CN109651532A - 一种铁皮石斛葡甘聚糖 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于所述铁皮石斛葡甘聚糖的重均相对平均分子量为398.4 kDa；所述铁皮石斛葡甘聚糖中甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.32：1，糖链连接方式为1,4‑Man(p)：1,4‑Glc(p)：t‑Man(p)：t‑Glc(p)摩尔比为3.77：1.00：0.08：0.03。其提取方法包括：铁皮石斛粗多糖提取——、铁皮石斛精多糖分离——纯化铁皮石斛纯多糖纯化过程。本发明所提供的新的铁皮石斛葡甘聚糖具有很好的抗黑色素瘤细胞活性，在制备抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种铁皮石斛葡甘聚糖
技术领域
本发明属于制药领域。更具体地，涉及一种铁皮石斛葡甘聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
多糖具有复杂多样的结构和生物活性，特别是在增强机体免疫力和抗肿瘤方面有良好的作用。恶性黑色素瘤是一种高度恶性肿瘤，多发生于皮肤，发病率在过去几十年中正逐步提高，成为皮肤的首位致死性疾病。主要由日光暴晒、遗传、性别、激素和黑色素细胞痣等原因引起。
铁皮石斛Dendrobium catenatum Lindley（D. officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属名贵药用植物，茎入药，始载于《神农本草经》，列为上品；具有益胃生津，滋阴清热的功效；2010年版《中国药典》特将铁皮石斛从药材石斛中划出，单独收载。野生铁皮石斛濒临灭绝，被列入《中国植物红皮书》，20世纪90年代以前完全依靠野生资源，没有形成产业，成为稀缺药材。随着种子生产、组培育苗和设施栽培等人工栽培关键技术的突破，铁皮石斛全国栽培面积超10万亩，产值达200亿元，成为我国市场份额最大、发展最快的中药材之一。
铁皮石斛多糖是一类混合物，是铁皮石斛中所含的高分子碳水化合物的总称，在铁皮石斛中含量丰富，约占茎的干重的25～60%。具有免疫调节、抗氧化、抗心肌细胞损伤等活性。多糖的药理活性与其相对分子质量、单糖组成、糖苷键类型等密切相关，牛樟芝多糖需要相对分子质量大于100 kDa才具有明显抗血管生成作用，手掌参多糖的免疫活性明显受其α-1,4-半乳糖醛酸和β-1,4-甘露糖苷键影响。近年来，石斛属植物多糖的研究取得了很大的进展，但与蛋白质、核酸和小分子化合物的研究相比还有很大距离，并且不够深入，主要有以下方面的问题：（1）多糖的构效关系阐释不清晰，通常认为多糖的活性与糖链组成和连接方式等一级结构、分子量、溶解度和高级结构等相关，但缺乏系统性研究和充分的科学依据，大多尚属推测和分析；（2）多糖体内代谢机理研究不够深入，其活性靶点和作用机制的研究甚少；（3）多糖与肠道菌群微环境和生物功能之间的关系还不十分清楚，有待深入研究。
虽然存在诸多困难，但多糖因其低毒性具有巨大的发展潜力。铁皮石斛中均一多糖用于抗黑色素瘤的研究尚未见报道。研究铁皮石斛葡甘聚糖在抗肿瘤尤其是抗黑色素瘤方面的应用，可进一步开拓在抗黑色素瘤方面的药物来源。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有铁皮石斛多糖及其结构研究的技术不足，提供一种新的铁皮石斛多糖，以及这种铁皮石斛葡甘聚糖的制备方法。
本发明的另一目的是提供铁皮石斛葡甘聚糖在抗黑色素瘤方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于，所述铁皮石斛葡甘聚糖的重均相对平均分子量为398.4 kDa；所述铁皮石斛葡甘聚糖中甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.32：1，糖链连接方式为1,4-Man(p) ：1,4-Glc(p) ：t-Man(p) ：t-Glc(p)摩尔比为3.77：1.00：0.08：0.03。
本发明所述的铁皮石斛多糖由如下方法制备得到：
S1. 提取铁皮石斛粗多糖：
S11. 取铁皮石斛茎段，加入温水进行搅碎榨汁，控制温度在50～70℃，料液比为1:3～1:5；
S12. 将S11得到的溶液离心，上清液浓缩后加入无水乙醇，4℃放置过夜；
S13. 将S12得到的溶液离心，沉淀依次用80%乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干，得铁皮石斛粗多糖（CPS）；
S2. 分离铁皮石斛精多糖：
S21. 铁皮石斛粗多糖经α-淀粉酶酶解后，加入无水乙醇4℃过夜，取沉淀；
S22. 将S21得到的沉淀溶解，透析，浓缩，干燥，得到铁皮石斛精多糖；
S3. 纯化铁皮石斛纯多糖：
S31. 将铁皮石斛精多糖通过DEAE-纤维素柱色谱，水洗、浓缩、干燥，检测收集多糖流份；
S32. 将S31收集的多糖流份经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱纯化，检测收集纯多糖流份；
S33. 将S33收集的纯多糖流份浓缩、干燥，得铁皮石斛纯多糖，即权利要求1所述铁皮石斛葡甘聚糖（POW）。
进一步的，步骤S11所述铁皮石斛的材料为2年生新鲜茎段；
步骤S12所述离心为1500～3000rpm离心20～40 min，所述无水乙醇的用量为浓缩后上清液体积的4倍；
步骤S13所述离心为1500～3000 rpm离心20～40 min；烘干温度为50℃，烘干至无乙醚味。
进一步的，步骤S21所述酶解是在pH6.8～7.0 条件下，使用终浓度为5 U/mL的α-淀粉酶，38～40 ℃酶解反应30～45 min，再升温至90～100℃后终止反应；
步骤S21所述无水乙醇的用量为酶解后溶液体积的4倍；
步骤S22所述透析的截留分子量为14 kDa；浓缩为60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15。
进一步的，步骤S2的具体操作为：
按铁皮石斛粗多糖溶解于蒸馏水中，配成10～15 mg/mL溶液；将α-淀粉酶溶解于10 mMTris-马来酸盐缓冲液中，配成终浓度为5 U/mL，按铁皮石斛粗多糖与α-淀粉酶溶液100:1的比例，控制酶解温度为38～40 ℃，溶液的pH为6.8～7.0，酶解30～45 min后，再升温至90～100℃后终止反应；按照1:4的体积比，在上述反应后的溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，4℃过夜，取沉淀；将沉淀复溶于蒸馏水中，配成10mg/mL溶液；用截留分子量为14 kDa的透析袋透析72 h，收集透析液于60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15，冷冻干燥，得到铁皮石斛精多糖；
步骤S3的具体操作为：取20～25 mg/mL的铁皮石斛精多糖溶液20 mL，上DEAE-纤维素柱色谱，用蒸馏水以2 mL/min流速进行洗脱，每5mL收集一份，采用苯酚硫酸法测定各流份中多糖类成分的OD值，合并第23～89流份，采用旋转蒸发仪在60～70℃浓缩、冷冻干燥得多糖；所得多糖溶于蒸馏水中继续经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱，用蒸馏水以1 mL/min流速进行洗脱纯化，检测收集纯多糖流份进行合并，浓缩、冷冻干燥，得铁皮石斛纯多糖，即葡甘聚糖POW。
所述铁皮石斛葡甘聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述肿瘤为黑色素瘤；所述黑色素瘤为黑色素瘤细胞株B16。
本发明具有以下有益效果：本发明通过水提醇沉法得到铁皮石斛2年生新鲜茎段中的粗多糖CPS，并经酶解、浓缩、通过DEAE cellulose和Sephadex G-200分离纯化首次得到均一多糖——葡甘聚糖POW。该铁皮石斛葡甘聚糖的重均相对平均分子量为398.4 kDa；甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.32：1，糖链连接方式为1,4-Man(p) ：1,4-Glc(p) ：t-Man(p) ：t-Glc(p)摩尔比为3.77：1.00：0.08：0.03。
本发明所提供的新的铁皮石斛葡甘聚糖具有很好的抗黑色素瘤细胞活性，在制备抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为铁皮石斛中分离纯化的葡甘聚糖POW；
图2为铁皮石斛葡甘聚糖POW的高效凝胶渗透色谱（HPGPC）分子量分布图；
图3为多糖标准品的HPGPC色谱图；
图4为多糖分子量的校正曲线；
图5为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）的结构式；
图6为PMP-Man和PMP-Glc的结构式；
图7为单糖标准品-PMP柱前衍生-HPLC色谱图，其中1是PMP，2是Man，3是Rib，4是Rha，5是GlcA，6是GlcN，7是Glc，8是Gal，9是Xyl，10是Ara，11是Fuc；
图8为铁皮石斛葡甘聚糖POW的PMP柱前衍生-HPLC色谱图；
图9为铁皮石斛粗多糖CPS和葡甘聚糖POW对B16肿瘤细胞的抑制作用。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特殊说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备， 除非特殊说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1：铁皮石斛多糖的提取：
S1. 温水对铁皮石斛茎段进行榨汁，再用无水乙醇处理过夜后，沉淀依次用80%乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干得铁皮石斛粗多糖（CPS）；
S2. CPS经α-淀粉酶酶解，再用无水乙醇处理过夜后，沉淀溶解，透析，浓缩，干燥得到铁皮石斛精多糖；
S3. 用DEAE-纤维素柱和葡聚糖凝胶 G-200柱层析，对铁皮石斛精多糖分离纯化，得铁皮石斛纯多糖，即权利要求1所述铁皮石斛葡甘聚糖（POW）。
具体地，所述铁皮石斛葡甘聚糖是由如下方法制备得到：
S11. 取铁皮石斛茎段，加入温水进行搅碎榨汁，控制温度在50～70℃，料液比为1:3～1:5；
S12. 将S11得到的溶液离心，上清液浓缩后加入无水乙醇，4℃放置过夜；
S13. 将S12得到的溶液离心，沉淀依次用80%乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干，得铁皮石斛粗多糖（CPS）；
S2. 分离铁皮石斛精多糖：
S21. 铁皮石斛粗多糖经α-淀粉酶酶解后，加入无水乙醇4℃过夜，取沉淀；
S22. 将S21得到的沉淀溶解，透析，浓缩，干燥，得到铁皮石斛精多糖，结果如图1所示；
S3. 纯化铁皮石斛纯多糖：
S31. 将铁皮石斛精多糖通过DEAE-纤维素柱色谱，水洗、浓缩、干燥，检测收集多糖流份；
S32. 将S31收集的多糖流份经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱纯化，检测收集纯多糖流份；
S33. 将S33收集的纯多糖流份浓缩、干燥，得结构如附图1所示的铁皮石斛纯多糖（POW）。铁皮石斛葡甘聚糖的重均相对平均分子量为398.4 kDa；所述铁皮石斛葡甘聚糖中甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.32：1，糖链连接方式为1,4-Man(p) ：1,4-Glc(p) ：t-Man(p) ：t-Glc(p)摩尔比为3.77：1.00：0.08：0.03。
其中，步骤S11所述铁皮石斛的材料为2年生新鲜茎段；
步骤S12所述离心为1500～3000rpm离心20～40 min，所述无水乙醇的用量为浓缩后上清液体积的4倍；
步骤S13所述离心为1500～3000 rpm离心20～40 min；烘干温度为50℃，烘干至无乙醚味。
其中，步骤S21所述酶解是在pH6.8～7.0 条件下，使用终浓度为5 U/mL的α-淀粉酶，38～40 ℃酶解反应30～45 min，再升温至90～100℃后终止反应；
步骤S21所述无水乙醇的用量为酶解后溶液体积的4倍；
步骤S22所述透析的截留分子量为14 kDa；浓缩为60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15。
步骤S2的具体操作条件为：按铁皮石斛粗多糖溶解于蒸馏水中，配成10～15 mg/mL溶液；将α-淀粉酶溶解于10 mM Tris-马来酸盐缓冲液中，配成终浓度为5 U/mL，按铁皮石斛粗多糖与α-淀粉酶溶液100:1的比例，控制酶解温度为38～40 ℃，溶液的pH为6.8～7.0，酶解30～45 min后，再升温至90～100℃后终止反应；按照1:4的体积比，在上述反应后的溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，4℃过夜，取沉淀；将沉淀复溶于蒸馏水中，配成10mg/mL溶液；用截留分子量为14 kDa的透析袋透析72 h，收集透析液于60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15，冷冻干燥，得到铁皮石斛精多糖；
步骤S3的具体操作条件为：取20～25 mg/mL的铁皮石斛精多糖溶液20 mL，上DEAE-纤维素柱色谱，用蒸馏水以2 mL/min流速进行洗脱，每5mL收集一份，采用苯酚硫酸法测定各流份中多糖类成分的OD值，合并第23～89流份，采用旋转蒸发仪在60～70℃浓缩、冷冻干燥得多糖；所得多糖溶于蒸馏水中继续经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱，用蒸馏水以1 mL/min流速进行洗脱纯化，检测收集纯多糖流份进行合并，浓缩、冷冻干燥，得铁皮石斛纯多糖，即葡甘聚糖POW。
作为一种最优选的方案，可以采用以下方法进行步骤S2和S3：
步骤S2：取铁皮石斛粗多糖1 g溶于100 mL蒸馏水中，待粗多糖完全溶解后，加入5 U/mL α-淀粉酶的Tris-马来酸盐缓冲液（10 mM）1 mL，控制酶解温度为38 ℃，溶液的pH为7.0，酶解30 min后，再升温至100℃后终止反应；按照1:4的体积比，在上述反应后的溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，4℃过夜，取沉淀；将沉淀复溶于蒸馏水中，配成10 mg/mL溶液；用截留分子量为14 kDa的透析袋透析72 h，收集透析液于70℃浓缩至原液体积的1/15，冷冻干燥，得到铁皮石斛精多糖；
步骤S3：取铁皮石斛粗多糖0.2 g溶于10 mL蒸馏水中，待粗多糖完全溶解后，上DEAE-纤维素柱色谱（φ3.2 cm，50 cm），用蒸馏水以2 mL/min流速进行洗脱，每5 mL收集一份，采用苯酚硫酸法测定各流份中多糖类成分的OD值，合并第23～89流份，采用旋转蒸发仪在70℃浓缩、冷冻干燥得多糖；所得多糖溶于蒸馏水中继续经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱（φ1.8cm，50 cm），用蒸馏水以1 mL/min流速进行洗脱纯化，检测收集纯多糖流份进行合并，浓缩、冷冻干燥，得铁皮石斛纯多糖，即葡甘聚糖POW。
实施例2：多糖含量测定
1）制作葡萄糖标准曲线：准确配制0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL，分别用蒸馏水补至1.0 mL，置于冰水中加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，精密加入5 mL浓硫酸，摇匀，静置5 min，置于沸水浴中加热20 min，取出，静置冷却至室温，于490 nm处测定吸光度，试验重复3次。以葡萄糖标准品制作得标准曲线：y = 12.638x- 0.0061，R2=0.9999 （x为葡萄糖浓度，y为吸光度值）。
2）样品多糖含量测定：精密量取1 mL样品溶液，按照上述步骤操作，测吸光度值，根据标准曲线计算多糖含量。铁皮石斛粗多糖和精多糖多糖含量测定结果如表1所示。
经过大量实验验证，本发明制备得到的粗多糖中多糖含量为50～75%，精多糖中多糖含量为80～90%。
表1 铁皮石斛粗多糖和精多糖的多糖含量
项目 粗多糖 精多糖
多糖含量 65.34% 89.30%
实施例3：铁皮石斛葡甘聚糖纯度的鉴定
1、由于多糖是大分子化合物，其纯度标准与小分子（分子量小于2000 Da）不同，即多糖的纯度只代表某一多糖的相似链长的平均分布，高效凝胶渗透色谱（HPGPC）是检测高聚物平均分子量及其分布和多糖纯度的一种方法。表现为峰形越对称，该多糖纯度越高；多分散性系数越接近于1，该多糖纯度越高。
2、采用HPGPC检测POW的纯度：
配置1.0 mg/mL POW水溶液，沸水溶解后冷却至室温，经0.45 μm微孔滤膜过滤，采用HPGPC分析。
实验条件：高效液相凝胶色谱分析柱为XtimateTM SEC-300 (7.8 × 300 mm，5 µm)，两柱串联，流动相为双蒸水，进样量10 µL，流速1.0 mL/min，示差折光检测器（RID)，柱温35 ℃。
POW的凝胶色谱检测结果如附图2～3所示。
如附图2所示，多糖POW在HPGPC的分离图中显示出一个近似于对称的单峰，表明POW纯度较高，为均一多糖。
3、聚合物分子量可以用重均分子量（Mw）和数均分子量（Mn）来统计，本发明根据普鲁兰多糖标准品（6.2 kDa，10.0 kDa，21.7 kDa，48.8 kDa，113.0 kDa，200.0 kDa，366.0kDa，805.0 kDa），采用HPGPC法测定相对分子量对数lgM(x)与保留时间(y)的标准曲线，根据重均分子量标准曲线y=-2.2313x+18.54 （R=0.9828）和数均分子量标准曲线y = -2.3008x + 18.768 （R = 0.9857）分别计算相对平均分子量，结果如表2和附图4所示。
表2 铁皮石斛葡甘聚糖的相对平均分子量（单位：kDa）
Mw Mn Mw/Mn
398.4 339.0 1.18
注：*一般主要看Mw（重均分子量）。
多分散性系数（D）描述聚合物试样相对分子了的多分散程度，D=Mw/Mn越接近于1，该均一多糖纯度越高。如表2所示，本发明制备得到的葡甘聚糖具有良好的纯度。
实施例4 ：铁皮石斛葡甘聚糖POW单糖组成成分分析
供试品液：精密量取浓度为1.0 mg/mL的POW溶液1 mL，置于水解管中，加入3.0 mol/L盐酸溶液0.5 mL，封口，混匀，110℃水解1 h，放冷后加入 3.0 mol/L的氢氧化钠溶液调节PH值至中性，吸取400 μL，加0.5 mol/L PMP甲醇溶液与0.3 mol/L 氢氧化钠溶液各400 μL，混匀，置于70 ℃水浴100 min。再加入0.3 mol/L 盐酸溶液500 μL，混匀。用三氯甲烷溶液萃取3次，每次2 mL。随后弃去三氯甲烷溶液，离心水层，取上清液10 μL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。试验平行三次。
色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 × 150 nm，1.7 μm）；柱温30℃；流动相：0.02 m mol/L 乙酸铵-乙腈，梯度洗脱；检测波长254 nm；流速：0.2 mL/min；进样量：5 μL。
由于单糖极性较强且无紫外吸收特征光谱，需要通过1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮PMP（附图5）将其衍生化制备成适用于HPLC-C18色谱柱分离、紫外检测器检测的衍生物，本实验多糖经完全酸水解成单糖，将单糖进行PMP衍生化（附图6），并用HPLC分析。标准品单糖组成PMP柱前衍生-HPLC分析结果如附图7～8所示。总共选取10种单糖标准品，分别是甘露糖Man、核糖Rib、鼠李糖Rha、半乳糖醛酸GlcA、葡萄糖胺GlcN、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、木糖Xyl、阿拉伯糖Ara、岩藻糖Fuc。由图可见，10种单糖得到很好的分离。
根据各种单糖标准品保留时间的比较和外标定量法，可知POW由Man和Glc2种单糖组成，并且摩尔比为5.32:1.00。
实施例5：铁皮石斛葡甘聚糖抗黑色素瘤活性研究
取CPS和POW，加入DMEM培养基中，使终浓度为100、50、25、12.5、6.25 μg/mL。将B16细胞株消化制成5×10-4个/L的细胞悬液，在96孔板中每孔接种100 μL的量，用含10%胎牛血清和铁皮石斛多糖的DMEM培养液置于37℃二氧化碳细胞培养箱中培养24 h，按照实验分组培养后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL， 37℃孵育4 h去上清液，加入150 μL DMSO，摇匀，用酶标仪测定490 nm处吸光度值，计算B16细胞抑制率。如附图9所示。
结果显示，铁皮石斛葡甘聚糖POW在浓度低至6.25 μg/mL时仍具有显著的黑色素细胞瘤抑制率，并优于同等条件下（12.5 μg/mL）粗多糖的抑制率。表明了本发明对所提纯得到的新的铁皮石斛葡甘聚糖具有良好的抗黑色素瘤（黑色素瘤细胞株B16）活性，在制备抗肿瘤药物方面具有良好的应用前景。

Claims (7)

1.一种铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于，所述铁皮石斛葡甘聚糖的重均相对平均分子量为398.4 kDa；所述铁皮石斛葡甘聚糖中甘露糖与葡萄糖的摩尔比为5.32：1，糖链连接方式为1,4-Man(p) ：1,4-Glc(p) ：t-Man(p) ：t-Glc(p)摩尔比为3.77：1.00：0.08：0.03。
2.根据权利要求1所述铁皮石斛多糖，其特征在于，由如下方法制备得到：
S1. 提取铁皮石斛粗多糖：
S11. 取铁皮石斛茎段，加入温水进行搅碎榨汁，控制温度在50～70℃，料液比为1:3～1:5；
S12. 将S11得到的溶液离心，上清液浓缩后加入无水乙醇，4℃放置过夜；
S13. 将S12得到的溶液离心，沉淀依次用80%乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干，得铁皮石斛粗多糖（CPS）；
S2. 分离铁皮石斛精多糖：
S21. 铁皮石斛粗多糖经α-淀粉酶酶解后，加入无水乙醇4℃过夜，取沉淀；
S22. 将S21得到的沉淀溶解，透析，浓缩，干燥，得到铁皮石斛精多糖；
S3. 纯化铁皮石斛纯多糖：
S31. 将铁皮石斛精多糖通过DEAE-纤维素柱色谱，水洗、浓缩、干燥，检测收集多糖流份；
S32. 将S31收集的多糖流份经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱纯化，检测收集纯多糖流份；
S33. 将S33收集的纯多糖流份浓缩、干燥，得铁皮石斛纯多糖，即权利要求1所述铁皮石斛葡甘聚糖（POW）。
3.根据权利要求2所述铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于，步骤S11所述铁皮石斛的材料为2年生新鲜茎段；
步骤S12所述离心为1500～3000rpm离心20～40 min，所述无水乙醇的用量为浓缩后上清液体积的4倍；
步骤S13所述离心为1500～3000 rpm离心20～40 min；烘干温度为50℃，烘干至无乙醚味。
4.根据权利要求2所述铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于，步骤S21所述酶解是在pH6.8～7.0 条件下，使用终浓度为5 U/mL的α-淀粉酶，38～40 ℃酶解反应30～45 min，再升温至90～100℃后终止反应；
步骤S21所述无水乙醇的用量为酶解后溶液体积的4倍；
步骤S22所述透析的截留分子量为14 kDa；浓缩为60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15。
5.根据权利要求2所述铁皮石斛葡甘聚糖，其特征在于，步骤S2的具体操作为：
按铁皮石斛粗多糖溶解于蒸馏水中，配成10～15 mg/mL溶液；将α-淀粉酶溶解于10 mMTris-马来酸盐缓冲液中，配成终浓度为5 U/mL，按铁皮石斛粗多糖与α-淀粉酶溶液100:1的比例，控制酶解温度为38～40 ℃，溶液的pH为6.8～7.0，酶解30～45 min后，再升温至90～100℃后终止反应；按照1:4的体积比，在上述反应后的溶液中加入无水乙醇，搅拌均匀，4℃过夜，取沉淀；将沉淀复溶于蒸馏水中，配成10mg/mL溶液；用截留分子量为14 kDa的透析袋透析72 h，收集透析液于60～70℃浓缩至原液体积的1/12～1/15，冷冻干燥，得到铁皮石斛精多糖；
步骤S3的具体操作为：取20～25 mg/mL的铁皮石斛精多糖溶液20 mL，上DEAE-纤维素柱色谱，用蒸馏水以2 mL/min流速进行洗脱，每5mL收集一份，采用苯酚硫酸法测定各流份中多糖类成分的OD值，合并第23～89流份，采用旋转蒸发仪在60～70℃浓缩、冷冻干燥得多糖；所得多糖溶于蒸馏水中继续经葡聚糖凝胶 G-200柱色谱，用蒸馏水以1 mL/min流速进行洗脱纯化，检测收集纯多糖流份进行合并，浓缩、冷冻干燥，得铁皮石斛纯多糖，即葡甘聚糖POW。
6.权利要求1所述铁皮石斛葡甘聚糖在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤；所述黑色素瘤为黑色素瘤细胞株B16。
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