TWI824330B - 經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物及其製備方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物及其製備方法，嘉寶果經乳酸菌發酵後，其萃取物具有更佳的抗氧化、美白及抗光老化之功效，可應用於化粧品或保養品中。
Description
本發明係關於一種經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物及其製備方法，具體而言，係關於一種應用於抗氧化、美白及抗光老化之乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物及其製備方法。
「乳酸菌」泛指能利用碳水化合物進行發酵生產多量乳酸之細菌總稱，其中又有乳酸桿菌(
Lactobacillus)、念球菌(
Leuconostoc)、鏈球菌(
Streptococcus)等不同類別。在過去發現，當食物經過乳酸菌發酵處理過後，會有特殊的風味，並增強人體內的有益菌叢，因而廣泛的運用在食品及保健食品中。
植物乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)為一種革蘭氏陽性(Gram positive)兼性厭氧菌，存在於多種蔬菜發酵物(如：泡菜、酸菜)中，生長環境於15~45℃的培養溫度，可生成D/L兩種光學異構型乳酸。
嘉寶果原產地為南美洲巴西，名稱由英文Jaboticaba音譯而來，學名：
Plinia cauliflora，舊學名
Myrciaria cauliflora，為熱帶、亞熱帶水果，常綠果樹，終年枝葉茂密，花為白色小花，果實形似葡萄，但會密集結果於樹幹上，故又稱「樹葡萄」。
嘉寶果之產季為4~6月以及9~12月，風味特殊，果肉呈半透明狀，內含一籽。有研究發現，嘉寶果富含多種酚類化合物，包括花青素、類黃酮、單寧、酚類酸以及多酚，其具有豐富的維生素能增強抵抗力，減少疾病對身體的傷害，含有豐富的B群能夠維護神經系統的正常功能。
皮膚會隨著年齡增加及內在和外界因素而逐漸氧化衰老，內在因素主要來自於精神壓力、疲勞、失眠、熬夜、憂慮等等；外界因素包含：紫外線、空氣汙染及飲食不均缺乏營養等，人們為了延緩衰老，因此開始關注攝取具有抗氧化效果的天然水果。
美白為因應現代社會部分客群需求，各界早已發現開發具有高度商業價值的美白產品。近年來研究發現，抑制酪胺酸酶以減少黑色素生成，是有效的美白機制。為了找到具有美白效果的天然化合物，利用體外及細胞試驗觀察酪胺酸酶抑制力是一個具參考性的方式。
因此，為了能有效從天然水果中萃取出具有美白效果的天然化合物，需開發一種新的製備方法。
有鑑於上述之問題，本發明的目的在於克服上述習知技術的不足之處，進而提供一種更具有抗氧化及美白效果之天然水果萃取物。
首先，將植物乳桿菌以蔬菜來源的全素MRS broth培養基來進行培養，而一般植物乳桿菌常用的MRS broth培養基皆含動物來源，且其中蛋白腖(peptone)係為牛或豬作為來源取得，屬於葷食；另含豬來源蛋白腖的MRS broth培養基會不符合清真halal認證，故本發明以嘉寶果及蔬菜來源的全素MRS broth培養基進行植物乳桿菌的發酵，開發全素且具有抗氧化、美白功效的經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物及其製備方法。
目前尚未有相關研究報導有關於嘉寶果經乳酸菌發酵後，具有抗光損傷之功效，本發明之經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物可減少因UVB照後DNA斷裂的損傷，進而達到抗光老化之功效，尤其是光保護力可達62%以上。
經實驗結果證實，在特定之製備條件下所獲得之經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，具有更佳的抗氧化、美白功效及光保護力，且其功效可大幅提升，並可用於抗氧化、修復、美白、光保護之化粧品或保養品中的應用。
以下，藉由具體實施例配合所附的圖式詳加說明，當更容易瞭解本發明之目的、技術內容、特點及其所達成之功效。
以下內容將搭配圖式，藉由特定的具體實施例說明本發明之技術內容，熟悉此技術之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用。本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不背離本發明之精神下，進行各種修飾與變更。
實驗材料
1.嘉寶果(Plinia cauliflora,Taiwan)，係由台灣南投地區或取得。
2. 乳酸菌係使用植物乳桿菌(
Lactobacillus plantarum)，其寄存編號為BCRC 10069。
3.MRS broth培養基係使用蔬菜來源之全素MRS broth培養基(HiMedia
@HiVeg MV369)。
實施例1
嘉寶果發酵比例之篩選
1.種菌培養：將植物乳桿菌(BCRC 10069)以5.5wt%之MRS broth培養基(HiMedia
@HiVeg MV369)培養18~24小時，較佳為21小時；而培養種菌之溫度為35℃，培養箱之轉速為50~150rpm，較佳為150rpm。
2.嘉寶果發酵：將1~2.5wt%之MRS broth培養基(HiMedia
@HiVeg MV369)與47.5~69wt%之水進行滅菌後，加入30-50wt%之嘉寶果，並在含有不同比例之嘉寶果、培養基及水之組合物的各實驗組中加入5wt%之種菌菌液，在溫度35℃下進行24小時發酵，培養箱之轉速為150rpm。其配方如下表1所示。
表1
| 比例篩選實驗組 | J1 | J2 | J3 | J4 | J5 | J6 | J7 |
| 嘉寶果(wt%) | 30 | 30 | 30 | 40 | 50 | 40 | 50 |
| 培養基(wt%) | 2.5 | 1.5 | 1 | 2.5 | 2.5 | 1.5 | 1.3 |
| 水(wt%) | 67.5 | 68.5 | 69 | 57.5 | 47.5 | 58.5 | 48.7 |
| 總和(wt%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
3.萃取：將所得之嘉寶果發酵物使用高速離心機進行離心，旋轉速率為1300~3600rpm，較佳為3000rpm；離心15~40分鐘，較佳為20~35分鐘；經離心後所獲取之上清液，進行後續試驗。
4.乳酸含量分析：將上述各組嘉寶果發酵物離心後所獲取之上清液(即發酵產物)，使用甲醇稀釋100倍，並經0.22µm濾膜過濾後，以HPLC檢測乳酸含量。使用管柱：synergi fusion-RP(150x4.6mm)、溫度25℃、注射體積1µL、流速1mL/min、移動相:磷酸甲醇溶液。
參照第1圖，第1圖係為使用不同比例之嘉寶果、培養基及水之組合物，以乳酸菌進行發酵後之乳酸含量示意圖，由圖中可看出，J1配方的乳酸含量最高，約為2.38%；因此，以J1配方進行後續製程優化、抗氧化及美白試驗。
實施例2
製程優化
在發酵過程，水果本身即有天然微生物存在，以酵母菌、乳酸菌類居多，且該等菌類均對MRS broth培養基以及本發明所用之植物乳桿菌(BCRC10069)會有共生之特性，故進行嘉寶果有無滅菌、有無添加種菌，以及僅添加種菌無放入嘉寶果等條件下進行發酵之差異比較，實驗配方如下表2所示。
表2
| 製程優化實驗組 | J1-1 | J1-2 | J1-1N | J1-2N | J1-2C |
| 嘉寶果(wt%) | 30 | 30 | 30 | 30 | - |
| 培養基(wt%) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
| 水(wt%) | 67.5 | 67.5 | 67.5 | 67.5 | 97.5 |
| 總和(wt%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 備註 | 培養液先滅菌，後添加嘉寶果，再加入種菌 | 嘉寶果與培養液一同滅菌，再加入種菌 | 培養液先滅菌，後添加嘉寶果，無接種菌 | 嘉寶果與培養液一同滅菌，無接種菌 | 僅添加種菌，無放入嘉寶果 |
1.種菌培養：將植物乳桿菌(BCRC 10069)以5.5wt%之MRS broth培養基(HiMedia
@HiVeg MV369)培養18~24小時，較佳為21小時；而培養種菌之溫度為35℃，培養箱之轉速為50~150rpm，較佳為150rpm。
2.嘉寶果發酵：製程分別為嘉寶果不滅菌、嘉寶果與MRS broth培養基一起滅菌、無添加種菌發酵以及僅添加種菌無放入嘉寶果等組別進行比較，將2.5wt%之MRS broth培養基(HiMedia
@HiVeg MV369)與67.5wt%之水或97.5wt%之水(僅添加種菌，無放入嘉寶果之空白組)分別進行滅菌後，加入30wt%之嘉寶果，並在各實驗組中加入5wt%之種菌菌液，在溫度35℃下進行24小時發酵，培養箱之轉速為150rpm。其配方如上表2所示。
3.萃取：將所得之嘉寶果發酵物以及僅添加種菌之發酵物之各實驗組使用高速離心機進行離心，旋轉速率為1300~3600rpm，較佳為3000rpm；離心15~40分鐘，較佳為20~35分鐘；經離心後所獲取之上清液，進行後續試驗。
參照第2圖，第2圖係為使用特定比例之嘉寶果、培養基及水之組合物，以嘉寶果是否滅菌、乳酸菌是否添加，以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵後之乳酸含量示意圖；因未添加種菌之J1-1N以及J1-2N之組別均未測得乳酸含量，因此第2圖中僅有J1-1、J1-2以及J1-2C三組數據。由圖中可看出J1-1、J1-2以及J1-2C三組的乳酸含量依序為2.32%、2.23%以及0.95%，代表經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物中，有無滅菌在產出乳酸含量上之差異不大，均可產出至少2%以上之乳酸，故再進一步進行功效性之評估。
實施例3
DPPH抗氧化力分析
將實施例2之製程優化實驗組J1-1~J1-2C五組發酵得到之發酵萃取物分別稀釋為0.625%、1.25%、2.5%、5%及10%，進行DPPH自由基清除試驗，其結果如第3圖所示；由圖中可知，各組於濃度越低時，其DPPH自由基清除力越低，而J1-2組在稀釋至0.625%時，仍然高於其他組別，且清除力大於20%。
再經上述實驗結果計算得出IC
50，IC
50為抑制50%DPPH自由基時所需的濃度，濃度越低表示抗氧化力越強。參考下表3，當達IC
50時，J1-1~J1-2C各組所需濃度分別依序為2.38%、1.56%、5.67%、2.19%以及42.35%，其中以J1-2此組的自由基清除能力最佳。
表3
| 組別 | IC 50(wt%) |
| J1-1 | 2.38 |
| J1-2 | 1.56 |
| J1-1N | 5.67 |
| J1-2N | 2.19 |
| J1-2C | 42.35 |
實施例4
總還原力試驗
將實施例2之製程優化實驗組J1-1~J1-2C五組發酵得到之發酵萃取物進行總還原力試驗。參照第4圖，第4圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之總還原力示意圖。由圖中可知，製程優化實驗組J1-1~J1-2C五組發酵得到之每克發酵萃取物相對於沒食子酸(gallic acid)的總還原力(mg of (gallic acid equivalent)GAE/g)依序約為1.0mg、1.4mg、0.9mg、1.2mg及0.2mg；此結果為J1-2組優於J1-1組，而經發酵組(J1-1、J1-2)優於無接種菌組(J1-1N、J1-2N)。此外，由空白組(J1-2C)比較得知嘉寶果經乳酸菌(即植物植物乳桿菌，寄存編號為BCRC 10069)發酵可提升總還原力，J1-2組之總還原力為J1-2C組之7倍。
實施例5
總酚含量試驗
以酚類指示劑(Folin-Ciocalteu's phenol reagent)檢測製程優化實驗組J1-1~J1-2C五組中酚類化合物的含量；如各組中含有酚類化合物，則會與酚類指示劑在波長750nm反應呈色，當吸光值越高，表示樣品中所含多酚類物質越多，抗氧化能力越強。在本試驗中以沒食子酸做爲正對照組，以比較本發明J1-1~J1-2C各組相較於沒食子酸(正對照組)的相對總酚含量。
參照第5圖，第5圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之總酚含量示意圖。由圖中可知，製程優化實驗組J1-1~J1-2C發酵得到之發酵萃取物的總酚含量依序約為1.0、1.6、1.1、2.0及0.1(mg of GAE/g)；此結果為J1-2組優於J1-1組，但經無接種菌組(J1-1N、J1-2N)卻優於發酵組(J1-1、J1-2)，應為嘉寶果本身含有大量酚類化合物，推測嘉寶果未經微生物發酵，造成酚含量較高之情形，且經試驗發現總酚含量越少，DPPH抗氧化力則越強，更可證實植物乳酸桿菌(BCRC 10069)會攝取嘉寶果中的酚類化合物，產出其他抗氧化物質。
實施例6
體外酪胺酸酶抑制試驗
將製程優化實驗組J1-1~J1-2C發酵得到之發酵萃取物分別稀釋0.5%、1%、2%及5%進行體外酪胺酸酶抑制試驗，並將實驗結果計算得出IC
50，IC
50為抑制50%酪胺酸酶時所需的濃度，濃度越低表示酪胺酸酶抑制能力越強。參考下表4，當達IC
50時，J1-1~J1-2C各組所需濃度分別依序為4.28%、3.99%、7.69%、5.06%及11.61%，其中以J1-2此組的酪胺酸酶抑制能力最佳。此結果為J1-2組優於J1-1組，而經發酵組(J1-1、J1-2)優於無接種菌組(J1-1N、J1-2N)；此外，由空白組(J1-2C)比較得知嘉寶果經乳酸菌(即植物植物乳桿菌，寄存編號為BCRC 10069)發酵可提升抑制體外酪胺酸酶活性，J1-2組之酪胺酸酶抑制能力為J1-2C組之2.9倍。
表4
| 組別 | IC 50(wt%) |
| J1-1 | 4.28 |
| J1-2 | 3.99 |
| J1-1N | 7.69 |
| J1-2N | 5.06 |
| J1-2C | 11.61 |
實施例7
細胞中酪胺酸酶抑制
以細胞密度為5×10
4cells/well的B16F10小鼠皮膚黑色素瘤細胞種入24孔培養盤中，置入37°C、5%CO
2培養箱24小時；接著換置J1-1~J1-2C各組加入24孔培養盤中，置入37°C、5%CO
2培養箱24小時，離心取出酪胺酸酶酵素，再與L-DOPA進行試驗，經實驗結果計算得出IC
50，IC
50為抑制50%酪胺酸酶時所需的濃度，濃度越低表示酪胺酸酶抑制能力越強。
參照第6圖，第6圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之酪胺酸酶抑制力示意圖。當達IC
50時，J1-1~J1-2C各組所需濃度分別依序為0.67%、0.31%、1.84%、1.61%及4.21%，其中以J1-2此組的酪胺酸酶抑制能力最佳。此結果為經發酵組(J1-1、J1-2)優於無接種菌組(J1-1N、J1-2N)，而J1-2組之酪胺酸酶抑制能力為J1-2N組之5.19倍，且J1-2組之酪胺酸酶抑制能力為J1-2C之13.6倍。
實施例8
MTT試驗(細胞存活率試驗)
將製程優化實驗組J1-2發酵得到之發酵萃取物分別稀釋至2.5%以及0.625%後，進行Hs68細胞存活率試驗(使用MTT試劑)。參照第7圖，第7圖係以具有最佳酪胺酸酶抑制力的經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，進行細胞存活率試驗之示意圖。由圖中可知，Hs68細胞在含有稀釋至2.5%以及0.625%的J1-2組之發酵萃取物時，細胞存活率依然高於80%，因此確定J1-2組之發酵萃取物無細胞毒性。
實施例9
光保護力試驗(UV光)
使用alpha plate 24孔盤，每格種入1x10
5的HS68細胞，體積為500µl，分種2盤，種入至少隔6小時待細胞貼壁後，移除全部舊DMEM培養基，更換500µl含有稀釋至2.5%以及0.625%的J1-2組之發酵萃取物的新無血清DMEM培養基培養24小時，以PBS清洗孔盤，將其中一盤細胞送入核酸固定儀中以開蓋方式照射UVB 2.5J/cm
2，照射完畢後移除PBS更換500µl的新DMEM培養基，培養3小時後，每格加入50µl的MTT試劑，再培養3小時，移除DMEM培養基，加入500µl的DMSO回溶，以ELISA波長570nm偵測。
將製程優化實驗組J1-2發酵得到之發酵萃取物分別稀釋至2.5%以及0.625%後，進行Hs68細胞之光保護力試驗，其中正控制組係添加5ppm之水飛薊素(Silimarin)，為一種抗氧化劑。參照第8圖，第8圖係以具有最佳酪胺酸酶抑制力的經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，進行光保護力試驗之示意圖。由圖中可知，經UV照射Hs68細胞後之光損傷，空白組(C)光保護力為0%，J1-2組稀釋至2.5%以及0.625%之光保護力依序為62.62%以及37.48%。故由試驗結果得知，在安全劑量下，隨著J1-2組發酵得到之發酵萃取物的濃度越高，光保護力也隨之增加，證實經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物的確具有光保護之效力，且光保護力可達50%以上。
綜上所述，本發明確立最適化配方比例發酵嘉寶果之製程，由從J1-J7等組別篩選，並以HPLC檢測發酵液之乳酸(乳酸菌代謝產物)含量，挑選出乳酸含量最高之組別，再依功效性測試結果改良製程方法-嘉寶果有滅菌及無滅菌之差異。從J1-J7各組發酵所得之萃取物，經HPLC檢測得知J1配方為最適合乳酸菌生長之環境，以此接續實驗後發現抗氧化試驗、體外及細胞端酪胺酸酶抑制中，J1-2組功效均優於J1-1組，證實製程中嘉寶果在進行發酵前與培養基一同經高溫高壓滅菌處理，可有效提高抗氧化及美白功效。在發酵組(J1-1、J1-2)與無接種菌組(J1-1N、J1-2N)及空白組(J1-2C)的比較可以發現，嘉寶果的DPPH自由基清除力、總還原力、體外及細胞端酪胺酸酶抑制效果都會因植物乳桿菌(BCRC10069)發酵代謝而上升，證明其經發酵後無法預期之功效；另與J1-2C組的比較也可以證明，該功效來源不是來自於培養基，添加培養基之目的僅為輔助植物乳桿菌的生長。
綜上，經實驗結果證實，在特定之製備條件下所獲得之經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，具有更佳的抗氧化、美白功效及光保護力，且其功效可大幅提升，並可用於抗氧化、修復、美白、光保護之化粧品或保養品中的應用。
本發明所屬技術領域者能夠自前述內容理解，本發明可藉由其他具體形式例式之而不改變本揭露內容之技術概念或本質特徵。就此而言，本文中揭露之例示性態樣係僅用於例示性說明之用，且不應解釋為限制本揭露內容之範疇。反之，本揭露內容係傾向於不僅涵蓋該等例示性態樣，亦涵蓋可包括於如後所附申請專利範圍定義者之本發明內容之精神及範疇內的多種變更、修飾、均等物、及其他態樣。
無
以下搭配圖式，對於本發明進行進一步說明：
第1圖係為使用不同比例之嘉寶果、培養基及水之組合物，以乳酸菌進行發酵後之乳酸含量示意圖；
第2圖係為使用特定比例之嘉寶果、培養基及水之組合物，以嘉寶果是否滅菌、乳酸菌是否添加，以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵後之乳酸含量示意圖；
第3圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之DPPH自由基清除力示意圖；
第4圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之總還原力示意圖；
第5圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之總酚含量示意圖；
第6圖係為在不同條件下，經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物以及不加入嘉寶果且僅添加乳酸菌之條件下進行發酵所的萃取物之酪胺酸酶抑制力示意圖；
第7圖係以具有最佳酪胺酸酶抑制力的經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，進行細胞存活率試驗之示意圖；
第8圖係以具有最佳酪胺酸酶抑制力的經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，進行光保護力試驗之示意圖。
Claims (5)
- 一種經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，該嘉寶果萃取物係將嘉寶果以BCRC編號10069寄存之植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)發酵所得之產物中萃取而得，其中，該嘉寶果萃取物之DPPH自由基清除能力達到IC50時，該嘉寶果萃取物之使用濃度為1.56wt%；該嘉寶果萃取物相對於沒食子酸的總酚含量為1.6(mg of GAE/g)；該嘉寶果萃取物抑制體外酪胺酸酶活性達到IC50時，該嘉寶果萃取物之使用濃度為3.99wt%；該嘉寶果萃取物抑制細胞中酪胺酸酶活性達到IC50時，該嘉寶果萃取物之使用濃度為0.31wt%；以及該嘉寶果萃取物係以MRS broth培養基、水及嘉寶果之總重量計，將2.5wt%之MRS broth培養基、67.5wt%之水進行滅菌後，加入30wt%經滅菌之嘉寶果，並加入5wt%之該乳酸菌的種菌菌液發酵24小時所得。
- 如請求項1所述之經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，其中該嘉寶果萃取物稀釋至2.5wt%，使用於Hs68細胞後，該Hs68細胞之存活率大於80%。
- 如請求項1所述之經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物，其中該嘉寶果萃取物稀釋至2.5wt%，使用於HS68細胞並照射UV後，其光保護力達62%以上。
- 一種如請求項1所述經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物之製備 方法，該製備方法包括：以植物乳桿菌及MRS broth培養基之總重量計，將植物乳桿菌以5.5wt%之MRS broth培養基，於35℃、50~150rpm下培養18~24小時，作為種菌；以MRS broth培養基、水及嘉寶果之總重量計，將2.5wt%之MRS broth培養基、67.5wt%之水進行滅菌後，加入30wt%之嘉寶果，並加入5wt%之該種菌的菌液，於35℃、150rpm下發酵24小時，得到嘉寶果發酵物；以及將該嘉寶果發酵物使用高速離心機於1300~3600rom、15~40分鐘下離心後，所獲取之上清液即為該嘉寶果萃取物，其中該嘉寶果在加入該種菌的菌液前，進行滅菌。
- 一種經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物用於抗氧化、美白、光保護之化粧品或保養品中的用途，其中該經乳酸菌發酵之嘉寶果萃取物係如請求項4之製備方法所製備而成。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 網路文獻 李姿芳 ，嘉寶果萃取之化妝品活性及其多酚微膠囊之製備， 弘光科技大學化妝品科技 研究所碩士論文， 上架日:2016/11/10。 |
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