CN104593457A - 一种具有清除自由基功能的小分子多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种具有清除自由基功能的小分子多肽。在与清除自由基功能相关的生物领域，蚯蚓是一种新型的高蛋白质源，蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，利用蚯蚓自溶、或外源蛋白酶降解，所获得的蚯蚓蛋白酶解产物，具有优异的清除自由基功能。本发明所述小分子多肽从蚯蚓中提取得到，将蚯蚓分散成匀浆液后，使用不同的水解酶依次进行酶解，所得酶解液经抽滤和超滤后，浓缩、干燥，即得本发明所述小分子多肽。本发明提供的多肽分子量小，致敏性弱，分子量小于1000Da的多肽占总量的90％以上；通过对DPPH清除能力的检测，本发明提供的小分子多肽具有优异的清除自由基功能。

Description

一种具有清除自由基功能的小分子多肽

技术领域

本发明涉及多肽领域，具体涉及了一种具有清除自由基功能的小分子多肽。

背景技术

能将自由基还原为非自由基的氧化剂称为自由基清除剂。自由基清除剂是指具有延迟、抑制和阻断ROS(活性氧)/OFR(氧自由基)氧化损伤的物质的总称，是能够与OFR结合并使之清除的机体保护剂。因此，在机体正常过程中以及保护细胞和组织免受氧化损伤中具有重要作用。目前，酶类和多肽类的自由基清除剂越来越受到人们的关注。

现代医学研究表明，蚯蚓具有抗血栓、平喘、皮肤修复、抑菌、抗氧化等多种生理功能，通常以煎煮所得提取物或蚯蚓粉直接入药，或以提取纯化的纤溶蛋白用于治疗血栓等疾病。蚯蚓是一种新型的高蛋白质源，蛋白质含量高，氨基酸种类丰富，利用蚯蚓自溶、或外源蛋白酶降解，所获得的蚯蚓蛋白酶解产物，具有多种生理活性功能，且清除自由基功效显著。

具体而言，专利文献CN103845272A提供了一种具有抗皮肤老化作用的蚯蚓提取物的制备方法，其将干净蚯蚓捣碎或将蚯蚓干品捣碎并浸泡于水中得到蚯蚓样品液，蚯蚓样品液利用自身酶或外加蛋白酶水解，得到蚯蚓水解液，将蚯蚓水解液经截留分子量小于等于3万道尔顿的超滤膜超滤并冷冻干燥，得到蚯蚓提取物。专利文献CN103845273A提供了一种抗皮肤老化的地龙肽的制备的方法，其将蚯蚓样品液利用自有酶或加入蛋白酶水解，再将水解液采用膜过滤和膜截留，冷冻干燥得到地龙肽，得到的地龙肽应用在抗皮肤老化化妆品或保健品中。

然而，现有技术公开的技术方案中，多肽的分子量均一性差，将多肽进行过滤或超滤等后处理后，会造成大量活性多肽的损失，影响其清除自由基功能。

发明内容

本发明的目的克服现有技术的缺陷，提供一种以蚯蚓为原料，采用混合多步酶解法制备而成的小分子多肽，所述多肽具有优异的清除自由基功效。

本发明提供了一种具有清除自由基功能的小分子多肽，所述小分子多肽以蚯蚓为原料，由包括以下步骤的方法提取得到：

1)将蚯蚓浸泡于浓度0.1～5％的甲基纤维素溶液中，排净沙土后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于纯净水中，分散成匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其浓度为0.2～0.4％，再加入胃蛋白酶，36～38℃下充分酶解后，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.7～6.9，加入中性蛋白酶，48～52℃下充分酶解后，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入菠萝蛋白酶，54～56℃下充分酶解后，得菠萝蛋白酶解液；升温至88～92℃使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量量为4-5kD的超滤膜超滤，所得滤液脱苦脱色，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

本发明步骤1)中使用甲基纤维素溶液浸泡蚯蚓，甲基纤维素可以促进蚯蚓的肠道蠕动，可以高效、快速的清除蚯蚓体内的沙土和废物，大幅度缩短蚯蚓清洗、浸泡的时间。具体的，所述甲基纤维素溶液的浓度优选为0.5～2％；蚯蚓与甲基纤维素溶液的质量体积比为1：1～10，优选为1：2～5，此处蚯蚓的质量单位为g，甲基纤维素溶液的体积单位为ml；蚯蚓在甲基纤维素中浸泡的时间应足以将其体内沙土排除干净，浸泡的时间优选为10～90min，进一步优选为30～60min；沙土排除干净后，用清水将蚯蚓通体清洗至少三次，彻底将沙土、废物和甲基纤维素溶液的残留清洗干净。

所述步骤1)中，蚯蚓与纯净水的质量体积比为1：1～20，优选为1：3～5，此处蚯蚓的质量单位为g，纯净水的体积单位为ml；将蚯蚓分散成匀浆液的设备选用常规的高速剪切机，高速剪切机的操作温度为-5～20℃，优选为0～4℃，转速为300～12000rpm，优选为6000～8000rpm，剪切时间为0.5～20min，优选为3～10min。

本发明步骤2)中，所述盐酸的浓度为加入盐酸后的溶液的终浓度，所述百分比为盐酸与溶液的质量体积比，优选为0.4％，；所述胃蛋白酶的比活为2500～4000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.3～0.5％；胃蛋白酶解反应的温度优选为37℃，酶解反应应充分，时间优选为2～5h。

本发明步骤3)中，所述中性蛋白酶的比活为30000～60000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.4～0.8％；中性蛋白酶解反应的pH值优选为6.8，温度优选为50℃，酶解反应应充分，时间优选为2～3h。

本发明步骤4)中，所述菠萝蛋白酶的比活为400000～800000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.5～1.5％；菠萝蛋白酶解反应温度优选为55℃，酶解反应应充分，时间优选为3～5h；酶灭活的温度优选为90℃，保持时间不宜过长或过短，为了保证酶被灭活的同时减小多肽的失活，保持时间优选为10～20min，进一步优选为15min。

本发明步骤5)中，所述脱苦脱色的具体步骤为：所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后，过滤除去活性炭即可。

本发明步骤5)中依次经过过滤和超滤可以获得小分子的多肽，从免疫学角度出发，小分子肽抗原性差，只能诱导机体产生很弱的免疫反应，在不经载体偶联的情况下即会失去免疫原性，最大程度地减少多肽的致敏性，从而提高其应用时的安全性。

作为优选方案，本发明所述小分子多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将蚯蚓浸泡于质量体积比1:2的0.5％甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于质量体积比1:3的纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.4％，再加入比活为3500U/g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.3％，37℃下反应3h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.8，加入比活为50000U/g的中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.5％，50℃下反应2h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.8％，55℃下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至90℃，保持15min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.45μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

为了保证制备得到的小分子多肽的活性，除了酶解反应对温度的特别要求外，本发明各个步骤的操作温度均优选为0～4℃。

本发明进一步保护所述小分子多肽在制备化妆品、食品、保健品、药品中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案可以取得显著的效果。本发明提供的方法原料来源广泛，且操作简单，制备得到的小分子多肽具有良好的自由基清除功效，无异味、不致敏，可广泛应用于化妆品、食品、保健品、药品中。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

小分子多肽按照以下步骤制备而成：

1)将100g蚯蚓浸泡于200ml浓度0.5％的甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于300ml纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.4％，再加入比活为3500U/g的胃蛋白酶0.3g，37℃下反应3h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.8，加入比活为50000U/g的中性蛋白酶0.5g，50℃下反应2h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝蛋白酶0.8g，55℃下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至90℃，保持15min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.45μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

实施例2

小分子多肽按照以下步骤制备而成：

1)将100g蚯蚓浸泡于300ml浓度1％的甲基纤维素溶液中，45min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于200ml纯净水中，用高速剪切机在8000rpm条件下剪切3min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.2％，再加入比活为2500U/g的胃蛋白酶0.4g，36℃下反应2h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.7，加入比活为30000U/g的中性蛋白酶0.4g，48℃下反应2h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为400000U/g的菠萝蛋白酶0.5g，54℃下反应3h，得菠萝蛋白酶解液；升温至88℃，保持10min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.4μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

实施例3

小分子多肽按照以下步骤制备而成：

1)将100g蚯蚓浸泡于500ml浓度2％的甲基纤维素溶液中，60min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于500ml纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切10min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.4％，再加入比活为4000U/g的胃蛋白酶0.5g，38℃下反应5h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.9，加入比活为60000U/g的中性蛋白酶0.8g，52℃下反应3h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝蛋白酶1.5g，56℃下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至92℃，保持20min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

对比例1

与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤2)的胃蛋白酶水解，步骤1)后即为步骤3)。

对比例2

与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤3)的中性蛋白酶水解，步骤2)后即为步骤4。

对比例3

与实施例1相比，区别仅在于，不进行步骤4)的菠萝蛋白酶水解，步骤3)后即为步骤5)。

实验例1：多肽分子量的测定

检测方法：通过凝胶层析法测定分子量，试验过程中选用0.1mol/L的Tris-HCl洗脱液平衡处理SPhedexG-25凝胶柱后，在220nm的波长下，检测浓度为2mg/ml的标准物质：还原性谷胱甘肽(307Da)、缩宫素(1007Da)、胰高血糖素(3485Da)、和胰岛素(5808Da)，根据标准物质分子量对数和洗脱体积，拟合得回归方程为：y＝-39.865x+203.53(R²＝0.9917)；其中，y为洗脱体积，x为相应分子量的对数值。

将各实施例和对比例所得多肽分别配置为浓度为5mg/ml，在上述条件下分别进样洗脱，将出峰体积带入标准曲线，即可得样品分子量及其分布范围，通过峰面积归一法，确定不同分子量蛋白肽的相对百分含量，所得结果如表1所示。

表1：多肽分子量分布

	≥3000Da	3000～1000Da	1000～300Da	＜300Da
					实施例1	--	1.9％	55％	43.1％
实施例2	--	5.7％	51.1％	43.2％
					实施例3	--	2.4％	54.8％	42.8％
对比例1	34.1％	24.6％	26.3％	15％
					对比例2	23.5％	26.7％	28.4％	21.4％
对比例3	14.8％	32.6％	35.8％	16.8％

由表1可知，本发明提供的小分子多肽中，95％左右的分子量小于1000Da。

实验例2：自由基清除测定

试验原理：DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其孤对电子在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有机清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。

试验方法：取各实施例和对比例所得多肽配置成浓度相同的溶液，将溶液2mL和浓度为100μmoL/L的DPPH溶液2mL先后加入同一具塞试管中，摇匀；室温下静置30min，于517nm波长下测定样品吸光度。抑制率的计算方法为：K％＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％；其中，Ai：2mLDPPH溶液+2mL待测品溶液的吸光度，Aj：2mL待测品溶液+2mL溶剂的吸光度，Ac：2mL DPPH溶液+2mL溶剂的吸光度。测试时，将待测品统一稀释浓度为0.1％(w/v)。

检测结果：见表2。

表2：DPPH的清除率(％)

	清除率(％)
		实施例1	85.3
实施例2	78.5
		实施例3	80.4
对比例1	51.4
		对比例2	58.7
对比例3	63.0

由表2结果可知，本发明提供的小分子多肽具有较高的抗氧化活性，且效果优于各对比例。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种具有清除自由基功能的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将蚯蚓浸泡于浓度0.1～5％的甲基纤维素溶液中，排净沙土后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于纯净水中，分散成匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其浓度为0.2～0.4％，再加入胃蛋白酶，36～38℃下充分酶解后，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.7～6.9，加入中性蛋白酶，48～52℃下充分酶解后，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入菠萝蛋白酶，54～56℃下充分酶解后，得菠萝蛋白酶解液；升温至88～92℃使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量量为4-5kD的超滤膜超滤，所得滤液脱苦脱色，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

2.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤1)所述将蚯蚓分散成匀浆液的设备为高速剪切机，高速剪切机的转速为300～12000rpm，剪切时间为0.5～20min。

3.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤2)所述胃蛋白酶的比活为2500～4000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.3～0.5％。

4.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤3)所述中性蛋白酶的比活为30000～60000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.4～0.8％。

5.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤4)所述菠萝蛋白酶的比活为400000～800000U/g，其加入量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.5～1.5％。

6.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，步骤5)所述脱苦脱色具体为：所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后，过滤除去活性炭。

7.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将蚯蚓浸泡于质量体积比1:2～5的0.5～2％甲基纤维素溶液中，30～60min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于质量体积比1:2～5的纯净水中，用高速剪切机在6000～8000rpm条件下剪切3～10min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.2～0.4％，再加入比活为2500～4000U/g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.3～0.5％，36～38℃下反应2～5h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.7～6.9，加入比活为30000～60000U/g的中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.4～0.8％，48～52℃下反应2～3h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为400000～800000U/g的菠萝蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.5～1.5％，54～56℃下反应3～5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至88～92℃，保持10～20min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.4～0.5μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为4-5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌1～3h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

8.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于，所述小分子多肽由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将蚯蚓浸泡于质量体积比1:2的0.5％甲基纤维素溶液中，30min后，将蚯蚓清洗干净后，浸泡于质量体积比1:3的纯净水中，用高速剪切机在6000rpm条件下剪切3min，得匀浆液；

2)在步骤1)所得匀浆液中加入盐酸，使其终浓度为0.4％，再加 入比活为3500U/g的胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.3％，37℃下反应3h，得胃蛋白酶解液；

3)将步骤2)所得胃蛋白酶解液的pH值调至6.8，加入比活为50000U/g的中性蛋白酶，所述中性蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.5％，50℃下反应2h，得中性蛋白酶解液；

4)维持步骤3)所得中性蛋白酶解液的pH值不变，加入比活为800000U/g的菠萝蛋白酶，所述菠萝蛋白酶的质量为步骤1)所述蚯蚓质量的0.8％，55℃下反应5h，得菠萝蛋白酶解液；升温至90℃，保持15min，使酶灭活，得酶解液；

5)将步骤4)所得酶解液用0.45μm的滤膜抽滤，再用截留分子量为5kD的超滤膜超滤，所得滤液中加入活性炭，室温低速搅拌2h后过滤除去活性炭，真空浓缩，喷雾干燥，即得小分子多肽。

9.权利要求1～8任意一项所述小分子多肽在制备化妆品、食品、保健品或药品中的应用。