CN115819639A

CN115819639A - 一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法及其用途

Info

Publication number: CN115819639A
Application number: CN202310035059.3A
Authority: CN
Inventors: 刘袆帆; 刘智慧; 肖更生; 王琴
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2023-01-10
Filing date: 2023-01-10
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2043-01-10
Also published as: CN115819639B

Abstract

本发明涉及植物多糖提取技术领域，具体涉及一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法及其用途。该小分子量铁皮石斛多糖的制备方法是采用乳酸菌对铁皮石斛多糖进行降解，然后利用超滤装置对目标分子量的石斛多糖进行截留，制得分子量为2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖。该方法具有试验条件温和、效率高，低耗能、低污染、设备简单、适用工业化要求的优点。本发明制得的分子量为2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖对酒精性肝损伤具有显著的治疗效果，其可以明显逆转酒精肝小鼠细胞中严重的病理损伤，改善了酒精肝小鼠肝细胞的结构，减少了细胞坏死，炎性细胞浸润的现象，具有较好的护肝作用。

Description

一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及植物多糖提取技术领域，具体涉及一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法及其用途。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科石斛属植物，其叶为两列长圆状披针形，茎不分支，具多节。铁皮石斛常以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现有研究表明，铁皮石斛含多糖、生物碱、多酚、黄酮和氨基酸等多种活性成分，其中铁皮石斛多糖(Dendrobium officinale polysaccharides，DOP)为其主要的活性成分，也是含量最高的物质，具有抗菌、增强免疫力、降血糖血脂和血压、抗肿瘤以及抗氧化等作用。然而，铁皮石斛多糖的生物吸收率很低，降低铁皮石斛多糖的分子量、提高消化系统吸收率、提高或保持其生理活性，是铁皮石斛多糖研究的难点。

目前，用于铁皮石斛多糖的提取方法主要有化学法、物理法和酶法，其中化学法是采用酸降解与氧化降解，利用氧化剂生成的羟自由基，使多糖的糖苷键断裂；物理法是采用超声波与微波降解，利用机械剪切作用使大分子主链上的碳键断裂，达到降解高分子的作用；酶法是利用特异性酶类作用于多糖的糖苷键，使其断裂。但是，上述方法均存在不同程度的缺陷，化学法环境污染较大，化学试剂残留问题较多，耗能高；物理法降解效率低，容易受环境因素影响，成本高；而酶法则受限于特定酶类，酶活性低，稳定性差，难以适应工业要求。因此，研究和开发出一种能耗低，环保，操作方便，纯度高的小分子铁皮石斛多糖的制备工艺仍是目前亟需解决的难题。

专利文献CN110128564A公开了一种小分子铁皮石斛多糖的提取方法，该方法包括：(1)将铁皮石斛粉末用石油醚回流脱脂，得到脱脂石斛粉末；(2)将脱脂石斛粉末醇提，过滤，得到滤液和滤渣；(3)将步骤(2)所得滤渣用水提取后过滤，得到水提后的滤渣和水提液，水提液浓缩，得到浓缩液；(4)用超滤膜截留步骤(2)所得浓缩液中的大分子多糖，超滤膜的滤过液使用乙醇醇沉，得到小分子石斛多糖a；(5)将步骤(3)水提后的滤渣和步骤(4)截留的大分子多糖合并，加入强酸水解，冷却过滤，得到滤液和滤渣；所得滤渣加水再次提取，再次提取后的滤液与前述冷却过滤后所得滤液合并，浓缩，使用超滤膜截留弃去大分子；(6)向步骤(5)所得超滤膜滤过液中加入乙醇进行醇沉，过滤后所得滤渣用乙醇洗涤，得到小分子石斛多糖b。该方法得到分子量基本分布在2kD-50kD的产品对多糖进行了深加工，提高了多糖的综合利用率，特别是小分子多糖的得率。通过生物试验证明了水解后的多糖在提高免疫功能方面也具有良好活性。然而，石油醚、强酸等化学试剂对环境污染较大，而且操作人员稍有不慎，容易受伤。

专利文献CN113667031A公开了一种小分子铁皮石斛多糖制备方法及其用途，该方法以铁皮石斛干制品为起始原料，通过低共熔溶剂与亚临界提取，再经酶解、洗脱、浓缩、析出，最终得到小分子铁皮石斛多糖。通过该小分子铁皮石斛多糖的制备方法能制备得到分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖，而且分子量小于等于50kD的铁皮石斛多糖还具有纯度高及提取率的优点。该小分子铁皮石斛多糖分子量小于等于50kDa的铁皮石斛多糖分子量小、纯度高，有利于皮肤吸收，能显著改善皮肤免疫屏障功效且具有良好的抗炎功效。然而酶解受限于特定酶类，酶活性低，稳定性差，难以适应工业要求。

发明内容

为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法。本发明提供的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法是采用乳酸菌对铁皮石斛多糖进行降解，然后利用超滤装置对目标分子量的石斛多糖进行截留，制得分子量为2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖。该方法具有试验条件温和、效率高，低耗能、低污染、设备简单、适用工业化要求的优点。

本发明提供的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1.取MRS肉汤，加入超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，吸取乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌的离心管，离心，再用无菌生理盐水洗涤2～3次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:(10～20)mL，灭菌，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为55～65℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；所述乳酸菌悬液30％的接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％；

步骤S3.将步骤S2发酵后的铁皮石斛粉末加入超纯水，水浴加热3～4h，离心，取上清液，得铁皮石斛多糖溶液；

步骤S4.将分子量为5kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，连接蠕动泵，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将步骤S3制得的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，开启膜分离设备，110～130min后取出透过液，得分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液，接着将分子量为2kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，开启膜分离设备，110～130min后取出未透过液，得小分子铁皮石斛多糖溶液，冷冻，干燥，即得。

进一步地，所述步骤S1和步骤S2中的灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理12～16min。

进一步地，所述步骤S1中的乳酸菌为植物乳杆菌(L5)和解淀粉乳杆菌(L6)中的一种或其二者的组合。

进一步地，所述步骤S1中的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷～10⁸cfu/mL。

进一步地，所述步骤S1的离心条件为在3500～4500r的条件下离心4～6min。

进一步地，所述步骤S3中发酵后的铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:(38～42)mL。

进一步地，所述步骤S3的离心条件为在3500～3800r的条件下离心12～18min。

进一步地，所述步骤S4中的超滤分离条件为：温度为18～22℃，进口压力为0.07～0.09MPa，出口压力为0.02～0.06MPa。

进一步地，所述步骤S4中的冷冻，干燥条件为：将小分子铁皮石斛多糖溶液于-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冻干2～3d。

外，本发明还提供了所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法制得的分子量为2～5kDa的铁皮石斛多糖在制备预防或治疗酒精性肝损伤药物中的用途。

发明人在研究中发现，铁皮石斛多糖中大分子多糖含量较多，小分子多糖含量较少，而大分子多糖往往与蛋白质结合，导致铁皮石斛多糖的结构是以大分子多糖与蛋白质紧密缠绕的结构。虽然铁皮石斛多糖具有诸多生物活性，但受限于其分子量大，结构紧密不易溶解，结构复杂和不易被机体吸收等问题，严重限制了铁皮石斛多糖的应用。

发明人参考了现有的化学法、物理法和酶法等方法对铁皮石斛多糖进行降解，发现其降解效果均不理想。发明人在查阅文献中发现，乳酸菌在发酵过程中产生的酶具有水解功效，而且乳酸菌在发酵过程中还会产生一系列的代谢产物，也具有一定的生理活性。发明人尝试性地将乳酸菌应用于铁皮石斛多糖的降解中，发现乳酸菌可以降解碳水化合物，而且发酵过程会产生许多降解多糖的酶类，对铁皮石斛多糖具有很好的降解作用。但是，每种乳酸菌对铁皮石斛多糖的降解效果不同，也无法保证分子量范围。经过大量的摸索试验，发明人意外地发现，将植物乳杆菌(L5)和/或解淀粉乳杆菌(L6)应于铁皮石斛多糖的降解中，可以制得分子量为2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖，可以更好的拓宽铁皮石斛多糖的应用范围。

发明人为了进一步拓宽2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖的应用范围，通过动物试验发现，本发明制得的2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖对酒精性肝损伤具有显著的治疗效果，该小分子铁皮石斛多糖可以明显逆转酒精肝小鼠细胞中严重的病理损伤，改善了酒精肝小鼠肝细胞的结构，减少了细胞坏死，炎性细胞浸润的现象，同时该小分子铁皮石斛多糖还可以显著降低酒精肝小鼠MDA、AST、ALT及T-AOC等指标的含量，具有较好的护肝作用。

总之，与现有技术相比，本发明提供小分子量铁皮石斛多糖的制备方法采用乳酸菌对铁皮石斛多糖进行降解，然后利用超滤装置对目标分子量的石斛多糖进行截留，制得分子量为2～5kDa的小分子铁皮石斛多糖。该方法具有试验条件温和、效率高，低耗能、低污染、设备简单、适用工业化要求的优点。

附图说明：

图1为本发明实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖的近红外图谱图；

图2为显微镜观察不同组别的肝脏病理组织切片图(400x)，其中：KFDP为实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖(发酵后2～5kDa铁皮石斛多糖)，KDP为市售铁皮石斛多糖(未发酵的常规市售铁皮石斛多糖)，KFDP-L:40mg/kg、KFDP-M:80mg/kg、KFDP-H：160mg/kg；KDP-L:40mg/kg、KDP-M:80mg/kg、KDP-H：160mg/kg；

图3为不同组别处理的肝脏MDA、AST、ALT、T-AOC指标测定数据图。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，本发明不仅仅限于以下实施例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的内容、精神和范围内，对本发明进行的变更、组合或替换，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。所述MRS肉汤为产品名称:MRS肉汤，产品型号:产品展商:HZbscience；所述铁皮石斛购于民生石斛专业合作社，产品名：一级石斛干条，使用时用粉碎机粉碎为粉末使用；所述植物乳杆菌(L5)购于颖心实验室，货号YXJ0032-ATCC801；解淀粉乳杆菌(L6)，分离自豆腐酸浆水，现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保存编号为(CGMCC NO.9090)。

实施例1、小分子量铁皮石斛多糖的制备方法

步骤S1.准确称取MRS肉汤52.25g，加入1000mL超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，吸取10μL乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，所述的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷cfu/mL，所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌离心管，离心，所述离心条件为在4000r的条件下离心5min，再用无菌生理盐水洗涤2次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:10mL，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，所述30％的乳酸菌悬液接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为60℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

步骤S3.将步骤S2发酵后的铁皮石斛粉末加入超纯水，所述发酵后的铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:40mL，水浴加热3h，离心，所述离心条件为在3600r的条件下离心15min，取上清液，得铁皮石斛多糖溶液；

步骤S4.将分子量为5kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，连接蠕动泵，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将步骤S3制得的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为20℃，进口压力为0.09MPa，出口压力为0.04MPa，开启膜分离设备，120min后取出透过液，得分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液，接着将分子量为2kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为20℃，进口压力为0.09MPa，出口压力为0.04MPa，开启膜分离设备，120min后取出未透过液，得小分子铁皮石斛多糖溶液，将小分子铁皮石斛多糖溶液于-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冻干2d，即得。

实施例2、小分子量铁皮石斛多糖的制备方法

步骤S1.准确称取MRS肉汤52.25g，加入1000mL超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，吸取10μL乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，所述的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁸cfu/mL，所述乳酸菌为解淀粉乳杆菌(L6)，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌离心管，离心，所述离心条件为在4000r的条件下离心5min，再用无菌生理盐水洗涤2次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:20mL，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，所述30％的乳酸菌悬液接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为60℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

实施例3、小分子量铁皮石斛多糖的制备方法

步骤S1.准确称取MRS肉汤52.25g，加入1000mL超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理14min，吸取10μL乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，所述的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷cfu/mL，所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比2:1混合组成，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌离心管，离心，所述离心条件为在3800r的条件下离心6min，再用无菌生理盐水洗涤2次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:15mL，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理14min，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，所述30％的乳酸菌悬液接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为60℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

步骤S3.将步骤S2发酵后的铁皮石斛粉末加入超纯水，所述发酵后的铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:38mL，水浴加热3h，离心，所述离心条件为在3500r的条件下离心18min，取上清液，得铁皮石斛多糖溶液；

步骤S4.将分子量为5kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，连接蠕动泵，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将步骤S3制得的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为18℃，进口压力为0.07MPa，出口压力为0.03MPa，开启膜分离设备，130min后取出透过液，得分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液，接着将分子量为2kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为18℃，进口压力为0.07MPa，出口压力为0.03MPa，开启膜分离设备，130min后取出未透过液，得小分子铁皮石斛多糖溶液，将小分子铁皮石斛多糖溶液于-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冻干2d，即得。

实施例4、小分子量铁皮石斛多糖的制备方法

步骤S1.准确称取MRS肉汤52.25g，加入1000mL超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，吸取10μL乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，所述的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷cfu/mL，所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比3:2混合组成，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌离心管，离心，所述离心条件为在4000r的条件下离心5min，再用无菌生理盐水洗涤2次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:17mL，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理15min，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，所述30％的乳酸菌悬液接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为60℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

实施例5、小分子量铁皮石斛多糖的制备方法

步骤S1.准确称取MRS肉汤52.25g，加入1000mL超纯水，调节pH至6.2±0.2，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理16min，吸取10μL乳酸菌菌液于已灭菌培养基中，所述的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷cfu/mL，所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比3:1混合组成，在温度为37℃的条件下培养36h，接着将培养好的菌液转移至已灭菌离心管，离心，所述离心条件为在4300r的条件下离心4min，再用无菌生理盐水洗涤2次，收集沉淀，得乳酸菌悬液；

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:13mL，灭菌，所述灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理16min，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，所述30％的乳酸菌悬液接种量是铁皮石斛糊状物总重量的30％，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为60℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

步骤S3.将步骤S2发酵后的铁皮石斛粉末加入超纯水，所述发酵后的铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:42mL，水浴加热3h，离心，所述离心条件为在3800r的条件下离心12min，取上清液，得铁皮石斛多糖溶液；

步骤S4.将分子量为5kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，连接蠕动泵，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将步骤S3制得的铁皮石斛石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为22℃，进口压力为0.08MPa，出口压力为0.05MPa，开启膜分离设备，110min后取出透过液，得分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液，接着将分子量为2kDa的超滤膜安装在膜分离设备上，用超纯水洗涤超滤膜至中性，将分子量小于5kDa的铁皮石斛多糖溶液注入膜分离设备料液罐中，超滤分离，所述超滤分离条件为：温度为22℃，进口压力为0.08MPa，出口压力为0.05MPa，开启膜分离设备，110min后取出未透过液，得小分子铁皮石斛多糖溶液，将小分子铁皮石斛多糖溶液于-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冻干2d，即得。

试验例一、铁皮石斛多糖分子结构的测定

1、试验方法：

对实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖进行分子结构测定。具体测定方法为：

称取3mg实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖与200mg溴化钾混匀后，压制厚度为1mm片状，然后上机检测。采用Nicolet iZ-10傅里叶变换红外光谱仪扫描分析，仪器分辨率4.00cm-1，扫描范围为4000-400cm-1，扫描次数：32次。采样增益为8.0；动镜速度为0.4747；光阑80.00；DTGS KBr检测器；KBr分束器；红外光源。

2、试验结果

本发明实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖的近红外图谱图如图1所示。

试验例二、铁皮石斛多糖分子量的测定

1、试验方法：

对实施例1和实施例2制得的小分子铁皮石斛多糖进行分子量测定。具体测定方法为：

1.1、精密称量不同分子量的右旋糖酐标准品(分子量1000、5000、12000、25000、50000、80000、150000、270000、410000、670000系列分析标准品)，分别加入0.05M NaCl溶液配制成5mg/ml右旋糖酐的标准溶液，使用0.22μm的微孔滤膜过滤备用，采用HPGPC法，使用高效凝胶渗透色谱串联柱来进行检测，以标准品相对分子质量的对数值为纵坐标，以相应色谱峰的保留时间为横坐标进行线性回归，得校正曲线。

1.2、精确称取实施例1和实施例2制得的小分子铁皮石斛多糖粉末样品5mg，向样品中加入0.05M NaCl溶液1ml，配制成5mg/ml供试样品溶液，8000rpm离心10min，取上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后将样品转置于2ml进样瓶中备用。

1.3、高效凝胶渗透色谱分析条件

色谱柱：聚合物基质水溶性SEC(GFC)色谱柱(8×300mm)3根串联；流动相：0.05MNaCl溶液；流速：0.65ml/min；柱温：40℃；进样量：30μl。

2、试验结果：

试验结果如表1所示。

表1.铁皮石斛多糖的分子量

由表1可知，本发明使用高效凝胶色谱分析铁皮石斛多糖的分子量，植物乳杆菌(L5)和解淀粉乳杆菌(L6)发酵后的铁皮石斛多糖，分子量均在2～5kDa，尤其是植物乳杆菌L5的发酵效果最佳。结果表明，以该方法制备小分子量的铁皮石斛多糖是可行的。

试验例三、铁皮石斛多糖的产率测定

1、试验方法：

测定以下各组制得的小分子铁皮石斛多糖的产率和纯度，具体的测定方法为：

准确称取标准葡萄糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml,然后加入6％苯酚0.5m1及浓硫酸5.0m1,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测光密度，以2.0m水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数纵坐标为光密度值，得标准曲线。取小分子铁皮石斛多糖样品1.0ml，加入6％苯酚0.5ml，迅速加入浓硫酸5.0ml，充分混匀，静置30分钟，于490nm测定吸光度，并将测得的吸光度带入标准曲线中，可获得多糖浓度。

小分子铁皮石斛多糖的制备方法参考实施例1的制备方法，乳酸菌的添加量如下：

试验一组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)；

试验二组：所述乳酸菌为解淀粉乳杆菌(L6)；

试验三组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比1:1混合组成；试验四组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比2:1混合组成；试验五组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比3:1混合组成；试验六组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比3:2混合组成；试验七组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比1:2混合组成；试验八组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比1:3混合组成；试验九组：所述乳酸菌为植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)按质量比2:3混合组成。

2、试验结果：

试验结果如表2所示。

表2小分子铁皮石斛多糖的产率

	提取率(％)	纯度(％)
			试验一组	2.43±0.15	92.46±2.82
试验二组	2.05±0.12	87.56±2.54
			试验三组	2.14±0.19	89.42±2.65
试验四组	2.87±0.13	94.22±2.48
			试验五组	2.26±0.09	92.88±2.57
试验六组	2.64±0.17	93.23±2.31
			试验七组	2.27±0.10	88.45±2.74
试验八组	2.10±0.14	87.99±2.58
			试验九组	4.08±0.16	98.12±2.90

发明人为了进一步增加产率和纯度，将植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)混合使用，刚开始的预想是，植物乳杆菌(L5)的发酵效果最佳，植物乳杆菌(L5)的量比解淀粉乳杆菌(L6)多，其产率和纯度，理应会增加，但是发明人发现其增加的效果并不明显，后来抱着试试的想法将解淀粉乳杆菌(L6)的量增加，在植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)的质量比为2:3时，其产率和纯度的效果最佳。发明人猜测其原因是：植物乳杆菌(L5)与解淀粉乳杆菌(L6)在细微的量比中会相互协同作用，在这个特定比例关系中植物乳杆菌(L5)可以进一步降解解淀粉乳杆菌(L6)降解不到位的铁皮石斛多糖，可以进一步提高分子量为2～5kDa的小分子量的铁皮石斛多糖的纯度。

试验例四、铁皮石斛多糖的功效试验

1、试验对象：

实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖(发酵后2～5kDa铁皮石斛多糖，KFDP)，市售铁皮石斛多糖(未发酵的常规市售铁皮石斛多糖，品牌：solarbio，货号：SD9310，分子量约37.8kDa，KDP)。

2、试验方法：

2.1、小鼠适应性饲养：

72只6-8w龄的C57雄性小鼠，称量体重并记录后随机将鼠分成9组，每组8只鼠，分装在9个鼠笼中。给予光照12h黑暗12h，温度20-24℃、湿度60-70％，正常取食饮水环境下适应性饲养7天后开始建动物模型。

2.2、动物模型：

除空白对照组外，其余组鼠行白酒灌胃(动物房多备两只鼠用于成模鉴定)，每只鼠每天灌胃300μl，空白对照组灌生理盐水300μl，灌胃建模7天时随机取一只模型鼠和正常组的鼠取血(200μl)测AST/ALT生化指标(酒精肝模型成立时比值＞2)；

2.3、动物给药

2.3.1试验分组：

KFDP：实施例4制得的小分子铁皮石斛多糖

KDP：市售铁皮石斛多糖

C空白对照组、阳性对照组、M酒精模型组、KFDP-L低剂量组(40mg/kg)、KFDP-M中剂量组(80mg/kg)、KFDP-H高剂量组(160mg/kg)、KDP-L低剂量组(40mg/kg)、KDP-M中剂量组(80mg/kg)、KDP-H高剂量组(160mg/kg)。

2.3.2试验方法

2.3.2.1取样方法

注射异氟烷麻醉小鼠后采血分离血清，于冰箱-20℃保存备用；

肝脏：取新鲜组织，滴注10％福尔马林冲出组织内血液的同时固定肝脏组织，用于组织病理学切片。离体后立即液氮冻存，如果不能及时冻存，放在RNA保存液里面，使组织完全浸润在液体中，放在4°过夜，最后-80冻存，组织每份0.5g-1g左右，每个样本取多份。

血清：收集全血，室温放置2h，4℃3000rpm/min离心10min，吸取上部的血清，-80度保存。

2.3.2.2肝细胞HE染色

试验步骤：

(1)取材后迅速固定；

(2)脱钙；

(3)脱水，80％、90％、95％、100％浓度乙醇依次脱水2小时，二甲苯透明；

(4)使石蜡浸入组织中，取代组织中含有的透明剂；

(5)包埋：将浸蜡后的组织置于融化的固体石蜡中，石蜡凝固后，组织即被包在其中；

(6)切片、铺片：用眼科镊子镊起切片轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的切片自然展平；

(7)贴片、烘片：待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片上的余水，置入60～65℃恒温箱内或切片漂烘温控仪的烘箱内烤片15分钟，脱去溶化组织间隙的石蜡；

(8)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗；

(9)苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗；

(10)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min；

(11)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I5min-95％酒精II5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片；

(12)显微镜镜检，图像采集分析。

2.3.2.3肝脏MDA、AST、ALT、T-AOC指标的测定

分别采用MDA、AST、ALT、T-AOC试剂盒对小鼠血清和肝脏进行测定。

3、试验结果：

3.1、肝细胞HE染色结果如图2所示。其中，图2中显微镜观察不同组别的肝脏病理组织切片(400x)；KFDP-L:40mg/kg、KFDP-M:80mg/kg、KFDP-H：160mg/kg；KDP-L:40mg/kg、KDP-M:80mg/kg、KDP-H：160mg/kg，为了证明发酵后铁皮石斛多糖(KEDP)对酒精性肝损伤的保护作用，本试验从动物水平上进行试验。首先，对肝脏组织进行病理学观察，观察结果如图2所示。正常组细胞核形态正常，边缘清晰，然而模型组的细胞内细胞核消失并产生大面积空泡化，说明小鼠肝脏已经出现典型的细胞凋亡。用KEDP治疗小鼠可明显逆转细胞中严重的病理损伤，尤其是中剂量的KFDP(KFDP-M)，改善了小鼠肝细胞的结构，减少了细胞坏死、炎性细胞浸润的现象；然而低剂量与高剂量的KFDP，也观察到肝细胞不同程度的坏死特征。与未发酵的铁皮石斛多糖(KDP)相比，KFDP不同剂量均优于KDP，证实了发酵后铁皮石斛多糖(KEDP)比未发酵的铁皮石斛多糖(KDP)对肝细胞的保护效果更好。

3.2、肝脏MDA、AST、ALT、T-AOC指标的测定结果如图3所示。图3为铁皮石斛多糖对酒精性肝脏的损伤程度的影响，酒精经肠胃吸收可直接进入肝脏参与代谢，增强肝组织中超氧阴离子自由基、轻基自由基等的生成，引起脂质的过氧化反应，产生MDA，从而引起肝脏中AST及ALT活性的升高，因此评估MDA、AST、ALT及T-AOC可以系统的判断肝脏的损伤程度。由图3可知，模型组的各项指标均显著高于正常组(p<0.05)，说明酒精已对肝脏产生严重的损伤，而经KFDP与KDP治疗后，各项指标显著降低(p<0.05)，此外，80mg/kg的KFDP治疗时，各项指标与正常组无显著差异。以上结果表明，发酵后铁皮石斛多糖(KEDP)对酒精性肝损伤具有更好的保护作用。

Claims

1.一种小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S2.将铁皮石斛粉末加入超纯水浸湿，所述铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:(10～20)mL，灭菌，得铁皮石斛糊状物，接着以30％的接种量将步骤S1制得的乳酸菌悬液接种于铁皮石斛糊状物中，在温度为37℃的条件下发酵36h，得发酵液，接着将发酵液放入温度设置为55～65℃的烘箱中放置36h，得发酵后铁皮石斛粉末；

2.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1和步骤S2中的灭菌条件为在温度为121℃的条件下处理12～16min。

3.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的乳酸菌为植物乳杆菌(L5)和解淀粉乳杆菌(L6)中的一种或其二者的组合。

4.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的乳酸菌悬液的菌种浓度为8×10⁷～10⁸cfu/mL。

5.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S1的离心条件为在3500～4500r的条件下离心4～6min。

6.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中发酵后的铁皮石斛粉末与超纯水的料液比为1g:(38～42)mL。

7.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S3的离心条件为在3500～3800r的条件下离心12～18min。

8.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的超滤分离条件为：温度为18～22℃，进口压力为0.07～0.09MPa，出口压力为0.02～0.06MPa。

9.如权利要求1所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中的冷冻，干燥条件为：将小分子铁皮石斛多糖溶液于-80℃冷冻过夜，用真空冷冻干燥机冻干2～3d。

10.如权利要求1～9任一所述的小分子量铁皮石斛多糖的制备方法制得的分子量为2～5kDa的铁皮石斛多糖在制备预防或治疗酒精性肝损伤药物中的用途。