CN101805246B - 漆酚化合物,其药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
漆酚化合物,其药物组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以传统中药干漆中提取的酚性化合物(结构式I)为主要有效成份制备的药物制剂，它可以制成片剂、胶囊剂等口服给药剂型或注射剂，以干漆中酚性化合物为有效成份的口服剂型或注射剂可加入其它成份和辅料组成复方制剂，具有显著的肿瘤细胞毒活性、肿瘤血管生成抑制效果以及核转录因子-κB抑制活性等，可用于白血病、肝癌、肺癌、食道癌、骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等癌症，具有显著的治疗效果。
Description
技术领域：
本发明属于药物技术领域，具体地，涉及漆酚化合物，以其为主要有效成份制备的药物制剂，及其在抗癌药物中的应用。
背景技术：
癌症严重危害人类健康，其发病率近年来呈上升趋势，死于癌症的人数逐年增加，世界卫生组(WHO)曾预测21世纪癌症将成为人类的“第一杀手”，癌症控制已成为全球性的卫生战略重点之一。天然药物在医疗保健和药物研究中占有重要角色，资料表明约有80％的抗菌药物和60％的抗癌药物直接或间接来自天然产物(J Nat Prod，2003，66：1022-1237)。表明自然界已经成为全球寻找抗癌药物的重要源泉。
癌症属于恶性肿瘤，其发病特点之一是病势凶猛，变化迅速，死亡率高。在各种对付癌症的策略中，“以毒攻毒”被认为是治疗癌症的有效办法之一。中医药对于恶性病历来也有“以毒攻毒”的治疗原则，雄黄是有毒中药，其主要成分是硫化砷，复方黄黛片中硫化砷能直接作用于癌蛋白，通过诱导其降解，从根本上逆转癌细胞的疯长。最近的研究还显示硫化砷能激活蛋白泛素化等通路，并导致癌蛋白降解，协同伊马替尼阻断细胞周期，激活细胞程序化死亡通路，这一研究发现得到了科学界的承认，并使得硫化砷正在受到世界的关注。美国科学家利用纳米粒子成功地运送具有致命毒素的白喉基因，“以毒攻毒”彻底杀死了胰腺癌细胞。该研究第一次展示了在胰腺癌细胞实验上的这种独特策略，为未来临床前动物研究，甚至是全新的临床方法提供了可能。大量临床实践证明，化疗药物的毒性与其疗效成正比，其毒性越大疗效也越好，所以，化疗药物治疗肿瘤的最重要机理之一是其细胞毒作用。我国古代早就有运用毒剧中药治疗疑难病(包括肿瘤)的丰富经验，如《医学问答》指出，“药之治病，无非以毒拔毒，以毒攻毒”，且有“大毒大效，小毒小效，无毒无效”的论述，古书中也有记载陶宗仪《辍耕录》卷二十九：“骨咄犀，蛇角也，其性至毒，而能解毒，盖以毒攻毒也。”因此从中医药中发现“以毒攻毒”的肿瘤治疗药物是可能的。
同时，现有的文献资料也表明，在肿瘤细胞分泌的促血管生成因子的刺激下，邻近血管静息状态的内皮细胞被激活。活化的内皮细胞分泌蛋白酶，使内皮细胞连接松弛，基底膜和细胞外基质降解，于是基质中包含的各种促血管生成因子(如VEGF)被释放，继续刺激内皮细胞，使其侵入周围组织，并增殖、迁移，形成管腔结构。最后，基底膜和细胞外基质重塑，周围支持细胞(如平滑肌细胞)被募集，使新生血管稳定并成熟(Angiogenesis and hepatocellular carcinoma.Journal of Hepatology 2004，41：864-880.)。肿瘤血管的生成是导致肿瘤复发和转移的重要原因。因此肿瘤血管生成抑制剂近年来被认为是通过“饿死”疗法治疗肿瘤的又一重要策略，而且这种方法具有疗效好、毒副作用少的优势。血管主要由内皮细胞组成，目前，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)已建系并被认为是研究肿瘤血管生成比较成熟的筛选模型，通过评价药物对HUVEC的增殖、迁移和成管的抑制作用，将可以评价药物是否具有肿瘤血管生成抑制潜力。
另外，近些年很多研究发现NF-kappaB介导了多种疾病，包括炎症和肿瘤，而炎症又和肿瘤的发生又密切相关，如一篇文章描述说“Inflammation：Gearing the journey to cancer.MutationResearch，2008，659：15-30.”。NF-kappaB能够控制细胞增殖和癌变，调控细胞周期及凋亡，影响细胞分化，促进肿瘤转移。在多数白血病和实体肿瘤中，NF-kappaB或IκB(Inhibitor of kappaB)家族成员往往通过遗传学改变或信号转导异常，而持续性激活或出现异常的核定位(NF-kappaB activation in human prostate cancer：important mediator or epiphenomenon？Journal of CellularBiochemistry 2004，91：100-117.)。且已经有研究表明有些药物如藤黄酸的抗癌作用与抑制NF-kappaB直接相关。因此NF-kappaB抑制剂将可能用于抗癌。
目前现有技术中未发现关于干漆中酚性化合物对于多种肿瘤细胞株的抑制作用的报道，也未见其抗肿瘤血管生成以及NF-kappaB抑制作用的药理报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供漆酚化合物，其制备方法，以及以漆酚及其衍生物为主要有效成份制成的片剂、胶囊剂等口服剂型或注射剂的抗癌药物组合物和抗癌药物；并提供漆酚及其衍生物在制备抗恶性肿瘤药物以及其药物组合物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
结构式(I)所示漆酚或其药用盐，
所述的药用盐，是指药学上可接受的盐，包括但不限于与有机酸如酒石酸或柠檬酸或甲酸或乙二酸，或是与无机酸如盐酸或硫酸或磷酸形成的盐。
本发明漆酚的制备方法：取来自漆树科植物漆树(Rhusverniciflua Stokes)的干燥树脂干漆(Toxicodendronvernicifluum)，粉碎，用80％乙醇浸泡提取3次，然后残渣再用丙酮浸泡一次，提取液合并后减压浓缩得浸膏，浸膏经水分散后分别用等量乙酸乙酯萃取三次，萃取物经硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，以薄层层析作为指导进行合并得组份A：1-11，B：12-17，C：18-24，D：25-32；C组份经MCI gel CHP 20P柱层析，以薄层层析作为合并的指导原则，得上述70％洗脱部分组份BI，上述80％洗脱部分组份BII；组份BI经过Sephadex LH-20凝胶过滤后即可。
所述的制备方法中，乙酸乙酯萃取硅胶柱规格：10.5×60cm；硅胶200-300目，2.5kg；组份A为氯仿-甲醇，98∶2，3L洗脱，组份B为氯仿-甲醇，96∶4，4L洗脱，组份C为氯仿-甲醇，92∶8，4L洗脱，组份D为氯仿-甲醇，90∶10，3L洗脱；C组份柱层析条件为3.5×40cm，丙酮-水，50％ 60％，70％，80％，500mL/梯度；Sephadex LH-20凝胶过滤条件为∶氯仿-甲醇6∶4。
药物组合物，其中含有漆酚化合物或其药用盐作为有效成分，并含有至少一种可药用载体。
抗癌药物，其中含有治疗有效量的漆酚化合物和药学上可接受的载体。
漆酚化合物或其药用盐在制备治疗或预防癌症药物中的应用。
漆酚化合物或其药用盐在制备治疗或预防白血病、肝癌、肺癌、食道癌、骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的药物中的应用。
本发明是基于正向药理学的研究方法，即从在临床人种药理学中长期应用有效的中草药中去高效地寻找药效物质，从而使得这些一旦被发现的活性物质将具有现代临床价值，具体地，本发明依据“以毒攻毒”的理念从具有小毒的干漆中去寻找有效抗癌物质；本发明旨在解决目前抗癌药物靶点单一、治疗效果不佳、耐药性产生等问题，从具有千百年人群应用历史的中草药中目的性地寻找具有多靶点、或新颖作用途径的抗癌药物，具体地，本发明的物质具有多个靶点的作用，如细胞毒、肿瘤血管生成、NF-kappaB抑制作用等；本发明的有益效果是从自然界中捷径发现新型抗癌药物，提高癌症的治疗效果，同时带来巨大的经济效益和社会效益。
本发明的漆酚及其衍生物天然可来自干漆(Toxicodendronvernicifluum)。干漆为漆树科植物漆树(Rhus verniciflua Stokes)的干燥树脂，具有破血通经，消积杀虫的功效，用于妇女瘀血阴滞、经闭、癥瘕(类似于现代肿瘤)、虫积等；干漆为有小毒中药，是张仲景《金匮要略》著名方剂大黄蛰虫丸的主要组成之一。漆树原产我国，且生长迅速，因此漆酚的天然来源丰富。漆酚及其衍生物的另一来源是化学合成，由于该类化合物手性中心少，因此利于合成和大规模生产。
本发明漆酚及其衍生物特征之一在于有效成份中所含有的化学成分具有邻二酚羟基，并在酚羟基的邻位有一个侧链，这是漆酚类化合物的核心结构。侧链可含有多个碳原子，侧链上可具有一个或多个双键或环氧，双键的构型可为顺式或反式，侧链上的碳原子可以不同氧化方式存在。由于漆酚类具有了这些特征，因此其极性一般较小，可用低极性溶剂萃取和色谱法获得；也可用不同金属盐和邻二酚羟基络合的方法获得。
本发明漆酚及其衍生物或其药用盐可以单独直接应用，可以相互组合应用，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂或液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。对成人来说，给药量每天可以5-200mg比较合适。
附图说明：
图1为本发明化合物(I)漆酚对HUVEC的IC50值；
图2为本发明化合物(I)漆酚对HUVEC迁移能力的实验结果；
图3为本发明化合物(I)漆酚对HUVEC成管的实验结果。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都应该理解为本发明范围。
实施例1：
结构式(I)漆酚化合物及衍生物的制备和结构鉴定：
取来自漆树科植物漆树(Rhus verniciflua Stokes)的干燥树脂干漆(Toxicodendron vernicifluum)17kg，粉碎，用80％乙醇浸泡提取3次(15L，10L，10L)，然后残渣再用丙酮浸泡一次(8L)，提取液合并后减压浓缩得浸膏400g，浸膏经适量水分散后分别用等量乙酸乙酯萃取三次，萃取液浓缩得浸膏220g。乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析(柱子规格：10.5×60cm；硅胶200-300目，2.5kg)，氯仿-甲醇梯度洗脱，以薄层层析作为指导(10％硫酸乙醇显色，下同)进行合并得组份A：1-11(氯仿-甲醇，98∶2，3L)，B：12-17(氯仿-甲醇，96∶4，4L)，C：18-24(氯仿-甲醇，92∶8，4L)，D：25-32(氯仿-甲醇，90∶10，3L)。C组份(15g)经MCI gel CHP20P(3.5×40cm，丙酮-水，50％60％，70％，80％，500mL/梯度)柱层析，以薄层层析作为合并的指导原则，得组份BI(上述70％洗脱部分)，BII(上述80％洗脱部分。组份BI(12g)经过Sephadex LH-20(氯仿-甲醇6∶4)凝胶过滤后得结构I所示化合物漆酚(10g)。
化合物漆酚(I)的结构鉴定数据：
核磁共振波谱用Bruker AV-400光谱仪测定；质谱测试仪器为VG Autospec-3000和API QSTAR Pulsar 1光谱仪。
化合物漆酚的结构式如下所示：
化合物漆酚：白色油状物。1H(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据见表1；TOFMS(negative)m/z：317[M-H]-，353[M+Cl]-。
表1.结构式(I)漆酚化合物的核磁共振波谱数据
本发明漆酚衍生物特征之一在于有效成份中所含有的化学成分具有邻二酚羟基，并在酚羟基的邻位有一个侧链，这是漆酚类化合物的核心结构。侧链可含有多个碳原子，侧链上可具有一个或多个双键或环氧，双键的构型可为顺式或反式，侧链上的碳原子可以不同氧化方式存在。由于漆酚类具有了这些特征，因此其极性一般较小，可用低极性溶剂萃取和色谱法获得；也可用不同金属盐和邻二酚羟基络合的方法获得本发明漆酚衍生物。
实施例2：
按实施例1的方法制得结构式(I)所示漆酚化合物及其衍生物，按常规法加注射用油，过滤，灌封、灭菌后可制成注射用乳剂。
实施例3：按实施例1的方法制得漆酚及其衍生物，按常规法配以各种药用辅料可制成各种其它固体和液体制剂。
实施例4：
按实施例1的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例5：
按实施例1的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
实施例6：
将所分离得到结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
实施例7：
按实施例1-10的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1∶5-1∶10的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例8：
按实施例1的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例7：
按实施例1的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
实施例8：
按实施例1的方法先制得结构式(I)所示漆酚化合物，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为3∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
实施例9：
本发明漆酚及其衍生物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗恶性肿瘤作用：细胞毒活性。
(1)实验原理：对肿瘤细胞的杀伤和抑制将有可能发展成为抗肿瘤药物，多年来细胞毒类药物在人类征服癌症的过程中起到了重要的作用，到目前为止，该类药物仍占据抗癌药物的主要市场。细胞毒类抗肿瘤药物筛选一般采取MTT法，MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定光密度OD值，以反映出活细胞数目，即可了解药物对细胞的毒性。本实验采取这一原理进行。
(2)实验方法：细胞毒实验是按照文献(J.Immunol.Methods 1983，65，55-63；Cancer Res.1988，48，589-601；Chin.J.Pharm.1993，24，455-457)通用方法进行的。简单而言，100μl贴壁细胞种到96孔微板中，在加药物前，贴壁12小时；悬浮细胞在将加受试药物前以1×105cells/ml密度种到96孔微板。每个受试药物浓度分别为0.0625，0.32，1.6，8和40μM，药物与细胞接触时间为48小时。然后，细胞生存能力按照文献(Am.J.Hygiene 1938，27，493-497)方法测试，以IC50值表示。
(3)实验结果：IC50值(μM)如表2所示。
表2结构式(I)漆酚化合物细胞毒活性IC5o值(μM)
| 样品名称 | HL-60 | Jurkat | K562 | U937 | HepG2 | MCF7 | SGC7901 |
| 结构I | 0.9 | 0.7 | 4.1 | 0.5 | 18.0 | 40.0 | 18.4 |
实施例10：
本发明漆酚及其衍生物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗恶性肿瘤作用：抗肿瘤血管生成作用。
实验原理：许多研究已经证实当肿瘤生长到一定体积，比如约1立方毫米时(约106个细胞)，就具有形成血管的能力以获得养分和促进排泄，肿瘤血管生成也是肿瘤复发和转移的重要原因。内皮细胞是血管的重要组成部分，因此对内皮细胞具有增殖、迁移以及成管抑制的物质被认为将会抑制肿瘤血管生成，从而抗癌。HUVEC(人脐静脉内皮细胞)作为内皮细胞的一个类型被广泛用于肿瘤血管生成的模型研究，因此对HUVEC具有增殖、迁移和成管抑制的物质将可能发展成为新的抗肿瘤血管生成药物，用于癌症治疗和防治癌症的复发和转移。本实验采取这一原理进行。
实验方法及结果：
1、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)增殖抑制实验：药物抑制HUVEC增殖试验是按照文献(Bioorg Med Chem Lett 2009；19：1851-1854)方法采用MTT进行测定的。简单而言，以1000HUVECs/孔将细胞种到96孔微板中，在加不同浓度的药物(药物溶解在DMSO或其它细胞可耐受的溶剂中，并控制其溶剂的终浓度)前，细胞贴壁20小时。在37℃孵育96小时后，细胞用MTT试剂处理，测定细胞活力，以IC50值表示活性大小。
实验结果如图1所示。
其中gq-3＝gq-5＝结构I漆酚化合物，IC50值为0.25μM.
2、HUVEC迁移能力实验：HUVEC细胞迁移能力实验是按照文献(J Cell Biol 107：1199-1205)受伤愈合方法进行的。HUVEC以3×105/孔种到24孔板中，并用完全培养基于37℃含5％CO2培养，24小时后，细胞换用低浓度血清(0.5％FBS)培养24小时。然后每孔HUVEC以水平方式用P100吸液管尖端进行划痕，随机选择三个含划痕的视野采用配备有相机的荧光倒置显微镜，在刚换新鲜培养基时对每孔划痕进行图像获得。继续孵育7小时，采取上面相同的方法对划痕进行图像获得。细胞迁移能力的分析可以通过比较对照和受试药物7小时前后划痕变化而确定。
实验结果如图2所示。
3、HUVEC成管实验：HUVEC成管实验按照文献(J Natl CancerInst 95：388-399)方法进行。收获汇合的HUVEC，并用低浓度的血清培养基250毫升稀释(4.5×104HUVECs)，含药物10μg/ml，将其种到24孔板中，并设对照组，37℃孵育7小时，然后用装备有照相机的倒置荧光显微镜，随机选择3个视野进行图像获取，比较药物和对照组图像中管状结构以评价药物对成管的效能。
实验结果：如图3所示，其中gq-3＝gq-5＝结构I漆酚化合物。
干漆为漆树科植物漆树(Rhus verniciflua Stokes)的干燥树脂，辛温毒烈，功专破血杀虫，是张仲景《金匮要略》著名方剂大黄蛰虫丸的主要组成之一。本发明从干漆的性味、功效出发，发现干漆的提取物对HL-60，Jurkat，K562，U937，HepG2，MCF和SGC7901等7种肿瘤细胞株均显示出显著的生长抑制活性；鉴于肿瘤血管生成与肿瘤生长、侵袭和转移等特性密切相关，因此以肿瘤血管生成为靶点，开发肿瘤血管生成抑制剂已成为肿瘤药物研究中的热点，本发明在研究中也首次发现该提取物能明显抑制与肿瘤血管生成相关的HUVEC(内皮细胞)的增殖，划痕法试验显示其能在六小时内显著抑制HUVEC内皮细胞的迁移和成管；进一步本发明采用乙酸乙酯作为溶剂提取干漆中的酚性小分子化合物，并从中筛选出具有抗肿瘤活性的化合物，其中编号为GQ-35的化合物对人淋巴母细胞株(TK6)、多发性骨髓瘤细胞株(RPMI8226)、人红白血病细胞等肿瘤细胞株(HEL)作用良好；同时，本发明分离纯化出一个GQ-35的结构类似物，编号为GQ-5(结构I)，其同样具有较强的生物活性，表现出该化合物对上述7种肿瘤细胞株尤其是4种白血病细胞株显示出较强的细胞毒活性，对HUVEC内皮细胞的增殖、迁移和成管均具有明显的抑制效应，提示该分子可能在肿瘤血管生成方面具有重要的研究价值，在NF-kappaB模型上，结构I的IC50＝0.8μM；为了对结构I的药物潜力做出评价，本发明进一步的小鼠急性毒性实验显示，结构I在30mg/kg的高剂量时灌胃，除了给药头4天体重略有下降，然后很快自行恢复外，其它主要脏器肝、心、脾、肺、肾等均未见毒性反应；同时本发明采用猪做模型研究其是否对皮肤具有刺激性，结果24小时内未见皮肤刺激性反应。因此无论从细胞毒、肿瘤血管生成、以及NF一kappaB等任何一个角度来看，具有结构I的漆酚化合物及其衍生物或其药用盐均具有较好的抗癌前景。
本发明的漆酚及其衍生物来自本身具有显著抗肿瘤作用的传统中药材干漆，本发明的化合物在药材中含量较高，因此是干漆发挥抗肿瘤作用的重要药效物质基础，成药性好。本发明化合物及其衍生物或药用盐呈现的显著肿瘤细胞毒活性、肿瘤血管生成抑制作用等，将对恶性肿瘤及其引起的多种不适症状均具有较好的疗效，适用于任何年龄的患者。由于其新颖和独特的多靶点效应，因此对于肿瘤的复发和转移具有重要治疗价值。对肝癌前期的肝硬化也有一定的疗效。制成的剂型符合临床需要，且使用和携带方便。
Claims (2)
1.结构式（I）所述的漆酚化合物的制备方法：取来自漆树科植物漆树（Rhus verniciflua Stokes）的干燥树脂干漆（Toxicodendron vernicifluum），粉碎，用80％乙醇浸泡提取3次，然后残渣再用丙酮浸泡一次，提取液合并后减压浓缩得浸膏，浸膏经水分散后分别用等量乙酸乙酯萃取三次，萃取物经硅胶柱层析，氯仿－甲醇梯度洗脱，以薄层层析作为指导进行合并得组份A： 1－11，B: 12－17，C: 18－24，D: 25－32；C组份经MCI gel CHP 20P柱层析，以薄层层析作为合并的指导原则，得上述70％洗脱部分组份BI，上述80％洗脱部分组份BII；组份BI经过Sephadex LH-20凝胶过滤后即可
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于乙酸乙酯萃取硅胶柱规格：10.5×60 cm；硅胶200－300目，2.5 kg；组份A为氯仿－甲醇，98∶2，3 L洗脱，组份B为氯仿－甲醇，96∶4，4L洗脱，
组份C为氯仿－甲醇，92∶8，4 L洗脱，组份D为氯仿－甲醇，90∶10，3 L洗脱；C组份柱层析条件为3.5× 40cm，丙酮－水，50％，60%，70%，80%，500 mL/梯度；Sephadex LH-20凝胶过滤条件为：氯仿－甲醇6∶4。
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