CN112870298B - 一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明是一种铁皮石斛原液，为铁皮石斛水提原液或富含寡糖的铁皮石斛原液；其中，铁皮石斛水提原液的寡糖含量按体积百分比计大于80％；富含寡糖的铁皮石斛原液，其寡糖含量按体积百分比计为75％‑85％；寡糖含有3‑9个糖苷残基，优选的，寡糖的结构如式(I)所示：
Figure DDA0002964493050000011
并提供了其制备方法和应用。本发明的有益效果：本发明提供了富含寡糖铁皮石斛原液的工业化制备方法，解决了铁皮石斛多糖的澄清度及透明度问题，改善了铁皮石斛水提液的皮肤透过性问题，增加了铁皮石斛的提取率及充分利用率。还首次提出铁皮石斛寡糖具有抗衰老作用，可加入化妆品中，用于实现抗衰老功效。

Description

一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及天然药物化学技术领域，特别是涉及一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用。
背景技术
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为兰科(Orchidaceae)石斛属多年生草本植物，又称黑节草，载于各版药典，是铁皮石斛药材的重要来源，主要分布于云南、浙江、安徽和广东等省份，在缅甸、越南也有分布。铁皮石斛主要含有菧类、菲类、多酚、多糖等化学成分，具有抗氧化，降糖，调节免疫和抗炎等活性。具有生津养胃；滋阴清热；润肺益肾；明目强腰等功效。铁皮石斛的茎作为传统中药可以用于肌肤润泽和消渴症。
岁月流失的雕刻刀在一个人脸上及身体上留下的深浅刻痕首先呈现在衰老上，衰老大体分为两类：生理性衰老和病理性衰老。生理性衰老是指成熟期后出现的生理性退化过程，病理性衰老是由于各种外来因素(包括各种疾病)所导致的老年性变化。两者实际很难区分。同时衰老是人体生长发育的必然结果。如何延缓衰老的脚步一直是护肤品领域及生物医药大健康领域所关注的焦点。现今所使用的抗衰老护肤品中大多添加有抗坏血酸、透明质酸、细胞生长因子等成分，这些成分或多或少的在衰老的某个环节中起到延缓衰老的作用，但随着天然产物的不断发展，人们更多的将视线转移到了天然产物上，以期获得天然、绿色、安全、高效的中药抗衰老化妆品原料。
目前，国内外多位研究者对铁皮石斛的各个部分进行化学成分提取分离研究，大部分研究者主要得到的均是分子量大于10万的多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、木糖及少量阿拉伯糖和甘露糖等单糖构成。有研究人员从铁皮石斛中提取出了2种多糖，其分子量分别为7.4×105,5.4×105。还有研究人员利用水提醇沉，硫酸水解方法，鉴定铁皮石斛中多糖主要由葡萄糖、木糖及阿拉伯糖三种单糖构成，并通过活性筛选发现铁皮石斛多糖类成分对小鼠外围白细胞计数有影响，说明其具有免疫调节的作用。有研究人员通过超声萃取得到铁皮石斛多糖并通过活性筛选发现铁皮石斛多糖类成分对果蝇的SOD、MDA、CAT有影响，说明其具有抗氧化的作用。还有部分研究者对铁皮石斛中的小分子成分进行化学分离鉴定及药理活性研究，研究人员从鉴定铁皮石斛中分离得到了20个化合物，主要为联苄类成分，并通过活性筛选发现铁皮石斛小分子酚类成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。有研究人员从鉴定铁皮石斛中分离得到了9个化合物，主要为木质素类酚类成分，这些前人研究工作，大量的集中在小分子酚类成分及多糖的药理活性研究上，对于寡糖的研究鲜有报道，本发明对寡糖的分子量、构成、制备及抗衰活性进行了全面研究，首次提出铁皮石斛寡糖具有抗衰老功效，适用于具有抗衰老功效的皮肤化妆品、及药品中。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用，主要目的在于提供或制备一种具有抗衰老功效的铁皮石斛原液。
为达到上述目的，本发明主要提供如下技术方案：
一方面，一种铁皮石斛原液，所述铁皮石斛原液是对铁皮石斛提取处理后得到的原液；其中，所述铁皮石斛原液为铁皮石斛富酚原液、铁皮石斛水提原液、富含寡糖的铁皮石斛原液中的任一种；
所述铁皮石斛水提原液含有寡糖，且所述寡糖的含量按体积百分比计大于80％；其中，所述寡糖含有3-9个糖苷残基；其中，所述糖苷残基包括葡萄糖残基，甘露糖残基，葡萄糖醛酸残基，优选的，所述寡糖含有6个糖苷残基；优选的，所述寡糖的结构如式(I)所示：
Figure GDA0003820276810000031
所述富含寡糖的铁皮石斛原液包括由铁皮石斛富酚原液和所述铁皮石斛水提原液混合处理后得到的混合原液；其中，所述富含寡糖的铁皮石斛原液的寡糖含量按体积百分比计为75％-85％；
优选的，所述富含寡糖的铁皮石斛原液还包括防腐剂，进一步优选的，所述防腐剂的用量为所述混合原液体积的4-6％。
另一方面，上述的一种铁皮石斛原液的制备方法，所述铁皮石斛水提原液的制备方法，包括以下步骤：
1)制备铁皮石斛粉末：
对铁皮石斛茎进行干燥处理后，再将其粉粹过筛，得到铁皮石斛粉末；
2)制备铁皮石斛醇提滤液：
用乙醇对所述铁皮石斛粉末进行回流提取，抽滤后合并滤液，并浓缩回收乙醇，得到浓缩滤液；
3)制备酚类成分液体：向所述浓缩滤液中加入1,3-丁二醇助溶，得到酚类成分液体；其中，所述酚类成分液体为所述铁皮石斛富酚原液；
4)制备铁皮石斛滤渣溶液：将步骤2)抽滤的滤渣挥干后与超纯水混合，得到铁皮石斛滤渣溶液；
5)制备铁皮石斛水提原液：在铁皮石斛滤渣溶液中加入水解酶反应，灭活后离心，弃去沉淀，得到铁皮石斛水提原液。
再一方面，上述的一种铁皮石斛原液的制备方法，
所述步骤1)中，优选的，干燥处理的温度为55-60℃；优选的，所述干燥处理后的铁皮石斛茎的水分含量低于6％；优选的，所述过筛的目数为20-40目；
所述步骤2)中，优选的，所述乙醇浓度为70-85％，所述铁皮石斛粉末和乙醇按照质量体积比1:(10-20)g/ml的比例混合；优选的，加热至80℃-85℃回流提取1-3次，每次40-80min；优选的，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味；
所述步骤3)中，优选的，是按减压浓缩后滤液回收乙醇后得到的水混悬液体积的4-6％加入1,3-丁二醇助溶；优选的，所述酚类成分液体为透明澄清的；优选的，酚类成分液体中，总黄酮含量为0.2％-0.9％，总联苄的含量0.1％-0.5％；水混悬液是指乙醇全部蒸出后所剩的水液，因为小分子溶于醇，在水中即成混悬液，需要加入丁二醇助溶至澄清溶液；
所述步骤4)中，优选的，滤渣挥干至无醇味；优选的，铁皮石斛滤渣与超纯水按质量体积比1:(50-80)g/ml的比例混合；
所述步骤5)中，优选的，水解酶加入量为铁皮石斛粉末重量的2％-4％；优选的，水解反应条件为50-80℃反应2h-4h；优选的，灭活方法为煮沸30min-60min；优选的，离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；优选的，水解酶为纤维素酶；优选的，铁皮石斛水提原液中寡糖含量为大于80％。
优选的，铁皮石斛水提原液的制备方法，具体步骤如下：B.铁皮石斛新鲜茎切断放置于鼓风干燥箱中55℃干燥，测其水分，水分达到6％以下时，将其粉碎过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃回流提取2次，每次60min，抽滤，合并滤液，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得铁皮石斛水提原液(原液中寡糖含量大于80％，分子量≈1000，含有3-9个葡萄糖，甘露糖，葡萄糖醛酸片段)。
再一方面，上述一种铁皮石斛原液的制备方法，所述富含寡糖的铁皮石斛原液的制备方法，还包括以下步骤：
6)制备富含寡糖的铁皮石斛原液：将步骤3)得到的铁皮石斛富酚原液和步骤5)得到的铁皮石斛水提原液合并，静置后离心，得到混合原液；其中，所述混合原液为所述富含寡糖的铁皮石斛原液，或向所述混合原液中加入防腐剂后，得到富含寡糖的铁皮石斛原液；
优选的，合并后涡旋混匀，隔夜静置22-26h；
优选的，离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；
优选的，富含寡糖的铁皮石斛原液中，寡糖的体积含量为75％-85％；
优选的，按所述混合原液的体积百分比加入4-6％苯氧乙醇防腐剂，得到富含寡糖的铁皮石斛原液。
优选的，所述富含寡糖的铁皮石斛原液的制备方法具体包括如下步骤：铁皮石斛新鲜茎切断放置于鼓风干燥箱中55℃干燥，测其水分，水分达到6％以下时，将其粉碎过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃回流提取2次，每次60min，抽滤，合并滤液，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得铁皮石斛水提液(水提液中寡糖含量为80％-90％)。合并酚性成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得富含寡糖铁皮石斛原液(原液中寡糖含量为75％-85％)，按原液体积比加入5％苯氧乙醇防腐。
另一方面，上述的一种铁皮石斛原液在制备抗衰老产品中的应用；优选的，所述产品包括药物、制剂及化妆品；优选的，所述化妆品的类型包括面霜、乳剂、化妆水或修复霜。
再一方面，一种抗衰老产品，所述抗衰老产品为面霜或乳剂；其中，
按照质量百分比计，所述面霜包括：富含寡糖的铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸7.5-8.5％，C16醇1.5-2.5％，自乳化单甘酯1.5-2.5％，氢化羊毛脂1.5-2.5％，液体石蜡11-13％，甘油6-8％，乳化剂1-2％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量；
按照质量百分比计，所述乳剂包括：富含寡糖的铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸1.3-1.5％，鲸蜡醇0.08-0.12％，2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯1.7-1.9％，肉豆蔻酸异丙酯0.1-0.3％，2-己基-1-癸醇0.9-1.1％，液体石蜡7-8％，甘油2.5-3.5％，丙二醇7-9％，三乙醇胺0.5-1.5％，羧乙烯基聚合物0.30-0.40％，Arlacel 165 1.5-2.5％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量。
再一方面，一种抗衰老产品，所述抗衰老产品为化妆水；其中，
按照质量百分比计，所述化妆水包括：富含寡糖的铁皮石斛原液5-10％，聚丙烯酸钠0.3-0.4％，甘油3-5％，1，3-丁二醇2-3％，维生素B5 0.4-0.6％，熊果苷0.4-0.6％，EDTA-Na2 0.04-0.06％，去离子水余量；
另一方面，上述一种抗衰老产品的制备方法，所述化妆水的制备方法为：将聚丙烯酸钠溶入水中，搅拌，充分溶胀，再加入其余成分，持续搅拌；然后再加入富含寡糖的铁皮石斛原液搅拌后，加去离子水定容，得到化妆水。
再一方面，一种抗衰老产品，所述抗衰老产品为修复霜；其中，
按照质量百分比计，所述修复霜包括：甘油5-7％，卡波姆1-2％，三乙醇胺1-2％，丙二醇5-7％，尼伯金乙酯0.1-0.3％，富含寡糖的铁皮石斛原液9-11％，精油0.4-0.6％，去离子水余量；
另一方面，上述一种抗衰老产品的制备方法，所述修复霜的制备方法为：取卡波姆于适量去离子水中，搅匀，静置过夜，使其充分溶胀后，加入甘油，用三乙醇胺调节pH值，使凝胶基质粘稠性增加，得到卡波姆凝胶；
将富含寡糖的铁皮石斛原液、丙二醇及去离子水混合后，再向其中加入卡波姆凝胶、精油和尼伯金乙酯，搅拌至均匀细腻，加蒸镏水至足量，研磨均匀，得到修复霜。
铁皮石斛多糖的分子量大(≥10万)，难以透过皮肤细胞被吸收，主要作用于皮肤外起到保湿作用，而多糖被酶解后形成的寡糖则分子量小，易于透过皮肤细胞被吸收，起到抗衰老作用，依据二者分子量不同，区别应用。
与现有技术相比，本发明的一种铁皮石斛原液及其制备方法和应用，至少具有下列有益效果：
一方面，本发明所涉及的工业化制备方法，可以直接的到寡糖含量≥80％以上的铁皮石斛原液，操作简单易行，生产成本低；
另一方面，本发明所涉及的工业化制备方法，添加适量纤维素酶之后可以充分酶解铁皮石斛植株中纤维素成为寡糖，大大的提高了铁皮石斛的利用率及产品得率，经济效益好。
另一方面，本发明所涉及的工业化制备方法，生产过程不使用任何有毒有机溶剂，所涉及的技术过程也无污水、废气排放，安全环保。
另一方面，本发明所制备出的产物用途广泛，可作为中间体用于铁皮石斛系列产品的开发(如应用于医药、日用品开发等领域)。
综合来说，本发明是一种富含寡糖铁皮石斛原液的工业化制备方法，解决了铁皮石斛多糖的澄清度及透明度问题，改善了铁皮石斛水提液的皮肤透过性问题，增加了铁皮石斛的提取率及充分利用率。本发明还首次提出铁皮石斛寡糖具有抗衰老作用，可以作为功能添加剂加入化妆品中，用于实现抗衰老功效。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1-4为铁皮石斛寡糖的结构及纯度鉴定的MS图谱,PMP-HPLC图谱,酶解HPLC图谱，纯度鉴定HPLC图谱。
图1为寡糖的MS图谱，1042附近出峰。
图2为寡糖的PMP-HPLC图谱，14.684出峰。
图3为寡糖的不同酶解正交实验HPLC图谱。
其中，图3A为淀粉酶酶解HPLC图谱，图3B为纤维素酶酶解HPLC图谱，图3C为α-淀粉酶酶解HPLC图谱，图3D为β-葡聚糖酶酶解HPLC图谱；A中出峰过于密集，无法区分；C、D中寡糖占比较少，故选择B中的纤维素酶进行酶解。
图4为寡糖的纯度鉴定HPLC图谱。
图5为铁皮石斛多糖及寡糖在水中的澄清度，透明度对比。
图6-9为不同批次铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱，从图中可以看出，扩大化生产后寡糖的产量比率并无明显变化。
图6为10克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱。
图7为100克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱。
图8为1000克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱。
图9为20千克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明申请的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一个或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。
本发明中的术语“护肤品”指的是可以是护肤水、护肤乳液、护肤面膜、护肤霜等；本发明实施例的护肤品也可以指化妆品。
下面通过具体实施例对本发明进一步详细说明如下：
以下所提及的铁皮石斛寡糖可采用以下提取方法得到，提取方法包括以下步骤：
1)制备铁皮石斛粉末：对铁皮石斛茎进行干燥处理后，再将其粉粹过筛，得到铁皮石斛粉末；干燥处理的温度为50-60℃；干燥处理后的铁皮石斛茎的水分质量含量低于6％；过筛的目数为20-40目；
2)制备铁皮石斛水提液：将所述铁皮石斛粉末和水混合后，进行2-3次沸水浴，然后合并水提液，得到铁皮石斛水提液；铁皮石斛粉末和水按照质量体积比1:(50-80)g/mL混合；每次沸水浴的时间为1-2h；
3)制备铁皮石斛浓缩水提液：将所述铁皮石斛水提液离心后，再减压浓缩，得到铁皮石斛浓缩水提液；离心条件为：3000-4000rpm/min，9-11min，室温25℃；减压浓缩条件为：采用旋转蒸发方式，回收乙醇温度为＜50℃，压力为0.8Pa；铁皮石斛浓缩水提液的料液质量体积比为1:(5-10)g/ml；
4)制备复溶液：在所述铁皮石斛浓缩水提液中加乙醇，沉淀，然后离心并弃去上清液；在得到的沉淀中加入水复溶，得到复溶液；在所述铁皮石斛浓缩水提液中加入体积浓度为95％的乙醇至混合液的醇浓度以体积百分比计为70％-80％后，进行隔夜沉淀；离心条件为3500-4500rpm，15-25min，室温25℃；所述沉淀和水的重量体积比1:(4-6)g/ml加入水复溶；
5)制备铁皮石斛寡糖水溶液：对所述复溶液除蛋白后，冷冻干燥得铁皮石斛粗多糖；在所述铁皮石斛粗多糖中加水溶解后，再向其中加入纤维素酶进行反应后，灭活并离心，弃去沉淀，得到铁皮石斛寡糖水溶液；以Sevage法对所述复溶液除蛋白；冷冻干燥温度为45℃；在所述铁皮石斛粗多糖中加水溶解至4-6mg/ml；纤维素酶的加入量为所述铁皮石斛粗多糖重量的2％-4％；加入纤维素酶后，进行反应的反应温度为55-65℃、反应时间为2h-4h；通过煮沸25-35min灭活处理；离心条件为3500-4500rpm，15-25min，室温25℃；所述铁皮石斛寡糖水溶液中的寡糖含量大于80％；
6)制备铁皮石斛寡糖：将铁皮石斛寡糖水溶液纯化，得到铁皮石斛寡糖；纯化是采用过G75凝胶柱的方式；铁皮石斛寡糖的纯度为99.86％。
铁皮石斛原液的制备方法中，所述铁皮石斛水提原液的制备方法，包括以下步骤：
1)制备铁皮石斛粉末：
对铁皮石斛茎进行干燥处理后，再将其粉粹过筛，得到铁皮石斛粉末；
2)制备铁皮石斛醇提滤液：
用乙醇对所述铁皮石斛粉末进行回流提取，抽滤后合并滤液，并浓缩回收乙醇，得到浓缩滤液；
3)制备酚类成分液体：向所述浓缩滤液中加入1,3-丁二醇助溶，得到酚类成分液体；
4)制备铁皮石斛滤渣溶液：将步骤2)抽滤的滤渣挥干后与超纯水混合，得到铁皮石斛滤渣溶液；
5)制备铁皮石斛水提原液：在铁皮石斛滤渣溶液中加入水解酶反应，灭活后离心，弃去沉淀，得到铁皮石斛水提原液；
6)制备富含寡糖的铁皮石斛原液：合并步骤3)得到的酚类成分液体和步骤5)得到的铁皮石斛水提原液，静置后离心，得到富含寡糖的铁皮石斛原液。
所述步骤1)中，优选的，干燥处理的温度为55-60℃；优选的，所述干燥处理后的铁皮石斛茎的水分含量低于6％；优选的，所述过筛的目数为20-40目；
所述步骤2)中，优选的，所述乙醇浓度为70-85％，所述铁皮石斛粉末和乙醇按照质量体积比1:(10-20)g/ml的比例混合；优选的，加热至80℃-85℃回流提取1-3次，每次40-80min；优选的，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味；
所述步骤3)中，优选的，是按水混悬液体积的4-6％加入1,3-丁二醇助溶；优选的，所述酚类成分液体为透明澄清的；优选的，酚类成分液体中，总黄酮含量为0.2％-0.9％，总联苄的含量0.1％-0.5％；
所述步骤4)中，优选的，滤渣挥干至无醇味；优选的，铁皮石斛滤渣与超纯水按质量体积比1:(50-80)g/ml的比例混合；
所述步骤5)中，优选的，水解酶加入量为铁皮石斛粉末重量的2％-4％；优选的，水解反应条件为50-80℃反应2h-4h；优选的，灭活方法为煮沸30min-60min；优选的，离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；优选的，水解酶为纤维素酶；优选的，铁皮石斛水提原液中寡糖含量为大于80％。
所述步骤6)中，优选的，合并后涡旋混匀，隔夜静置22-26h；优选的，离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；优选的，富含寡糖的铁皮石斛原液中寡糖含量为75％-85％；优选的，富含寡糖的铁皮石斛原液中按原液体积百分比加入4-6％苯氧乙醇防腐。
采用MS质谱分析对铁皮石斛寡糖的结构进行了定量分析，结果如图1所示；采用柱前衍生高效液相色谱法对铁皮石斛寡糖的结构进行了鉴定，结果如图2所示；同时采用高效液相色谱法对铁皮石斛寡糖的纯度进行了分析，结果如图4所示，图4的数据来源如表1所示，11.179min出峰。
表1
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 6.769488811 BV 40.23174286 2.352228165 0.201942846
2 6.852133751 VV R 40.94359207 2.568725824 0.189158052
3 11.17887974 BV R 16024.21289 438.8120117 0.460434735
实施例1：
铁皮石斛寡糖提取物的制备正交优化：铁皮石斛茎粉末8g，分成4等份，每份2g，分别加200ml含2％酶的水液(淀粉酶；纤维素酶；α-淀粉酶；β-葡聚糖酶)，60℃反应3h，100℃灭活30min,在室温下，3000-4000rpm，离心10min，得酶解水液，HPLC-ELSD检测4种酶分别酶解后多糖变化，从图3A-D可以看出，纤维素酶酶解后寡糖重量百分比占整个富集物的90.74％。
图3A的数据来源如表2所示。
表2
Figure GDA0003820276810000111
Figure GDA0003820276810000121
图3B的数据来源如表3所示。
表3
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 23.66985321 BV 14024.92285 228.6728821 0.72753787
2 23.72913742 VB 11490.125 226.2951813 0.60797435
图3C的数据来源如表4所示。
表4
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 0.774680912 BB 11885.66504 169.6676178 0.822880864
2 13.90172672 BV 218.1112213 7.564940929 0.349971563
3 14.1812458 VV 92.33811188 3.651203871 0.300247312
4 14.93360996 BV 291.5343018 19.14448357 0.185261294
5 14.96254444 VV 35.62771988 19.67281723 0.025528479
6 15.0128212 VV 184.9187469 20.91959 0.110727519
7 15.15221405 VV 70.55730438 21.99413109 0.042626735
8 15.19134808 VB 955.6001587 22.62205887 0.500422895
9 22.94096947 BV 697.9572144 31.27036095 0.274001032
10 22.97301865 VV 116.8808517 31.35572624 0.048288386
11 23.06373024 VB 1273.253418 31.78355789 0.480168164
图3D的数据来源如表5所示。
表5
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰宽min 峰高mV
1 5.563746929 VV 86.98929596 4.508536339 0.238700807
2 5.713636398 VB 55.41862106 3.733890295 0.180757359
3 7.891392231 BV R 89.49617767 3.664180756 0.293353736
4 9.508887291 BB 27.06645966 4.189338207 0.083775952
5 10.0333643 BV 3994.690918 231.3220215 0.210671201
6 10.44964123 VV 7195.538574 349.9858704 0.251860976
7 10.5349617 VB 9819.294922 354.4259033 0.337222546
8 12.56717777 BV 94.98821259 4.76493454 0.239773139
9 12.6916647 VV 16.04438019 3.633192778 0.059920646
10 12.95662594 VV 88.60762787 4.963991642 0.22465089
11 13.073946 VB 8.897475243 2.834820271 0.049417447
12 13.37678814 VB 155.9636841 4.106844902 0.455859423
从结果可以说明，纤维素酶是最合适制备铁皮石斛寡糖的酶。原液也是直接用纤维素酶酶解铁皮石斛粉末，其中虽然增加了醇提小分子部位，单不影响寡糖的含量。
铁皮石斛多糖及寡糖在水中的澄清度，透明度对比如图5所示，多糖呈鲜黄色，略浑浊，多糖呈透明色，较澄清。
实施例2：
富含寡糖的铁皮石斛原液的制备：铁皮石斛茎粉末10g，过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃回流提取2次，每次60min，抽滤，合并滤液，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得铁皮石斛寡糖水提原液(水提液中寡糖含量为80％-90％)。合并酚类成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；富含寡糖的铁皮石斛原液，冷冻干燥后的干燥提取物4.16g，HPLC-ELSD检测寡糖重量百分比占整个富集物的88.35％；整个富集物是酚性部位和寡糖水提物部位两者混合后的整体。
10g干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱如图6所示。
图6的数据来源如表6所示。
表6
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 6.87695694 VV 21.45358467 2.271809578 0.116172887
2 6.942527294 VV 10.54810619 2.388936043 0.055912994
3 7.035868168 VV 13.24473476 2.562784195 0.067494541
4 7.096868038 VB 42.23923111 2.604604006 0.193199992
5 10.8740139 BV R 70411.10938 942 0.873241305
实施例3：
富含寡糖的铁皮石斛原液的制备：铁皮石斛茎粉末100g，过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃回流提取2次，每次60min，抽滤，合并滤液，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得铁皮石斛水提原液(水提液中寡糖含量为80％-90％)。合并酚类成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10min，室温25℃；获得富含寡糖的铁皮石斛原液，冷冻干燥后的干燥提取物45.24g。HPLC-ELSD检测寡糖重量百分比占整个富集物的89.01％。
100克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱如图7所示。
图7的数据来源如表7所示。
表7
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 10.22959328 BV 57.20526123 3.162356377 0.219443485
2 10.40849686 VB 26.70018196 2.141137123 0.157084435
3 12.23865891 BV 38.94721603 4.123637676 0.117390133
4 12.5206461 VV 107.1384506 8.393046379 0.156126693
5 12.5555563 VB 126.0357208 8.590420723 0.182769358
6 16.40464592 BB 35.22862244 4.917002201 0.094787635
7 17.3089447 BV 2381.318848 103.0751495 0.276731998
8 17.55348015 VV 1611.04541 105.4294662 0.192675859
9 17.63690948 VV 673.8622437 99.56824493 0.086158164
10 17.81682396 VV 838.9467773 81.49963379 0.140895173
11 17.93532372 VB 449.8588867 56.8625679 0.101898924
12 18.89395714 VB R 44157.11328 828.5678101 0.627355218
实施例4：
富含寡糖的铁皮石斛原液的制备：铁皮石斛茎粉末1000g，过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃提取罐回流提取1次/60min，纱网过滤，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后纱网过滤，室温25℃；获得铁皮石斛寡糖水提原液。合并酚类成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，纱网过滤，室温25℃；获得富含寡糖铁皮石斛原液(HPLC-ELSD检测原液中寡糖含量为85.37％)，按原液体积比加入5％苯氧乙醇防腐。
1000克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱如图8所示。
图8的数据来源如表8所示。
表8
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 6.144955635 VV R 4146.835938 192.3141785 0.274766237
2 6.34721899 VV R 4314.679199 199.8202667 0.281916022
3 10.298316 VV R 36942.67188 931.0443726 0.540518701
实施例5：
富含寡糖的铁皮石斛原液的制备：铁皮石斛茎粉末2.5kg，过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃提取罐回流提取1次/60min，纱网过滤，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后纱网过滤，室温25℃；获得铁皮石斛寡糖水提原液。合并酚类成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，纱网过滤，室温25℃；获得富含寡糖铁皮石斛原液(HPLC-ELSD检测原液中寡糖含量为82.95％)，按原液体积比加入5％苯氧乙醇防腐。
实施例6：
富含寡糖的铁皮石斛原液的制备：铁皮石斛茎粉末20kg，过20-40目筛；以铁皮石斛粉末:80％乙醇＝1:10-1:20(m:v)(g/ml)加热至80℃-85℃提取罐回流提取1次/60min，纱网过滤，减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味，按水混悬液体积的5％加入1,3-丁二醇助溶得到透明澄清酚类成分液体。滤渣挥干至无醇味，以铁皮石斛滤渣:超纯水＝1:50-1:80(m:v)(g/ml)，按铁皮石斛粉末重量的2％-4％投入纤维素酶，混匀，60℃反应2h-4h后，煮沸30min-60min灭活，之后纱网过滤，室温25℃；获得铁皮石斛寡糖水提原液。合并酚类成分液体及水提原液，涡旋混匀，隔夜静置24h，纱网过滤，室温25℃；获得富含寡糖铁皮石斛原液(HPLC-ELSD检测原液中寡糖含量为80.28％)，按原液体积比加入5％苯氧乙醇防腐。
20千克干燥铁皮石斛茎提取后寡糖的含量测定HPLC图谱如图9所示。
图9的数据来源如表9所示。
表9
峰 保留时间min 类型 峰面积mV*s 峰高mV 峰宽min
1 6.344268799 BV 290.2240601 8.713479042 0.395787328
2 6.411105156 VV 46.21111298 8.71803093 0.066640757
3 6.489415169 VB 209.3903046 8.786341667 0.285232306
4 10.32175064 BV R 1513.009399 26.6459446 0.671256423
通过实施例2-6的逐步扩大化培养可以看出，对制备工艺进行稍许改进后，可完全适应工厂化大规模生产，其产物，富含寡糖的铁皮石斛原液的产物得率均很稳定。
实施例7：
富含寡糖的铁皮石斛原液抗衰老活性评估
一、实验细胞与试剂：
人永生化皮质细胞(Hacat细胞)、人透明质酸Elisa试剂盒、蒸馏水二、实验原理：
本试剂盒采用竞争法检测样本中的透明质酸(HA)含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30min，两者与固体抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30min。洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)呈蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450nm处有吸收。
三、实验方法：
促透明质酸表达实验
96孔板每孔接种100ml细胞悬液，悬液浓度为4×105个/ml。孵育24h后弃去原培养液，用PBS洗涤1-2次后加入含有不同浓度待测药物的无血清培养基，继续孵育24h。设置不含药物的空白对照和TGF-β阳性对照，之后用含有1％PMSF的ripa裂解液裂解细胞，离心后取上清液，按胶原蛋白ELISA试剂盒中提供的方法检测透明质酸的分泌，酶标仪测定OD值，检测波长为450nm。OD值代入标准曲线的回归方程计算得到透明质酸分泌增加率。
四、实验结果：
样品促透明质酸表达作用如表10所示。
表10
Figure GDA0003820276810000171
Figure GDA0003820276810000181
样品终浓度是指样品在整个反应体系里面的最终浓度。
五、结论：
如表10所示，本实验对3个批次12个样品的促透明质酸分泌能力进行了评价。结果显示，8％-15％浓度下，富含寡糖的铁皮石斛提取液均有一定的促透明质酸分泌活性(＞20％，表10)。
实施例8：
本实施例提供一种抗衰老面霜,其中，按照质量百分比计，面霜包括：富含寡糖的铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸7.5-8.5％，C16醇1.5-2.5％，自乳化单甘酯1.5-2.5％，氢化羊毛脂1.5-2.5％，液体石蜡11-13％，甘油6-8％，乳化剂1-2％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量；按常规制作化妆品的方法制得上述配方的面霜。
实施例9：
本实施例提供一种抗衰老乳剂,其中，按照质量百分比计，乳剂包括：富含寡糖的铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸1.3-1.5％，鲸蜡醇0.08-0.12％，2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯1.7-1.9％，肉豆蔻酸异丙酯0.1-0.3％，2-己基-1-癸醇0.9-1.1％，液体石蜡7-8％，甘油2.5-3.5％，丙二醇7-9％，三乙醇胺0.5-1.5％，羧乙烯基聚合物0.30-0.40％，Arlacel 1651.5-2.5％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量；按常规制作化妆品的方法制得上述配方的面霜。
实施例10：
本实施例提供一种抗衰老化妆水，其中，按照质量百分比计，化妆水包括：富含寡糖的铁皮石斛原液5-10％，聚丙烯酸钠0.3-0.4％，甘油3-5％，1，3-丁二醇2-3％，维生素B50.4-0.6％，熊果苷0.4-0.6％，EDTA-Na20.04-0.06％，去离子水余量；化妆水的制备方法为：将聚丙烯酸钠溶入水中，搅拌，充分溶胀，再加入其余成分，持续搅拌；然后再加入富含寡糖的铁皮石斛原液搅拌后，加去离子水定容，得到化妆水。
较佳的方案为：将聚丙烯酸钠0.35克溶入70ml水中，搅拌，充分溶胀。缓缓加入处方中其余成分，不停搅拌；然后加入本发明的实施例1制备的富含寡糖得铁皮石斛原液10％，搅拌使其混合均匀。去离子水，加至100ml，包装即可。
实施例11：
本实施例提供一种抗衰老修复霜，其中，按照质量百分比计，修复霜包括：甘油5-7％，卡波姆1-2％，三乙醇胺1-2％，丙二醇5-7％，尼伯金乙酯0.1-0.3％，富含寡糖的铁皮石斛原液9-11％，精油0.4-0.6％，去离子水余量；
修复霜的制备方法为：取卡波姆于适量去离子水中，搅匀，静置过夜，使其充分溶胀后，加入甘油，用三乙醇胺调节pH值，使凝胶基质粘稠性增加；另取配方量的富含寡糖的铁皮石斛原液、丙二醇及去离子水，混合均匀，再将卡波姆凝胶加入，加入配方量的精油和尼伯金乙酯，合并搅拌至均匀细腻，加蒸镏水至足量，研磨均匀，得到修复霜。
较佳的方案为：甘油6克，卡波姆1.5克，三乙醇胺1.5克，丙二醇6克，尼伯金乙酯0.2克，本发明的实施例1所得富含寡糖得铁皮石斛原液10％，去离子水适量，加至总重量为100克。制备方法：取卡波姆于适量去离子水中，搅匀，静置过夜，使其充分溶胀后，加入甘油后，用三乙胺调节pH值，使凝胶基质粘稠性增加。另取处方量的丹参酮提取物、丙二醇及去离子水，混合均匀。再将卡波姆凝胶加入，加入0.5％精油，尼伯金乙酯，合并搅拌至均匀细腻，加蒸镏水至足量，研磨均匀，即可。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (17)

1.一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述铁皮石斛原液是对铁皮石斛提取处理后得到的原液；
其中，所述铁皮石斛原液的制备方法，包括以下步骤：
1)制备铁皮石斛粉末：
对铁皮石斛茎进行干燥处理后，再将其粉粹过筛，得到铁皮石斛粉末；
2)制备铁皮石斛醇提滤液：
用乙醇对所述铁皮石斛粉末进行回流提取，抽滤后合并滤液，并浓缩回收乙醇，得到浓缩滤液；所述乙醇浓度为70-85％，其中，所述铁皮石斛粉末和乙醇按照质量体积比1:(10-20)g/ml的比例混合；
3)制备酚类成分液体：向所述浓缩滤液中加入1,3-丁二醇助溶，得到酚类成分液体；其中，所述酚类成分液体为所述铁皮石斛富酚原液；其中，是按减压浓缩后滤液回收乙醇后得到的水混悬液体积的4-6％加入1,3-丁二醇助溶；
4)制备铁皮石斛滤渣溶液：将步骤2)抽滤的滤渣挥干后与超纯水混合，得到铁皮石斛滤渣溶液；
5)制备铁皮石斛水提原液：在铁皮石斛滤渣溶液中加入水解酶反应，灭活后离心，弃去沉淀，得到铁皮石斛水提原液；其中，水解酶加入量为铁皮石斛粉末重量的2％-4％；
6)制备富含寡糖的铁皮石斛原液：将步骤3)得到的铁皮石斛富酚原液和步骤5)得到的铁皮石斛水提原液合并，静置后离心，得到混合原液；其中，所述混合原液为所述富含寡糖的铁皮石斛原液，或向所述混合原液中加入防腐剂后，得到富含寡糖的铁皮石斛原液；
所述寡糖含有6个糖苷残基；其中，所述寡糖的结构如式(1)所示：
Figure FDA0003820276800000021
所述富含寡糖的铁皮石斛原液包括由铁皮石斛富酚原液和所述铁皮石斛水提原液混合处理后得到的混合原液；其中，所述富含寡糖的铁皮石斛原液的寡糖含量按体积百分比计为75％-85％。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛原液，其特征在于，所述富含寡糖的铁皮石斛原液还包括防腐剂。
3.根据权利要求2所述的铁皮石斛原液，其特征在于，所述防腐剂的用量为所述混合原液体积的4-6％。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，
所述步骤1)中，干燥处理的温度为55-60℃；
所述步骤4)中，滤渣挥干至无醇味。
5.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤1)中，
所述干燥处理后的铁皮石斛茎的水分含量低于6％；和/或
所述过筛的目数为20-40目。
6.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤2)中，
加热至80℃-85℃回流提取1-3次，每次40-80min；和/或
减压浓缩滤液并回收乙醇至无醇味。
7.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤3)中，
所述酚类成分液体为透明澄清的；和/或
酚类成分液体中，总黄酮含量为0.2％-0.9％，总联苄的含量0.1％-0.5％。
8.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤4 中，铁皮石斛滤渣与超纯水按质量体积比1:(50-80)g/ml的比例混合。
9.根据权利要求4所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤5)中，
水解反应条件为50-80℃反应2h-4h；和/或
灭活方法为煮沸30min-60min；和/或
离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；和/或
水解酶为纤维素酶；和/或
铁皮石斛水提原液中寡糖含量为大于80％。
10.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛原液，其特征在于，所述步骤6)中，
合并后涡旋混匀，隔夜静置22-26h；和/或
离心条件为3000-4000rpm，9-11min，室温；和/或
富含寡糖的铁皮石斛原液中，寡糖的体积含量为75％-85％；和/或
按所述混合原液的体积百分比加入4-6％苯氧乙醇防腐剂，得到富含寡糖的铁皮石斛原液。
11.权利要求1-10任一项所述的一种铁皮石斛原液在制备抗衰老产品中的应用；其中，所述产品包括药物、制剂及化妆品。
12.根据权要求11所述的一种铁皮石斛原液在制备抗衰老产品中的应用，其特征在于，所述化妆品的类型包括面霜、乳剂、化妆水或修复霜。
13.一种抗衰老产品，其特征在于，所述抗衰老产品为面霜或乳剂；其中，
按照质量百分比计，所述面霜包括：铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸7.5-8.5％，C16醇1.5-2.5％，自乳化单甘酯1.5-2.5％，氢化羊毛脂1.5-2.5％，液体石蜡11-13％，甘油6-8％，乳化剂1-2％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量；其中，所述铁皮石斛原液为权利要求1-10任一项所述铁皮石斛原液，且所述铁皮石斛原液为富含寡糖的铁皮石斛原液；
按照质量百分比计，所述乳剂包括：铁皮石斛原液0.4-0.6％，硬脂酸1.3-1.5％，鲸蜡醇0.08-0.12％，2-乙基醇鲸蜡基硬脂酸酯1.7-1.9％，肉豆蔻酸异丙酯0.1-0.3％，2-己基-1-癸醇0.9-1.1％，液体石蜡7-8％，甘油2.5-3.5％，丙二醇7-9％，三乙醇胺0.5-1.5％，羧乙烯基聚合物0.30-0.40％，Arlacel 165 1.5-2.5％，防腐剂0.1-0.3％，香精0.1-0.3％，水余量；其中，所述铁皮石斛原液为权利要求1-10任一项所述铁皮石斛原液，且所述铁皮石斛原液为富含寡糖的铁皮石斛原液。
14.一种抗衰老产品，其特征在于，所述抗衰老产品为化妆水；其中，
按照质量百分比计，所述化妆水包括：铁皮石斛原液5-10％，聚丙烯酸钠0.3-0.4％，甘油3-5％，1，3-丁二醇2-3％，维生素B5 0.4-0.6％，熊果苷0.4-0.6％，EDTA-Na2 0.04-0.06％，去离子水余量；其中，所述铁皮石斛原液为权利要求1-10任一项所述铁皮石斛原液，且所述铁皮石斛原液为富含寡糖的铁皮石斛原液。
15.权利要求14所述一种抗衰老产品的制备方法，其特征在于，所述化妆水的制备方法为：将聚丙烯酸钠溶入水中，搅拌，充分溶胀，再加入其余成分，持续搅拌；然后再加入富含寡糖的铁皮石斛原液搅拌后，加去离子水定容，得到化妆水。
16.一种抗衰老产品，其特征在于，所述抗衰老产品为修复霜；其中，
按照质量百分比计，所述修复霜包括：甘油5-7％，卡波姆1-2％，三乙醇胺1-2％，丙二醇5-7％，尼泊 金乙酯0.1-0.3％，铁皮石斛原液9-11％，精油0.4-0.6％，去离子水余量；其中，所述铁皮石斛原液为权利要求1-10任一项所述铁皮石斛原液，且所述铁皮石斛原液为富含寡糖的铁皮石斛原液。
17.权利要求16所述一种抗衰老产品的制备方法，其特征在于，所述修复霜的制备方法为：取卡波姆于适量去离子水中，搅匀，静置过夜，使其充分溶胀后，加入甘油，用三乙醇胺调节pH值，使凝胶基质粘稠性增加，得到卡波姆凝胶；
将富含寡糖的铁皮石斛原液、丙二醇及去离子水混合后，再向其中加入卡波姆凝胶、精油和尼泊 金乙酯，搅拌至均匀细腻，加蒸镏水至足量，研磨均匀，得到修复霜。
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