KR102427855B1

KR102427855B1 - 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102427855B1
Application number: KR1020210077563A
Authority: KR
Inventors: 최윤출; 최강민; 이미은; 추영무; 고탁
Original assignee: 최윤출; (주)히원
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2022-08-04
Also published as: WO2022265335A1

Abstract

본 발명에 따른 저분자량의 세리신은 피부에 적용 시 흡수 효율을 높일 수 있으며, 특히 항산화 효과와 티로시나제의 저해 효과가 우수하기 때문에 피부 탄력을 유지시키는 엘라스틴 및 콜라겐의 분해를 근본적으로 저해할 수 있다.
또한 상기 세리신은 필수 아미노산 중 트립토판을 제외한 모든 필수 아미노산을 함유하고 있기 때문에 화장품 이외에도 창상 피복제나 식품류에도 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물{A manufacturing method of silk sericin of small molecule and cosmetic composition containing thereof}

본 발명은 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 효소 분해 시 분해조건을 제어하여 3 kDa 이하의 저분자량 세리신을 수득함으로써 피부 흡수율을 향상시키고 미백, 항산화능을 개선한 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

누에고치에 생산되는 실크는 고순도의 천연단백질원으로 섬유를 이루는 피브로인과 그를 감싸며 접착시키는 아교질의 세리신으로 구성된다. 이 중에서 세리신은 누에고치를 뜨거운 물에 담그면 녹아 나오는 것으로, 대체로 피브로인과 비슷 한 아미노산의 조성을 가지나, 글리신, 알리닌 및 티로신의 함유량이 적고 세린과 산성아미노산의 함유량이 많다. 고압정련방법에 의하여 얻어지는 세리신의 분자량은 대체로 30,000 내지 100,000으로 그 분자량의 분포가 매우 넓다.

세리신은 고치실 중량의 약 30%인데, 견직물의 정련공정에서 불필요한 성분으로 용해시켜 폐기되어 왔다. 이러한 세리신의 주요 아미노산은 Serine 33%, Glycine 17%, Threonine 9%, 아스파라긴산 19% 등으로 친수성이 풍부하고 보습성과 생체친화성이 우수하여, 피부에 좋은 천연소재로 섬유제품, 로션, 린스, 크림 등 기초화장품, 속눈썹, 아토피완화, 자외선차단 등 스킨케어제품에 이용이 확대되고 있으며, 최근 티로시나제의 활성억제, 지질의 과산화방지, 세포증식 촉진, 산소안정화 효과가 밝혀져 세포배양용 시약과 효소 안정화제 등 의료분야에서도 세리신의 새로운 용도 확대가 기대되고 있다.

그러나 세리신은 그 분자량이 매우 높기 때문에 수용액의 상태에서는 겔화가 쉽게 일어나고, 또한 동결 건조시키는 경우에는 용해도가 현저히 감소하는 현상을 보이므로, 이러한 이유로 지금까지 그 산업적인 이용이 활성화되지 못하고 있다.

따라서, 이러한 문제점을 해소하기 위해서는 무엇보다도 세리신의 저분자화가 필수적이다. 최근까지 효소가수분해방법이 세리신의 저분자화에 가장 효율적인 방법으로 알려지고 있는데, 이 방법은 실크 단백질 용액에 효소를 직접 첨가하여 세리신의 고분자량을 저분자량으로 분해하는 방법이다. 일반적으로 효소가수분해방법은 효소의 반응특이성에 의하여 특정부위에서만 절단이 일어난다는 점과 환경친화적이라는 점에서 다른 방법에 비하여 그 우수성이 인정되고 있다.

그러나, 세리신은 구성하는 단백질이 단일 종류가 아닌 여러 종류가 혼합되어 형성된 물질로 추출 시 추가적인 가수분해로 인하여 새로운 단백질이 형성되므로 실제 생리활성에 관여하는 세리신 단백질을 분리하는 것이 어려우며, 무엇보다도 분해 후에도 분자량이 크기 때문에 사용처가 제한될 수밖에 없는 문제점을 가진다.

대한민국 공개특허 제10-2010-0123514호 (2010년 11월 24일)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 상세하게는 효소 분해 시 분해조건을 제어하여 3 kDa 이하의 저분자량 세리신을 수득함으로써 피부 흡수율을 향상시키고 미백, 항산화능을 개선한 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태는,

a) 실크 원사를 정련액으로 정련하여 피브로인 섬유와 세리신을 분리하는 단계; 및

b) 분리된 세리신을 효소 조성물과 혼합하여 저분자량의 세리신을 제조하는 단계;

를 포함하며,

상기 저분자량의 세리신은 3 kDa 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 세리신의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 a) 단계는 90 내지 150℃에서 10 내지 120분간 진행할 수 있으며, 이때 상기 정련제는 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨 및 수산화나트륨에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 알칼리제; 비누; 차아황산나트륨, 황산칼슘 및 황산마그네슘에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 황산염; 및 용매;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 상기 효소 조성물은 서브틸리신 또는 이의 유도체와 용매의 혼합물일 수 있으며, 농도가 1 내지 30 중량%, pH가 5 내지 9일 수 있고 상기 b) 단계는 30 내지 70℃의 온도에서 1 내지 24시간 동안 진행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 제조방법에 따라 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 화장료 조성물은 유칼립투스(Eucalypus), 페퍼민트(Peppermint), 그레이프프루츠(Grapefruit), 네롤리(Nenolri), 니아룰리(Niaouli), 라벤더(Lavender), 라임(Lime), 레몬(Lemon), 레몬그래스(Lemongrass), 멜리사(Melissa officinalis), 로즈마리(Rosemary), 로즈우드(Rosewood), 마조람(Majoram), 만다린(Citrus madurensis), 머틀(Myrtle), 미르(Myrrh), 바질(Basil), 버베나(Verbena), 버취(Birch), 베르가못(Bergamot), 베이(Bay), 안식향(Benzoinum), 사이프러스(Cypress), 샌달우드(Sandaiwood), 시나몬(Cinnamon), 시더우드(Cedarwood), 시트로넬라(Citronella), 오렌지스윗(Orange sweet), 일랑일랑(Ylang ylang), 자스민(Jasmine), 제라늄(Geranium), 쥬니퍼베리(Juniper berry), 진저(Ginger), 카모마일(Chamomile), 캠퍼(Camphor), 클라리세이지(Clary sage), 타임(Thyme), 탠저린(Tangerine), 티트리(Tea tree), 팔마로사(Paimarosa), 패?Z리(Patchouli), 페티그레인(Petitgrain), 프랭킨센스(Frankincense), 펜넬(Fennel), 히솝(Hyssop), 녹차(Green tea), 생강(Ginger), 감초(Chinese Liquorice), 오미자(Schisandra), 황련(Coptis), 알로에베라(Aloe vera) 및 브로콜리(Broccoli)에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 정유 성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 저분자량의 세리신은 피부에 적용 시 흡수 효율을 높일 수 있으며, 특히 항산화 효과와 티로시나제의 저해 효과가 우수하기 때문에 피부 탄력을 유지시키는 엘라스틴 및 콜라겐의 분해를 근본적으로 저해할 수 있다.

또한 상기 세리신은 필수 아미노산 중 트립토판을 제외한 모든 필수 아미노산을 함유하고 있기 때문에 화장품 이외에도 창상 피복제나 식품류에도 효과적으로 사용할 수 있다.

도 1은 제조예 1을 통해 제조된 정련된 세리신의 분자량 분포를 도시한 것이다.
도 2는 제조예 1을 통해 제조된 정련된 세리신(a)과 시판 세리신(b)의 분자량 분포를 도시한 것이다.
도 3은 실시예 1에 따른 pH별 세리신의 가수분해 활성도를 도시한 것이다.
도 4는 실시예 2에 따른 온도변화별 세리신의 가수분해 활성도를 도시한 것이다.
도 5는 실시예 3에 따른 가수분해시간별 세리신의 가수분해 활성도를 도시한 것이다.
도 6은 실시예 4에 따른 효소 농도별 세리신의 가수분해 활성도를 도시한 것이다.
도 7은 실시예 5 중 alcalase 및 flavourzyme의 세리신 가수분해물 분자량 분포를 도시한 것으로, 왼쪽은 Tris-Glycine SDS-PAGE 상에서의 분자량 분포, 오른쪽은 Tris-Tricine SDS-PAGE 상에서의 분자량 분포를 도시한 것이다.
도 8은 실시예 6 중 alcalase 및 flavourzyme의 세리신 가수분해물 분자량 분포를 도시한 것으로, 왼쪽은 Tris-Glycine SDS-PAGE 상에서의 분자량 분포, 오른쪽은 Tris-Tricine SDS-PAGE 상에서의 분자량 분포를 도시한 것이다.

이하, 실시예 및 비교예를 들어 본 발명에 따른 저분자량 실크 세리신의 제조방법 및 이로부터 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물을 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 구체예들은 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다.

따라서 본 발명은 이하 제시되는 구체예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 이하 제시되는 구체예들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 기재된 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 발명에서 용어 ‘실크 원사’는 곤충각(Insectada), 인시목(lepidoptera), 가잠아과(Bombyxidae), 가잠아속(Bombyx), 가잠종(mori)에 속하는 곤충인 누에가 생산한 생사를 의미하는 것으로, 구체적으로는 일정 정도의 정련과정을 통해 얻어진 정련견을 의미하며, 주로 대부분의 불순물과 일부의 세리신이 제거된 것을 뜻한다.

본 발명에 따른 저분자량 실크 세리신의 제조방법은,

를 포함하여 진행하는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 견, 면, 양모 등과 같은 천연섬유는 섬유 성분 이외에 불순물을 포함하고 있다. 이러한 불순물 등은 염색가공처리에 앞서 제거해 주어야 하는데, 특히 견섬유의 정련(Degumming)은 섬유상의 세리신을 제거함과 동시에 왁스 성분, 지방산 색소, 무기물 등, 소위 1차 불순물과 연사 및 제직할 때에 이용되는 유제, 호제 등 2차 불순물을 제거해 주어야 한다.

실크라고도 불리는 견섬유는 생사의 전체 중량의 약 75%를 차지하는 피브로인(fibroin)과 약 25%를 차지하는 세리신(Sericin, Silk glue)으로 구성된 소위 이상구조(二相構造) 섬유이며, 피브로인은 미세구조상 마이크로피브릴(microfibril), 피브릴(fibril)의 단계로 구성되는 고차구조를 가지고 있다. 난용성의 섬유상 단백질인 피브로인은 섬유로서의 역할을 하며, 이용성의 비섬유상 단백질인 세리신은 내부의 피브로인을 보호하고 각각의 섬유를 접속하는 역할을 한다.

물에 비교적 잘 녹는 단백질인 세리신이 그대로 잔류하고 있는 생사는 다소 뻣뻣하고 거친 촉감을 나타내므로 노방 등에 많이 사용되고 있으나, 세리신은 비섬유상 단백질로 그 구조가 치밀하지 못하고 세탁, 땀, 마찰 등 외부 충격에 약하기 때문에 사용상 많은 문제점이 나타나고 있다. 따라서 이러한 세리신은 일반적으로 정련공정에 의하여 제거한 후 피브로인만을 섬유 형태로 가공하여 사용하게 된다.

본 발명에서 상기 실크 원사는 생사로도 불리며 누에고치에 일정 정도의 정련을 가하여 섬유화한 것으로, 누에고치에서 세리신이 완전히 제거되지 않고 일부 남아있는 것을 뜻한다. 상기와 같은 실크 원사는 정련에 의해 완숙된 것이 아니기 때문에 잔존하는 세리신에 의해 모시와 비슷하게 다소 굵고 빳빳하며 시원한 질감을 가진다.

상기와 같은 실크 원사는 누에고치를 직접 정련하여 세리신을 추출하는 경우에 비해 여러 장점을 가진다. 먼저, 누에고치에는 세리신 이외에도 여러 아미노산이나 불순물이 있는 경우가 대부분이나, 상기와 같은 불순물은 누에고치를 정련하여 실크 원사를 생산하는 과정에서 제거되기 때문에 순수한 세리신만을 얻을 수 있다. 또한 정련액 중에서 세리신 전체가 팽윤되어 용해되는 과정에서 세리신 전체의 용출이 일어나기 전에 정련을 마침으로써 잔류하는 세리신이 불안정하고 불균일하게 피브로인에 잔존하게 되며, 이 과정에서 세리신의 일부 가수분해가 발생했기 때문에 추후 효소에 의한 세리신의 가수분해 시 저분자량이면서도 분자량 분포가 좁은 세리신을 쉽게 수득할 수 있다.

상기 실크 원사의 정련법으로는 일반적으로 알칼리 상태에서 실시되는 화학정련과 효소정련으로 구분되며, 구체적으로는 비누정련법, 알칼리 정련법, 비누/알칼리 정련법, 효소정련법, 산 정련법 등을 들 수 있다.

상기 비누정련법은 보통 최초로 40℃ 전후의 열탕에 견직물을 30분간 침지하여 전처리 한 후 15 내지 20% owf(on the weight of fiber)의 비누용액에 97 내지 99℃에서 2시간 정도 정련하고 정련의 정도에 따라 재정련하며, 1% owf의 탄산나트륨용액 80 내지 90℃, 10 내지 15분간 마무리 정련을 하고, 마지막으로 0.5% owf의 탄산나트륨 용액 50 내지 60℃에서 처리한 후, 충분히 수세하는 것으로 이루어진다.

상기 알칼리 정련법은 무수 탄산나트륨, 규산 나트륨, 메타 규산 나트륨, 수산화나트륨, 무수 제2인산나트륨, 각종 축합 인산나트륨, 알칼리성 나트륨등을 알칼리 정련제로 하여 시료의 40 내지 50배의 무수 탄산나트륨 5 내지 10% owf 용액 중에 생견을 침지하고, 95 내지 99℃에서 2 내지 3시간 정련한 후 정련의 정도에 따라 재정련하고 40 내지 50℃의 온탕으로 수차에 걸쳐 충분히 수세하여 진행한다.

상기 비누/알칼리 정련법은 비누정련과 알칼리 정련법의 장점만 살린 정련법으로 마르세이유 비누와 알칼리성 나트륨을 사용하는 가장 일반적인 방법이다. 사용되는 약제로는 비누 4 내지 8 중량%, 규산소다, 비이온 계면활성제 각각 1 중량%, 하이드로설파이드 1 중량%, EDTA 1 중량%, 트리폴리 인산소다 0.5 중량% 등이며 욕비 1 : 15로 95 내지 98℃에서 약 2시간 정련하며, 꼬임이나 정련의 정도에 따라 재정련을 행한다. 정련 후 0.5 내지 1 중량% 농도의 탄산소다용액으로 1회 세척한 후 50℃의 물로 수 회 충분히 세척하여 진행한다.

상기 효소 정련법은 단백질 분해 효소를 생견 정련에 응용한 것으로 일반적으로 다음 3단계를 통해 처리한다. 먼저 전처리 공정으로 0.03 중량%의 비누와 0.015 중량%의 탄산소다 용액에 생견을 침지하여 90 내지 95℃에서 15분간 처리한 후 40 내지 60℃의 온수로 세정한 후 효소처리 단계로 파파인(papain) 효소를 0.2 내지 0.3 중량% 용액으로 하여 파파인의 2배량의 하이드로 설파이드와 비이온활성제 1cc/ℓ를 첨가하여 75 내지 80℃에서 1 내지 2시간 처리한 후 다시 0.03 중량%의 비누와 0.015 중량%의 탄산소다 용액에 생견을 침지하여 90 내지 95℃에서 15분간 처리한 후 40 내지 60℃의 온수로 수차에 걸쳐 수세하여 정련을 마친다.

상기 산 정련법은 세리신을 완전히 정련하지 않고 일부만 제거하여 견의 촉감 및 물성을 변화시키기 위한 정련법으로 3부정련, 5부정련, 7부정련 등으로 나누고, 사용되는 정련제로는 맥클베인(Mcllvain) 완충액 (0.1M 구연산과 0.2M 인산수소 2나트륨 혼합액)으로 pH 2 내지 12로 맞추고 10 내지 60분간 처리하면 필요로 하는 정련율을 얻을 수 있다.

본 발명에서 상기 a) 단계는 상기와 같은 정련법 중 비누/알칼리 정련법을 적용하는 것이 좋으며, 구체적으로 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨 및 수산화나트륨에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 알칼리제; 비누; 차아황산나트륨, 황산칼슘 및 황산마그네슘에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 황산염; 및 용매;를 포함하는 정련액에 실크 원사를 투입하여 진행할 수 있다.

이때 상기 정련액은 알칼리제의 농도를 15 내지 25% owf로, 비누를 5 내지 15% owf로 하는 것이 좋으며, 황산염은 0.01 내지 5% owf의 비율로 첨가하는 것이 바람직하다.

일반적으로 단백질 같은 고분자 전해질은 적당한 저농도의 염이 존재하면 물에 대한 용해도가 증가하는데 이를 염해(salting-in)라 한다. 이 현상은 고분자 전해질이 갖는 해리기와 용액에 공존하고 있는 염이온 사이의 정전기적인 상호작용에 의한 것으로 이를 이용해 효에 의한 가수분해 시 발생하는 단백질의 응집현상을 해소할 수 있다.

이때 염해를 위한 염으로는 다가의 음이온도 사용 가능하나, 단백질이 변성되지 않으면서도 염의 용해도가 온도에 의해 영향을 받지 않으며, 염에 의해 효소의 활성이 저해되지 않는 점 등을 고려할 때 황산염이 가장 바람직하다.

본 발명에서 상기 a) 단계는 90 내지 150℃에서 10 내지 120분간 진행하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 110 내지 130℃에서 10 내지 60분간 진행하는 것이 세리신의 분리 효율을 높이면서도 피브로인 원사의 물성에 영향을 주지 않아 바람직하다.

상기 a) 단계는 처리 장치 등을 한정하지 않으며, 일예로 고온의 처리를 위해 내부를 가열 가능한 챔버에 실크 원사와 정련액을 투입하고 상기와 같은 조건에서 진행하는 것이 바람직하다. 또한 정련이 끝난 후에는 정련액을 한외여과막 등의 여과장치나 여과지 등에 통과시켜 고액 분리하는 것이 바람직하다. 이때 가수분해 대상인 세리신은 불용성의 세리신이 아닌 가용성의 세리신을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 b) 단계는 상기와 같이 분리된 가용성의 세리신 용액에 효소 조성물을 혼합하고 가수분해를 진행하여 저분자량의 세리신을 수득하는 단계이다.

본 발명에서 상기 효소 조성물은 기본적으로 단백질인 세리신을 분해할 수 있는 단백질 분해효소로, 상기 단백질 분해효소는 일반적으로 특정 기질의 특정 반응만을 촉진하는 기질특이성을 가지고 있으며, 효소의 작용에 영향을 미치는 인자는 크게 온도와 pH로 나눌 수 있다.

효소의 작용은 다른 화학반응과 같이 온도의 상승과 더불어 반응속도가 증대되나, 효소는 그 소재가 단백질이기 때문에 변성이 시작되는 온도를 경과하면 반응 속도는 급격히 저하하며 마침내는 응고하여 활성을 잃게 된다. 이때 최대 반응속도를 가질 때의 온도를 최적온도라고 한다. 그리고 효소는 단백질이므로 그의 성질은 pH에 따라 영향을 받는다. 예를 들어 극단적인 산성 또는 알칼리성이 되면 변성하여 그 활성을 완전히 상실한다.

따라서 본 발명에서의 가수분해는 사용하는 효소와 함께 반응 온도, 반응 시간, 반응 pH 등의 조건들을 최적화함으로써 상술한 3 kDa 이하의 분자량을 갖는 세리신을 갖는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 단백질 분해효소는 엔도형(endo type)의 Protease와 엑소형(exo type)의 aminopeptidase로 단백질을 분해하는 방법으로 분류되고 있다. 효소의 active site에 존재하는 아미노산의 기능에 따라 Serine protease, thiol (cysteine) protease, Aspartyl protease 등으로 분류되기도 한다. 단백질 분해효소를 생성하는 생물체에 따라 Bacterial protease와 Fungal protease로, 반응조건인 pH에 따라 acidic, neutral, alkaline protease로도 구분되고 있으며 각각의 특이성이 다른 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 효소는 기본적으로 고분자량의 세리신 주쇄를 가수분해하여 저분자량화하는 것으로, 여러 효소를 사용할 수도 있으나, 기본적으로 펩티드 결합의 가수분해를 촉진할 수 있는 세린 프로테아제나 이들의 하위 그룹일 수 있다.

구체적으로 상기 세린 프로테아제는 서브틸리신(subtilisin)일 수 있다. 상기 서브틸리신은 세린 프로테아제의 하위 그룹으로, 문헌[Siezen etal., Protein Engng. 4 (1991) 719-737]; 및 [Siezen et al., Protein Science 6 (1997) 501-523]에 정의된 바와 같은 I-S1 및 I-S2 하위 그룹을 포함하거나, 바람직하게는 상기 I-S1 및 I-S2 하위 그룹으로 이루어진다. 세린 프로테아제의 활성 부위의 고도로 보존된 구조로 인하여, 본 발명에 따른 서브틸리신은 Siezen etal.(상기함)에 의하여 서브틸라제로 지정된 제안된 하위 그룹과 기능적으로 동등할 수 있다.

상기 서브틸리신은 화학적으로 또는 유전자가 변형된 돌연변이체(단백질 조작 변이체)나 유도체를 포함할 수 있으며, 동물, 식물 또는 미생물 기원을 가질 수 있다. 이러한 서브틸리신의 예로는 바실러스(Bacillus), 예컨대 서브틸리신 노보(Novo), 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg), 서브틸리신 BPN', 서브틸리신 309, 서브틸리신 147 및 서브틸리신 168(WO 제89/06279호에 기술되어 있음) 및 프로테아제 PD138(WO 제93/18140호)로부터 유래하는 것으로 구체적인 예로는 WO 제98/020115호, WO 제01/44452호, WO 제01/58275호, WO 제01/58276호, WO 제03/006602호 및 WO 제04/099401호에 기술되어 있다. 기타 다른 예로는 WO 제92/19729호, WO 제98/20115호, WO 제98/20116호, WO 제98/34946호, WO 제2011/036263호에 기술된 변이체 및 프로테아제의 혼합물이 있다.

또한 상업적으로 수득 가능한 서브틸리신의 예로는 Kannase™, Everlase™, Relase™, Esperase™, Alcalase™, Durazym™, Savinase™, Ovozyme™, Liquanase™, Coronase™, Polarzyme™, Pyrase™, 췌장 트립신 노보(Pancreatic Trypsin NOVO: PTN), Bio-Feed™ Pro 및 Clear-Lens™ Pro; Blaze(모두 Novozymes A/S(덴마크 백스베어드 소재)로부터 입수가능함)를 포함할 수 있으며, 기타 다른 상업적으로 입수가능한 서브틸리신은 Ronozyme™ Pro, Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Opticlean™, Properase™, Purafast™, Purafect™, Purafect Ox™, Purafact Prime™, Excellase™, FN2™, FN3™ 및 FN4™(Genencor International Inc., Gist-Brocades, BASF, 또는 DSM으로부터 입수가능함)를 포함할 수 있다. 또한 기타 다른 예로는 Primase™ 및 Duralase™, Blap R, Blap S 및 Blap X(Henkel로부터 입수가능함)가 있다.

상기 서브틸리신은 상기 가용성 세리신 100 중량부에 대하여 1 중량부 이상이거나 조성물 100 중량% 중 1 내지 30 중량%의 비율로 첨가하는 것이 바람직하다. 서브틸리신과 같은 효소의 경우 농도의존적으로 가수분해 효과가 증가하기 때문에 상기와 같이 1 중량부 이상 첨가되는 것이 좋으며, 1 중량부 미만 첨가되는 경우 상술한 가수분해 효과가 미비할 수 있다.

또한 상기 효소 조성물은 상술한 서브틸리신 이외에도 추가적으로 제2효소를 더 포함하여 가수분해 효과를 더욱 높일 수 있다. 이러한 효소의 예를 들면 리파제, 큐티나제, 아밀라제, 카르보하이드라제, 셀룰라제, 펙티나제, 펙테이트 리아제, 만나나제, 아라비나제, 갈락타나제, 자일라나제, 옥시다제, 락카제 및 퍼옥시다제 등이 있으며, 이들은 단독으로 또는 둘 이상 혼합하여 사용하여도 좋다.

본 발명에서 상기 b) 단계는 액상의 가용성 세리신과 효소 조성물을 반응기에 투입하되, 반응기의 온도와 조성물의 pH, 반응시간을 조절하여 효소가 활성 상태를 유지할 수 있는 조건으로 맞춰야 한다. 따라서 일단 반응기의 내부 온도를 30℃, pH를 7 내외로 조절한 후, 세리신과 효소 조성물을 투입하고 반응을 진행하는 것이 바람직하다.

구체적으로 상기 b) 단계는 효소의 종류에 따라 다르나, pH가 5 내지 9, 더욱 바람직하게는 7 내지 9인 것이 좋으며, 온도는 30 내지 70℃, 더욱 바람직하게는 55 내지 65℃인 것이 좋다. 또한 반응시간은 1 내지 24시간 동안, 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2.5시간인 것이 효소의 활성을 제어할 수 있어 바람직하다.

본 발명은 상기와 같은 제조방법으로 제조된 저분자량의 세리신과, 상기 저분자량의 세리신을 함유하는 화장료 조성물을 포함할 수 있다. 이때 상기 저분자량의 세리신은 3 kDa 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다. 이 때문에 용매에 대한 용해도가 우수하여 다른 화장료 성분과의 혼화성이 높으며, 추가적으로 낮은 분자량으로 인해 피부로의 흡수력이 우수한 특징을 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 세리신 이외에 목적을 해치지 않는 범위 내에서 다양한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 이러한 첨가제의 예로는 다당류 폴리머, 정유(oil) 성분, 보습제, 증점제, 식물 추출물, 용매 등을 들 수 있다.

상기 다당류 폴리머는 증점제와 유사하게 조성물의 점도를 유지시켜주며, 특히 세리신의 용해성을 높이는 효과를 가진다. 대표적인 다당류 폴리머 중 하나인 잔탄검은 수용성 고분자로, 포도당이나 옥수수 시럽에서 추출되는 물질이다. 잔탄검은 우수한 내열성과 내산성을 가지고 있으며, 일반적인 증점제가 산 또는 알칼리 물질이 공존하면 점도가 저하되는 데 반해 잔탄검은 pH에 의한 점도 변화도 거의 없다.

상기 잔탄검 이외에도 셀룰로오스 검, 알긴산 등의 다당류 폴리머가 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 다당류 폴리머는 고분자 세리신의 용해와 동시에 제형의 점도까지 조절 가능하므로 O/W형 에멀전 제형을 제조하는 데 있어 매우 유용하게 사용될 수 있다.

구체적으로 본 발명에 사용되는 상기 다당류 폴리머는 검류, 알긴산, 알긴산나트륨, 알긴산칼슘, 전분, 한천 카라기난, 셀룰로오스계 고분자, 젤란(Gellan), 펙틴, 덱스트란(Dextran), 글루칸(Grucan), 글루코만난(Glucomannan), 아라비노갈락탄(Arabino Galactan), 퍼셀레란(Furcelleran), 풀루란(Pullulan), 글루코사민(Glucosamine) 및 젤라틴(Gelatin)으로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 검류는 잔탄검, 디하이드로잔탄검(Dehydroxanthan Gum), 셀룰로오스 검, 하이드롤라이즈드 셀룰로오스 검(Hydrolyzed Cellulose Gum), 카라기난검, 구아검, 벤조인나무검(Styrax Benzoin Gum), 스클레로튬검(Sclerotium Gum), 바이오사카라이드검(Biosaccharide Gum), 아라비아검(ARABIC GUM), 로커스트콩검(LOCUST BEAN GUM), 타마린드검(TAMARIND GUM), 가티검(GHATTI GUM), 캐럽콩검(Ceratonia Siliqua Gum), 트래거캔스고무(Astragalus Gummifer Gum), 하이드롤라이즈드 라이조비안 검(Hydrolyzed Rhizobian Gum), 스크레로티움 검(Sclerotium Gum) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 셀룰로오스계 고분자는 칼슘 카르복시메틸 셀룰로오스(Calcium Carboxymethyl Cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트(Carboxymethyl Cellulose Acetate Butyrate), 카르복시메틸 하이드록시에틸 셀룰로오스(Carboxymethyl Hydroxyethylcellulose), 셀룰로오스 아세테이트(Cellulose Acetate), 셀룰로오스 아세테이트 부티레이트(Cellulose Acetate Butyrate), 셀룰로오스 아세테이트 프로피오네이트(Cellulose Acetate Propionate), 셀룰로오스 아세테이트 프로피오네이트 카르복실레이트(Cellulose Acetate Propionate Carboxylate), 셀룰로오스 숙시네이트(Cellulose Succinate), 세틸 하이드록시에틸셀룰로오스(Cetyl Hydroxyethylcellulose), 에틸셀룰로오스(Ethylcellulose), 하이드록시부틸 메틸셀룰로오스(Hydroxybutyl Methylcellulose), 하이드록시에틸셀룰로오스(Hydroxyethylcellulose), 하이드록시에틸 에틸셀룰로오스(Hydroxyethyl Ethylcellulose), 하이드록시프로필셀룰로오스(Hydroxypropylcellulose), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl Methylcellulose), 메틸셀룰로오스(Methylcellulose), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 아세테이트/숙시네이트(Hydroxypropyl Methylcellulose Acetate/Succinate), 메틸셀룰로오스(Methylcellulose), 메틸에틸셀룰로오스(Methyl Ethylcellulose), 메틸 하이드로시에틸셀룰로오스(Methyl Hydroxyethylcellulose), 미결정 셀룰로오스(Microcrystalline Cellulose), 포타슘 셀룰로오스 숙시네이트(Potassium Cellulose Succinate), 소듐 셀룰로오스 설페이트(Sodium Cellulose Sulfate) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 정유(oil) 성분은 유효성분으로 폴리페놀과 비타민 C 등을 함유하며, 상기 세리신의 항산화, 미백, 주름개선 등의 효과를 증폭시키는 역할을 한다.

이러한 정유 성분의 예를 들면 유칼립투스(Eucalypus), 페퍼민트(Peppermint), 그레이프프루츠(Grapefruit), 네롤리(Nenolri), 니아룰리(Niaouli), 라벤더(Lavender), 라임(Lime), 레몬(Lemon), 레몬그래스(Lemongrass), 멜리사(Melissa officinalis), 로즈마리(Rosemary), 로즈우드(Rosewood), 마조람(Majoram), 만다린(Citrus madurensis), 머틀(Myrtle), 미르(Myrrh), 바질(Basil), 버베나(Verbena), 버취(Birch), 베르가못(Bergamot), 베이(Bay), 안식향(Benzoinum), 사이프러스(Cypress), 샌달우드(Sandaiwood), 시나몬(Cinnamon), 시더우드(Cedarwood), 시트로넬라(Citronella), 오렌지스윗(Orange sweet), 일랑일랑(Ylang ylang), 자스민(Jasmine), 제라늄(Geranium), 쥬니퍼베리(Juniper berry), 진저(Ginger), 카모마일(Chamomile), 캠퍼(Camphor), 클라리세이지(Clary sage), 타임(Thyme), 탠저린(Tangerine), 티트리(Tea tree), 팔마로사(Paimarosa), 패?Z리(Patchouli), 페티그레인(Petitgrain), 프랭킨센스(Frankincense), 펜넬(Fennel), 히솝(Hyssop), 녹차(Green tea), 생강(Ginger), 감초(Chinese Liquorice), 오미자(Schisandra), 황련(Coptis), 알로에베라(Aloe vera), 브로콜리(Broccoli) 및 감귤(Citrus) 등이 있으며, 이들은 단독으로 또는 둘 이상 혼합하여 사용하여도 좋다.

상기 보습제는 당업계에서 화장료 조성물 제조 시 통상적으로 첨가하는 것이라면 종류에 한정치 않는다. 상기 보습제의 예를 들면, 디프로필렌글리콜(Dipropylene Glycol, D.P.G), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 디프로필렌글리콜(dipropylene glycol) 부틸렌글리콜(butylene glycol), 1,2-헥산디올(1,2-hexanediol), 글리세린(glycerine), 베타인(betaine), 글리세레스-26(Glycereth-26), 솔비톨(sorbitol), 헥실렌글리콜(Hexylene Glycol), 디글리세린(Diglycerin) 및 판테놀(Panthenol)에서 선택되는 하나 이상이 사용될 수 있으며, 디프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,2-헥산디올, 베타인, 판테놀 및 글리세린 등을 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 증점제는 상기 다당류 폴리머와 유사하게 조성물의 점도를 유지하기 위해 첨가하는 것으로, 당업계에서 통상적으로 첨가하는 것이라면 종류에 한정치 않는다. 상기 증점제의 예를 들면, Carbopol 340, 940, 941, 980 등의 카보머(carbomer), 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 및 폴리아크릴산나트륨(sodium polyacrylate) 등을 들 수 있으며, 이들 중 카보머를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 용매는 정수, 정제수, 경수, 연수, 천연수, 해양심층수, 전해 알칼리이온수, 전해 산성이온수, 이온수 및 클러스터수가 사용될 수 있으며, 이들 중 하나 또는 복수를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 성분들 이외에도 당업계에서 통상적으로 첨가하는 다양한 성분들을 더 첨가하여도 좋다. 예를 들어 호호바에스터 등의 에센셜 오일; 에틸헥실글리세린, 소듐히알루로네이트, 알지닌, 카프릴릴글리콜, 바이오사카라이드검-4, 메나디온, 바이오플라보노이드 등의 컨디셔닝제; 계면활성제; 디소듐이디티에이 등의 킬레이트제; 디포타슘글리시리제이트, 폴리글리세릴-10라우레이트, 폴리글리세릴-10미리스테이트, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드, 폴리글리세릴-10디이소스테아레이트, 하이드로제네이티드레시틴 등의 유화제; 색소; 방부제; 향료; 등을 포함할 수 있으며, 이들은 조성물의 용도, 제형 등에 따라 종류 및 첨가량 등을 취사선택하여 첨가할 수 있다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물은 그 제형을 한정하지 않는다. 예를 들어 상기 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 밀크로션, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 및 파우더에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 제형을 포함할 수 있다.

또한 상기 화장료 조성물은 상기 여러 제형 중 마스크팩 형태를 가질 수 있다. 이는 일반적으로 사용하는 수팽윤성 필름 또는 부직포 형태의 시트를 상기 화장료 조성물에 담지시킨 후, 이를 건져내고 포장함으로써 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예들은 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명하기 위한 하나의 예시일 뿐, 본 발명이 하기 실시예들에 제한되는 것은 아니다.

실시예들을 통해 제조된 시편의 물성을 다음과 같이 측정하였다.

(세리신의 분자량)

추출한 세리신 단백질의 분자량 분포도를 확인하기 위해 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)을 이용하였다. 실크 세리신 2%(w/v)를 stock solution으로 제조하기 위해 추출별 동결건조분말 세리신 0.5g에 25 ㎖의 D/W (욕비 1:50)을 첨가하여 70℃에서 30분간 용해시켰다. 이후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 불용성의 세리신을 제외한 상등액을 회수하여 각 세리신에 대한 농도를 정량하여 동량의 세리신(100 ㎍)을 Tris-Tricine SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하여 각 추출별 세리신의 전반적인 분자량 분포를 확인하였다.

(제조예 1)

실크 원사로부터 온도 및 시간별로 고온고압 추출한 실크 세리신의 최적 추출조건을 설정하기 위해 세리신 단백질의 분자량 및 농도를 측정하였다. 추출조건으로는 95℃에서 2시간과 6시간, 120℃에서 30분과 4시간으로 4가지의 조건으로 진행되었다. 조건별 세리신 추출물의 동결건조 분말 0.5 g을 욕비 1:50으로 70℃에서 1시간 교반하여 최대한 용해한 후 3,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 불용성의 세리신을 제외한 상등액을 회수하여 각 세리신에 대한 농도를 정량하였다. 정량 방법은 Pierce BCA Protein Assay kit(ThermoFisher scientific)를 이용하여 단백질 농도를 측정하였으며 세리신 용액의 pH 측정은 SevenEasy pH meter (Mettler Toledo)를 이용하여 그 결과를 표 1에 기재하였다.

[표 1]

상기 표 1과 같이 추출조건별로 보았을 때 세리신 회수량은 95℃에서 6 h과 120℃에서 4 h간 추출하였을 때 22.88 g/ℓ, 22.04 g/ℓ로 가장 높은 회수량을 보여주고 있으나 120℃에서 30 min 조건으로 추출한 세리신(21.92 g/ℓ)과 유의적인 차이는 보이지 않았다. 또한, 추출조건별에 대한 세리신 고유의 pH는 5.6 내지 6.3 범위를 유지하였다. 이를 통해 원료 확보를 위한 최적의 세리신 추출조건은 120℃에서 30 min으로 세리신을 회수하는 것이 에너지 절감 및 시간 절약 면에서 가장 적합할 것으로 판단된다.

도 1은 추출 조건 별 세리신의 분자량 분포를 도시한 것으로, SDS-PAGE 상에서의 분자량 분포 결과, 세리신 단백질은 고유의 밴드형태가 아닌 고온고압에 의한 단백질 열변성 형태의 특징을 보이고 있으며, 분자량 분포로는 120℃에서의 4시간, 95℃에서의 6시간, 120℃에서의 30분, 그리고 95℃에서의 2시간 순으로 열 가수분해로 인한 저분자량을 형성하고 있다. 또한, 고온고압 추출 조건에서는 세리신의 대부분이 10 내지 245 kDa 상에서 존재하였다.

도 2는 120℃, 4시간에서 정련을 진행한 세리신의 분자량과 시판 세리신(중국)의 분자량 분포를 280㎚의 흡광도 세기로 분석한 것으로, 도 2의 (a)와 같이 본 발명에 따라 정련한 세리신은 200 kDa 이상의 분자량을 가지는 세리신의 함량도 많으나, 대부분 10 kDa 이하의 저분자량을 갖는 세리신이 확인되었다. 이에 반해 시판 세리신의 경우 30 kDa 이하의 세리신 함량이 많았으나, 본 발명의 정련 세리신에 비해 10 kDa 이하의 저분자량을 갖는 세리신의 양이 적은 것을 확인할 수 있었다.

(제조예 2)

효소의 종류에 따른 세리신의 가수분해 정도를 확인하기 위해 endopeptidase 타입의 alcalase, esperase, protamax, bromelain, papain, neutrase와 exopeptidase 타입의 flavourzyme 형태로 총 7종을 준비하였다. 이때 세리신은 상기 제조예 1에서 제조된 세리신들 중 120℃, 30분의 조건으로 추출한 세리신을 기질 시료로 사용하였으며, 원심분리 후 불용성 세리신을 제거하고 가용성 세리신을 이용하였다.

효소는 단일효소(alcalase, flavourzyme, esperase, protamax, bromelain, papain, neutrase) 또는 2종 혼합효소(alcalase와 flavourzyme; esperase와 flavourzyme; protamax와 flavourzyme; bromelain와 flavourzyme; papain와 flavourzyme; neutrase와 flavourzyme;)를 사용하였으며 2종 혼합효소의 조합은 endopeptidase와 exopeptidase 형태의 가수분해효소를 조합으로 구성하였다.

가수분해가 끝난 반응물은 85℃에서 10분간 효소를 불활성 시킨 다음 원심분리기(10,000 rpm, 10 min)를 이용하여 상등액을 취하여 진행하였다. 상등액은 D/W로 20배 희석한 후 분광광도계(UV/VIS Nano Spectrophotometer, Nabi, Microdigital)로 세리신의 최대흡수파장인 271 ㎚에서 측정한 흡광도 값을 용해도의 측도로 이용하였다.

(실시예 1)

제조예 2의 효소반응 중 pH의 변화를 최소화하기 위해 1M acetic acid와 평균 26.5% ammonia hydroxide를 사용하여 pH를 조정하였다. 가용성 세리신 1 ㎎에 효소 0.1 ㎎ (세리신 농도의 10%)를 처리하였으며, 온도 50℃, pH(4, 5, 6, 7, 8, 9)별로 8시간 가수분해하여 효소를 불활성 시킨 다음 상등액을 취하여 pH 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 3과 같이 단일효소의 경우 alcalase, esperase, protamax, neutrase는 pH 7 내지 9 부근에서 flavourzyme, papain, bromelain은 pH 6~8 부근에서 높은 활성을 보였다. 2종 혼합효소의 경우 alcalase와 flavourzyme; neutrase와 flavourzyme; papain와 flavourzyme; 및 bromelain와 flavourzyme;은 pH 6 내지 9 부근에서 esperase와 flavourzyme; 및 protamax와 flavourzyme;은 pH 7 내지 9 부근에서 높은 활성을 보이는 것으로 나타났다. 그 중 단일효소는 esperase와 alcalase가 가장 높은 활성을 보였으며 2종 혼합효소 또한 esperase와 alcalase가 혼합된 flavourzyme군에 높은 활성을 보였다.

다만 단일효소가 2종 혼합효소들 보다 약간은 높은 활성을 보이는 것으로 나타났는데 이는 2종 혼합효소들 사이에서의 기질 경쟁이 발생하여 단일효소 보다 활성이 감소되는 것으로 추정된다. 종합적으로 최적의 활성을 보이는 효소는 alcalase와 esperase로서 pH 7 내지 9 범위에서 가장 높은 활성을 보였다.

(실시예 2)

제조예 2의 가용성 세리신 1 ㎎에 효소 0.1 ㎎(세리신 농도의 10%)를 처리하였으며, pH는 7, 온도(30, 40, 50, 60, 70℃)별로 각각 8시간 가수분해하여 효소를 불활성 시킨 다음 상등액을 취하여 온도 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 4와 같이 단일효소의 경우 alcalase, esperase, protamax, papain는 온도 60℃, flavourzyme, bromelain, neutrase은 온도 50℃에서 높은 활성을 보였다. 2종 혼합효소의 경우 alcalase와 flavourzyme; esperase와 flavourzyme; protamax와 flavourzyme; papain와 flavourzyme은 온도 60℃에서 bromelain와 flavourzyme; neutrase와 flavourzyme은 온도 50℃에서 높은 활성을 나타내었다.

또한 온도 변화에 따른 효소 활성의 경우에도 2종 혼합효소 보다 단일효소에서 다소 높은 가수분해 활성을 보여주고 있으며 온도 변화에 따른 세리신 저분자의 최적 효소는 esperase와 alcalase로 확인되었다.

(실시예 3)

제조예 2의 가용성 세리신 1 ㎎에 효소 농도 0.1 mg(세리신 농도의 10%)를 처리하였으며, pH는 7로 고정하되 온도는 실시예 3에서 확인된 효소별 최적 온도로 각각 조절하였으며, 시간(1, 2, 3, 4, 8, 12, 18, 24)별로 가수분해하여 시간 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 5와 같이 단일효소의 경우 효소마다 초기 처리 후 2시간까지는 급격히 가수분해 활성이 증가하였으며 그 후 2시간부터 24시간까지는 완만하게 활성이 증가하는 것을 보여주었다. 2종 혼합효소의 경우 protamax와 flavourzyme; bromelain와 flavourzyme을 제외하고 대부분 24시간까지 계속적으로 가수분해 활성이 증가하는 것을 보여주고 있다. 단일효소의 경우 대부분 2시간 전까지 세리신 가수분해 활성이 상당 부분 일어나며 그 이후 24시간까지 완만한 가수분해 활성을 보였다.

반면, 2종 효소는 24시간까지 계속적으로 가수분해 활성이 유지되고 있는데 이는 2종 효소 간의 기질 경쟁으로 인해 반응 초기에 대부분 가수분해 활성이 일어나는 단일효소에 비해 다소 반응시간이 지연되는 것으로 판단된다. 시간별 효소 가수분해 활성도는 esperase와 esperase+flavourzyme에서 가장 가장 높은 효소 활성을 보이며 다음으로 alcalase와 alcalase+flavourzyme 순으로 나타났으며 적정 반응시간은 4 내지 12시간으로 판단되었다

(실시예 4)

제조예 2의 가용성 세리신 1 ㎎에 효소를 혼합하되 각 효소별로 세리신 농도의 1, 2.5, 5, 10, 20, 30%로 조절하여 투입하였으며, pH는 7로 고정하되 온도는 실시예 3에서 확인된 효소별 최적 온도로 각각 조절하였으며, 8시간 동안 가수분해하여 효소를 불활성 시킨 다음 상등액을 취하여 효소 농도변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 6과 같이 단일효소의 경우 모든 효소들이 농도 1% 이후부터 농도의존적으로 점차적인 활성의 증가를 보이고 있으며 esperase와 alcalase 경우에는 농도 10%에서는 더욱 급격한 활성 증가를 보였다. 이는 단백질의 열안정성과 관계가 있는 것으로 보이며 장시간의 반응속에서 단백질의 활성은 감소하기 마련이지만 esperase와 alcalase는 장시간 반응에서도 열안전성이 다른 효소에 비해 높은 것으로 추정된다. 2종 혼합효소의 경우도 단일효소의 경우와 마찬가지로 효소농도 1% 이후부터 농도의존적으로 점차적인 증가를 보이고 있으며 특히 esperase+flavourzyme은 10%에서부터 더욱 급격한 활성 증가를 보이고 있다. 효소 농도별 가수분해 활성에서도 단일효소 처리가 2종 혼합효소 처리보다 더욱 가수분해 활성이 높은 것으로 판단된다.

(실시예 5)

먼저 효소반응 중 pH의 변화를 최소화하기 위해 1M acetic acid와 평균 26.5% ammonia hydroxide를 사용하여 세리신 용액의 pH를 조정하였다. 그리고 제조예 2의 가용성 세리신 1 ㎎에 각 효소를 혼합하되, 첨가 후 조성물의 온도를 각각 alcalase, esperase, protamax, papain 온도는 60℃, flavourzyme, bromelain, neutrase 온도는 50℃, alcalase+flavourzyme, esperase+flavourzyme, protamax+flavourzyme, papain+flavourzyme 온도는 60℃, bromelain+flavourzyme, neutrase+flavourzyme온도는 50℃가 되도록 하였다. 또한 첨가량은 0.05㎎으로 하였으며, 두 종류의 효소가 혼합된 경우는 각각 1 : 1의 비율로 혼합하였다.

그리고 pH는 6, 7, 8, 9, 시간은 2, 4, 8, 12 단위로 가수분해하여 고분자 및 저분자 세리신을 SDS-PAGE 상에서 확인하였다. 구체적으로 고분자 세리신 가수분해 패턴을 확인하기 위해 각 시료에 동량의 2× Laemmli sample buffer를 넣어 희석하고 95℃에서 5분간 열처리하였다. 각 단백질 시료(250 ㎍/50 ㎕)를 Tris-Glycine SDS-PAGE gel의 각 well에 로딩하여 120V에서 1시간 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 염색용액을 이용하여 gel을 1시간 동안 염색한 다음 탈색용액을 이용하여 겔을 탈색하여 세리신 단백질 가수분해 패턴을 LED light pad 상에서 확인하고 사진촬영하였다. 저분자 세리신 가수분해 패턴을 확인하기 위해 각 시료에 동량의 Tricine sample buffer 넣어 희석하고 95℃에서 5분간 열처리하였다. 각 단백질 시료(150 ㎍/30 ㎕)를 Tris-Tlycine SDS-PAGE gel의 각 well에 로딩하여 100V에서 1시간 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 fixative sloution (40% methanol, 10% acetic acid)에서 30분간 단백질을 고정하고 staining solution (0.025% Coomassie Blue G-250, 10% acetic acid)에서 1시간 동안 염색 후 destaining solution (10% acetic acid)에서 15분 단위로 3번 탈색하여 세리신 단백질 저분자 펩타이드 패턴을 LED light pad 상에서 확인하고 사진촬영하였다.

[표 2]

(상기 표 2에서 A는 Tris-Glycine SDS-PAGE, B는 Tris-Tricine SDS-PAGE를 뜻한다.)

상기 표 2에서 Tris-Glycine SDS-PAGE 겔은 5 내지 100 kDa 이상의 고분자를 확인하기 위한 것이고 Tris-Tricine SDS-PAGE 겔은 5 kDa 이하에서 40 kDa 사이의 저분자를 가시적으로 확인하기 위한 것으로, 상기 표 2와 같이 기본적으로 단일효소의 경우가 혼합효소보다 더 효율이 높은 것을 확인할 수 있으며, 단일 효소 중 alcalase와 esperase가 가장 작은 크기로 가수분해됨과 동시에 분자량 범위의 중간값이 가장 작은 것을 확인할 수 있다. 이외의 다른 효소들은 가수분해 활성이 상기 효소들에 비해 다소 낮은 것으로 확인되었다.

(실시예 6)

하기 실시예 5에서 pH를 6.3으로 고정하고 효소별로 세리신 중량의 1, 5, 10 및 20%의 비율로 효소를 첨가하였을 때 단일효소별 가수분해된 세리신 분자량을 확인하였다. 특히 효소의 비율이 증가할수록 가수분해물이 특정 분자량에 집적되는 것을 확인하였는데, 이는 SDS-PAGE 상에서 비가시적으로 존재하는 고분자의 분자량이 효소의 증가에 의해 더욱 활발히 분해되어 특정 저분자량으로 집적되어 농도가 증가하는 것으로 보인다.

[표 3]

(상기 표 3에서 B는 Tris-Tricine SDS-PAGE를 뜻한다.)

표 3과 같이 세리신에 대한 효소 처리 농도가 증가할수록 모든 효소가 농도 의존적으로 저분자량의 세리신 농도를 증가시킨다. 다만 alcalase와 esperase 두 효소만이 대부분의 고분자 세리신을 분해하여 평균 분자량 3 kDa의 저분자량 세리신을 형성하는 것을 확인하였다.

이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

a) 실크 원사를 정련액으로 정련하여 피브로인 섬유와 세리신을 분리하는 단계; 및
b) 분리된 세리신을 에스퍼라제(esperase)의 농도가 1 내지 30 중량%이고, pH가 7 내지 9인 효소 조성물과 혼합하고 55 내지 65℃의 온도에서 반응시켜 저분자량의 세리신을 제조하는 단계;
를 포함하며,
상기 저분자량의 세리신은 3 kDa 이하의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 세리신의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 a) 단계는 90 내지 150℃에서 10 내지 120분간 진행하는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 세리신의 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 정련제는 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨 및 수산화나트륨에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 알칼리제; 비누; 차아황산나트륨, 황산칼슘 및 황산마그네슘에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 황산염; 및 용매;를 포함하는 것을 특징으로 하는 저분자량 실크 세리신의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
제 1항 내지 제 3항에서 선택되는 어느 한 항에 따라 제조된 세리신을 포함하는 화장료 조성물.
제 7항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 유칼립투스(Eucalypus), 페퍼민트(Peppermint), 그레이프프루츠(Grapefruit), 네롤리(Nenolri), 니아룰리(Niaouli), 라벤더(Lavender), 라임(Lime), 레몬(Lemon), 레몬그래스(Lemongrass), 멜리사(Melissa officinalis), 로즈마리(Rosemary), 로즈우드(Rosewood), 마조람(Majoram), 만다린(Citrus madurensis), 머틀(Myrtle), 미르(Myrrh), 바질(Basil), 버베나(Verbena), 버취(Birch), 베르가못(Bergamot), 베이(Bay), 안식향(Benzoinum), 사이프러스(Cypress), 샌달우드(Sandaiwood), 시나몬(Cinnamon), 시더우드(Cedarwood), 시트로넬라(Citronella), 오렌지스윗(Orange sweet), 일랑일랑(Ylang ylang), 자스민(Jasmine), 제라늄(Geranium), 쥬니퍼베리(Juniper berry), 진저(Ginger), 카모마일(Chamomile), 캠퍼(Camphor), 클라리세이지(Clary sage), 타임(Thyme), 탠저린(Tangerine), 티트리(Tea tree), 팔마로사(Paimarosa), 패?Z리(Patchouli), 페티그레인(Petitgrain), 프랭킨센스(Frankincense), 펜넬(Fennel), 히솝(Hyssop), 녹차(Green tea), 생강(Ginger), 감초(Chinese Liquorice), 오미자(Schisandra), 황련(Coptis), 알로에베라(Aloe vera) 및 브로콜리(Broccoli)에서 선택되는 어느 하나 또는 복수의 정유 성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.