CN106518831B

CN106518831B - 一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法

Info

Publication number: CN106518831B
Application number: CN201610946727.8A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 周蒙; 梅雪婷; 姜萍; 李迅; 黄申林; 张瑜
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: CN106518831A

Abstract

本发明公开了一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，将富含原花色素植物原料的乙醇水溶液提取物，经液‑液萃取后，过凝胶柱，再经FPLC或HSCCC分离，分别得到原花色素二聚体、三聚体成分。本发明的工艺适用于不同来源下的原花色素二聚体和三聚体的分离纯化，具有普适性。本发明的工艺方法得到的原花色素二聚体、三聚体纯度高，方法安全性强、操作简单、耗时短、生产成本低、环境友好、符合绿色化学标准，适用于工业化生产，具有极大的商业价值。

Description

一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法

技术领域

本发明属于黄烷-3-醇二聚体、三聚体快速分离制备方法技术领域，具体涉及一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法。

背景技术

原花色素是自然界广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚化合物。多酚类物质具有较强的抗氧化能力及其他生物活性，有益于人体健康，其中原花色素是植物多酚化合物中含量最丰富的一类物质，日益受到人们的关注。

原花色素具有较 V_E、Vc、胡萝卜素更高的生物利用性，并能与V_E产生协同氧化作用。近几年原花色素主要用于医药、保健品、化妆品以及功能高分子功能材料等方面。然而，针对原花色素分离纯化方面研究成效一般，主要对其进行分级分离，制备出低聚原花色素。2011年Rie Kusano等人从黑荆树提取物中得到原花色素纯品，但工艺复杂且得率低。葡萄籽原花色素的分离纯化较黑荆树原花色素容易，目前HSCCC分离纯化葡萄籽原花色素技术日益成熟。2015年孙宝山等人通过HSCCC从葡萄籽中制备出77%儿茶素、93%表儿茶素、85%表儿茶素没食子酸酯等。黑荆树皮原花色素成分更复杂，并未发现简单、适合工业化的分离纯化方法。因此，找到一种对不同原料均能很好分离的方法至关重要。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，具有工艺简单且成本低，可工业化，具有普适性等特点。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，将富含原花色素类植物原料粉碎、过筛后，用乙醇水溶液超声波辅助提取，提取液抽滤后，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥至恒重，得提取物；将上述提取物溶于水，用石油醚萃取，水层用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯层物质；将乙酸乙酯层物质溶于乙醇中，将样品过凝胶柱，用乙醇水溶液进行等度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥至恒重，即得原花色素初品；将原花色素初品经快速蛋白液相色谱（FPLC）或高速逆流色谱（HSCCC）分离，即得到原花色素二聚体、三聚物成分。

所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，具体步骤如下：

1）将植物原料粉碎、过30-60目筛，用乙醇水溶液超声波辅助提取，得到提取液进行旋转蒸发浓缩；

2）将上述浓缩样品依次经石油醚、乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯层，减压浓缩、冷冻干燥得乙酸乙酯萃取物；

3）将上述乙酸乙酯萃取物粉末溶于乙醇中，过已预处理好的凝胶柱，用乙醇进行等度洗脱，收集不同组分；

4）将收集到的组分进行液相色谱分析，将相同组分合并，合并组分通过FPLC或HSCCC进一步纯化，即得原花色素二聚体、三聚体纯品。

所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，植物原料包括黑荆树、葡萄籽。

步骤1）中，采用30%~80%乙醇作为溶剂进行提取，液料比为1:5~1:15，超声时间为10~60min，超声频率60kHz，提取温度35~70℃。

步骤3）中，乙酸乙酯萃取物经凝胶柱Sephadex G-25或Sephadex LH-20过滤，采用70%~100%的等浓度乙醇进行等度洗脱，洗脱流速为0.5~1.5mL/min，10-50mL作为一个组分进行收集。

步骤4）中，FPLC制备分离选择甲醇和水为流动相，进行梯度洗脱，6个柱体积下甲醇浓度以5%至60%线性增加。

步骤4）中，HSCCC溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水或正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水。

本发明的原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，采用超声波辅助提取技术提取原花色素，所得提取液减压浓缩、冷冻干燥。提取物用石油醚与水萃取，水层用乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯层减压浓缩、冷冻干燥。将上述乙酸乙酯层物质溶于乙醇中，将样品过凝胶柱Sephadex G-25及Sephadex LH-20，用70%~100%乙醇水溶液为流动相进行等度洗脱，洗脱流速为0.5~1.5mL/min，收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥至恒重，即得原花色素初品；将上述原花色素初品经快速蛋白液相色谱和高速逆流色谱分离，即得到原花色素二聚体、三聚体。

有益效果：与现有技术相比，本发明的原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，采用超声波辅助提取，以乙醇水为溶剂，经过简单的萃取分离后样品过凝胶柱SephadexG-25及Sephadex LH-20，流动相选用乙醇水溶液。采用该技术在操作过程中无毒害物质的添加，安全性强，操作简单，只需要过一次凝胶柱，耗时短，分离效率高，原花色素二聚体、三聚体的纯度及得率较高。2）制备过程中使用乙醇水为提取溶剂，柱分离过程中以乙醇水溶液为流动相，溶剂便宜易得且环境友好，因此更适合工业化生产原花色素，该分离纯化方法具有很高的商业价值。

附图说明

图1是黑荆树皮提取物乙酸乙酯萃取层液相色谱图；

图2是黑荆树皮原花色素初品液质联用分析图；其中，为二聚体、为三聚体；

图3是黑荆树原花色素初品经FPLC分离得到的二聚体液质联用分析图；

图4是黑荆树皮原花色素高速逆流色谱制备分离图；

图5是黑荆树原花色素初品经FPLC分离得到的三聚体液质联用分析图；

图6是葡萄籽提取物的乙酸乙酯萃取物液相色谱图；

图7是葡萄籽乙酸乙酯萃取物经凝胶柱过滤分离样品的液质联用分析图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

将10g经粉碎过筛的黑荆树树皮原料，按照料液比1:10加入100mL 60%乙醇，在50℃下采用超声波辅助提取30min，过滤后得到提取液。提取液旋蒸浓缩，将提取物溶于200mL水中。水溶液加入100mL石油醚萃取（三次），得水层。水层用600mL乙酸乙酯萃取（三次），得乙酸乙酯层。乙酸乙酯层旋干并冷冻干燥得到黑荆树皮乙酸乙脂萃取物，其成分的液相色谱分析结果见图1。由图1可知，黑荆树树皮提取物经乙酸乙酯萃取后成分复杂，液相图出现叠峰则说明乙酸乙酯层存在原花色素低聚物的同分异构体，增加黑荆树原花色素中单一化合物的分离纯化难度。

将2g黑荆树皮乙酸乙酯萃取物溶于约20mL乙醇中，过0.45μm滤膜、备用。溶解的样品过Sephadex LH-20凝胶柱，用浓度为100%的乙醇进行等度洗脱。以10mL/管收集组分，将所得组分进行液相分析，合并相同组分。将合并组分进行液质分析，初步确定其结构，结果见图2。由图2可知，将原花色素初品过葡聚糖凝胶柱、以乙醇等度洗脱能将原花色素根据不同聚合度进行分离，可制得60%纯度的黑荆树原花色素二聚体、47%纯度的黑荆树原花色素二聚体、50%纯度的黑荆树原花色素三聚体，该分离组分便于后续单体的进一步纯化。

将0.1g纯度为60%的黑荆树原花色素二聚体溶于约10mL水中，溶解样品通过FPLC分离纯化，流动相为甲醇与水，固定相为XBP C18半制备柱，洗脱方法为5%~60%甲醇梯度洗脱。上样量为2mL，流速1~1.5mL/min。合并相同组分。将合并组分进行液质分析，结果见图3。由图3可知，FPLC能有效分离纯化葡聚糖凝胶柱分离产物二聚体，制得原花色素二聚体纯度达92%。

将0.1g纯度为60%的黑荆树原花色素二聚体溶于约20mL逆流色谱下相中，溶解样品通过HSCCC分离纯化，溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水。上相以15~25mL/min泵入，转速750~900r/min，以1~3mL/min泵入流动相。按峰收集合并相同组分。将合并组分进行液质分析，原花色素二聚体纯度达92%， HSCCC制备分离结果见图4。由图4可知，HSCCC能有效分离纯化葡聚糖凝胶柱分离产物，根据图4在线图谱收集3个组分进行液相分析并合并目标组分，便于目标组分的收集。

将0.1g纯度约为50%的黑荆树原花色素三聚体样品溶于10mL水中，溶解样品通过FPLC分离纯化，流动相为甲醇与水，固定相为XBP C18半制备柱，洗脱方法为5%~60%甲醇梯度洗脱。上样量为2mL，流速1~1.5mL/min。合并相同组分。将合并组分进行液质分析，结果见图5。由图5可知，FPLC能有效分离纯化葡聚糖凝胶柱分离产物三聚体，制得原花色素三聚体纯度达93%。

实施例2

将10g经粉碎过筛的葡萄籽原料，按照料液比1:10加入100mL60%乙醇，在50℃下采用超声波辅助提取30min，过滤后得到提取液。提取液旋蒸浓缩，将提取物溶于200mL水中，水溶液加入100mL石油醚萃取（三次），得水层。水层用600mL乙酸乙酯萃取（三次），得乙酸乙酯层。乙酸乙酯层旋干并冷冻干燥后得到葡萄籽乙酸乙脂萃取物，其成分的液相色谱分析结果见图6。由图6可知，葡萄籽粗提物经乙酸乙酯萃取后得到葡萄籽低聚物，成分复杂，需要进一步分离纯化。

将2g葡萄籽乙酸乙酯萃取物溶于20mL乙醇中，过0.45μm滤膜、备用。溶解的样品过Sephadex G-25，用浓度为100%的乙醇等度洗脱。以10mL/管收集组分，将所得组分进行液相分析，合并相同组分。将合并组分进行液质分析，初步确定其结构，结果见图7。由图7可知，将葡萄籽原花色素初品经葡聚糖凝胶柱过滤、以乙醇等度洗脱能将葡萄籽低聚物有效分离，可制得纯度80%以上的葡萄籽原花色素二聚体，方法简单且重复性好，说明葡聚糖凝胶柱过滤配合乙醇等度洗脱是一种理想的原花色素二聚体、三聚体分离纯化方法。

Claims

1.一种植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，其特征在于：将富含原花色素类植物原料的原花色素乙酸乙酯萃取物溶于乙醇中，将样品过凝胶柱，用乙醇水溶液进行等度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩回收乙醇，冷冻干燥至恒重，即得原花色素初品；将原花色素初品经快速蛋白液相色谱或高速逆流色谱分离，即得到原花色素二聚体、三聚体成分；其中，植物原料为黑荆树，其二聚体、三聚体的快速分离制备的具体步骤如下：

1)将植物原料粉碎、过30-60目筛，用乙醇水溶液超声波辅助提取，得到提取液进行旋转蒸发浓缩；

2)将上述浓缩样品依次经石油醚、乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯层，减压浓缩、冷冻干燥得乙酸乙酯萃取物；

3)将上述乙酸乙酯萃取物粉末溶于乙醇中，过已预处理好的凝胶柱，用乙醇进行等度洗脱，收集不同组分；

4)将收集到的组分进行液相色谱分析，将相同组分合并，合并组分通过FPLC或HSCCC进一步纯化，即得原花色素二聚体、三聚体纯品。

2.根据权利要求1所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，其特征在于：步骤1)中，采用30％～80％乙醇作为溶剂进行提取，液料比为1:5～1:15，超声时间为10～60min，超声频率60kHz，提取温度35～70℃。

3.根据权利要求1所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，其特征在于：步骤3)中，乙酸乙酯萃取物经凝胶柱Sephadex G-25或Sephadex LH-20过滤，采用70％～100％的等浓度乙醇进行等度洗脱，洗脱流速为0.5～1.5mL/min，10-50mL作为一个组分进行收集。

4.根据权利要求1所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，其特征在于：步骤4)中，FPLC制备分离选择甲醇和水为流动相，进行梯度洗脱，6个柱体积下甲醇浓度以5％至60％线性增加。

5.根据权利要求1所述的植物原花色素二聚体、三聚体快速分离制备方法，其特征在于：步骤4)中，HSCCC溶剂体系为乙酸乙酯-甲醇-水或正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水。