成单细胞悬液，单细胞悬液与培养液的比例按1:3的比例传代，细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度条件下扩大培养。
(2)花青素对HUVEC细胞的毒性作用
①实验方法：CCK-8法
CCK-8法是应用成熟的细胞增殖-毒性检测方法。通过酶标仪测定样本在450nm处的吸光度值(OD值)，可以准确反映样本活细胞的相对量。通过比较给药组和对照组活细胞数量，可以间接衡量药物的细胞毒性情况。
②待测物质实验分组：
对照组：空白
实验组1：10μmol/L咖啡酸
实验组2：50μmol/L咖啡酸
实验组3：100μmol/L咖啡酸
实验组4：10μmol/L对比例1的锦葵-3-O-葡萄糖苷
实验组5：50μmol/L对比例1的锦葵-3-O-葡萄糖苷
实验组6：100μmol/L对比例1的锦葵-3-O-葡萄糖苷
实验组7：10μmol/L实施例3的锦葵-3-O-葡萄糖苷衍生物
实验组8：50μmol/L实施例3的锦葵-3-O-葡萄糖苷衍生物
实验组9：100μmol/L实施例3的锦葵-3-O-葡萄糖苷衍生物
③实验步骤：
取对数生长期HUVEC细胞，按5×103个/孔接种于96孔板中，每孔加入培养液200μL；按上述组别浓度分别加入待测物质20μL，置于37℃、5％CO2培养24h；之后加入20μL CCK-8溶液，37℃培养4h；酶标仪测定各孔在450nm处的OD值。
④计算方法：
增值率P(％)＝(实验组OD值/对照组OD值)×100％
抑制率I(％)＝1-(实验组OD值/对照组OD值)×100％
⑤实验结果：
实验结果如表7所示。
表7药物对HUVEC细胞的毒性作用结果
组别 对照组OD值 实验组OD值 增殖率P(％) 抑制率I(％)
实验组1 0.770 0.768 99.7 0.3
实验组2 0.770 0.770 100.0 0.0
实验组3 0.770 0.766 99.5 0.5
实验组4 0.770 0.768 99.7 0.2
实验组5 0.770 0.770 100.0 0.0
实验组6 0.770 0.767 99.6 0.4
实验组7 0.770 0.768 99.7 0.3
实验组8 0.770 0.768 99.7 0.2
实验组9 0.770 0.770 100.0 0.0
由表7结果可知，咖啡酸、锦葵-3-O-葡萄糖苷及锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物对HUVEC细胞无毒性作用，对HUVEC细胞的生长无促进增值作用，对细胞生长是安全的。
(3)H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤模型建立
①实验设置：分别采用浓度为0、100、200、300、500、750、1000μmol/L的H2O2溶液对HUVEC细胞进行不同时间(6、12、24、48h)的处理。
②测定指标：测定不同浓度H2O2对细胞的抑制率I(％)，计算细胞抑制率为50％(IC50)的H2O2浓度，并检测细胞内ROS。
细胞内ROS的产生和增多，将导致细胞衰老或调亡。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，可通过荧光分光光度仪或流式细胞分析仪检测DCF的荧光，进而检测细胞内ROS的水平。
③测定方法：细胞抑制率I的测定方法采用上述CCK-8法；细胞内ROS的测定方法如下：
取对数生长期HUVEC细胞，按5×103个/孔接种于96孔板中，每孔加入培养液200μL，37℃、5％CO2培养箱中培养24h，处理后用PBS润洗细胞1次；按照DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒操作说明，采用酶标仪荧光检测(激发波长为480nm，发射波长为525nm)进行测定，按如下公式计算：
ROS＝A/A0
式中：A为给药组的吸光度值；A0为对照组的吸光度值。
④实验结果：
不同时间点的IC50结果如表8所示。
表8 H2O2诱导细胞不同时间后对细胞IC50的影响
分组 6h 12h 24h 36h
IC<sub>50</sub>(μmol/L) 701.643 616.683 385.778 301.644
由表8结果可知，随着处理时间的延长，H2O2诱导HUVEC细胞氧化应激损伤的IC50逐渐降低，呈现出浓度依赖性。
不同浓度H2O2对HUVEC细胞进行不同时间处理后，细胞内ROS测定结果如表9所示。
表9不同浓度H2O2处理细胞不同时间对细胞内ROS的影响
注：与空白组(0μmolol/L)比较，*代表有显著性差异(p<0.05)，**代表有极显著性差异(p<0.01)
由表9结果可知，当H2O2溶液浓度为300μmol/L时，细胞中的ROS比值与空白组比较开始有显著性差异(p<0.05)，培养24h及48h时，细胞中的ROS比值与空白组比较有显著性差异(p<0.01)，24h时ROS比值为2.56，细胞损伤明显且稳定。
综上，后续实验H2O2诱导模型选择浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h。
(4)咖啡酸(CA)、锦葵3-O-葡萄糖苷(Mv3G)、稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物(Mv3CG)对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤的保护作用
①实验方案：
空白组：不经H2O2处理
对照组：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h
实验组1：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加10μmol的CA
实验组2：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加50μmol的CA
实验组3：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加100μmol的CA
实验组4：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加10μmol的Mv3G
实验组5：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加50μmol的Mv3G
实验组6：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加100μmol的Mv3G
实验组7：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加10μmol的Mv3CG
实验组8：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加50μmol的Mv3CG
实验组9：浓度为300μmol H2O2溶液诱导HUVEC细胞24h，并添加100μmol的Mv3CG
②测定指标：细胞增值率P及细胞ROS
③实验结果：
细胞增殖率P结果如表10所示，细胞ROS结果如表11所示。
表10细胞增值率结果
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组(H2O2)比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)；与添加咖啡酸组(CA)比较，#代表显著性差异(p<0.05)，##代表极显著性差异(p<0.01)；与添加锦葵-3-O-葡萄糖苷组(Mv3G)比较，▲代表显著性差异(p<0.05)，▲▲代表极显著性差异(p<0.01)H2O2
表11细胞ROS结果
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组(H2O2)比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)；与添加咖啡酸组(CA)比较，#代表显著性差异(p<0.05)，##代表极显著性差异(p<0.01)；与添加锦葵-3-O-葡萄糖苷组(Mv3G)比较，▲代表显著性差异(p<0.05)，▲▲代表极显著性差异(p<0.01)H2O2
由表10、表11结果可知，H2O2氧化损伤对照组的细胞增殖率为空白组的0.52倍，有极显著性差异(p<0.01)，表明建模成功，同时细胞内ROS释放量显著增加(p<0.01)。不同浓度的咖啡酸组与对照组相比，细胞增殖率无显著性差异(p>0.05)，说明浓度为100μmol/L的咖啡酸对氧化损伤细胞处理24h时无保护作用；不同浓度的锦葵3-O-葡萄糖苷(Mv3G)组处理后，细胞增殖率显著增加，浓度在100μmol/L时，与对照组相比有显著性差异(p<0.05)，细胞内ROS释放量显著降低(p<0.01)，说明锦葵3-O-葡萄糖苷(Mv3G)组对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤具有一定的保护作用。不同浓度的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物(Mv3CG)组处理后，细胞增殖率显著增加，浓度在50μmol/L与100μmol/L时，与对照组相比分别有显著性差异(p<0.05)和极显著性差异(p<0.01)，分别增至70.45±0.02％、76.14±0.04％，同时细胞内ROS释放量显著降低(p<0.01)，分别降至1.60±0.25％、1.52±0.20％。细胞增殖率和ROS活性指标显示稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物(Mv3CG)的作用效果优于锦葵-3-O-葡萄糖苷(Mv3G)，但未达到统计学差异(p>0.05)。结果表明稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物(Mv3CG)对H2O2诱导HUVEC细胞氧化损伤具有一定的保护作用，作用效果优于锦葵-3-O-葡萄糖苷(Mv3G)。
实验8锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物动物水平上抗氧化应激作用评价
①实验材料：取健康雄性ICR小鼠80只，体重20±2g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)2016-0004。适应性饲养1周后，随机分为4组。
②实验分组：空白组、对照组、实验组1、实验组2。
③实验设置：
对照组、实验组1和实验组2每天腹腔注射98％D-半乳糖，剂量为500mg/kg，空白组腹腔注射等量的生理盐水；实验组1每天灌胃给药对比例1的锦葵3-O-葡萄糖苷(50mg/kgbw)，实验组2每天灌胃给药实施例3的稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物(50mg/kgbw)，空白组和对照组灌胃给予等量的生理盐水。实验周期35天。④测定指标：小鼠体重；小鼠脏器指数；小鼠血清及肝脏的生化指标，包括总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。
⑤测定方法：
小鼠脏器指数的测定：给药喂养35天后，禁食12小时，称重，眼球取血后，迅速摘取出心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺，生理盐水冲洗，滤纸吸干，准确称重，并按如下公式计算：
脏器指数(％)＝脏器重量/小鼠体重×100％
小鼠血清及肝脏中生化指标的测定：小鼠摘取眼球取血，置于离心管中，3000～5000rpm离心10～15min，取上清液用于血清中生化指标的测定。同时摘取小鼠肝脏组织，剔除脂肪，生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，制备10％的肝组织匀浆液，3000～5000rpm离心10～15min，用于肝脏组织中生化指标的测定。按照试剂盒中说明书进行总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定。
⑥测定结果：
各组小鼠体重变化结果如表12所示。
表12小鼠体重变化结果
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
由表12结果可知，锦葵3-O-葡萄糖苷及稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物能明显改善氧化损伤小鼠的各种体征，并对氧化损伤小鼠体重的增长有促进作用。
各组小鼠脏器指数指标如表13所示。
表13小鼠脏器指数指标
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
由表13结果可知，锦葵3-O-葡萄糖苷及稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物能够使损伤小鼠的肝、脾、心、脑、肾、胸腺脏器指数显著升高(p<0.01)。
各组小鼠生化指标测定结果如表14～表18所示。
表14小鼠SOD活性
组别 血清(U/mLprot) 肝脏(U/mgprot)
空白组 17.76±0.85 11.32±0.78
对照组 15.76±1.45<sup>**</sup> 9.35±0.75<sup>**</sup>
实验组1 17.74±1.22<sup>ΔΔ</sup> 11.27±0.98<sup>ΔΔ</sup>
实验组2 17.75±1.43<sup>ΔΔ</sup> 14.30±0.65<sup>ΔΔ▲▲</sup>
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
表15小鼠GSH-Px活性
组别 血清(U/mLprot) 肝脏(U/mgprot)
空白组 270.34±20.65 484.97±20.72
对照组 182.75±40.21<sup>**</sup> 408.60±18.25<sup>**</sup>
实验组1 273.40±21.55<sup>ΔΔ</sup> 478.12±12.09<sup>ΔΔ</sup>
实验组2 280.00±20.85<sup>ΔΔ</sup> 617.28±18.33<sup>ΔΔ▲▲</sup>
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
表16小鼠CAT活性
组别 血清(U/mLprot) 肝脏(U/mgprot)
空白组 8.55±0.82 22.20±0.62
对照组 6.87±0.22<sup>**</sup> 19.70±1.64<sup>**</sup>
实验组1 7.90±0.93<sup>Δ</sup> 21.19±1.18<sup>Δ</sup>
实验组2 8.34±1.4<sup>ΔΔ</sup> 22.19±1.14<sup>ΔΔ</sup>
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
表17小鼠T-AOC活性
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
表18小鼠MDA含量
组别 血清(nmol/mLprot) 肝脏(nmol/mgprot)
空白组 1.54±0.08 0.59±0.07
对照组 3.87±0.23<sup>**</sup> 1.58±0.03<sup>**</sup>
实验组1 2.11±0.54<sup>ΔΔ</sup> 0.67±0.02<sup>ΔΔ</sup>
实验组2 1.86±0.32<sup>ΔΔ</sup> 0.54±0.11<sup>ΔΔ▲▲</sup>
注：与空白组比较，*代表显著性差异(p<0.05)，**代表极显著性差异(p<0.01)；与对照组比较，Δ代表显著性差异(p<0.05)，ΔΔ代表极显著性差异(p<0.01)，与实验组1比较，▲代表有显著性差异(p<0.05)，▲▲代表有极显著性差异(p<0.01)。
由表14～表18数据可知，锦葵3-O-葡萄糖苷及稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物能够显著升高血清及肝脏中SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC等抗氧活酶的活性(p<0.01)，显著降低MDA的含量(p<0.01)，对于肝脏中SOD、GSH-Px及MDA指标，稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的作用效果明显优于锦葵3-O-葡萄糖苷(p<0.01)。结合其细胞水平上抗氧化应激作用评价结果，说明稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物可以通过清除体内自由基进而保护细胞完整和活力，从而达到抗氧化应激作用，且抗氧化损伤能力优于锦葵3-O-葡萄糖苷。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的较为简单，相关之处参见方法部分说明即可。
本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物，其特征在于，其结构如式Ⅰ所示：
2.如权利要求1所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)预处理：将山葡萄经过筛选、去柄、清洗、打浆，得到山葡萄浆液，备用；
(2)提取：按照液料比为5～9:1(w/w)将提取溶剂加入山葡萄浆液中，再采用高压脉冲电场提取花青素，得到花青素提取液；
(3)离心浓缩：将上述花青素提取液做离心处理，取上清液，将上清液减压浓缩至密度为1.0×103～1.1×103kg/m3，得到花青素浓缩液；
(4)D101大孔树脂纯化：将上述花青素浓缩液上样于D101大孔树脂柱中，静置，然后进行梯度洗脱，收集洗脱峰得洗脱液，将洗脱液减压浓缩，得花青素纯化物膏体，备用；
(5)制备型高效液相色谱分离：用含0.5～1％(v/v)HCl甲醇溶液将花青素纯化物膏体稀释10～20倍得稀释液，将稀释液使用制备型高效液相色谱分离，收集洗脱峰，冷冻干燥得锦葵3-O-葡萄糖苷；
(6)使用无水乙醇溶解咖啡酸，咖啡酸与无水乙醇的质量比为1:3～8，之后加入锦葵3-O-葡萄糖苷，制得混合液，锦葵3-O-葡萄糖苷与咖啡酸的质量份数比为1:3～5；
(7)使用pH值3.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释上述混合液，使锦葵3-O-葡萄糖苷的浓度为0.1mg/mL，避光水浴30～60min，水浴温度50～60℃；
(8)避光水浴后进行超高压稳态化处理，稳定压力200～400MPa，稳定时间1～15min，得到处理液；
(9)将上述处理液离心后取上清液，经D101大孔树脂柱纯化后，再经减压浓缩和冷冻干燥，得到稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物。
3.如权利要求2所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)打浆步骤为使用胶体磨2000～4000r/min研磨10～20min。
4.如权利要求3所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述提取溶剂为0.1～0.5％盐酸—55～75％乙醇溶液(v/v，即100mL溶液中含有0.1～0.5mL的HCl和55～75mL的乙醇，其余为去离子水)；电场强度为10～20kV/cm，脉冲数为4～10。
5.如权利要求4所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)与步骤(9)的离心条件为3000～5000r/min离心5～10min。
6.如权利要求5所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)、步骤(4)与步骤(9)减压浓缩的条件为：45～55℃，40～60r/min，真空度0.08～0.1Mpa。
7.如权利要求6所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(4)与步骤(9)D101大孔树脂纯化按如下方法进行操作：
在4～10℃条件下，上样于处理好的D101大孔树脂柱中(2cm×40cm)，上样速率为1～2BV/h，上样后静置15～35min后进行梯度洗脱，先用4～6倍柱体积去离子水进行第一次洗脱，之后用4～6倍柱体积的0.1％HCl—75％乙醇(v/v，即100mL溶液中含有0.1mL的HCl和75mL的乙醇，其余为去离子水)进行第二次洗脱，洗脱至大孔树脂柱无色，洗脱速率为1～2BV/h，收集第二次洗脱峰，得洗脱液，将洗脱液减压浓缩至密度为1.0×103～1.1×103kg/m3，得花青素纯化物膏体。
8.如权利要求7所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中制备型高效液相色谱分离条件如下：
固定相为SunFire Prep C18柱；检测柱温25℃；检测波长530nm；进样量2mL；洗脱流速2mL/min；流动相为5％(v/v)甲酸水溶液和甲醇溶液，进行梯度洗脱；0～5min时甲醇溶液体积比由8％上升至10％，5～50min时甲醇溶液体积比维持10％，50～55min时甲醇溶液体积比由10％上升至15％，55～60min时甲醇溶液体积比由15％上升至20％，60～80min时甲醇溶液体积比由20％上升至25％，80～100min时甲醇溶液体积比由25％上升至35％，100～105min时甲醇溶液体积比由35％上升至70％，洗脱结束；收集出峰时间为90～92min时的洗脱液，冷冻干燥得到锦葵-3-O-葡萄糖苷。
9.如权利要求8所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(5)及步骤(9)冷冻干燥条件为在冷阱温度-40℃，真空度50～100Pa条件下冻干8～10h。
10.如权利要求1-9任意一项所述的一种稳态化锦葵3-O-葡萄糖苷衍生物在抗氧化应激作用中的应用。
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