CN113694106A - 一种欧李果汁发酵液的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种欧李果汁发酵液的制备方法及应用，将欧李果汁进行发酵，通过研究发现欧李果汁发酵液干预后的溃疡性结肠炎大鼠体重下降较缓，且精神状态较佳，且欧李果汁发酵液具有降低大鼠疾病活动指数、减少溃疡性结肠炎引起的盲肠和结肠萎缩的作用，结果表明，欧李果汁发酵液能改善大鼠结肠的氧化应激情况，显著降低大鼠结肠组织炎症因子水平的升高，对于大鼠结肠结构变化也有一定的对抗修复作用，能够改善溃疡性结肠炎引起的机体炎症和免疫性损伤，具有预防和调节溃疡性结肠炎的作用。可见，欧李果汁发酵液可以在制备预防或调节溃疡性结肠炎的保健品中得以应用。

Description

一种欧李果汁发酵液的制备方法及应用
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一种欧李果汁发酵液的制备方法及应用。
背景技术
欧李(Cerasus humilis(Bge.)Sok.，Ouli)是蔷薇科樱属矮生小灌木，其果实富含丰富的多酚类物质、微量元素等，具有较强的抗氧化能力和营养价值。欧李作为第三代功能水果的代表，其风味独特、果香浓郁、营养丰富，保健价值明显。由于欧李果实较软、种仁较小，高糖高酸，将其开发进行深加工作为功能性产品有一定意义。
发酵食品是人类在不断地生存发展的进程中，在一定自然环境下形成具有独特风味、富含营养和贮藏功能良好的食品。发酵的主要功能有：①发酵后风味独特且多样；②提高食品的营养价值和功能；③延长食品贮藏时间。发酵主要利用有益微生物，将原料中的糖类、蛋白质类、脂类等大分子营养物质进行代谢分解，使其分子组成、空间结构或理化性质等发生较大改变，从而形成具有独特风味、贮藏时间较长、保健价值较高的发酵食品。
目前欧李的主要应用主要集中在较少的加工领域，对欧李的营养价值利用尚不充分，需要对其深加工产品进行更多研究。目前已经有研究采用菌种发酵欧李开发果酒、果醋、发酵乳饮料等的相关工艺研究，制备发酵产品可以将欧李的生态价值和经济价值有机结合，但缺乏对其功能的挖掘。本发明的发明人在长期的欧李研究过程中，已经在公开号为CN111616353A的中国发明专利公开了“一种调节肠道菌群的欧李复合发酵液及其制备方法”，该专利公开了欧李复合发酵液能够调节肠道菌群，提高盲肠和结肠内的短链脂肪酸尤其是丁酸的产量；该欧李复合发酵液的发酵方法较为复杂。在对其深入研究的基础上，本发明继续采用益生菌等有益菌对欧李果汁进行发酵制备欧李果汁发酵液，并通过建立大鼠溃疡性结肠炎动物模型，研究欧李果汁发酵液对于溃疡性结肠炎的调节作用，对其进行其它的功能进一步挖掘。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种欧李果汁发酵液的制备方法，通过对欧李果汁的进一步发酵得到欧李果汁发酵液。
本发明的目的之二在于提供欧李果汁发酵液在制备预防或调节溃疡性结肠炎的保健品中的应用，通过对果汁发酵液的深入研究，发现其对于溃疡性结肠炎具有预防和调节作用。
为了实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
其中，上述欧李果汁发酵液的制备方法包括：
(1)制备欧李果汁；
(2)在尚未灭菌的欧李果汁中添加脱脂牛奶，调整糖度为11～13°Bx后，倒入发酵容器中；
(3)将调配好的欧李果汁于85～95℃水浴下灭菌8～9min，冷却至室温后，在超净工作台中接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为1∶1的种子液，于36.5～37.0℃培养箱中进行发酵得到欧李果汁发酵液。
优选地，所述欧李果汁的制备方法为：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到欧李果浆，添加果胶酶，于34.9～35.1℃水浴下酶解4.5～5.0h，用四层纱布过滤，85～95℃水浴下灭菌8～9min，冷却至室温后，得欧李果汁。更优选地，所述欧李果汁的制备方法为：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到，添加果胶酶，于35℃水浴下酶解5h，用四层纱布过滤，90℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，得欧李果汁。
优选地，所述欧李果浆的浓度为49％；果胶酶的添加量为30～31mg/kg，更优选地，果胶酶的添加量为30mg/kg。
优选地，所述脱脂牛奶的浓度为10.0～10.5％，添加量为12.0～12.5％；更佳优选地，所述脱脂牛奶的浓度为10％，添加量为12.3％。
优选地，所述种子液的接种量为6.0～6.5％，种子液在36.5～37.0℃培养箱中的发酵时间为40～42h；更佳优选地，所述种子液的接种量为6％，种子液在37℃培养箱中的发酵时间为41h。
优选地，所述种子液的配制方法为：首先配制营养基质，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000～4 5000r/min离心4～5min获取上清液，110～120℃高压灭菌15～18min，冷却至室温，备用；分别挑取活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别接种于灭菌后的基质中，置于36.5～37.0℃培养箱中分别培养8～10h、24～25h。更优选地，所述种子液的配制方法为：首先配制营养基质，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000r/min离心5min获取上清液，115℃高压灭菌15min，冷却至室温，备用；分别挑取活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别接种于灭菌后的基质中，置于37℃培养箱中分别培养8h、24h。
其中，所述营养基质配方为酵母提取物9.5～10.5g，白砂糖19.0～21.0g，蒸馏水1000～1100mL；优选营养基质配方为：酵母提取物10g，白砂糖20g，蒸馏水1000mL。
本发明最主要的目的在于保护欧李果汁发酵液在制备预防或调节溃疡性结肠炎的保健品中的应用。但是，所述欧李果汁发酵液的制备方法不限于上述制备方法，凡是采用欧李果汁进行发酵得到的发酵液均具有预防或调节溃疡性结肠炎的作用。
本发明的优点：
本发明首先对欧李果汁进行发酵，通过研究发现欧李果汁发酵液干预后的溃疡性结肠炎大鼠体重下降较缓，且精神状态较佳，且欧李果汁发酵液具有降低大鼠疾病活动指数、减少溃疡性结肠炎引起的盲肠和结肠萎缩的作用，结果表明，欧李果汁发酵液能改善大鼠结肠的氧化应激情况，显著降低大鼠结肠组织炎症因子水平的升高，对于大鼠结肠结构变化也有一定的对抗修复作用，能够改善溃疡性结肠炎引起的机体炎症和免疫性损伤，具有调节溃疡性结肠炎的作用。可见，欧李果汁发酵液可以在制备调节溃疡性结肠炎的保健品中得以应用。
附图说明
图1为各组大鼠结肠组织HE染色(×100)；
图中：“Control”为正常组，“DSS”为模型组，“OF”为欧李果汁发酵液组，“OJ”为欧李果汁组。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以从市场中购买获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
一种欧李果汁发酵液的制备方法包括：
(1)制备欧李果汁：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到49％的欧李果浆，添加果胶酶30mg/kg，于35℃水浴下酶解4.5h，用四层纱布过滤，85℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，得欧李果汁；
(2)在尚未灭菌的欧李果汁中添加浓度为10.5％的脱脂牛奶12.0％，调整糖度为11°Bx后，倒入发酵容器中；
(3)将调配好的欧李果汁于85℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，在超净工作台中接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为1∶1的种子液6.0％，于36.5℃培养箱中进行发酵40h得到欧李果汁发酵液。
其中，所述种子液的配制方法为：首先配制营养基质：酵母提取物9.5g，白砂糖19.0g，蒸馏水1000mL；搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000r/min离心5min获取上清液，110℃高压灭菌18min，冷却至室温，备用；分别挑取活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别接种于灭菌后的基质中，置于36.5℃培养箱中分别培养10h、25h。
实施例2
一种欧李果汁发酵液的制备方法包括：
(1)制备欧李果汁：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到49％的欧李果浆，添加果胶酶31mg/kg，于35℃水浴下酶解5h，用四层纱布过滤，85℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，得欧李果汁；
(2)在尚未灭菌的欧李果汁中添加浓度为10.0％的脱脂牛奶12.5％，调整糖度为11°Bx后，倒入发酵容器中；
(3)将调配好的欧李果汁于85℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，在超净工作台中接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为1∶1的种子液6.5％，于37.0℃培养箱中进行发酵42h得到欧李果汁发酵液。
其中，所述种子液的配制方法为：首先配制营养基质：酵母提取物10.5g，白砂糖21.0g，蒸馏水1100mL，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 5000r/min离心4min获取上清液，120℃高压灭菌15min，冷却至室温，备用；分别挑取活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别接种于灭菌后的基质中，置于37.0℃培养箱中分别培养9h、25h。
实施例3
一种欧李果汁发酵液的制备方法包括：
(1)制备欧李果汁：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到49％的欧李果浆，添加果胶酶31mg/kg，于35℃水浴下酶解5h，用四层纱布过滤，85℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，得欧李果汁；
(2)在已有的尚未灭菌的欧李果汁中添加12.3％浓度为10％的脱脂牛奶，调整糖度为12°Bx后，倒入发酵容器中。将调配好的欧李果汁于90℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后在超净工作台中接种6％植物乳杆菌∶嗜酸乳杆菌＝1∶1的种子液，于37℃培养箱中进行发酵41h。发酵结束后得到欧李发酵液，巴氏灭菌法进行灭菌，灭菌后的发酵液活菌数为100CFU/mL，远低于国家活菌型饮料的标准(106CFU/mL)，故可视为灭菌型发酵液。利用蒸馏水调整不同浓度后，分装将其冻存在-80℃，备用。
其中，菌种活化：将-80℃冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌甘油管解冻至室温，在超净工作台分别将100μL、300μL、300μL菌种接种至MRS固体培养基中，37℃下培养箱中培养48h。
种子液制备：配制基质，基质配方为酵母提取物10g，白砂糖20g，蒸馏水1000mL，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000r/min离心5min获取上清液，115℃高压灭菌15min，冷却至室温，备用。挑取上述活化的植物乳杆菌接种于灭菌后的基质中，置于37℃培养箱中培养8h；挑取上述活化的嗜酸乳杆菌于灭菌后的基质中，置于37℃培养箱中培养24h。
应用实例
1材料与设备
1.1样品采集
京欧2号欧李水果采集于河北省保定市满城区欧李种植基地。欧李近成熟期(水果硬度大于85％)采收后迅速冷链转运到实验室，经水洗和去杂质后，分装，-80℃低温保存备用。采收后的样品经北京中医药大学李卫东研究员鉴定为蔷薇科樱属欧李Cerasushumilis(Bge.)Sok的果实，可以用于后续实验研究。
1.2欧李果汁及欧李果汁发酵液制备方法
欧李果汁的制备：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到49％的欧李果浆，按照30mg/kg添加果胶酶，于35℃水浴下酶解5h，用四层纱布过滤，90℃水浴下灭菌8min，冷却至室温后，得欧李果汁。
欧李果汁发酵液的制备：采用实施例3的方法。
1.3动物实验材料及设备
SPF级SD大鼠，4周龄，180-220g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。葡聚糖硫酸钠盐(MW：36000-50000，pH＝5.0-7.5)，购自北京酷来搏科技有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、髓过氧化物酶(myeloperoxidasedeficiency，MPO)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)ELISA试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司。
2实验方法
2.1溃疡性结肠炎大鼠模型制备
大鼠连续7天自由饮用4％DSS溶液即可复制溃疡性结肠炎大鼠模型。
2.2动物分组及给药方法
SD大鼠随机分为4组，正常组、模型组、欧李果汁发酵液组(含49％果浆)、欧李果汁组(含49％果浆)，每组7只。正常组和模型组每天灌胃去离子水，欧李果汁发酵液和果汁预防组每天灌胃欧李发酵液和欧李果汁，灌胃量为100g/mL，持续14天。14天后，正常组自由饮用蒸馏水，模型组、欧李发酵液和欧李果汁组4％DSS诱导构建溃疡性结肠炎模型大鼠，连续干预7天。给药周期共计3周。给药期间每天对动物进行称重，开始造模后的7天，均对疾病活动指数进行评价。
2.3结肠上清液的制备
制备结肠上清液：最后一次灌胃24h后，取大鼠结肠组织，并将结肠组织迅速冻存至-80℃用于检测。将部分结肠组织快速放入圆底密封管中，并置于冰水浴上。向管中加入去离子水(稀释比例为1∶9)并涡旋混匀2min。之后，均质结肠组织样本，并将密闭管继续冰水浴20min，4℃下离心20min，上清液转移至另一圆底密封管中，-80℃冷冻保存。
2.4疾病活动指数评分
疾病活动指数(disease activity index，DAI)评分标准如下：0分，体重无下降，大便干硬、结实，隐血试验2min内无任何紫蓝色及紫红色的颜色反应；1分，体重下降0-5％，大便轻度松散，隐血试验1-2min内显紫红色；2分，体重下降5-10％，大便松软，隐血试验10-60s逐渐显紫红色；3分，体重下降10-15％，腹泻、水样便，隐血试验10s显紫蓝色；4分，体重下降大于15％，黏血便、脓血便，隐血试验3s即显紫蓝色(肉眼血便)。
2.5结肠组织氧化应激状态评价及炎症因子测定
结肠上清液中SOD测定：取冷冻大鼠结肠上清液，复溶后按照SOD试剂盒说明书，进行测定。测定原理为采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活力。通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2 -·)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用酶标仪在550nm处测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，测定管吸光度值低于对照管吸光度值，结果用U/mL或U/g蛋白表示。
结肠上清液中MPO测定：取冷冻大鼠结肠上清液，复溶后按照MPO试剂盒说明书进行测定。测定原理为中性白细胞中存在有MPO，每个细胞所含的酶的量是一定的，约占细胞干重的5％，该酶具有使过氧化氢还原的能力，可以通过这一特点分析酶活力并定量测定中性白细胞的数目。通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物，在460nm处通过比色测定黄色产物的生成量，结果用U/L或U/g组织湿重表示。
结肠上清液中NO测定：取冷冻大鼠结肠上清液，复溶后按照NO试剂盒说明书进行测定。测定原理为NO化学性质活泼，在体内代谢很快转为亚硝酸根离子和硝酸根离子，而亚硝酸根离子又进一步转化为硝酸根离子。本法利用硝酸还原酶特异性将硝酸根离子还原我亚硝酸根离子，在550nm下检测通过显色深浅测定其浓度的高低。
结肠上清液MDA测定：取冷冻大鼠结肠上清液，按照MDA试剂盒说明书，采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid，TBA)法测定MDA含量。过氧化脂质产物中的MDA可与TBA缩合形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，测定结果用nmol/mL单位表示。
炎症因子测定：采用ELISA试剂盒方法测定结肠中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子含量。将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30min，按前述方法配制试剂，备用。设置对照品孔和样品孔，对照品孔中各加对照品50μL。样本孔中加入待测样本50μL，空白孔不加。除空白孔外，对照品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。小心揭掉封板膜，弃去孔内液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1min后弃去，如此重复5次，甩干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)，在450nm波长依序测量各孔的OD值。利用OD值进行含量计算。
2.6结肠组织HE染色
将采血之后的各组小鼠，用手术刀剪开腹部，在冰上迅速取出结肠组织，并用生理盐水进行冲洗，将部分结肠组织浸泡于4％多聚甲醛之中固定。
(1)组织石蜡包埋切片实验步骤：
①取材：新鲜组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液中取出用手术刀在通风橱内将目的部位组织进行修整，然后将修好组织及对应的标签进行脱水。
②脱水：将脱水盒置于脱水机内进行梯度酒精脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I30min-无水乙醇II30min-醇苯5-10min-二甲苯I5-10min-二甲苯II5-10min-蜡I1h-蜡II1h-蜡III1h。
③包埋：把浸好蜡的组织进行包埋。先将融化后的蜡放入包埋框中，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡块凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
④切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上进行切片，待切片展平后用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内进行烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
(2)HE染色实验步骤
①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I20min-二甲苯II20min-无水乙醇I10min-无水乙醇II10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水进行温柔洗涤。
②苏木素染细胞核：切片进行Harris苏木素染3-8min，然后进行自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒后，用自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
③伊红染细胞质：将切片放入伊红染液中染色1-3min。
④脱水封片：将切片依次放入95％酒精I5min-95％酒精II5min-无水乙醇I5min-无水乙醇II5min-二甲苯I5min-二甲苯II5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
⑤显微镜镜检，图像采集分析。
⑥染色结果：细胞核蓝色，细胞质红色。
2.7数据处理
所有数据均采用
Figure BDA0003300251780000083
表示，使用SPSS 24.0进行统计分析，数据符合正态，采用one-way-ANOVA，多重比较选择Tukey方法，非参采用Welch检验。P＜0.05被认为有统计学差异。
3实验结果
3.1大鼠生长发育变化
大鼠的生长发育状态可以通过监测大鼠体重、毛发及精神状态等来评价。大鼠体重变化可以直接衡量欧李发酵液是否会对大鼠的机体状态产生影响。在0-14d时间内，各组大鼠体重稳步上升，见表1数据。期间，大鼠毛发顺滑，摄食量及饮水量正常，精神状态良好，以上都说明欧李果汁发酵液和欧李果汁对正常大鼠生长发育没有影响。在开始自由饮用4％DSS溶液后，DSS组体重下降明显，体重下降速率显著高于欧李发酵液和欧李果汁组，期间观察大鼠粪便，发现模型组大鼠粪便不成型且有隐血特征，同时精神状态日渐较差，倦怠懒动、皮毛失去光泽，甚至部分出现了竖毛、拱背等行为，说明溃疡性结肠炎大鼠模型建立成功。欧李果汁发酵液和欧李果汁干预后的大鼠体重下降较缓，且精神状态较佳，表明其具有一定的预防作用。
表1大鼠实验期间体重(g)变化(
Figure BDA0003300251780000081
n＝7)
Figure BDA0003300251780000082
Figure BDA0003300251780000091
3.2大鼠DAI指数变化
疾病活动指数是对大鼠模型建立过程动态评价的重要指标之一。结果见表2，与正常对照组相比，DSS模型组大鼠疾病活动指数显著升高(P＜0.01)。与模型组相比，欧李发酵液和欧李果汁组大鼠DAI指数均有降低，其中欧李发酵液组作用更显著(P＜0.05)。在造模初期1-3d范围内，欧李发酵液组与DSS组的疾病活动指数均上升较为明显，但在造模后期，前期进行欧李果汁发酵液预防作用凸显，其DAI指数变化速度放缓，后期呈现下降趋势。欧李果汁组相比模型组也由于下降趋势，无统计学差异。
表2大鼠实验期间DAI指数变化(
Figure BDA0003300251780000092
n＝7)
Figure BDA0003300251780000093
注：与正常组组相比，“**”代表两组间具较显著差异(P＜0.01)；与模型组组相比，“#”，代表两组间具显著差异(P＜0.05)。
3.3大鼠结肠氧化应激状态变化
结肠黏膜中含有的SOD酶同样可以对外界的炎症刺激做出反应，如图表3所示，与正常对照组相比，模型组中结肠组织SOD活性显著降低(P＜0.001)。与模型组相比，经预防14d后的大鼠，结肠组织SOD活性显著增强，说明欧李果汁发酵液的摄入能够对抗DSS引起的SOD活性的降低。
如表3所示，结肠组织中的MPO活性显著增加，是对照组的3倍(P＜0.001)。同时，欧李发酵液的摄入也能显著降低DSS引起的结肠炎症，降低结肠组织的MPO活性。
结果见表3，与对照组相比，模型大鼠结肠组织中的MDA含量显著增加(P＜0.01)。而欧李发酵液则可以显著降低DSS引起的溃疡性结肠炎大鼠的结肠炎症，使结肠组织中的MDA含量显著降低。
NO含量变化如表3所示，模型组大鼠结肠组织中NO含量相比于正常组其含量显著增高了两倍多(P＜0.01)，表明了模型组大鼠剧烈的氧化应激状态的变化，而摄入欧李果汁发酵液和欧李果汁的DSS大鼠其NO含量与模型组大鼠有较显著差异(P＜0.01)。
表3各组大鼠结肠中SOD、MPO、MDA及NO含量(
Figure BDA0003300251780000094
n＝7)
Figure BDA0003300251780000095
Figure BDA0003300251780000101
注：与正常组组相比，“*”，代表两组间具显著差异(P＜0.05)，“**”代表两组间具较显著差异(P＜0.01)，“***”代表两组间具极显著差异(P＜0.001)；
与模型组组相比，“#”，代表两组间具显著差异(P＜0.05)，“##”代表两组间具较显著差异(P＜0.01)，“###”代表两组间具极显著差异(P＜0.001)。
3.4大鼠结肠组织炎症因子变化
促炎症因子会对肠道黏膜屏障和机体免疫状态发挥重要影响，因此选取了TNF-α、IL-1β及IL-6在组织中的含量测定。如表4所示为TNF-α、IL-1β及IL-6在大鼠结肠中的含量变化。与空白组相比，模型组结肠组织中的炎症因子均显著上升(P＜0.05)，表明DSS造模可引发机体及结肠局部的组织发生炎症因子的变化，并伴有较为严重的炎症反应。而欧李果汁发酵液组在调节促炎症因子方面有良好效果，可以显著降低结肠中TNF-α、IL-1β及IL-6含量(P＜0.05)。与模型组相比，果汁组对于3个炎症因子水平的调节不及欧李果汁发酵液组。
表4各组大鼠结肠中TNF-α、IL-1β及IL-6含量(
Figure BDA0003300251780000102
n＝7)
Figure BDA0003300251780000103
注：与正常组组相比，“*”，代表两组间具显著差异(P＜0.05)，“**”代表两组间具较显著差异(P＜0.01)；与模型组组相比，“#”，代表两组间具显著差异(P＜0.05)，“##”代表两组间具较显著差异(P＜0.01)。
3.5大鼠结肠结构变化
结肠HE染色可以直接观察结肠肠道黏膜屏障的物理屏障的变化，结果见图1。由图可知正常组大鼠的结肠绒毛形态完整，结肠黏膜的上皮细胞及结构清晰整齐，组成结肠的四层结构完整且界限明显，未观察到任何病变。而经DSS诱导后的大鼠结肠组织其结肠上皮结构遭到破坏，肠绒毛不完整，出现脱落坏死等情况，黏膜层细胞缺失，炎性细胞浸润现象明显。而预防后的欧李发酵液组及欧李果汁组，其上皮结构完整，结肠黏膜结构基本正常，组织损伤有不同程度的对抗，结肠黏膜结构基本正常，且欧李发酵液组相比欧李果汁组效果显著。结果表明，欧李发酵液提前摄入对DSS引起的溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理变化有明显的对抗修复作用。
欧李果汁发酵液干预后的溃疡性结肠炎大鼠体重下降较缓，且精神状态较佳，且欧李果汁发酵液具有降低大鼠DAI指数、减少溃疡性结肠炎引起的盲肠和结肠萎缩的作用，此外，溃疡性结肠炎主要受到环境、遗传、微生物、免疫等因素的影响，目前较为认可的机制是免疫异常学说，发病机制与炎症介质增多、机体免疫功能异常有重要关系，而本研究结果表明，欧李果汁发酵液能改善大鼠结肠的氧化应激情况，显著降低大鼠结肠组织炎症因子水平的升高，对于大鼠结肠结构变化也有一定的对抗修复作用，能够改善溃疡性结肠炎引起的机体炎症和免疫性损伤，具有调节溃疡性结肠炎的作用。
本实验采用溃疡性结肠炎大鼠模型，通过测定模型组和给药组大鼠关于溃疡性结肠炎的指示性指标，包括一般指标中的大鼠体重变化、大鼠DAI指数变化及结肠的表观变化，大鼠血清、结肠的氧化应激情况、大鼠血清及结肠组织炎症因子变化及大鼠结肠结构变化，表明欧李果汁发酵液对于溃疡性结肠炎具有一定的预防和改善作用。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (9)

1.一种欧李果汁发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)制备欧李果汁；
(2)在尚未灭菌的欧李果汁中添加脱脂牛奶，调整糖度为11～13°Bx后，倒入发酵容器中；
(3)将调配好的欧李果汁于85～95℃水浴下灭菌8～9min，冷却至室温后，在超净工作台中接种植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌的质量比为1∶1的种子液，于36.5～37.0℃培养箱中进行发酵得到欧李果汁发酵液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述欧李果汁的制备方法为：选取成熟度一致、无损伤、无病虫害的欧李果实洗净，去核，用榨汁机破碎得到欧李果浆，添加果胶酶，于34.9～35.1℃水浴下酶解4.5～5.0h，用四层纱布过滤，85～95℃水浴下灭菌8～9min，冷却至室温后，得欧李果汁。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述欧李果浆的浓度为49％；果胶酶的添加量为30～31mg/kg。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂牛奶的浓度为10.0～10.5％，添加量为12.0～12.5％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子液的接种量为6.0～6.5％，种子液在36.5～37.0℃培养箱中的发酵时间为40～42h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子液的配制方法为：首先配制营养基质，搅拌均匀后，置于高速离心机中，转速4 000～4 5000r/min离心4～5min获取上清液，110～120℃高压灭菌15～18min，冷却至室温，备用；分别挑取活化后的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，分别接种于灭菌后的基质中，置于36.5～37.0℃培养箱中分别培养8～10h、24～25h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述营养基质配方为酵母提取物9.5～10.5g，白砂糖19.0～21.0g，蒸馏水1000～1100mL。
8.权利要求1-7任一项制备方法制备得到的欧李果汁发酵液在制备预防或调节溃疡性结肠炎的保健品中的应用。
9.一种欧李果汁发酵液在制备预防或调节溃疡性结肠炎的保健品中的应用。
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