CN111012726A - 一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括：(1)将鲜蚯蚓用水浸泡至无泥沙，置于盐水中浸泡，用杀菌液继续浸泡后捞出沥干；(2)将蚯蚓捣碎后加水调成溶液，搅拌反应，然后恒温放置20‑40min，过滤得酶解液和滤渣；(3)取滤渣加水调成溶液，加入蛋白酶进行酶解，离心过滤得到滤液；(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，进行脱色脱臭处理，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。本发明工艺简便，条件温和，无污染，所得的蚯蚓提取物具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，可用于保健品、化妆品领域，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法。
背景技术
蚯蚓，俗称地龙，是一种优质的动物蛋白资源，属于常用中药，具有抗凝血、溶血栓的双重作用、降压作用、免疫增强作用、杀灭精子、强化精子的双向作用、抗癌作用、解热、抗脑缺血、平喘、抗菌、抗氧化、促进创伤修复和细胞再生等作用。此外，蚯蚓经酶解获得的多肽提取物具有抗氧化、增强免疫、抗菌等生理活性。
目前将蚯蚓提取物用于抗皮肤老化产品的开发还比较少。蚯蚓提取物制备过程中，除了主要生成多肽类，还会产生氨基酸、水溶性小分子脂肪酸等活性成分。现有制备技术中，一方面往往忽视了这些活性成分以及蚯蚓体内自身含有的维生素和微量元素等其他小分子物质；另一方面制备提取物腥味较重，影响产品的后续开发。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，工艺简便，条件温和，无污染，所得的蚯蚓提取物中含有多种氨基酸和小分子肽，具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，促进胶原蛋白等基质的合成，可用于保健品、化妆品领域，具有重要的应用价值。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于盐水中浸泡20-45min，然后将蚯蚓捞出，用杀菌液继续浸泡15-30min后捞出沥干；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为35-45％的溶液，调节溶液pH为6.5-7.0，在30-40℃下搅拌反应50-120min，然后在36℃下恒温放置20-40min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为35～45％的溶液，加入滤渣重量0.02-0.05倍的蛋白酶进行酶解，离心过滤得到滤液；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，进行脱色脱臭处理，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
优选的，步骤(1)所述盐水质量百分浓度为0.02-0.03％。
优选的，步骤(1)所述杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为3-1:2-1:1组成。
优选的，步骤(1)所述杀菌液的温度为40-55℃。
优选的，步骤(3)所述蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为1-2:1组成。
优选的，步骤(3)所述酶解温度为40-55℃，酶解时间为40-60min。
优选的，步骤(4)所述脱色脱臭处理是用活性炭处理8-12min；所述活性炭的用量为提取液重量的0.5-1％。
与现有技术相比本发明的有益效果是：
(1)本发明采用盐水对蚯蚓进行浸泡，快速清除蚯蚓体内的沙土和污物，缩短清洗和浸泡时间；设定蚯蚓自溶酶解工艺参数，同时采用外源蛋白酶进行二次酶解，提高蚯蚓提取物的含量，同时对酶解液进行处理，使制备的提取物去除了蚯蚓自身所带的腥味，不仅具有均衡的营养物质，而且具有较好的抗氧化活性，可应用于抗衰老和增强免疫等功能的化妆品、保健食品开发。
(2)本发明采用的是蚯蚓活体，会存在病原菌以及病毒残留，在提取前采用中药杀菌剂进行杀菌处理，杀菌效果好，同时对蚯蚓提取物不产生影响，保证提取物的安全性。
(3)本发明提取方法中对提取物进行脱色脱臭处理，然后进行超滤膜过滤，去除了蚯蚓原有的腥味，使制备的蚯蚓提取物无异味，具有很好的应用价值。
(4)本发明提取方法工艺简便，条件温和，无污染，所得的蚯蚓提取物中含有多种氨基酸和小分子肽，具有清除超氧阴离子自由基和羟自由基的能力，可以有效促进人皮肤成纤维细胞的生长和增殖，促进胶原蛋白等基质的合成，可用于保健品、化妆品领域，具有重要的应用价值。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于质量百分浓度为0.02％的盐水中浸泡45min，然后将蚯蚓捞出，用40℃的杀菌液继续浸泡30min后捞出沥干；其中杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为3:2:1组成；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为35％的溶液，调节溶液pH为6.5，在30℃下搅拌反应120min，然后在36℃下恒温放置20min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为35％的溶液，加入滤渣重量0.02倍的蛋白酶在40℃下酶解60min，离心过滤得到滤液；其中蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为1:1组成；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，用提取液重量的0.5％的活性炭脱色脱臭处理12min，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
实施例2
一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于质量百分浓度为0.025％的盐水中浸泡35min，然后将蚯蚓捞出，用45℃的杀菌液继续浸泡25min后捞出沥干；其中杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为3:1:1组成；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为40％的溶液，调节溶液pH为6.7，在35℃下搅拌反应100min，然后在36℃下恒温放置30min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为40％的溶液，加入滤渣重量0.03倍的蛋白酶在45℃下酶解50min，离心过滤得到滤液；其中蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为2:1组成；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，用提取液重量的0.6％的活性炭脱色脱臭处理10min，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
实施例3
一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于质量百分浓度为0.03％的盐水中浸泡25min，然后将蚯蚓捞出，用50℃的杀菌液继续浸泡20min后捞出沥干；其中杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为2:2:1组成；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为42％的溶液，调节溶液pH为6.8，在38℃下搅拌反应80min，然后在36℃下恒温放置25min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为38％的溶液，加入滤渣重量0.04倍的蛋白酶在50℃下酶解45min，离心过滤得到滤液；其中蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为1:1组成；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，用提取液重量的0.8％的活性炭脱色脱臭处理9min，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
实施例4
一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于质量百分浓度为0.03％的盐水中浸泡20min，然后将蚯蚓捞出，用55℃的杀菌液继续浸泡15min后捞出沥干；其中杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为1:1:1组成；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为45％的溶液，调节溶液pH为7.0，在40℃下搅拌反应50min，然后在36℃下恒温放置40min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为45％的溶液，加入滤渣重量0.05倍的蛋白酶在55℃下酶解40min，离心过滤得到滤液；其中蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为2:1组成；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，用提取液重量的1％的活性炭脱色脱臭处理8min，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
试验分析
(一)蚯蚓提取物中成分的分析实验：
(1)蚯蚓提取物中多肽和蛋白的浓度测定：
双缩脲试剂的配制：a)4g无水Na 2CO 3溶解于200ml的0.1mol/l的NaOH溶液中，即为试剂A；b)0.5g CuSO 4·5H 2O溶解于10ml的1％酸钾钠溶液中，即为试剂B；c)将试剂A与试剂B以5∶1的比例进行混合摇匀，即为双缩脲试剂。
测定步骤：取实施例2制备的蚯蚓提取物，用去离子水配制蚯蚓提取物溶液，2ml样品液添加至4ml双缩脲试剂中混匀，于室温下放置30min，540nm处检测OD值。以杆菌肽为参照品，绘制标准曲线。参照标准曲线的回归方程，计算多肽和蛋白的总含量。
实验结果：蚯蚓提取物中多肽和蛋白的总含量为41.85％。
(2)蚯蚓提取物中总氮含量及游离氨基酸含量测定：
采用凯氏定氮法，对蚯蚓提取物中氮的总量进行检测；氮的总含量减去多肽和蛋白质的总量即为氨基酸含量。
实验结果：蚯蚓提取物中总氮的含量为84.18％，氨基酸含量为42.33％。
(二)蚯蚓提取物的抗氧化活性
(1)采用DPPH法检测蚯蚓提取物对DPPH自由基的清除作用，取实施例2制备的蚯蚓提取物，分别按照表1中的浓度配置提取物样品溶液，以α-熊果苷为阳性对照。清除率结果见表1。
表1蚯蚓提取物对有机自由基DPPH的清除作用
实验结果表明各浓度下的蚯蚓提取物对体外有机自由基DPPH都有一定的清除能力，并且在0.1-10mg/ml的范围内，其清除率随着浓度的增高而增强，当浓度为10mg/ml时蚯蚓提取物对DPPH的清除率达到95.6％。
(2)蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
取蚯蚓多肽提取物，分别按照表2中的浓度范围0.8-25mg/ml配置多肽提取物样品溶液，以VC作为阳性对照，设置VC对照品溶液配置0.1mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml三个浓度，采用邻苯三酚法检测蚯蚓多肽提取物对超氧阴离子自由基的清除作用，清除率结果见表2。
表2蚯蚓提取物对超氧阴离子自由基的清除作用
实验结果表明各浓度下的蚯蚓提取物样品溶液对体外超氧阴离子自由基都有一定的清除能力，并且在0.8-30mg/ml的范围内，其清除率随着浓度的增高而增强，当浓度为30mg/ml时蚯蚓提取物对超氧阴离子自由基的清除率达到74.6％。
以上为本发明较佳实施例，只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (8)
1.一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将鲜蚯蚓置于纯净水中进行浸泡至无泥沙，将蚯蚓洗净，置于盐水中浸泡20-45min，然后将蚯蚓捞出，用杀菌液继续浸泡15-30min后捞出沥干；
(2)将步骤(1)处理后的鲜蚯蚓捣碎后加水调成含量为35-45％的溶液，调节溶液pH为6.5-7.0，在30-40℃下搅拌反应50-120min，然后在36℃下恒温放置20-40min，过滤得酶解液和滤渣；
(3)取步骤(2)得到的滤渣加水调成含量为35～45％的溶液，加入滤渣重量0.02-0.05倍的蛋白酶进行酶解，离心过滤得到滤液；
(4)将步骤(1)得到的酶解液、步骤(2)中得到的滤液混合得到提取液，进行脱色脱臭处理，然后用超滤膜进行过滤得到蚯蚓提取物。
2.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述盐水质量百分浓度为0.02-0.03％。
3.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述杀菌液由鱼腥草提取液、艾草提取液、大蒜素按质量比为3-1:2-1:1组成。
4.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述杀菌液的温度为40-55℃。
5.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述蛋白酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶按质量比为1-2:1组成。
6.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述酶解温度为40-55℃，酶解时间为40-60min。
7.根据权利要求1所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：步骤(4)所述脱色脱臭处理是用活性炭处理8-12min。
8.根据权利要求4所述的具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其特征在于：所述活性炭的用量为提取液重量的0.5-1％。
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