CN110818812A - 一种铁皮石斛精制多糖提取物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种铁皮石斛精制多糖提取物及其应用，所述多糖的制备为：往铁皮石斛粉末中加入石油醚，回流提取，过滤，弃去滤液，得滤渣A；往滤渣A加入80%乙醇溶液，回流提取，过滤，弃去滤液，再往滤渣中加入水，回流提取，过滤，收集滤液，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；往浓缩液中加入sevage试剂进行脱蛋白，得脱蛋白的粗多糖浓缩液；在粗多糖浓缩液中加无水乙醇，静置，离心，收集沉淀；以及将沉淀溶解于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得粗多糖；依次采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，真空冷冻干燥，即可得到铁皮石斛精制多糖。本发明所得的多糖提取物在制备治疗结肠癌药物中的应用。

Description

一种铁皮石斛精制多糖提取物及其应用

技术领域

本发明涉及铁皮石斛技术领域，具体是一种铁皮石斛精制多糖提取物及其应用。

背景技术

铁皮石斛为兰科植物(Dendrobium officinale kimura et Migo)的干燥茎，是我国传统名贵珍稀中药材和药食两用的养生佳品，其具有治疗癌症、降血糖、增强免疫力、抗氧化、降血脂等多种功效，且毒副作用小。

其中铁皮石斛多糖具有提高免疫力、抗肿瘤作用；可改善造血、凝血功能，对降低血糖也有一定功效；对治疗中枢神经系统、肝脏、肾脏、胃肠道病变具有功效；对烫伤、病毒、细菌感染也有显著疗效。铁皮石斛多糖目前较为广泛地作为保健品或保健食品的添加成分，具有较高的经济价值。

虽然目前有研究对铁皮石斛多糖抑制肿瘤细胞的效果进行了报道，如刘亚娟的论文《铁皮石斛多糖抗癌及免疫活性研究》中报道，400μg/mL的铁皮石斛多糖对癌细胞HepG2、A549、F9、NCCIT作用48h后，抑制率分别达到37.28％，32.28％， 32.57％，28.70％。但铁皮石斛多糖在结肠癌方面的药用尚处于一片空白，尚无相关产品，也很少有相关的文献和专利的报道。而本发明研究结果显示，多糖作为铁皮石斛的主要成分，具有很好的抑制结肠癌的效果，其400μg/mL的抑癌率在48h达到了49.59％，远远高于铁皮石斛作用其他肿瘤细胞上的效果，甚至胜于化疗一线药物5-Fu的43.15％，且毒副作用小的多。因此，具有开发成新型抗结肠癌药物的前景。

以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。

发明内容

本发明目的在于提供一种铁皮石斛精制多糖提取物及其应用。本发明方法提取的石斛多糖具有纯度高、提取率高等优点，通过研究发现其提取物具有显著的抑制结肠癌活性，对于结肠癌新型抗肿瘤药物开发具有重要的意义。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

第一目的，本发明提供一种铁皮石斛精制多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)按照料液比1:18～1:25g/mL往铁皮石斛粉末中加入石油醚，回流提取 1-2h，过滤，弃去滤液，得滤渣A；

(2)往滤渣A按照料液比1:18～1:20g/mL加入80％乙醇溶液，回流提取1-2h，过滤，弃去滤液，再往滤渣中按照料液比1:25～1:35g/mL加入水，回流提取1-2h，过滤，收集滤液，再往滤渣中加水重复提取2～3次，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；

(3)往浓缩液中加入sevage试剂进行脱蛋白，摇匀，静置，弃去下层氯仿层与中间白色蛋白层，收集上层多糖溶液，重复多次至无新的白色蛋白层产生，合并上层多糖溶液，减压浓缩，得脱蛋白的粗多糖浓缩液；

(4)在粗多糖浓缩液中加入3-6倍体积的无水乙醇，4℃下静置，离心，收集沉淀；以及将沉淀溶解于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得粗多糖；

(5)依次采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，真空冷冻干燥，即可得到铁皮石斛精制多糖。

优选地，所述减压浓缩是在50～70℃下减压浓缩。

优选地，所述浓缩液和sevage试剂的料液体积比为3:1～5:1。所述sevage 试剂指氯仿(三氯甲烷)与正丁醇按照体积比4∶1配置而成的试剂。

优选地，所述分离纯化是将粗多糖溶于水后得到浓度为30mg/mL的粗多糖溶液，然后上样至阴离子交换树脂DEAE-52上，先采用纯化水以0.5mL/min的速度洗脱，收集300-350mL洗脱液，浓缩并真空冷冻干燥水洗脱液，得到半精制多糖；随后将半精制多糖溶于水后得到浓度为45mg/mL的半精制多糖溶液，随后上样至葡聚糖凝胶树脂Sephacryl S-300上，采用0.2M Nacl溶液以0.5mL/min的速度洗脱，收集245-255mL洗脱液即可完成。

优选地，所述真空冷冻干燥是在温度为-20℃～-40℃下干燥。

另一目的，本发明在于提供所述铁皮石斛精制多糖提取物，在制备治疗结肠癌药物，具体地是在抑制结肠癌细胞生长药物或抑制结肠癌细胞转移药物中的应用。加入药学上可接受的辅料将含有铁皮石斛精制多糖提取物的抗结肠癌的药物制成粉剂、浸膏、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂或口服液。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

1、本发明方法提取得到的铁皮石斛多糖产品纯度高，得率高，且产品色泽好，活性成分高，工艺较为简单。

2、本发明提供的铁皮石斛精制多糖提取物具有显著的抑制结肠癌活性，药理实验发现，作用结肠癌细胞48h时，其在高剂量浓度400μg/mL的抑癌率达到了49.59％，远远高于铁皮石斛作用其他肿瘤细胞上的效果，甚至强于结肠癌治疗的一线化疗药5-Fu，对于结肠癌新型抗肿瘤药物开发具有重要的意义。

3、本发明含铁皮石斛精制多糖提取物的药物为绿色天然植物的有效部位，具有绿色安全、无毒副作用的优势，克服了化疗药5-Fu引起的免疫能力低下、胃肠功能紊乱、肝部受损、以及静脉炎会导致局部组织出现坏死等缺陷。

附图说明

图1为25-400μg/mL的铁皮石斛精制多糖提取物粉末在24h、48h和72h 对结肠癌的抑制作用。

图2中(A)为铁皮石斛精制多糖提取物粉末处理后的斑马鱼移植瘤荧光强度，与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001；(B)为铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤生长抑制作用，与模型对照组比较，*p<0.05，***p< 0.001。

图3中(A)铁皮石斛精制多糖提取物粉末处理后的斑马鱼移植瘤转移累计距离与模型对照组比较，*p<0.05；(B)铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤的转移抑制作用，与模型对照组比较，*p<0.05。

具体实施例

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。

实施例1

一种铁皮石斛精制多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取铁皮石斛粉末50g，随后向铁皮石斛叶粉末加入900mL的石油醚，回流提取1h，过滤，弃去滤液，得滤渣A；

(2)往滤渣A加入900mL 80％乙醇溶液，回流提取1h，过滤，弃去滤液，再往滤渣中加入1250mL水，回流提取1h，过滤，收集滤液，再往滤渣中加水重复提取2次，合并滤液，在60℃减压浓缩，得390mL浓缩液；

(3)往浓缩液中加入130mL sevage(氯仿：正丁醇＝4:1)试剂进行脱蛋白，摇匀，静置，弃去下层氯仿层与中间白色蛋白层，收集上层多糖溶液，重复多次至无新的白色蛋白层产生，合并上层多糖溶液，减压浓缩，得脱蛋白的粗多糖浓缩液；

(4)在粗多糖浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃下静置，离心，收集沉淀；以及将沉淀溶解于蒸馏水中，在-20℃下真空冷冻干燥，得粗多糖；

(5)依次采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，首先将粗多糖溶于水得到浓度为30mg/mL粗多糖溶液，然后上样至阴离子交换树脂DEAE-52后，先采用纯化水以0.5mL/min的速度洗脱，收集300mL洗脱液，浓缩并在-20℃下真空冷冻干燥水洗脱液，得到半精制多糖；随后将半精制多糖溶于水得到浓度为45mg/mL半精制多糖溶液，然后上样至葡聚糖凝胶树脂 Sephacryl S-300上，采用0.2M Nacl溶液以0.5mL/min的速度洗脱，收集245mL 洗脱液，在-20℃下真空冷冻干燥，即可得到铁皮石斛精制多糖。经过测定本实施例多糖的得率为22.51％。

实施例2

一种铁皮石斛精制多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取铁皮石斛粉末50g，随后向铁皮石斛叶粉末加入1250mL的石油醚，回流提取2h，过滤，弃去滤液，得滤渣A；

(2)往滤渣A加入1000mL 80％乙醇溶液，回流提取2h，过滤，弃去滤液，再往滤渣中加入1250mL水，回流提取2h，过滤，收集滤液，再往滤渣中加水重复提取2次，合并滤液，在70℃减压浓缩，得400mL浓缩液；

(3)往浓缩液中加入100mL sevage(氯仿：正丁醇＝4:1)试剂进行脱蛋白，摇匀，静置，弃去下层氯仿层与中间白色蛋白层，收集上层多糖溶液，重复多次至无新的白色蛋白层产生，合并上层多糖溶液，减压浓缩，得脱蛋白的粗多糖浓缩液；

(4)在粗多糖浓缩液中加入5倍体积的无水乙醇，4℃下静置，离心，收集沉淀；以及将沉淀溶解于蒸馏水中，在-40℃下真空冷冻干燥，得粗多糖；

(5)依次采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，首先将粗多糖溶于水得到浓度为30mg/mL粗多糖溶液，然后上样至阴离子交换树脂DEAE-52后，先采用纯化水以0.5mL/min的速度洗脱，收集400mL洗脱液，浓缩并在-40℃下真空冷冻干燥水洗脱液，得到半精制多糖；随后将半精制多糖溶于水得到浓度为45mg/mL半精制多糖溶液，然后上样至葡聚糖凝胶树脂 Sephacryl S-300上，采用0.2M Nacl溶液以0.5mL/min的速度洗脱，收集255mL 洗脱液，在-40℃下真空冷冻干燥，即可得到铁皮石斛精制多糖。经过测定本实施例多糖的得率为25.12％。

本发明方法稳定可靠，其制备得到的铁皮石斛精制多糖提取物药物经多次反复试验，对人结肠癌细胞HT-29具有较强的生长抑制作用和转移抑制作用，并经实验得到充分证明，有关实验资料如下：

体外、体内抗结肠癌活性实验

一、实验材料与仪器

铁皮石斛精制多糖提取物粉末(实施例2制备，命名为DOPW-1)，人结肠癌HT-29(中国科学院细胞库)；McCoy′s 5A培养基，胎牛血清，双抗(美国 Gibco公司)，MTT，DMSO(Sigma公司)；5-Fu(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；显微注射仪(IM300， NARISHIGE，Japan)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，America)；6孔板(Nest Biotech，Shanghai， China)。

二、体外抗肿瘤实验

MTT法测铁皮石斛精制多糖提取物粉末对人结肠癌癌细胞HT-29增殖的影响

收集对数生长期的细胞，用McCoy′s 5A完全培养基将细胞悬浮液稀释成 8×10⁴/mL，吹打均匀后，将细胞接种于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬浮液，然后置细胞培养箱中继续培养。24h后弃上清液，分别加入McCoy′s 5A 培养基(不含血清)稀释的不同浓度铁皮石斛精制多糖提取物粉末(25、50、100、 200、400μg/mL)多糖溶液，每孔精密加入100μL，每个浓度设置5个复孔，另设置正常细胞对照组每孔加McCoy′s 5A培养基(不含血清)，阳性对照组(5-Fu 50μg/mL)。将96孔板置37℃，5％CO₂培养箱分别培养24h,48h,72h后，每孔加入20μL的MTT溶液，将96孔板放置培养箱中继续培养4h，然后小心的吸去孔内悬浮液，每孔加入100μL二甲基亚砜，将96孔板轻微震荡10min，待结晶紫完全溶解后，在490nm波长下检测各孔OD值。根据OD值计算细胞的存活率。

细胞存活率(cell viability)＝OD值药物组/OD值空白组×100％

三、体内抗肿瘤实验

3.1动物模型

斑马鱼模型：使用CM-DiI标记HT-29细胞，以显微注射的方式移植到受精后 2天(2dpf)的野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人肿瘤移植模型。饲养于28℃的养鱼用水中，实验动物使用许可证号为： SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

3.2分组和给药

根据浓度摸索实验，统计斑马鱼的死亡情况，根据斑马鱼毒性反应和死亡情况确定铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼的MTC(最大致死浓度)为250μg /mL。所以设置铁皮石斛精制多糖提取物粉末的实验浓度设置为：27.8、83.3和 250μg/mL。

实验设置模型对照组、阳性对照药(5-Fu 50ng/尾)、铁皮石斛精制多糖提取物粉末高中低剂量组(27.8μg/mL、83.3μg/mL、250μg/mL)

3.3铁皮石斛多糖粉末对肿瘤生长和转移的抑制作用

将建立好的斑马鱼人肿瘤移植模型的斑马鱼放置35℃培养至3dpf。3dpf 时，在显微镜下挑选出移植瘤一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，每孔 30尾，每孔养鱼水容量为3mL。分别水溶铁皮石斛精制多糖提取物粉末27.8、83.3 和250μg/mL浓度，与5-Fu50ng/尾剂量(注射体积为1nL)联用，阳性对照组5-Fu 50ng/尾剂量，同时设置模型对照组。35℃培养箱处理至5dpf，每个实验组随机选择10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；

(1)利用尼康NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼移植瘤荧光强度(S)，以荧光强度的统计分析结果评价铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤生长抑制作用。统计学处理结果用mean±SE表示，对斑马鱼移植瘤生长抑制作用计算公式如下：

(2)利用ImageJ图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼移植瘤细胞尾部转移累计距离(L)，以转移累计距离来评价铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤转移抑制作用，公式如下：

统计学分析采用单因素方差分析和Dunnett’s T检验，p<0.05表明具有显著性差异，提供具有代表性的实验图谱。

四、实验结果

4.1体外抗肿瘤作用

表1和图1的结果显示，其中图1为25-400μg/mL的铁皮石斛精制多糖提取物粉末在24h，48h，72h对结肠癌的抑制作用。铁皮石斛精制多糖提取物粉末抑制结肠癌具有时间依赖性和剂量依赖性，随着时间和剂量的增加，铁皮石斛精制多糖提取物粉末抑制结肠癌的效果越来越强。在高剂量时(400μg/mL)，铁皮石斛精制多糖提取物粉末抑制肿瘤的效果，接近50％，甚至强于化疗药5-Fu。

表1铁皮石斛精制多糖提取物粉末体外对结肠癌的抑制率

与模型对照组比较，***p<0.001

4.2体内抗肿瘤作用

(1)铁皮石斛精制多糖提取物粉末对肿瘤生长的抑制作用

5-Fu 50ng/尾剂量斑马鱼移植瘤荧光强度为289771像素，与模型对照组 (369950像素)比较p<0.05，肿瘤生长抑制作用为22％，表明阳性对照药5-Fu 对斑马鱼移植瘤的生长有明显抑制作用。

高中低浓度的铁皮石斛精制多糖提取物粉末(27.8、83.3和250μg/mL)斑马鱼移植瘤荧光强度分别为272936、194917和130514像素，与模型对照组 (369950像素)比较p＝0.001&p<0.001&p<0.001，肿瘤生长抑制作用分别为 26％、47％和65％。表明铁皮石斛多糖精制提取物粉末对斑马鱼人结肠癌移植瘤的生长有明显抑制作用。详见表2、图2。

表2铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤大小抑制作用(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001

图2为铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤生长抑制的表型图， (A)铁皮石斛精制多糖提取物粉末处理后的斑马鱼移植瘤荧光强度，与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001；(B)铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤生长抑制作用，与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。

(2)铁皮石斛精制多糖提取物粉末对肿瘤转移的抑制作用

5-Fu 50ng/尾剂量斑马鱼移植瘤转移累计距离为9658像素，与模型对照组(23788像素)比较p<0.05，肿瘤转移抑制作用为59％，表明阳性对照药5-Fu 对斑马鱼移植瘤的转移有明显抑制作用。

高中低浓度的铁皮石斛精制多糖提取物粉末(27.8、83.3和250μg/mL)作用的斑马鱼移植瘤转移累计距离分别为11584、10964和7258像素，与模型对照组(23788像素)比较p>0.05&p>0.05&p<0.05，肿瘤转移抑制作用分别为51％、 54％和69％。表明铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼人结肠癌移植瘤转移有明显抑制作用。详见表3、图3。

表3铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤转移的抑制作用(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01

图3中(A)铁皮石斛精制多糖提取物粉末处理后的斑马鱼移植瘤转移累计距离与模型对照组比较，*p<0.05；(B)铁皮石斛精制多糖提取物粉末对斑马鱼移植瘤的转移抑制作用，与模型对照组比较，*p<0.05。

综上所述，本发明提供的铁皮石斛精制多糖提取物具有显著的抑制结肠癌活性，药理实验发现，作用结肠癌细胞48h时，其在高剂量浓度400μg/mL的抑癌率达到了49.59％，远远高于铁皮石斛作用其他肿瘤细胞上的效果，甚至强于结肠癌治疗的一线化疗药5-Fu，对于结肠癌新型抗肿瘤药物开发具有重要的意义。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述多糖提取物的制备方法，包括如下步骤：

按照料液比1:18～1:25g/mL往铁皮石斛粉末中加入石油醚，回流提取1-2h，过滤，弃去滤液，得滤渣A；

往滤渣A按照料液比1:18～1:20g/mL加入80%乙醇溶液，回流提取1-2h，过滤，弃去滤液，再往滤渣中按照料液比1:25～1:35g/mL加入水，回流提取1-2h ，过滤，收集滤液，再往滤渣中加水重复提取2～3次，合并滤液，减压浓缩，得浓缩液；

往浓缩液中加入sevage试剂进行脱蛋白，摇匀，静置，弃去下层氯仿层与中间白色蛋白层，收集上层多糖溶液，重复多次至无新的白色蛋白层产生，合并上层多糖溶液，减压浓缩，得脱蛋白的粗多糖浓缩液；

在粗多糖浓缩液中加入3-6倍体积的无水乙醇，4℃下静置，离心，收集沉淀；以及将沉淀溶解于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得粗多糖；

依次采用阴离子交换树脂和葡聚糖凝胶树脂对粗多糖进行分离纯化，真空冷冻干燥，即可得到铁皮石斛精制多糖。

2.根据权利要求1所述的铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述减压浓缩是在50～70℃下进行的。

3.根据权利要求1所述的铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述浓缩液和sevage试剂的料液体积比为3:1～5:1。

4.根据权利要求1所述的铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述分离纯化是将粗多糖溶于水后得到浓度为30mg/mL的粗多糖溶液，然后上样至阴离子交换树脂DEAE-52上，先采用纯化水以0.5mL/min的速度洗脱，收集300-350mL洗脱液，浓缩并真空冷冻干燥水洗脱液，得到半精制多糖；随后将半精制多糖溶于水后得到浓度为45mg/mL的半精制多糖溶液，随后上样至葡聚糖凝胶树脂Sephacryl S-300上，采用0.2M Nacl溶液以0.5mL/min的速度洗脱，收集245-255mL洗脱液即可完成。

5.根据权利要求1所述的铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述真空冷冻干燥是在温度为-20℃～-40℃下干燥。

6.根据权利要求1所述铁皮石斛精制多糖提取物，其特征在于：所述多糖提取物在制备治疗结肠癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述铁皮石斛精制多糖提取物的应用，其特征在于：加入药学上可接受的辅料将含有铁皮石斛精制多糖提取物的抗结肠癌的药物制成粉剂、浸膏、颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂或口服液。

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