CN111905095B - 一种蚯蚓多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种蚯蚓多肽及其制备方法和应用。所述蚯蚓多肽的制备方法包括：发酵步骤：在含有蚯蚓颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养，得到发酵液；分离步骤：对所述发酵液进行分离处理，获取含所述蚯蚓多肽的分离产物；其中，所述混合菌种包括乳酸杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、假交替单胞菌、产阮假丝酵母菌、酿酒酵母菌、纳豆芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌中的两种或两种以上的组合。本发明的蚯蚓多肽的分子量更合适，安全性高，且稳定性优异，透皮吸收率高。进一步地，本发明的蚯蚓多肽对皮肤中的细胞的生长或增殖具有良好的促进作用，能够提高皮肤中的细胞再生能力，增加皮肤弹性。

Description

一种蚯蚓多肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域或化妆品领域，具体涉及一种蚯蚓多肽的制备方法，以及所述制备方法制备得到的蚯蚓多肽及其应用。
背景技术
皮肤被覆于体表，作为人体对抗外界伤害的第一道防线，保护体内各种器官和组织免受外界有害因素损伤的同时，也易因各种外界环境影响或自身内源性因素的共同作用而产生皮肤松弛、无光泽、皱纹加深、色素沉着等衰老迹象。
胶原是真皮的主要成分，也是人体中含量最丰富的蛋白质，人类皮肤中各类型的胶原比例也随着年龄而变化，在年轻皮肤中，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分别占皮肤总胶原的80％和15％，随着年龄的增长，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原会明显丢失，致使皮肤失去弹性，变得松弛，而胶原蛋白还具有涵养水分的作用，成为结缔组织中的保湿功臣，皮肤必须水分充足才不会干瘪松弛、出现皱纹。
造成这种变化的原因是：胶原是由皮肤中的成纤维细胞生成，而随着年龄及外界因素的变化，皮肤中的成纤维细胞的活性和数量都在慢慢衰减。因此如何增加皮肤中成纤维细胞的数量和增强其活性成了延缓皮肤衰老的一个重要且直接的途径。
蚯蚓，又名地龙，是一种蛋白质含量达45.9％-68.11％的软体环节动物。本身作为一种中药药材，具有溶栓、抗凝、抗癌、平喘、增强免疫力、促进伤口愈合等作用。蚯蚓的再生能力超强，身体受到外力的袭击被切断后会迅速生长出新的组织，最后恢复出完整的身体结构，如果将一条蚯蚓中间截断，能分裂复制出两条完整的蚯蚓。这种超强的再生能力提示我们，蚯蚓体内可能含有某些高生物活性的促细胞增殖物质。
目前对于蚯蚓分解成小分子片段的方法主要是水解或酶解。水解是利用酸或碱切断大分子结构中的某些分子链，水解反应强度较高，会形成分子量极小的片段；酶解是利用特定的酶作为催化剂来催化分解大分子结构，反应作用单一，特定的酶对特定的物质分解效果好，特定的酶只能作用于某些特定的肽键，所以形成的产物单一。
酶解法是现有的蚯蚓小分子肽的制备方法，大多数是以蚯蚓本身的自溶酶来制取去，也有引入外来蛋白酶的制备方法，如专利CN110025559A采用丙二醇作为溶剂，生姜作为促溶剂，利用黑曲霉产生的酸性蛋白酶作为外源蛋白酶，制备蚯蚓小分子肽提取物。这种方法虽然可以提升的提取率，但提取物混入了其他的杂质。专利CN103845272A通过将干净蚯蚓捣碎或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中制得蚯蚓样品液，再利用自身酶或外加蛋白酶水解，以3万道尔顿的超滤膜超滤并冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。这种方法所得产物虽然纯净，但产物较单一，影响其作用效果。
发明内容
一方面，本申请提供了蚯蚓多肽用于制备促进皮肤细胞生长或增殖的化妆品或药品中的用途，其中所述蚯蚓多肽的分子量为10000D以下。
在一些实施方案中，所述蚯蚓多肽的分子量为3000D～8000D。
在一些实施方案中，所述皮肤细胞选自人表皮成纤维细胞，人真皮成纤维细胞，人表皮角化细胞，人表皮角质形成细胞中的一种或多种。
一方面，本申请提供了所述蚯蚓多肽的制备方法，所述制备方法包括：
发酵步骤：在含有蚯蚓颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养；
分离步骤：对发酵步骤中制得的发酵液进行分离处理。
本申请是在含有蚯蚓颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养。通过使用混合菌种，形成多菌种联合培养技术，能够获得分子量合适、稳定性优异，且透皮吸收率高的蚯蚓多肽。
其中，所述混合菌种包括乳酸杆菌(Lactobacillus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)、产阮假丝酵母菌(Candida utilis)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中的两种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，所述发酵步骤中，所述蚯蚓颗粒浆液中蚯蚓颗粒的含量为1.5-6g/mL，优选为2-5g/mL。
在一些实施方案中，所述混合菌种的总接种量为6×103-9×107CFU/mL，优选为6×105-8×106CFU/mL。在一些实施方案中，当混合均菌的总接种量在6×103-9×107CFU/mL的范围内时，能够获得分子量合适的蚯蚓多肽。
在一些实施方案中，所述混合菌种包括乳酸杆菌、双歧杆菌和酿酒酵母菌中的两种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，所述乳酸杆菌、所述双歧杆菌与所述酿酒酵母菌的接种比为0.5～5:0.5～5:1。具体地，所述接种比可以是0.8～4:0.8～4:1，可以是1～3:1～3:1，可以是1.5～2.5:1.5～2.5:1等。在一些实施方案中，当乳酸杆菌、双歧杆菌和酿酒酵母菌的接种比为1～3:1～3:1时，所获得的蚯蚓多肽的分子量更为合适。
在一些实施方案中，所述发酵步骤中，为了使发酵培养的过程能够有效进行，可以将发酵培养前含有蚯蚓颗粒的浆液的pH调整为5.0～6.8。
在一些实施方案中，在进行发酵培养时会对发酵培养的温度和时间进行控制。
在一些实施方案中，所述发酵培养的温度为25～38℃；优选为28～35℃；进一步优选为30～35℃。
在一些实施方案中，所述发酵培养的时间为10～96h；优选为24～72h；进一步优选为45～50h。
进一步，本申请对进行发酵培养的装置不作特别限定，可以是本领域常用的一些培养装置。作为优选，在本发明中使用培养箱进行发酵培养。培养箱是指温度可控的，主要用于培养微生物、植物和动物细胞的箱体装置，可以具有制冷和加热的双向调温系统，培养箱的外箱体一般是采用聚氨酯等泡沫塑料作为隔热材料，对外源冷、热都有较好的隔绝能力；培养箱的内腔可以采用不锈钢制作，从而具有较强的抗腐蚀能力；培养箱可以具有加热、制冷以及自动温控装置，从而能够灵敏地调节箱内温度。
在一些实施方案中，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至培养基中进行活化的步骤。具体地，可将混合菌种中的每种菌种单独接种至培养基中进行活化；也可将菌种混合后得到的混合菌种接种至培养基中进行活化。
在一些实施方案中，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至活化培养基中进行活化的步骤。
在一些实施方案中，菌种活化的步骤包括：将菌种接入活化培养基中在30～35℃下静止培养12～48小时进行活化。
在一些实施方案中，菌种活化的步骤中使用的活化培养基可以为基础培养基。具体地，以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.5％-1.2％，蛋白胨0.3％-1.5％，氯化钠0.3％-2％，葡萄糖0.5％-2.5％，琼脂1.2％-2.8％，其余为水。
本申请以蚯蚓作为原料，考虑到蚯蚓的主要成分，本发明可以对蚯蚓进行处理，以制备蚯蚓颗粒。在一些实施方案中，在发酵步骤之前，所述制备方法还包括蚯蚓颗粒制备步骤。
本申请对蚯蚓颗粒制备步骤的具体步骤不作特定限定，都是本领域常用的一些方法，例如：清洗、浸泡、干燥、粉碎等。具体地，在本申请中，所述蚯蚓颗粒制备步骤包括将蚯蚓进行清洗后置于溶剂中浸泡，之后对所述蚯蚓进行干燥后粉碎，以得到所述蚯蚓颗粒。在一些实施方案中，所述蚯蚓颗粒制备步骤包括将蚯蚓置于溶剂中浸泡后，对所述蚯蚓进行干燥后粉碎。
所述清洗，可以使用水和/或低沸点的烃类、醇类、醚类、酮类等有机溶剂对蚯蚓进行清洗，以去除表面污物和浮沫。所述浸泡，可以使用溶剂进行浸泡，所述溶剂可以是水和/或低沸点的烃类、醇类、醚类、酮类等有机溶剂对蚯蚓进行浸泡，作为优选，浸泡的时间可以是12～36小时，每隔1-3小时换一次溶剂。为了不影响目标产物的性能，优选使用水进行清洗和/或浸泡。
对于干燥，所述干燥可以在加热和/或减压的条件下进行以得到干燥的产品。但是，为了不影响后续的发酵步骤，优选使用冷冻干燥的方式进行处理。
对于粉碎，可以是任意可行的粉碎技术，可列举的粉碎技术有手动或电动切割式粉碎技术、手动或电动研磨粉碎技术、电动球磨粉碎技术等中的一种或两种以上的技术联用。对于粉碎后的粒度，本申请不作特别限定，可以是有利于发酵步骤的任何可行的粒度。作为优选，所述粉碎的蚯蚓颗粒的平均粒度以目数计可以为20～200目；优选为20～100目；进一步优选为60～80目。
将上述粉碎的蚯蚓颗粒加入到水中，恢复至室温可以直接得到含有蚯蚓颗粒的浆液。
本申请是通过对发酵液进行分离处理，以获取含所述蚯蚓多肽的分离产物，进而得到蚯蚓多肽。本申请中，由于需要特定分子量的蚯蚓多肽，因此，在进行分离时，优选先去除杂质短肽、氨基酸以及盐等小分子物质后，再除去一部分分子量过高的发酵产物，然后再根据需要继续分离。
在一些实施方案中，所述分离步骤包括：至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D的物质去除，优选小于100D的小分子物质去除，得到第一分离产物。
在一些实施方案中，用透析装置制得第一分离产物。可以根据需要选择合适的透析装置进行透析处理。
在一些实施方案中，还包括至少将第一分离产物中数均分子量高于10000D的物质去除，得到含所述蚯蚓多肽的初提液。
在一些实施方案中，利用超滤装置制得含所述蚯蚓多肽的初提液。
在一些实施方案中，超滤装置包括一个或多个；其中，第一个超滤装置称之为“第一超滤装置”，在存在多个超滤装置的情况下，后续超滤装置的名称依次类推。
通过采用透析装置和第一超滤装置，可以脱除杂质短肽、氨基酸以及盐等小分子物质，并除去一部分数均分子量过高的发酵产物，得到分子量合适的蚯蚓多肽。
在一些实施方案中，所述分离步骤还包括采用不同规格的其它超滤装置，得到不同分子量范围的蚯蚓多肽。本文所述的“其它”超滤装置，其含义是第一超滤装置以外的，且规格小于第一超滤装置的超滤装置。
在本发明的一些具体的实施方案中，所述分离步骤包括：
(1)将发酵液离心，取上清液过滤后，利用透析装置至少将所述发酵液中的数均分子量小于100D的小分子物质去除，得到透析产物；
(2)利用第一超滤装置至少将透析产物中数均分子量高于10000D的部分去除，得到含所述蚯蚓多肽的初提液；
(3)采用不同规格的其它超滤装置，分离出不同分子量范围的蚯蚓多肽。
透析(dialysis)是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。具体地，在本发明中，可以使用透析装置进行透析。
透析装置通常是由半透膜制成的管状或袋状容器(例如透析袋)。具体地，可以将本发明的发酵液的上清液分别置于透析装置内，将此透析装置浸入水或缓冲液中，发酵液的上清液中的较大分子量的蚯蚓多肽被截留在透析装置内，而较小分子量的杂质短肽、氨基酸以及盐等物质不断扩散到透析装置外，直到透析装置内外两边的浓度达到平衡为止，从而能够得到分子量合适的蚯蚓多肽。
具体地，所述透析装置的规格，可以根据需要进行选择，例如可以是具有如下以数均分子量为规格的超滤装置：50D、100D、150D、200D、250D、300D、350D、400D、450D、500D等。经透析处理后，有利于得到分子量更为合适的蚯蚓多肽。
举例而言，当使用规格为500D的透析装置时，可以滤出数均分子量低于500D的部分，数均分子量在500D以上的分离产物被截留在透析装置内。再举例而言，当使用规格为100D的透析装置时，可以滤出数均分子量低于100D的部分，数均分子量在100D以上的分离产物被截留在透析装置内。同样地，当使用其它上述可行的透析装置时，截留的分子量可以依据透析装置的规格确定。
对于超滤装置，所述超滤装置是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.01微米以下的微孔过滤装置，例如超滤膜等。一般而言，在超滤装置的一侧施加一定压力，以克服渗透压差，可以筛出所需要的含有特定分子量的蚯蚓多肽的滤液。具体地，对于超滤装置的规格，可以根据需要进行选择，例如具有如下以数均分子量为规格的超滤装置：10000D、9000D、8000D、7000D、6000D、5000D、4000D、3000D、2000D、1000D等。本发明的第一超滤装置为规格为10000D的超滤装置，通过使用第一超滤装置处理，有利于得到分子量更为合适的蚯蚓多肽。
举例而言，当使用规格为10000D的超滤装置时，可以将数均分子量高于10000D的部分截留在超滤装置内，得到的数均分子量在10000D以下的滤液。再举例而言，当使用规格为5000D的超滤装置时，可以截留数均分子量高于5000D的部分截留在超滤装置内，得到数均分子量在5000D以下的滤液。同样地，当使用其它上述可行的超滤装置时，截留的分子量可以依据超滤装置的规格确定。
对于所述分离步骤中步骤(3)，具体操作步骤可举例如下：第1步中所获得的含所述蚯蚓多肽的初提液经过规格为1000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于1000D的部分，得到数均分子量为200～1000D的蚯蚓多肽A；剩余的初提液继续经过2000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到数均分子量为1000～2000D的蚯蚓多肽B；剩余的初提液继续经过3000D的超滤装置，可以截留分子量高于3000D的部分，得到数均分子量为2000～3000D的蚯蚓多肽C；剩余的初提液继续经过4000D的超滤装置，可以截留分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为3000～4000D的蚯蚓多肽D；剩余的初提液继续经过5000D的超滤装置，可以截留分子量高于5000D的部分，得到数均分子量为4000～5000D的蚯蚓多肽E；剩余的初提液继续经过6000D的超滤装置，可以截留分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为5000～6000D的蚯蚓多肽F；剩余的初提液继续经过7000D的超滤装置，可以截留分子量高于7000D的部分，得到数均分子量为6000～7000D的蚯蚓多肽G；剩余的初提液继续经过8000D的超滤装置，可以截留分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为7000～8000D的蚯蚓多肽H；剩余的初提液继续经过9000D的超滤装置，可以截留分子量高于9000D的部分，得到数均分子量为8000～9000D的蚯蚓多肽I；最后剩余数均分子量为9000～10000D的蚯蚓多肽J。
对于本申请通过分离步骤获得的含所述蚯蚓多肽的分离产物，可以采用检测细胞增殖率的方法对分离产物进行筛选，以获得数均分子量范围更加合适的蚯蚓多肽。
优选地，所述细胞可以是皮肤中的细胞，优选是成纤维细胞。
一般而言，检测细胞增殖率的方法包括细胞培养的步骤，具体地，可以使用少量获得的不同数均分子量的蚯蚓多肽，进行细胞培养。对于细胞培养的步骤本发明不作特别限定，可以是本领域常规培养细胞的步骤。
作为优选，以成纤维细胞为例，具体的细胞培养方法可以包括：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按500～5000个/孔接种于多孔培养板，用10％小牛血清培养液培养12～48h后，换RIPM-1640培养液继续培养12～48h；
然后取不同数均分子量的分离产物分别加入到培养孔中进行培养，添加量为15～50μg/mL，选取其中的一个孔不添加该分离产物，作为空白对照组，继续培养24～96h。
在本发明中，为了提高检测效果，可以采用MTT法检测细胞增殖率。在上述培养孔中加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A。
具体计算公式如下：
细胞增殖率(％)＝加入蚯蚓多肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％。
一方面，本发明提供了一种组合物，包括如表1所示按重量百分比计的以下成分：
表1
其中，所述蚯蚓多肽是根据前述的方法制备得到的。
在一些实施方案中，本申请还提供了上述组合物的制备方法，包括以下步骤：
1)将A相各组分依次加入到乳化锅中加热至85～90℃，均质3-10分钟，优选5分钟后开启搅拌，保温半小时；
2)将B相各组分依次加入到油锅中加热至85～90℃，搅拌均匀；
3)在搅拌状态下将油锅中的料体慢慢抽入到乳化锅中，均质3-10分钟，优选5分钟，抽真空保温搅拌10-20分钟，优选20分钟后开启冷却水；
4)待温度降至30-50℃，优选40℃时，依次加入C相和D相各组分，抽真空搅拌均匀，温度降至25-40℃，优选38℃即可。
在一些实施方案中，所述的组合物为护肤品，所述护肤品包括水剂型、乳剂型、霜剂型。所述水剂型护肤品包括：修护水、化妆水、卸妆水或保湿水等；所述乳剂型护肤品包括：润肤乳液、护肤精华、眼部精化、面膜、补水啫喱、洁面乳、防晒乳或隔离乳等；所述霜剂型护肤品包括护肤膏霜、防晒霜、BB霜、隔离霜或眼霜等。
附图说明
图1示出了本发明实施例1的不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图；
图2示出了本发明实施例2的不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图；
图3示出了本发明实施例3的不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化图；
图4是功效性测试中受试者鱼尾纹前后差异图片。
具体实施方式
以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
需要说明的是：
本说明书中，单位“D”为道尔顿，作为原子质量单位，定义为碳12原子质量的1/12，1D＝1g/mol。
本说明书中，如有使用“分子量”的表述，其含义是“数均分子量”。
本说明书中，术语“MTT”表示噻唑蓝。
本说明书中，所使用的“水”包括去离子水、蒸馏水、双蒸水、纯净水、离子交换水等任何化妆品领域可行的水。
本说明书中，所述的“室温”的含义可以是10～30℃。
如无特殊声明，本发明所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所允许的误差。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
乳酸杆菌(Lactobacillus)：BNCC106592，北纳生物菌种保藏中心；
双歧杆菌(Bifidobacterium)：GIM1.520，广东省微生物菌种保藏中心；
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)：GIM2.213，广东省微生物菌种保藏中心；
蚯蚓为人工养殖的参环毛蚓(Pheretima aspergillum)，在市场购得；
成纤维细胞是人真皮成纤维细胞：CP-H103，武汉普诺赛生命科技有限公司。
实施例1
将500g新鲜的蚯蚓清理干净，去除表面污物和浮沫；将清洗过的蚯蚓放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将蚯蚓捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎，得到以目数计平均粒度为60目的蚯蚓颗粒。将上述粉碎后的蚯蚓颗粒以3g/mL的浓度加入到去离子中，恢复到室温后，得到含有蚯蚓颗粒的浆液。
将乳酸杆菌、双歧杆菌、酿酒酵母菌菌种以1：2：1的接种比混合接种到活化培养基中在33℃下静止培养24h进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述蚯蚓颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，总接种量为6×105CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为6.3，发酵培养的温度为35℃，发酵培养的时间为45h，得到发酵液；将发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为100D的透析袋去除数均分子量低于100D的盐类等小分子物质，再通过规格为9000D的超滤膜去除数均分子量高于9000D的部分，得到含所述蚯蚓多肽的初提液。
初提液经过规格为1000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于1000D的部分，得到数均分子量为100～1000D的蚯蚓多肽A；剩余的初提液继续经过2000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到数均分子量为1000～2000D的蚯蚓多肽B；剩余的初提液继续经过3000D的超滤装置，可以截留分子量高于3000D的部分，得到数均分子量为2000～3000D的蚯蚓多肽C；剩余的初提液继续经过4000D的超滤装置，可以截留分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为3000～4000D的蚯蚓多肽D；剩余的初提液继续经过5000D的超滤装置，可以截留分子量高于5000D的部分，得到数均分子量为4000～5000D的蚯蚓多肽E；剩余的初提液继续经过6000D的超滤装置，可以截留分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为5000～6000D的蚯蚓多肽F；剩余的初提液继续经过7000D的超滤装置，可以截留分子量高于7000D的部分，得到数均分子量为6000～7000D的蚯蚓多肽G；剩余的初提液继续经过8000D的超滤装置，可以截留分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为7000～8000D的蚯蚓多肽H；最后剩余数均分子量为8000～9000D的蚯蚓多肽I。
MTT法细胞增殖实验：取对数生长期的成纤维细胞，计数后，按1500个/孔接种于96孔培养板，用10％小牛血清培养液在37℃培养箱中培养24h后，换RIPM-1640培养液继续培养24h。
然后取上述不同数均分子量的蚯蚓多肽A～I分别加入到不同的培养孔中进行培养，每种蚯蚓多肽添加量为15μg/mL，选取其中的一个孔不添加蚯蚓多肽，作为空白对照组，继续培养48h。
加入MTT继续孵育4h后，加入150μl二甲基亚砜DMSO充分振荡，在酶标仪上于490nm读取吸光度值A，并计算细胞增殖率。
其中，细胞增殖率(％)＝加入蚯蚓多肽的样品吸光度值/空白对照组样品吸光度值×100％
本实施例不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化如图1所示。
实施例2
将500g新鲜的蚯蚓清理干净，去除表面污物和浮沫；将清洗过的蚯蚓放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将蚯蚓捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎，得到以目数计平均粒度为80目的蚯蚓颗粒。将上述粉碎后的蚯蚓颗粒以2g/mL的浓度加入到去离子水中，恢复到室温后，得到含有蚯蚓颗粒的浆液。
将乳酸杆菌、双歧杆菌、酿酒酵母菌菌种以2：2：1的接种比混合接种到活化培养基中在34℃下静止培养28小时进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述蚯蚓颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，接种量为7×105CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为6.0，发酵培养的温度为34℃，发酵培养的时间为48h，得到发酵液；将发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为100D的透析袋去除数均分子量低于100D的盐类等小分子物质，再通过规格为10000D的超滤膜去除数均分子量高于10000D的部分，得到含所述蚯蚓多肽的初提液。
初提液经过规格为1000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于1000D的部分，得到数均分子量为100～1000D的蚯蚓多肽A；剩余的初提液继续经过2000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到数均分子量为1000～2000D的蚯蚓多肽B；剩余的初提液继续经过3000D的超滤装置，可以截留分子量高于3000D的部分，得到数均分子量为2000～3000D的蚯蚓多肽C；剩余的初提液继续经过4000D的超滤装置，可以截留分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为3000～4000D的蚯蚓多肽D；剩余的初提液继续经过5000D的超滤装置，可以截留分子量高于5000D的部分，得到数均分子量为4000～5000D的蚯蚓多肽E；剩余的初提液继续经过6000D的超滤装置，可以截留分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为5000～6000D的蚯蚓多肽F；剩余的初提液继续经过7000D的超滤装置，可以截留分子量高于7000D的部分，得到数均分子量为6000～7000D的蚯蚓多肽G；剩余的初提液继续经过8000D的超滤装置，可以截留分子量高于8000D的部分，得到数均分子量为7000～8000D的蚯蚓多肽H；剩余的初提液继续经过9000D的超滤装置，可以截留分子量高于9000D的部分，得到数均分子量为8000～9000D的蚯蚓多肽I；最后剩余数均分子量为9000～10000D的蚯蚓多肽J。
MTT法细胞增殖实验过程同实施例1。
本实施例不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化如图2所示。
实施例3
将500g新鲜的蚯蚓清理干净，去除表面污物和浮沫；将清洗过的蚯蚓放在去离子水中浸泡24小时，每隔2小时换水一次；浸泡完毕，将蚯蚓捞出沥干水分，放入冷冻室冷冻干燥，冷冻后粉碎，得到以目数计平均目数为70目的蚯蚓颗粒。将上述粉碎后的蚯蚓颗粒以4g/mL的浓度加入到去离子水中，恢复到室温后，得到含有蚯蚓颗粒的浆液。
将乳酸杆菌、双歧杆菌、酿酒酵母菌菌种以2：1：1的接种比混合接种到活化培养基中在32℃下静止培养32小时进行活化。以所述活化培养基的总质量计，所述活化培养基的具体组成为牛肉膏0.8％，蛋白胨1.0％，氯化钠0.5％，葡萄糖1.2％，琼脂2.0％，其余为水。
在所述蚯蚓颗粒的浆液中接种活化后的混合菌种，总接种量为6×106CFU/mL，置于培养箱中发酵培养，发酵培养的pH为5.8，发酵培养的温度为33℃，发酵培养的时间为50h，得到发酵液；将发酵液离心20分钟，取上层清液。
将上层清液通过规格为100D的透析袋去除低于数均分子量100D的盐类等小分子物质，再通过规格为8000D的超滤膜去除数均分子量高于8000D的部分，得到含所述蚯蚓多肽的初提液。
初提液经过规格为1000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于1000D的部分，得到数均分子量为100～1000D的蚯蚓多肽A；剩余的初提液继续经过2000D的超滤装置，可以截留数均分子量高于2000D的部分，得到数均分子量为1000～2000D的蚯蚓多肽B；剩余的初提液继续经过3000D的超滤装置，可以截留分子量高于3000D的部分，得到数均分子量为2000～3000D的蚯蚓多肽C；剩余的初提液继续经过4000D的超滤装置，可以截留分子量高于4000D的部分，得到数均分子量为3000～4000D的蚯蚓多肽D；剩余的初提液继续经过5000D的超滤装置，可以截留分子量高于5000D的部分，得到数均分子量为4000～5000D的蚯蚓多肽E；剩余的初提液继续经过6000D的超滤装置，可以截留分子量高于6000D的部分，得到数均分子量为5000～6000D的蚯蚓多肽F；剩余的初提液继续经过7000D的超滤装置，可以截留分子量高于7000D的部分，得到数均分子量为6000～7000D的蚯蚓多肽G；最后剩余数均分子量为7000～8000D的蚯蚓多肽H。
MTT法细胞增殖实验过程同实施例1。
本实施例不同分子量的蚯蚓多肽使用MTT法检测细胞增殖率变化如图3所示。
从实施例1-3的MTT细胞增殖实验的结果和图1-3可以看出，本申请制备的蚯蚓多肽D-H(即数均分子量为3000-8000D)能显著提升成纤维细胞的增殖率，增殖率达到20％～30％。
实施例4
一种促进皮肤细胞生长的化妆品，包括如表2所示按重量百分比计的以下成分：
表2
其中蚯蚓多肽为将实施例2中制备的蚯蚓多肽D、E、F、G、H混合得到的，即实施例2制备的所有分子量为3000D～8000D的蚯蚓多肽。
上述化妆品的具体制备工艺如下：
1)将A相各组分依次加入到乳化锅中加热至85～90℃，均质5分钟开启搅拌，保温半小时；
2)将B相各组分依次加入到油锅中加热至85～90℃，搅拌均匀；
3)在搅拌状态下将油锅中的料体慢慢抽入到乳化锅中，均质5分钟，抽真空保温搅拌20分钟后开启冷却水；
4)待温度降至40℃时，依次加入C相和D相各组分，抽真空搅拌均匀，温度降至38℃即可出料、灌装。
所述化妆品能促进皮肤细胞生长，促进细胞分泌胶原蛋白，具有紧致肌肤，平滑皱纹，延缓皮肤衰老的作用。
实施例5功效测试
实验人群：选取眼、面部有明显皱纹的健康女性受试者，共30人，年龄跨度20～50岁，受试者无面部皮肤敏感状态，近3个月内没有使用过任何有抗皱功效的化妆品、药品、保健品和医美治疗等，随机分成两组，每组15人。
实验方法：洁面使用普通保湿水后，在全脸区域使用本发明制备的化妆品，特别是鱼尾纹，抬头纹，法令纹区域，一天两次，连续使用28天。一组使用不含本发明蚯蚓多肽的化妆品(除此之外，其它组分及重量百分比均与实施例4相同)，称为对照例组；一组使用含有本发明蚯蚓多肽的化妆品，即实施例4制备的化妆品，称为实施例组，其中蚯蚓多肽的分子量为3000D～8000D，添加量为2％。
评价指标：受试者每天早晚各涂抹一次，持续使用28天，分别在第0天，第14天，第28天用Primos Lite皮肤三维成像系统拍摄受试者皱纹区域局部皮肤3D图像，再由专业分析软件分析，得到皱纹深度和皱纹数量的数值。数值越小，表示皱纹状况越好。对鱼尾纹区域进行分析，结果如表3。
表3
与基线值(D0)相比，对照例组的D14和D28时的鱼尾纹数量下降1.97％和5.57％，没有表现出显著差异；而实施例组的D14和D28时的鱼尾纹数量下降19.33％和35.93％，表现出显著性差异。说明本发明蚯蚓多肽及其制备的化妆品具有显著的减少皱纹，平滑皱纹的作用。
图4是选取的受试者鱼尾纹部位D0和D28的前后差异图片。从图片也可以看出，本申请制备的包含蚯蚓多肽的化妆品能显著淡化鱼尾纹，延缓皮肤衰老。

Claims (18)

1.一种蚯蚓多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
发酵步骤：在含有蚯蚓颗粒的浆液中接种混合菌种进行发酵培养；所述混合菌种包括乳酸杆菌、双歧杆菌和酿酒酵母菌；所述乳酸杆菌、所述双歧杆菌和所述酿酒酵母菌的接种比为1~3:1~3:1；所述混合菌种的总接种量为6×105-9×107 CFU/mL；发酵培养前的浆液的pH为5.0~6.8；所述发酵培养的时间为45~50 h；所述发酵培养的温度为25~38 ℃；
分离步骤：对发酵步骤中制得的发酵液进行分离处理；所述分离步骤包括：至少将所述发酵液中的数均分子量小于50D的物质去除，得到第一分离产物，将第一分离产物中数均分子量高于10000D的物质去除，得到含所述蚯蚓多肽的初提液；采用不同规格的超滤装置，得到不同分子量范围的蚯蚓多肽，制得分子量为3000D~8000D的蚯蚓多肽。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蚯蚓颗粒的浆液中蚯蚓颗粒的含量为1.5-6g/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蚯蚓颗粒的浆液中蚯蚓颗粒的含量为2-5g/mL。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合菌种的总接种量为6×105-8×106 CFU/mL。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述发酵培养的温度为28~35 ℃。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵步骤中，所述发酵培养的温度为30~35 ℃。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述分离步骤包括：用透析装置制得第一分离产物。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用超滤装置制得含所述蚯蚓多肽的初提液。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵步骤之前，还包括将混合菌种接种至活化培养基中进行活化的步骤。
10.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵步骤之前，所述制备方法还包括蚯蚓颗粒制备步骤。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述蚯蚓颗粒制备步骤包括将蚯蚓浸泡后，对所述蚯蚓进行干燥后粉碎。
12.一种组合物，其特征在于，包括按重量百分比计的以下成分：
；
所述蚯蚓多肽由如权利要求1-11所述方法制备得到；
所述组合物的制备方法包括以下步骤：
1）将A相各组分依次加入到乳化锅中加热至85~90 ℃，均质3-10分钟后开启搅拌，保温半小时；
2）将B相各组分依次加入到油锅中加热至85~90 ℃，搅拌均匀；
3）在搅拌状态下将油锅中的料体慢慢抽入到乳化锅中，均质3-10分钟，抽真空保温搅拌10-20分钟后开启冷却水；
4）待温度降至30-50℃时，依次加入C相和D相各组分，抽真空搅拌均匀，温度降至25-40℃即可。
13.如权利要求12所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将A相各组分依次加入到乳化锅中加热至85~90 ℃，均质3-10分钟后开启搅拌，保温半小时；
2）将B相各组分依次加入到油锅中加热至85~90 ℃，搅拌均匀；
3）在搅拌状态下将油锅中的料体慢慢抽入到乳化锅中，均质3-10分钟，抽真空保温搅拌10-20分钟后开启冷却水；
4）待温度降至30-50℃时，依次加入C相和D相各组分，抽真空搅拌均匀，温度降至25-40℃即可。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中均质5分钟。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中均质5分钟。
16.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中搅拌20分钟。
17. 如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中，待温度降至40 ℃时，依次加入C相和D相各组分。
18.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中，抽真空搅拌均匀，温度降至38℃即可。
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