CN102627533A

CN102627533A - 一种漆酚化合物的制备方法

Info

Publication number: CN102627533A
Application number: CN2012100852163A
Authority: CN
Inventors: 程永现; 陈显强; 吕青
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2012-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2012-08-08

Abstract

公开了生漆中一种漆酚化合物(Z)-3-(pentadec-8-en-1-yl)benzene-1，2-diol的制备方法，包括将来自漆树的生漆用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，HPLC检测并收集含有该化合物的流份，合并洗脱液并减压回收溶剂得浓缩后的油状物，进行RP-18反相柱层析，甲醇-水洗脱，收集含有该化合物的流份，浓缩得到的油状物行Sephadex LH-20柱层析进行脱色，并除去部分杂质。该工艺操作方便，三步柱层析即可从生漆中获得高纯度和高收率的纯品。工艺中使用的反相硅胶和凝胶材料均可反复使用，洗脱溶剂相对廉价，且可循环使用，适合工业化生产。

Description

一种漆酚化合物的制备方法

技术领域

本发明属于化学化工领域，涉及天然药物提取分离工艺技术，具体地，涉及生漆中一种漆酚化合物(Z)-3-(pentadec-8-en-1-yl)benzene-1，2-diol(简称GQ-3)的分离纯化工艺，该漆酚化合物具有抗癌作用，是生漆、干漆中的药效成分之一。

背景技术

癌症严重危害人类健康，被喻为“人类的第一杀手”，并且发病率逐年上升，预计到2020年，全球每年可能新增癌症病人1500万。纵观1981至2002年间人们寻找抗癌药物研究工作，60％直接或间接来自天然产物，说明自然界已成为寻找抗癌药物的重要源泉，尤其，近些年，喜树碱、长春新碱、三尖杉酯碱、紫杉醇的发现，表明从天然产物中寻找抗癌药物已取得重要的进展。

生漆是漆树[Toxicodendron vernicifluum(Stokes)F.A.Barkley]经人工割口从韧皮层中分泌出来的乳白色乳状液体。漆树主要分布于中国，在缅甸、柬埔寨、印度、越南、老挝、泰国、日本、朝鲜等国家也有少量分布，因此，中国是生漆的主产国，全世界约有70％-85％的生漆是中国生产的。生漆是一种优质的天然涂料，也可以入药，明代李时珍《本草纲目》记载“生漆，去长虫。久服，轻身耐老。”现代研究表明生漆主要由漆酚(60％-70％)、漆酶(＜1.0％)、树胶质(5％-7％)、糖蛋白(2％-5％)及水份(20％-30％)等组成，漆酚是生漆的主要成份，是由饱和漆酚、单烯漆酚、双烯漆酚和三烯漆酚等异构体组成的混合物，其中三烯漆酚与单烯漆酚之和占总漆酚的90％。

目前一般的中药分离纯化技术路线为回流提取，提取溶剂为乙醇和水，得到提取物，再用一定的柱色谱技术对提取物进行纯化(多见于大孔吸附树脂柱色谱技术)。本发明人长期从事从自然界寻找具有抗癌物质的工作，曾发现干漆中的一个漆酚化合物(GQ-3)具有抗癌作用，寻找高含量资源过程中，发现GQ-3在漆树的树脂(生漆)中含量较高，是药物开发的优质资源，但目前尚未见从生漆中简便高效获取该漆酚化合物的工艺。

发明内容

本发明旨在提供生漆中一种漆酚化合物(GQ-3)的分离纯化工艺，并且获得高纯度、高收率的单体化合物，为天然药物的开发应用提供效率高、操作简单、工艺简化、低成本的制备工艺。

本发明考虑到化合物GQ-3易氧化以及对热不稳定等特性，经过大量探索研究，形成了温和、廉价、简便和高效的制备方法。比如本发明没有经过提取的过程，而是直接将生漆溶解拌样，用正相硅胶柱进行分离，这一步集常规方法的提取、萃取、粗分于一体，可以避免样品的热不稳定性，同时也简化了工艺。本发明在研究三种柱色谱分离工艺中，考察了上样量、色谱柱径高比、洗脱剂类型及比例、洗脱流速，最终确定了最佳的工艺条件。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案加以实现的：

如下结构式的漆酚化合物

(Z)-3-(pentadec-8-en-1-yl)benzene-1，2-diol的分离制备方法，

以生漆为原料，用有机溶剂溶解，硅胶拌样，挥干溶剂，待上样；取4-20倍样品重量的硅胶，用石油醚-乙酸乙酯湿法装柱，柱子径高比1∶4-1∶10，将拌好的样上到柱子顶部，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，流速为0.5-2BV/h，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物进行反相RP-18柱层析，柱子径高比1∶10-1∶30，上样量为反相填料的1/30-1/100，用甲醇-水洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物；将反相柱层析所得的样品用Sephadex LH-20脱色并且除去部分杂质，SephadexLH-20柱子径高比1∶30-1∶50，Sephadex LH-20用量至少为上样量的40倍，用氯仿或二氯甲烷-甲醇洗脱，HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂。

更具体地，本发明通过下述的3种柱色谱技术路线来实现：

(1)将生漆用乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，挥干溶剂，待上样。

(2)取4-10倍样品重量的硅胶，用石油醚-乙酸乙酯湿法装柱，柱子径高比1∶4-1∶10，样品与硅胶比例为1∶4-1∶20，将拌好的样品上柱，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，流速为0.5-2BV/h，以对照品为参照，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物的流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物，油状物重量为上样量的8％；

(3)把(2)所得的样品进行反相(C-18)柱层析，柱子径高比1∶10-1∶30，上样量为反相填料的1/30-1/100，用甲醇-水70∶30-90∶10洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物，油状物重量为上样前的33.6％；

(4)将反相柱层析所得的样品用Sephadex LH-20脱色并除去部分杂质，Sephadex LH-20柱径高比约1∶30-1∶50，Sephadex LH-20用量为上样量的40倍及其以上，用氯仿或二氯甲烷-甲醇洗脱，HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，即得到了高纯度的化合物GQ-3。

本发明提供了一种制备高纯度单体的制备方法，该单体可以单独或与适宜的赋形剂制成药物，也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用。

发明人通过研究，开发出一套完整的从生漆中制备该漆酚化合物单体的生产工艺。与现有技术相比，本发明具有以下显著的特点和优益性：

1、与常规的提取分离技术手段相比，本发明没有经过提取这一过程，而是采用集提取、萃取、粗分于一体，这样可以避免热破坏漆酚物质，同时也简化工艺，缩短得到单体的时间，从经济效益看，节省了人力、物力的成本。

2、对于柱层析的条件和参数，如上样量、柱子径高比、洗脱剂、洗脱流速等，发明人通过单因素和多因素实验的考察，获得了最佳的工艺路线，并获得了最好的得率以及高纯度的单体。

3、本发明步骤少，只用了三步即得到高纯度的化合物，即三次柱层析，无需反复进行层析等工作；本工艺的操作简便，稳定，可重复。

4、本发明采用的检测流份的手段也是经过反复摸索获得的最佳的手段。在检测流份中的目标化合物常用的手段为TLC，但是本发明所用材料具有较多理化性质类似的漆酚，它们在TLC板上的比移值接近甚至相同，这样会给合并工作带来许多干扰，同时也给后面的纯化工作带来很多困难，然而用HPLC手段检测流份中的目标化合物，可以避免TLC手段带来的困惑，更加精准的定位目标化合物，更少的把非目标化合物引入，给后面的纯化工作带来极大的方便。

5、本发明使用的C-18反相柱填料和Sephadex LH-20均可再生和反复利用，洗脱剂价格便宜，且可重复利用。

具体实施方式：

本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限制本发明。

实施例1：

取生漆50.2克，用乙酸乙酯溶解，硅胶拌样(100-200目)，挥干溶剂，备用。

取300克硅胶，用石油醚-乙酸乙酯(30∶1)湿法装柱，柱径5cm，柱长35cm；把拌好的样品加到柱子的顶端，用石油醚-乙酸乙酯(30∶1)进行洗脱，流速为1BV/h，前面1000ml洗脱液弃去，然后每100ml收集一份，用HPLC检测流份，合并22-36，减压回收溶剂，得到样品4.1g。

称取50g C-18反相材料，湿法装柱，柱径为2.1cm，柱长21cm，称取由硅胶柱层析所得的样品1.25g，用甲醇溶解，上样，用甲醇-水(80∶20)洗脱，流速为2ml/min，20ml收集一个流份，共收集200份，用HPLC检测，结果如下：第111份至116份含有少量的目标成分，但含有较多的杂质，第117份至第190份含有目标成分，并且杂质较少，自第191份以及之后没有目标成分，因此合并第117-190份，减压浓缩，得到420mg样品。

将反相柱层析得到的样品进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱子规格为1.56×65cm。取反相柱色谱所得样品300mg上样，用氯仿-甲醇进行洗脱，流速为6秒一滴，每5ml收集一份，共收集13份，HPLC检测各流份，结果第6-11份含有目标成分，但是第6份杂质较多，颜色也较深，因此，弃去第6份，合并第7-11份，减压回收溶剂，得到205mg样品，用HPLC检测纯度达92.5％(按峰面积归一化法计算)。

实施例2：

取生漆50.8克，用氯仿溶解，硅胶拌样(100-200目)，挥干溶剂，备用。

取200克硅胶，用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)湿法装柱，柱径5cm，柱长22cm；把拌好的样品加到柱子的顶端，用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)进行洗脱，流速为1.5BV/h，前面900ml洗脱液弃去，然后每100ml收集一份，用HPLC检测流份，合并11-26，减压回收溶剂，得到样品4.2g。

称取80g C-18反相材料，湿法装柱，柱径为2.1cm，柱长约33cm，称取由硅胶柱层析所得的样品1.31g，用甲醇溶解，上样，用甲醇-水(75∶25)洗脱，流速为1ml/min，20ml收集一个流份，共收集260份，用HPLC检测，合并含有目标成分的第174-258份，减压浓缩，得到450mg样品。

将反相柱层析得到的样品进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱子规格为1.56×65cm。取反相柱色谱所得样品150mg上样，用氯仿-甲醇进行洗脱，流速为5秒一滴，每5ml收集一份，共收集13份，HPLC检测各流份，结果第5-9份含有目标成分，但是第5份杂质较多，颜色也较深，因此，弃去第5份，合并第6-9份，减压回收溶剂，得到100mg样品，用HPLC检测纯度达93.8％(按峰面积归一化法计算)。

实施例3：

取生漆51.2克，用氯仿溶解，硅胶拌样(100-200目)，挥干溶剂，备用。

取约400克硅胶，用石油醚-乙酸乙酯(15∶1)湿法装柱，柱径6cm，柱长31cm；把拌好的样品加到柱子的顶端，用石油醚-乙酸乙酯(15∶1)进行洗脱，流速为2BV/h，前面1500ml洗脱液弃去，然后每100ml收集一份，用HPLC检测流份，合并15-28，减压回收溶剂，得到样品4.25g。

称取约100g C-18反相材料，湿法装柱，柱径为3cm，柱长约20cm，称取由硅胶柱层析所得的样品1.28g，用甲醇溶解，上样，用甲醇-水(85∶15)洗脱，流速为1.5ml/min，约20ml收集一个流份，共收集249份，用HPLC检测，合并含有目标成分的第145-230份，减压浓缩，得到441mg样品。

将反相柱层析得到的样品进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱子规格为2.5×120cm。取反相柱色谱所得样品441mg上样，用氯仿-甲醇进行洗脱，流速为5秒一滴，约每10ml收集一份，共收集20份，HPLC检测各流份，合并第7-13份，减压回收溶剂，得到300mg样品，用HPLC检测纯度达94.7％(按峰面积归一化法计算)。

实施例4：

取生漆25.4克，用乙酸乙酯溶解，硅胶拌样(100-200目)，挥干溶剂，备用。

取约500克硅胶，用石油醚-乙酸乙酯(15∶1)湿法装柱，柱径5cm，柱长58cm；把拌好的样品加到柱子的顶端，用石油醚-乙酸乙酯(20∶1)进行洗脱，流速为1BV/h，前面2000ml洗脱液弃去，然后每100ml收集一份，用HPLC检测流份，合并15-30，减压回收溶剂，得到样品2.0g。

称取约100g C-18反相材料，湿法装柱，柱径为2.1cm，柱长约41.6cm，称取由硅胶柱层析所得的样品1.1g，用甲醇溶解，上样，用甲醇-水(85∶15)洗脱，流速为1ml/min，约20ml收集一个流份，共收集270份，用HPLC检测，合并含有目标成分的第162-263份，减压浓缩，得到400mg样品。

将反相柱层析得到的样品进行Sephadex LH-20凝胶柱色谱，柱子规格为2.5×120cm。取反相柱色谱所得样品350mg上样，用氯仿-甲醇进行洗脱，流速为5秒一滴，约每10ml收集一份，共收集30份，HPLC检测各流份，合并第6-17份，减压回收溶剂，得到240mg样品，用HPLC检测纯度达93.8％(按峰面积归一化法计算)。

Claims

1.如下结构式的漆酚化合物(Z)-3-(pentadec-8-en-1-yl)benzene-1，2-diol的分离制备方法，

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

(1)将生漆用乙酸乙酯溶解，用100-200目硅胶拌样，挥干溶剂，待上样；

(2)取4-10倍样品重量的硅胶，用石油醚-乙酸乙酯湿法装柱，柱子径高比1∶4-1∶10，样品与硅胶比例为1∶4-1∶20，将拌好的样品上柱，用石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，流速为0.5-2BV/h，以对照品为参照，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物的流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物；

(3)把(2)所得的样品进行反相(C-18)柱层析，柱子径高比1∶10-1∶30，上样量为反相填料的1/30-1/100，用甲醇-水70∶30-90∶10洗脱，洗脱流速为0.5-2BV/h，用HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，得到浓缩后的油状物；

(4)将反相柱层析所得的样品用Sephadex LH-20脱色并除去部分杂质，Sephadex LH-20柱径高比1∶30-1∶50，Sephadex LH-20用量为上样量的40倍及以上，用氯仿或二氯甲烷-甲醇洗脱，HPLC检测各个流份，收集含有目标化合物流份，减压回收溶剂，即得目标化合物(Z)-3-(pentadec-8-en-1-yl)benzene-1，2-diol。