CN110128564A - 一种小分子铁皮石斛多糖的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种小分子铁皮石斛多糖的提取方法。本发明涉及铁皮石斛提取领域，首先使用水提石斛多糖，截留大分子多糖；对大分子多糖和水提残渣进行酸提，得到小分子多糖，增加多糖的提取率；然后洗涤除去2kD以下分子量的单糖和寡糖，得到分子量基本分布在2kD‑50kD的产品。对多糖进行了深加工，提高了多糖的综合利用率，特别是小分子多糖的得率。通过生物实验证明了水解后的多糖在提高免疫功能方面也具有良好活性。

Description

一种小分子铁皮石斛多糖的提取方法

技术领域

本发明涉及铁皮石斛提取领域，更具体的说是一种铁皮石斛中石斛多糖的提取工艺，特别涉及一种使用酸解增加铁皮石斛中小分子量石斛多糖提取率的工艺。

背景技术

石斛作为药用最早载于2000年以前的《神农本草经》和东汉的《名医别录》，许多古今名师和经典的良方多有石斛。我国常见的有金钗石斛、铁皮石斛、樱石斛、棒节石斛、大苞鞘石斛、细茎石斛、春石斛等。

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura.et Migo)是兰科石斛属多年生草本植物，其主要药用部位是新鲜或干燥茎，主要分布于安徽、浙江、广西、湖南、云南、贵州等地，是传统名贵中药材。《神农本草经》将其列为上品，道家养生经典《道藏》将它誉为“中华九大仙草”之首。民间称铁皮石斛为“救命仙草”、“寸金草”，作为养生保健的极品，历代医家推崇信至。

传统医学认为铁皮石斛具有益胃生津，滋阴清热之功效。现代药理研究证明，石斛属植物具有抗肿瘤、增强机体免疫力、抗血小板聚集、治疗白内障等作用；其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱、毛兰素等。

其中石斛多糖具有提高免疫力、抗肿瘤作用；可改善造血、凝血功能，对降低血糖也有一定功效；对治疗中枢神经系统、肝脏、肾脏、胃肠道病变有效；对烫伤、病毒、细菌感染也有显著疗效。

石斛多糖目前较为广泛地作为保健品或保健食品的添加成分，具有较高的经济价值；然而目前市售保健品未将石斛多糖进行深度分离纯化，其中高分子量的多糖组分很难被人体吸收利用。

李明智等在《食品工业科技》2018年15期采用分级醇沉的方法获得铁皮石斛多糖不同分级组分,并对各组分的糖、糖醛酸、蛋白质含量、单糖组成、分子量进行分析。以巨噬细胞RAW264.7为研究模型,比较DOP不同分级组分的体外免疫调节活性。发现DOP和各分级组分均可显著(p＜0.05)增强RAW264.7巨噬细胞的增殖能力、NO的释放以及TNF-α和IL-1β的分泌。基于此，有必要开展铁皮石斛多糖的深加工。

目前文献报道的铁皮石斛提取物的制备方法大多围绕多糖开展研究，活性成分单一，提取方式主要有加热浸提法、酶解法、超声辅助提取法、微波辅助提取法等，且都采用水作为提取溶剂。分离方法中凝胶柱纯化价格昂贵不适合大规模生产，大孔树脂效果很差，分级醇沉对不同分子量的多糖分离效果不佳，多级膜分离方法耗时过长，以上方法单独应用都不理想。关于选择提取纯化小分子量多糖的研究仅有韩冉等在《农产品加工》2017年第9期报道了使用超声提取得到的多糖分子量比较小。目前机理尚不明确，推测是超声时产生的局部高温高压环境使多糖水解。

发明内容

发明人在研究中发现，铁皮石斛多糖的分布并非完全线性的，在10kD以下的小分子较多，10kD-100kD的多糖含量较少，100kD以上的大分子多糖也较多，大分子多糖往往结合蛋白。为了更多获得小分子多糖，一方面需要完成分离，另一方面考虑对大分子多糖进行水解，除去蛋白和缩短糖链。

基于此，本发明提供一种铁皮石斛中石斛多糖的提取工艺，首先使用水提石斛多糖，截留大分子多糖；对大分子多糖和水提残渣进行酸提，得到小分子多糖，增加多糖的提取率；然后洗涤除去2kD以下分子量的单糖和寡糖，得到分子量基本分布在2kD-50kD的产品。

本发明对多糖进行了深加工，提高了多糖的综合利用率，特别是小分子多糖的得率。通过生物实验证明了水解后的多糖在提高免疫功能方面也具有良好活性。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

步骤(1)：将铁皮石斛粉末用石油醚回流脱脂，得到脱脂石斛粉末；

步骤(2)：将脱脂石斛粉末醇提，过滤，得到滤液和滤渣；

步骤(3)：将步骤(2)所得滤渣用水提取后过滤，得到水提后的滤渣和水提液，水提液浓缩到20-50％体积，得到浓缩液；

步骤(4)：用超滤膜截留步骤(2)所得浓缩液中的大分子多糖，超滤膜的滤过液使用乙醇醇沉，得到小分子石斛多糖a；

步骤(5)：将步骤(3)水提后的滤渣和步骤(4)截留的大分子多糖合并，加入强酸水解，冷却过滤，得到滤液和滤渣；所得滤渣加水再次提取，再次提取后的滤液与前述冷却过滤后所得滤液合并，浓缩，使用超滤膜截留弃去大分子；

步骤(6)，将步骤(5)所得超滤膜滤过液中加入乙醇醇沉，滤渣用乙醇洗涤，得到小分子石斛多糖b。

根据本发明的一个具体实施方案，本发明提供了一种从铁皮石斛中提取小分子多糖的方法包括以下步骤：

步骤(1)：脱脂。取铁皮石斛粉末，以石油醚回流脱脂，得到脱脂石斛粉末。

步骤(2)：醇提。该步骤能去除石斛生物碱、单糖、寡糖和其他醇溶杂质。

步骤(3)：第一次水提。向步骤(2)所得的滤渣1中加入水，加热提取2-3次，过滤得到第一次水提液和第一次水提滤渣。水提液浓缩到20-50％体积。

步骤(4)：粗分离。以20-50kD(道尔顿)的超滤膜截留浓缩液中的大分子多糖。超滤膜的滤过液加入2-3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜。得到小分子石斛多糖a。

步骤(5)：酸解和第二次提取。步骤(4)截留的大分子多糖和第一次水提滤渣合并，加入强酸，60-70℃加热0.5-1h水解，冷却过滤，得到滤液和滤渣，滤渣加水再60℃-70℃提取1-2h。滤液与中和后的酸提滤液合并，浓缩，使用50kD(5万道尔顿)的超滤膜截留弃去大分子。

步骤(6)，将步骤(5)超滤膜的滤过液加入2-3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜，滤渣用乙醇洗涤。得到小分子石斛多糖b。

根据本发明一个实施方案，步骤(1)中每千克铁皮石斛加入3-5升石油醚提取0.5-2h，重复2-3次。石油醚可回收循环利用。

根据本发明一个实施方案，步骤(2)醇提中使用质量浓度为60-80％乙醇溶液浸泡8-12h，反复2-3次。

根据本发明一个实施方案，步骤(3)中，向步骤(2)所得的滤渣中加入水，每千克铁皮石斛加入5-10L水，加热至60-70℃，提取2-3次，过滤得到合并的水提液和水提滤渣。水提液浓缩到20-50％体积。

根据本发明一个实施方案，使用50kD的超滤膜。

根据本发明一个实施方案，使用的强酸可以为硫酸或盐酸，也可以使用固体强酸，例如大孔磺酸树脂。水解时间优选为40-50min。

根据本发明一个实施方案，观察酸解超滤后滤过液的颜色，可以使用阳性和阴性离子交换树脂来脱色。

本发明的优点在于：

仅使用50kD的大孔径超滤膜进行分离，没有使用小孔径的多次超滤、纳滤进行分离。对于少量50kD左右分子量的多糖，其是否被截留并无影响，进入小分子多糖组分则增加了少许低活性的无毒杂质，被截留酸解也不至于形成过小分子量的寡糖和单糖。

使用酸水解，脱除了蛋白质，增加了多糖的产量，并且同时断开了部分糖链，增加了小分子多糖的产量。

提取的小分子多糖产品具有较好的免疫促进功效。

具体实施方式

原料：戴传勇等测定了不同产地铁皮石斛的多糖含量，参见《食品工业》2017年第38卷第7期。考虑原料获取方便，我们选用了市售的浙江温州所产的铁皮石斛进行实验，其文献报道多糖含量为6.90％。需要指出的是，尽管本申请单位重量铁皮石斛中提取得到的多糖量少于部分现有技术报道的得率，但是这是由于原料选择造成的，并不影响本申请技术方案的先进性。本领域技术人员容易将本发明的方法用于提取不同产地和品质的铁皮石斛，并依据多糖和石斛碱的含量对溶剂添加量等参数做出等比例调整，同样能够解决增产小分子多糖的技术问题。

由于铁皮石斛烘干时表面会有粘液包裹，影响提取效率，因此，本申请采用阴干的铁皮石斛粉末；也可以使用新鲜铁皮石斛茎部，低温粉碎后直接进行提取。

实施例1

步骤(1)，取阴干的铁皮石斛粉末100g，加入石油醚400mL，加热回流脱脂1h，反复3次，得到脱脂石斛粉末。石油醚蒸馏后可回收循环利用。

步骤(2)，向步骤(1)得到的脱脂石斛粉末加入400mL70％乙醇浸提8h*两次，过滤、滤液可用于提取石斛生物碱，固相为滤渣。

步骤(3)：第一次水提。向步骤(2)所得的滤渣中加入500mL水，加热至60℃，提取2h*3次，过滤得到合并后的第一次水提液和第一次水提滤渣。第一次水提液浓缩到500mL。

步骤(4)：粗分离。以50kD(5万道尔顿)的超滤膜截留浓缩液中的大分子多糖。超滤膜的滤过液加入3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜。乙醇洗涤、干燥，得到小分子石斛多糖a。多糖a中糖含量为96.9％(依据《中国药典》第一部铁皮石斛项下多糖含量检测方法，下同)，重3.2g。

步骤(5)：酸解和第二次提取。步骤(4)截留的大分子多糖和第一次水提滤渣合并，加入硫酸调节0<pH<1，60℃加热40min水解，冷却过滤，得到滤液和滤渣，滤渣加水再60℃提取2h。滤液与中和后的酸提滤液合并，浓缩至400mL，使用50kD(5万道尔顿)的超滤膜截留弃去大分子。

步骤(6)，将步骤(5)超滤膜的滤过液过阴离子和阳离子交换树脂脱色，加入3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜，滤渣用乙醇洗涤。得到小分子石斛多糖b，含量为94.5％，重3.4g。

实施例2

步骤(1)，取阴干的铁皮石斛粉末100g，加入石油醚400mL，加热回流脱脂1h，反复3次，得到脱脂石斛粉末。石油醚蒸馏后可回收循环利用。

步骤(2)，向步骤(1)得到的脱脂石斛粉末加入400mL80％乙醇浸提10h*两次，过滤、滤液可用于提取石斛生物碱，固相为滤渣。

步骤(3)：第一次水提。向步骤(2)所得的滤渣中加入600mL水，加热至70℃，提取3h*2次，过滤得到合并后的第一次水提液和第一次水提滤渣。第一次水提液浓缩到500mL。

步骤(4)：粗分离。以50kD(5万道尔顿)的超滤膜截留浓缩液中的大分子多糖。超滤膜的滤过液加入3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜。乙醇洗涤、干燥，得到小分子石斛多糖a。多糖a中糖含量为97.6％(依据《中国药典》第一部铁皮石斛项下多糖含量检测方法，下同)，重3.1g。

步骤(5)：酸解和第二次提取。步骤(4)截留的大分子多糖和第一次水提滤渣合并，加入20g大孔磺酸树脂，60℃加热50min水解，冷却分级过滤回收树脂，并得到滤液和滤渣，滤渣加水再70℃提取2h。滤液与中和后的酸提滤液合并，浓缩至400mL，使用50kD(5万道尔顿)的超滤膜截留弃去大分子。

步骤(6)，观察步骤(5)超滤膜的滤过液，如对产品色度有要求，则过阴离子和阳离子交换树脂脱色(使用大孔磺酸树脂催化时一般不造成变色)，加入3倍体积的乙醇，冷却醇沉过夜，滤渣用乙醇洗涤。得到小分子石斛多糖b，含量为95.5％，重4.0g。

活性测试

本发明对实施例1制备得到的小分子石斛多糖a和b的生物活性进行测试。

多糖的免疫活性测定：

本发明参考了李明智等在《食品工业科技》2018年15期文章中的方法，对小分子石斛多糖a和b的生物活性进行测试，为进行对比，根据CN101979639A实施例1的方法制备得到了石斛多糖c样品。

详细测定方法和结果如下：

RAW264.7细胞NO释放的测定：将RAW264.7细胞按5×105个/孔接种于96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板于37℃含5％CO2培养箱中培养4h，再分别加入终浓度均为40μg/mL的a、b、c样品(分别为前述小分子石斛多糖a、b和多糖c样品)，同时设置空白对照孔和脂多糖(LPS)阳性对照孔。实验中各多糖组及对照组均设置10个复孔(a、b、c均取不同批次提取的多糖)，在37℃含5％CO2的培养箱中培养24h。24h后收集细胞培养上清液，参照NO检测试剂盒说明书测定NO含量。

与空白对照组相比，铁皮石斛多糖组分对RAW264.7巨噬细胞NO的释放具有促进作用，空白对照孔NO浓度为9.8μmol/L，LPS阳性对照孔NO浓度为27.3μmol/L，组分a、b、c样品孔NO平均浓度分别为17.6μmol/L、16.5μmol/L和12.1μmol/L。

由于经费和时间因素，本发明仅进行了多糖促进巨噬细胞释放NO的活性，并未对TNF-α和IL-1β等其他指标进行测试。NO是巨噬细胞产生的主要效应分子，同时也是巨噬细胞被激活的重要标志；所以当前数据已经可以说明较小分子量的多糖具有较好的生理活性，其中纯天然提取的多糖a效果更好，酸解得到的小分子多糖b效果略差，但是二者都优于直接水提醇沉的多糖产品。

Claims (8)

1.一种从铁皮石斛中提取小分子多糖的方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)：将铁皮石斛粉末用石油醚回流脱脂，得到脱脂石斛粉末；

(2)：将脱脂石斛粉末醇提，过滤，得到滤液和滤渣；

(3)：将步骤(2)所得滤渣用水提取后过滤，得到水提后的滤渣和水提液，水提液浓缩，得到浓缩液；

(4)：用超滤膜截留步骤(2)所得浓缩液中的大分子多糖，超滤膜的滤过液使用乙醇醇沉，得到小分子石斛多糖a；

(5)：将步骤(3)水提后的滤渣和步骤(4)截留的大分子多糖合并，加入强酸水解，冷却过滤，得到滤液和滤渣；所得滤渣加水再次提取，再次提取后的滤液与前述冷却过滤后所得滤液合并，浓缩，使用超滤膜截留弃去大分子；

(6)，向步骤(5)所得超滤膜滤过液中加入乙醇进行醇沉，过滤后所得滤渣用乙醇洗涤，得到小分子石斛多糖b。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中每千克铁皮石斛加入3-5升石油醚提取0.5-2h，重复2-3次，石油醚回收循环利用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)醇提中使用60-80％乙醇溶液浸泡8-12h，反复2-3次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，向步骤(2)所得的滤渣中加入水，每千克铁皮石斛加入5-10L水，加热至60-70℃，提取2-3次，过滤得到合并后的水提液和水提滤渣；水提液浓缩到20-50％体积。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)使用50kD的超滤膜。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)使用的强酸为硫酸或盐酸，也可以使用固体强酸，例如大孔磺酸树脂，水解时间优选为40-50min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)醇沉之前使用阳性和阴性离子交换树脂来脱色。

8.根据权利要求1方法制备得到的小分子石斛多糖a和b。