JP2008289370A

JP2008289370A - セリシン水溶液の製造方法およびセリシン水溶液

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Publication number: JP2008289370A
Application number: JP2007135119A
Authority: JP
Inventors: Haruki Takatoya; 春樹高塒; Hironori Mori; 裕紀森
Original assignee: Dai Ichi Kogyo Seiyaku Co Ltd
Current assignee: DKS Co Ltd
Priority date: 2007-05-22
Filing date: 2007-05-22
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2027-05-22
Also published as: JP5253760B2

Abstract

【課題】高い透明性、均一性を有する低分子量セリシン水溶液を効率よく調製する。
【解決手段】重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液をアニオン界面活性剤を用いて可溶化し、可溶化した高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素によりセリシンを加水分解させて、重量平均分子量５万未満、好ましくは１万以下の低分子量セリシン水溶液を調製する。タンパク質分解酵素としてシステインプロテアーゼを用いる場合には、システイン塩酸塩などの還元剤の存在下で、セリシンを加水分解させる。
【選択図】なし

Description

本発明は、セリシン水溶液の製造方法に関し、より詳細には、高分子量のセリシン水溶液を加水分解して低分子量のセリシン水溶液を調製する方法、及び、該加水分解により得られたセリシン水溶液に関し、更には該セリシン水溶液を配合した化粧品組成物に関するものである。

セリシンは、フィブロインとともに絹繊維を構成するタンパク質であり、絹繊維等からアルカリ、酸、界面活性剤、タンパク質分解酵素、イオン水、熱水などを用いて抽出される。かかるセリシンは、従来、絹繊維の精錬工程において精錬廃液として廃棄されていたが、近年、機能性素材として、生体機能に関連する応用分野や、化粧品、食品といった分野への活用が検討されている。

セリシンを分離回収するための方法として、下記特許文献１には、絹織物を高温高圧水で処理し、得られたセリシン水溶液を凍結、解凍してセリシンを抽出する技術が開示されている。この方法で得られるセリシンは平均分子量が１０万以上であり、その水溶液は０〜４０℃でゲル化することが記載されている。

特許文献１にも記載されているように、平均分子量が５万以上となるような高分子量セリシンの水溶液は、高分子量セリシンの水に対する溶解性が乏しいことから、白濁しゲル状になってしまう。すなわち、高分子量セリシン水溶液では、セリシンが完全には溶解しておらず、溶液は白濁し、粘度が高く、経時的にコロイド状のゲルを形成したり、凝集沈殿したりする。そのため、高粘度のせいで扱いづらく、外観が悪かったり、離水したりするといった不都合が生じる。

このような状態では、高い均一性や透明性を要求される用途で使用しづらい。また、スキンケアやヘアケアなどの化粧品の原料として高分子量セリシン水溶液を使用した場合、皮膚や毛髪の内部に大部分のセリシンが浸透、吸着するなどの現象は期待できず、その効果が確認されにくい。そこで、高温高圧水で抽出して得られた高分子量セリシンを効率よく低分子量化でき、高い透明性、均一性を有する低分子量セリシン水溶液を調製する方法が求められる。

低分子量セリシン水溶液を得る方法として、下記特許文献２には、イオン水生成装置で水又は電解質水溶液を電気分解して生成したイオン水を用いて、繭糸のセリシンを加水分解する方法が提案されている。

また、下記特許文献３には、家蚕又は天蚕由来の絹タンパク原料を中性塩水溶液に溶解し、タンパク質分解酵素などのペプチド結合切断物質を用いて絹タンパク質の特異的アミノ酸残基間のペプチド結合を切断することにより、平均分子量が１万以上２０万未満の絹タンパク質水溶液を製造する方法が開示されている。また、下記特許文献４には、セリシンではなくフィブロインペプチドの製造方法に関するものであるが、絹フィブロインを中性塩によって分解し、タンパク質分解酵素による加水分解を施すことで低分子量化する技術が開示されている。これらの方法では、絹糸から高分子量セリシン又はフィブロインを、高濃度の中性塩を含有する水溶液に溶出させるため、ペプチド結合切断物質による加水分解後に透析などの脱塩工程が必要となる。
特開平１１−１３１３１８号公報特開平１０−０２９９０９号公報特開２００４−３００１４２号公報特開平０７−０６７６８６号公報

上記のように、絹織物を高温高圧水で処理して得られた重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液は、溶解性が乏しく白濁しており、室温ではゲル状である。そこで、高分子量セリシン水溶液を、タンパク質分解酵素、アルカリ、酸やそれらの併用により加水分解することにより、透明性を有する低分子量セリシン水溶液を得ようと試みた。

しかしながら、ゲルろ過クロマトグラフィーにより低分子量化したことは確認できたものの、溶解性は改善されなかった。すなわち、アルカリによる分解では、低分子量化したにもかかわらず白濁したままで外観が改善されなかった。また、酸やタンパク質分解酵素による分解では、凝集沈殿が生じて外観や性能に劣るものであった。このような低分子量セリシンは産業利用上有用とは言いがたく、白濁や凝集沈殿を生じない高分子量セリシンの分解方法を確立することが必要である。

本発明は、以上の点に鑑みてなされたものであり、高い透明性、均一性を有する低分子量セリシン水溶液を調製することができる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意検討していく中で、加水分解前に高分子量セリシンをアニオン界面活性剤で可溶化しておくことが有効でないかと考えた。本出願人によって先に提案されているように、高分子量セリシン水溶液は、アニオン界面活性剤により溶解性を改善して、コロイド状のゲル形成や凝集沈殿を抑制することができる（特願２００６−２４８１９８参照）。そのため、このようにして得られた均一性に優れる高分子量セリシン水溶液を用いて加水分解すれば、上記課題が解決されるのではないかと考えた。

しかしながら、アニオン界面活性剤で可溶化した均一な高分子量セリシン水溶液を用いた場合でも、酸による加水分解では、溶解性が低下して可溶化していたセリシンが凝集沈殿し、中和後も沈殿したままであることが判明した。また、アルカリによる加水分解では、凝集沈殿はしなかったが、加水分解に長時間を要し非効率的であった。

そこで、本発明者らは、短時間で反応が進行するタンパク質分解酵素による加水分解に着目し、アニオン界面活性剤による可溶化とタンパク質分解酵素による加水分解を組み合わせることで、白濁や凝集沈殿を起こさずに短時間で低分子化したセリシン水溶液が得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係るセリシン水溶液の製造方法は、アニオン界面活性剤で可溶化した重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素でセリシンを加水分解させて重量平均分子量５万未満の低分子量セリシン水溶液を調製するものである。

また、本発明に係るセリシン水溶液は、アニオン界面活性剤で可溶化した重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素でセリシンを加水分解させることで調製された重量平均分子量５万未満のセリシン水溶液である。

本発明はまた、上記セリシン水溶液を配合した化粧品組成物を提供するものである。

本発明において、前記タンパク質分解酵素としてシステインプロテアーゼを用いる場合、アニオン界面活性剤によりタンパク質分解酵素が失活し加水分解が進行しづらい。そのため、この場合には、アニオン界面活性剤によるシステインプロテアーゼの失活を抑制する改善策として還元剤を添加し、還元剤の存在下でセリシンを加水分解させることが好ましい。これにより、システインプロテアーゼの活性が維持され、白濁や凝集沈殿を起こさずに短時間でセリシンを低分子化することができる。

本発明において、前記タンパク質分解酵素としてはアルカリプロテアーゼを用いることもでき、この場合、還元剤を添加しなくても活性を維持することができ、白濁や凝集沈殿を起こさずに短時間でセリシンを低分子化することができる。

本発明によれば、高分子量セリシン水溶液から低分子量セリシン水溶液を調製する際に、凝集沈殿や白濁が生じるのを抑制することができ、従って、透明性、均一性に優れ、広い用途に適合した低分子量セリシン水溶液を得ることができる。また、タンパク質分解酵素を用いるため、短時間に低分子化することができ、またセリシンペプチドの分子量制御も行うことができる。また、低分子化したことにより、化粧品用として配合した場合に、皮膚や毛髪の内部への浸透性を向上することができる。

以下、本発明の実施に関連する事項について説明する。

本発明において、高分子量セリシンとは、重量平均分子量（Ｍｗ）が５万以上のセリシンのことである。また、低分子量セリシンとは、重量平均分子量が５万未満のセリシンないしセリシンペプチドのことであり、該重量平均分子量はより好ましくは２万以下、更に好ましくは１万以下である。このような低分子量のセリシンとすることで、例えば化粧品用として配合した場合に、皮膚や毛髪の内部への浸透性を向上することができる。

高分子量セリシンの重量平均分子量の上限値は特に限定されないが、２０万以下であることが、界面活性剤で可溶化した状態での均一性、透明性の点で好ましい。また、低分子量セリシンの重量平均分子量の下限値も特に限定されないが、５００以上であることが好ましい。

本発明において、重量平均分子量は、ゲル濾過クロマトグラフィーにて測定されるものである。

本発明の一実施形態に係るセリシン水溶液の製造方法は、
（１）界面活性剤で可溶化した高分子量セリシン水溶液を調製する工程と、
（２）調製した高分子量セリシン水溶液に対し、タンパク質分解酵素によりセリシンを加水分解させる工程と、
を含むものである。

工程（１）において、可溶化した高分子量セリシン水溶液は、白濁し、凝集沈殿した高分子量セリシン水溶液の原液に、アニオン界面活性剤を加えて加熱混合することにより調製することができる。

上記高分子量セリシン水溶液の原液としては、絹繊維（繭糸）を高温水（例えば１００〜１４０℃）で抽出処理することにより得られたものが好適である。このような高温水で抽出したものであれば、アルカリ抽出したものに比べて、高分子量のセリシンを含んだ水溶液が得られる。かかる高温水によるセリシンの抽出方法は、例えば上記特許文献１に記載されたような公知の方法を用いて行うことができ、特に限定されない。高温水抽出で得られた上記高分子量セリシン水溶液の原液は、通常、室温では、セリシンが完全には溶解しておらず（従って、セリシン水分散液と称することもできる。）、白濁し、凝集沈殿により増粘した状態の液体である。

この高分子量セリシン水溶液の原液に、アニオン界面活性剤を所定量加えた後、加熱条件下（好ましくは８０〜９５℃）で、所定時間（例えば１０分程度）撹拌し、その後、速やかに冷却する。これにより、均一性に優れる高分子量セリシン水溶液が得られる。

なお、高い透明性を要する場合には、得られた高分子量セリシン水溶液に圧力処理を加えてもよい。圧力処理は、マイクロフルイダイザー、ホモジナイザー、アルティマイザーなどの公知の高圧処理機を用いて行うことができ、上記高分子量セリシン水溶液に圧力をかけて微粒子化することにより、透明性が向上する。処理圧力としては、特に限定されないが、５０〜１００ＭＰａであることが好適である。また、処理回数は２パス（pass）以上であることが好ましい。

上記可溶化にはアニオン界面活性剤が用いられる。アニオン界面活性剤を用いることにより、セリシンの溶解性を改善することができ、一方、カチオン界面活性剤や両性界面活性剤などの他の界面活性剤では、高分子量セリシンの溶解性改善効果は得られず、溶解性がむしろ低下することもある。なお、アニオン界面活性剤がセリシンの溶解性を改善させる理由は明らかではないが、アニオン界面活性剤の親油基がセリシンの親油的な領域に吸着したとき、親水基がアニオンであることから、セリシン分子内もしくは分子間の静電反発力が生じ、セリシンのunfolding状態（ランダム構造）を促すとともに、セリシン分子間の凝集を防ぐためと推測される。

上記アニオン界面活性剤としては、セリシンを可溶化するものであれば特に限定なく用いることができ、例えば、アミノ酸系活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩、アルキル硫酸塩（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）などが挙げられる。好ましくは、Ｎ−アシル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−アシル−Ｄ，Ｌ−アラニン塩、Ｎ−アシル−サルコシン塩などのアミノ酸系活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩であり、これらは、アニオン界面活性剤の中でも高分子量セリシンの溶解性改善に高い効果があり、均一性だけでなく、透明性の向上にも寄与し得る。

上記アミノ酸系活性剤のアシル基は、特に限定されるものではないが、炭素数８〜２０の脂肪酸由来のものが好ましく、より好ましくは炭素数１２〜１８の脂肪酸由来のものである。これらの脂肪酸組成は単一でもよく、２種以上の混合でもよい。また、上記ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩のアルキル基は、特に限定されるものではないが、炭素数８〜２０であることが好ましく、より好ましくは炭素数１２〜１８である。

また、該アニオン界面活性剤の塩は、特に限定されるものではないが、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、トリエタノールアミン塩などが好ましい。

上記の可溶化とは、高分子量セリシンの水に対する溶解性を向上させて均一性を有するセリシン水溶液を得ることを意味しており、必ずしも高分子量セリシンの全てが完全に水に溶解した状態を要求するものではない。かかる可溶化に要する界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、セリシンの総濃度に対して、重量比で、０．１倍以上であることが好ましい。また、その上限は、濃度が高すぎると、工程（２）においてアニオン界面活性剤でタンパク質分解酵素の活性が低下しやすいため、極力低く抑えることが好ましく、具体的には２倍以下であることが好ましい。

上記高分子量セリシン水溶液中のセリシンの総濃度は、３重量％未満であることが好ましい。セリシン濃度が高すぎると、界面活性剤の濃度を増やしても、溶解性のよい高分子量セリシン水溶液を得ることが難しくなり、高い透明性、均一性を有する低分子量セリシン水溶液の調製が困難となる。セリシン濃度は、より好ましくは、０．５〜２．５重量％である。

上記工程（２）で用いるタンパク質分解酵素としては、セリシンを加水分解できるものであれば特に限定されず、例えば、パパイン、ブロメライン、キモパパイン、フィシンなどのシステインプロテアーゼ、サーモライシンなどの金属プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシンなどのセリンプロテアーゼなどが挙げられ、また、Aspergillus属、Rhizopus属、Bacillus属などの微生物由来のプロテアーゼが挙げられる。これらはそれぞれ単独で又は２種以上併用することができる。

該タンパク質分解酵素としては、中性領域からアルカリ性領域において活性を持つものが用いられ、具体的には、アルカリ性領域に酵素活性を持つアルカリプロテアーゼ（特には、アルカリプロテイナーゼ）、例えば、Bacillus属由来のアルカリプロテアーゼ（subtilisinなど）等が好適に用いられる。また、パパインやブロメラインなどのシステインプロテアーゼ（特には、システインプロテイナーゼ（ＳＨ酵素））も、植物由来であることから、特に化粧品用途において好ましく用いられる。

タンパク質分解酵素の濃度は、特に限定されないが、セリシンの総濃度に対して、重量比で、０．００１〜０．５倍であることが好ましい。

上記工程（２）において、タンパク質分解酵素としてシステインプロテアーゼを用いる場合には、還元剤の存在下でセリシンを加水分解させる。該還元剤は、アニオン界面活性剤によるシステインプロテアーゼの失活を抑制し得るものであれば、特に限定されない。すなわち、還元剤は、パパインやブロメラインなどの活性中心にあるＳＨ基の酸化による失活を抑制して、還元により活性なＳＨ基を維持し得るものである。具体的には、システイン又はその塩類（例えば、システイン塩酸塩）、システアミン又はその塩類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール、グルタチオンなどが挙げられ、これらはそれぞれ単独で又は２種以上併用することができる。特に好ましくは、システイン又はシステアミンあるいはこれらの塩類である。

還元剤の濃度は、特に限定されないが、タンパク質分解酵素の使用量に対して、重量比で、０．１〜１倍であることが好ましい。

上記工程（２）では、より詳細には、工程（１）で調製した高分子量セリシン水溶液にタンパク質分解酵素を添加し、該酵素が触媒機能を発揮する最適温度域にて所定時間（例えば１５〜３０分間）撹拌することによりセリシンを加水分解させる。ここで、該酵素がシステインプロテアーゼの場合には、工程（１）で調製した高分子量セリシン水溶液に還元剤を添加して撹拌混合した後に、酵素を添加することが好ましい。

その際、水溶液のｐＨが７より小さいと、可溶化した場合でもセリシンの溶解度が低下して再び白濁したり凝集沈殿したり、あるいは顕著に着色したりするため、ｐＨは常に７以上に調整することが好ましい。また、水溶液のｐＨが１１を超えると、タンパク質分解酵素の活性に影響したり、凝集沈殿したり、あるいは顕著に着色したりするため、ｐＨは１１以下に調整することが好ましい。以上より、上記加水分解に際しては、ｐＨを７〜１１に維持し、より好ましくはｐＨは８〜１０に維持する。なお、ｐＨの調整は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムといった無機アルカリ、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンといった有機アルカリなどの各種アルカリ、塩酸、硫酸、リン酸といった無機酸、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸といった有機酸などの各種酸を用いることができる。このようなｐＨの調整により、水溶液中に塩を生じることになるが、その量は少量であるため、上記特許文献３，４のような脱塩工程は必要としない。

上記のようにタンパク質分解酵素による加水分解でセリシンを低分子化した後、所定温度に加熱撹拌することで、酵素を失活させることができる。その後、冷却することにより、低分子量セリシン水溶液が得られる。なお、失活させたタンパク質分解酵素は、そのまま低分子量セリシン水溶液中に残存させておけばよい。

このように本実施形態によれば、アニオン界面活性剤を添加して溶解性を改善した高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素によりセリシンを加水分解することにより、凝集沈殿を起こさずかつ高い透明性、均一性、浸透力を有する低分子量セリシン水溶液を、非常に短時間で調製することができる。

得られた低分子量セリシン水溶液は、低分子量セリシンと、アニオン界面活性剤と、場合により還元剤と、失活したタンパク質分解酵素と、ｐＨ調整のための酸及び／又はアルカリ及び／又はそれらの塩を含むものであるが、発明の効果を損なわない範囲内で、防腐剤などの他の成分を含有してもよい。

本発明の一実施形態に係る化粧品組成物は、上記低分子量セリシン水溶液を配合してなるものである。配合量は特に限定されるものではないが、通常は、化粧料組成物中に、セリシン濃度として０．００１〜０．１重量％の範囲内で配合される。

該化粧品組成物には、一般に化粧品組成物に配合される各種成分を配合することができる。例えば、エタノール、グリセリン、ソルビトールなどのアルコール類、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタントリステアレート等のソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノオレエート等のグリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエーテル変性シリコーン系界面活性剤、ジメチコンポリオールなどの界面活性剤、可塑剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、染料、顔料、色素、防腐剤、ビタミン剤、ホルモン剤、消臭剤、ｐＨ調整剤、固着剤等が挙げられる。

該化粧品組成物の用途としては、特に限定されず、ヘアジェル、ヘアシャンプー、ヘアトリートメント、ヘアリンス、スタイリングローション、ヘアミスト、スタイリングムース、ヘアスプレー等のヘアケア化粧品、化粧水、乳液、モイスチュアクリーム、モイスチュアローション等のスキンケア化粧品、ボディシャンプー等の洗浄剤、マスカラ、ファンデーション等のメイクアップ化粧品などに用いることができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。重量平均分子量と外観の測定・評価方法は以下の通りである。

（重量平均分子量）
・サンプル調製法：
１．セリシンの濃度が０．１重量％となるように移動相と同じ組成の水溶液で希釈
２．上記１．の液を５分間煮沸処理
３．上記２．の液をシリンジフィルタ（ＡＤＡＶＡＮＴＥＣ社製「ＤＩＳＭＩＣ−１３ＨＰ」、ＰＴＦＥ０．４５μm）に通し、サンプルとした。
・試薬：リン酸水素二ナトリウム（ナカライテスク社製）、リン酸二水素ナトリウム（ナカライテスク社製）、塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）、分子量マーカ（オリエンタル酵母社製「ＭＷ−Ｍａｒｋｅｒ」、分子量１２，４００〜２９０，０００）
・分析条件：
ＵＶ検出器…島津製作所社製「ＳＰＤ−６Ａ」、測定波長２１０ｎｍ
カラム…昭和電工社製「ＡｓａｈｉｐａｋＧＳ−５２０ＨＧ」
カラム温度…４０℃
移動相…０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
流速…０．６ｍｌ／分
注入量…１０μｌ
・分子量算出方法：分子量マーカを測定して検量線を作成し、重量平均分子量を測定した。

（外観評価）
セリシン水溶液の外観を目視により評価し、均一性、透明性が良好であるものを「○」、白濁が生じていたものを「△」、凝集沈殿が生じていたものを「×」と評価した。

（実施例１）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、第一工業製薬社製「ネオハイテノールＥＣＬ−３０Ｓ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷し、可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た。

（２）可溶化した高分子量セリシン水溶液９９．７６重量部に１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製、特級）を０．０４重量部加え、均一になるまで撹拌した。

（３）さらに１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約８であることを確認した。

（４）５０℃で３０分撹拌した後、９５℃で３０分加熱撹拌して酵素を失活させ、水浴中で急冷して低分子量セリシン水溶液を得た。

（５）調製した低分子量セリシン水溶液を５℃で２４時間静置し、目視で水溶液の外観を評価した後、重量平均分子量を測定した。

（実施例２）
上記実施例１の（３）において、パパインに代えて、ブロメライン（天野エンザイム社製「ブロメラインＦ」）を０．２重量部加え、その他は実施例１と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例３）
上記実施例１の（２）において、可溶化した高分子量セリシン水溶液の量を９９．８６重量部とし、またＬ−システイン塩酸塩一水和物の添加量を０．０４重量部とし、更に（３）において、パパインの添加量を０．１重量部とし、その他は実施例１と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例４）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９８．３重量部に、アニオン界面活性剤（Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム塩、ライオン社製「エナジコールＬ−３０ＡＮＴ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）１．７重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷し、可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た。この後、マイクロフルイダイザー（みづほ工業社製「超高圧ホモジナイザーＭ−１１０−Ｅ／Ｈ」）にて圧力処理した（処理圧力＝１００ＭＰａ、処理回数＝２パス）。

（３）さらに１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、ブロメライン（天野エンザイム社製「ブロメラインＦ」、ブロメライン８５重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約８であることを確認した。

（実施例５）
上記実施例４の（１）において、アニオン界面活性剤として、Ｎ−ヤシ油脂肪酸−Ｄ，Ｌ−アラニントリエタノールアミン塩（味の素社製「アミライトＡＣＴ−１２」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）を用い、その他は実施例４と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例６）
上記実施例４の（１）において、アニオン界面活性剤として、Ｎ−ヤシ油脂肪酸−サルコシントリエタノールアミン塩（日光ケミカルズ社製「サルコシネートＣＴ−３０」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）を用い、その他は実施例４と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例７）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、第一工業製薬社製「ネオハイテノールＥＣＬ−３０Ｓ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷し、可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た。

（２）可溶化した高分子量セリシン水溶液９９．８５重量部に１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、アルカリプロテアーゼ（大和化成社製「プロチンＳＤ−ＡＹ１０」、プロテアーゼ１５重量％、Bacillus licheniformis（枯草菌）由来のエンド型アルカリプロテアーゼ、EC3.4.21.14）を０．１５重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約９であることを確認した。

（実施例８）
上記実施例７の（１）において、アニオン界面活性剤として、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム塩（ライオン社製「エナジコールＬ−３０ＡＮＴ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）を用い、高分子量セリシン水溶液９８．３重量部に対する添加量を１．７重量部とし、その他は実施例７と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例９）
上記実施例７の（１）において、アニオン界面活性剤として、Ｎ−ヤシ油脂肪酸−Ｄ，Ｌ−アラニントリエタノールアミン塩（味の素社製「アミライトＡＣＴ−１２」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）を用い、高分子量セリシン水溶液９８．３重量部に対する添加量を１．７重量部とし、その他は実施例７と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例１０）
上記実施例７の（１）において、アニオン界面活性剤として、Ｎ−ヤシ油脂肪酸−サルコシントリエタノールアミン塩（日光ケミカルズ社製「サルコシネートＣＴ−３０」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）を用い、高分子量セリシン水溶液９８．３重量部に対する添加量を１．７重量部とし、その他は実施例７と同様にして、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（実施例１１）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、第一工業製薬社製「ネオハイテノールＥＣＬ−３０Ｓ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷し、可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た。

（２）可溶化した高分子量セリシン水溶液９９．８５重量部に１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを１１に調整し、アルカリプロテアーゼ（天野エンザイム社製「ブロレザーＦＧ−Ｆ」、プロテアーゼ１０重量％、Bacillus subtilis由来のエンド型アルカリプロテアーゼ、EC3.4.21.62）を０．１５重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約１０であることを確認した。

（４）６０℃で３０分撹拌した後、９５℃で３０分加熱撹拌して酵素を失活させ、水浴中で急冷して低分子量セリシン水溶液を得た。

（比較例１：可溶化なし）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．７２重量部に、１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製、特級）を０．０８重量部加え、均一になるまで撹拌した。

（２）次いで、１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約８であることを確認した。

（３）５０℃で３０分撹拌した後、９５℃で３０分加熱撹拌して酵素を失活させ、水浴中で急冷して低分子量セリシン水溶液を得た。

（４）調製した低分子量セリシン水溶液を５℃で２４時間静置し、目視で水溶液の外観を評価した後、重量平均分子量を測定した。

（比較例２：可溶化及び還元剤なし）
高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．８重量部に、１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約８であることを確認した。その後は、比較例１の（３）及び（４）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例３：還元剤なし）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．８５重量部に、アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム塩、第一工業製薬社製「ネオハイテノールＥＣＬ−３０Ｓ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．１５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷し、可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た。

（２）可溶化した高分子量セリシン水溶液９９．８重量部に１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、ｐＨが約８であることを確認した。

（３）その後は、比較例１の（３）及び（４）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例４：可溶化、還元剤及びｐＨ調整なし）
高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．８重量部に、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌した。その後は、比較例１の（３）及び（４）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例５：ｐＨ調整なし）
比較例３の（１）と同様にして可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た後、得られた高分子量セリシン水溶液９９．７２重量部にＬ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製、特級）を０．０８重量部加え、均一になるまで撹拌した。その後、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌した。このときの溶液のｐＨは約６であった。その後は、比較例１の（３）及び（４）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例６：ｐＨを１２に調整）
比較例３の（１）と同様にして可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た後、得られた高分子量セリシン水溶液９９．７２重量部に１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約９に調整し、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（和光純薬工業社製、特級）を０．０８重量部加え、均一になるまで撹拌した。その後、パパイン（天野エンザイム社製「パパインＷ−４０」、パパイン５０重量％）を０．２重量部加え、均一になるまで撹拌し、１０重量％水酸化ナトリウムを適宜添加してｐＨを約１２に調整した。その後は、比較例１の（３）及び（４）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例７：可溶化なし及びアルカリ加水分解）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製、特級）を０．５重量部加え、５０℃で１６時間撹拌した後、中和して水浴中で急冷し低分子量セリシン水溶液を得た。

（２）５℃で２４時間静置した後の水溶液の外観の評価と、重量平均分子量の測定を行った。

（比較例８：可溶化あり及びアルカリ加水分解）
比較例３の（１）と同様にして可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た後、得られた高分子量セリシン水溶液９９．５重量部に水酸化ナトリウム（和光純薬工業社製、特級）を０．５重量部添加して、５０℃で１６時間撹拌した。その後、中和して水浴中で急冷し、低分子量セリシン水溶液を得て、５℃で２４時間静置した後の水溶液の外観の評価と、重量平均分子量の測定を行った。

（比較例９：可溶化なし及び酸加水分解）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、塩酸（佐々木化学薬品社製、塩酸濃度３５％、一級）を０．５重量部加え、５０℃で１６時間撹拌した後、中和して水浴中で急冷し低分子量セリシン水溶液を得た。

（比較例１０：可溶化あり及び酸加水分解）
比較例３の（１）と同様にして可溶化した高分子量セリシン水溶液を得た後、得られた高分子量セリシン水溶液９９．５重量部に塩酸（佐々木化学薬品社製、塩酸濃度３５％、一級）を０．５重量部添加して、５０℃で１６時間撹拌した。その後、中和して水浴中で急冷し、低分子量セリシン水溶液を得て、５℃で２４時間静置した後の水溶液の外観の評価と、重量平均分子量の測定を行った。

（比較例１１：両性界面活性剤）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、両性界面活性剤（ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、第一工業製薬社製「アモーゲンＣＢ−Ｈ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷した。

（２）その後は、実施例１の（２）〜（５）の通りに、低分子量セリシン水溶液を得て、外観評価と重量平均分子量の測定を行った。

（比較例１２：カチオン界面活性剤）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、カチオン界面活性剤（塩化ラウロイルトリメチルアンモニウム、第一工業製薬社製「カチオーゲンＴＭＬ」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷した。

（比較例１３：非イオン界面活性剤）
（１）高分子量セリシン水溶液（第一工業製薬社製「ＤＫ−セリシンＭＴ」、セリシン濃度１．１重量％、重量平均分子量６１，０００）９９．５重量部に、非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレントリデシルエーテル、第一工業製薬社製「ノイゲンＴＤＳ−５００」、界面活性剤濃度が３０重量％である水溶液）０．５重量部を添加し、９５℃の水浴中で１０分間加熱撹拌後、氷浴中で急冷した。

上記実施例及び比較例の結果は、表１に示す通りであり、実施例１〜１１によれば、約３０分という短い反応時間で、高分子量セリシンを低分子化させることができた。また、得られた低分子量セリシン水溶液は、透明性、均一性に優れていた。

（実施例１２：モイスチュアローション）
濃グリセリン（阪本薬品工業社製）３重量部、ジプロピレングリコール（ＢＡＳＦジャパン社製）７．５重量部、クエン酸（ナカライテスク社製）０．０２重量部、クエン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）０．１重量部、ＰＣＡイソステアリン酸グリセレス−２５（ＢＡＳＦジャパン社製「ピロテルＧＰＩ−２５」）０．１５重量部、エタノール（日本エタノール社製）４重量部、クインスシードエキス（香栄興業社製「マルメロＢＧ」）７重量部、ホホバリーフエキス（香栄興業社製）１重量部、実施例１で得た低分子量化セリシン水溶液（１重量％）５重量部、防腐剤及び香料を適量、及び、精製水を残余（但し、合計で１００重量部）にて、配合してモイスチュアローションを調製した。

調製方法は次の通り。（１）濃グリセリン、ジプロピレングリコール、クエン酸、クエン酸ナトリウム、精製水を十分に混合する。（２）防腐剤、ＰＣＡイソステアリン酸グリセレス−２５、エタノール、香料を十分に混合する。（３）マルメロＢＧ、ホホバリーフエキス、低分子量化セリシン水溶液を十分に混合する。（４）上記（１）の液を撹拌しながら、上記（２）の液を添加して均一した後、上記（３）の液を添加して均一にする。

（実施例１３：ヘアシャンプー）
ＰＯＥラウリルエーテル硫酸ナトリウム（第一工業製薬社製「ハイテノール３２５Ｌ」、２５％溶液）２４重量部、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（第一工業製薬社製「アモーゲンＬＢ−Ｃ」、３０％溶液）３０重量部、ラウリン酸ポリグリセリル−１０（太陽化学社製「サンソフトＭ−１２Ｊ」）５重量部、カプリル酸ポリグリセリル−６（太陽化学社製「サンソフトＱ−８１Ｆ」）２重量部、グリセリン（新日本理化社製）５重量部、ジステアリン酸エチレングリコール（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬＥＧＤＳ」）２重量部、実施例１で得た低分子量化セリシン水溶液（１重量％）０．５重量部、防腐剤を適量、クエン酸を適量、及び、精製水を残余（但し、合計で１００重量部）にて、配合してヘアシャンプーを調製した。
調製方法は次の通り。（１）クエン酸以外の全ての原料を混合し、約７０℃まで加温し均一溶解する。（２）撹拌しながら３０℃まで冷却し、クエン酸でｐＨを６．８に調整する。

（実施例１４：ヘアトリートメント）
ベヘントリモニウムクロリド（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬＣＡ−２５８０」、８０％溶液）２４重量部、ジステアリルジモニウムクロリド（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬＣＡ−３４７５」、７５％溶液）３０重量部、ステアリン酸グリセリル（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬＭＧＳ−ＢＶ」）５重量部、セタノール（共和テクノス社製「セタノール＃２５００」）２重量部、オレイルアルコール（共和テクノス社製「オレイル＃１５００ＨＳ」）５重量部、低融点ワックス（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬニコワックスＬＭ）２重量部、オリーブ油（日光ケミカルズ社製「ＮＩＫＫＯＬオリーブ油）０．２重量部、ＤＬ−α−トコフェロール（ナカライテスク社製）を適量、ジメチコン（信越化学社製「ＫＦ−９６−１００ｃｓ」、動粘度１００ｍｍ^２／ｓ）１重量部、ジメチコン（信越化学社製「ＫＦ−９６−１０００ｃｓ」、動粘度１０００ｍｍ^２／ｓ）０．５重量部、実施例１で得た低分子量化セリシン水溶液（１重量％）０．５重量部、防腐剤を適量、及び、精製水を残余（但し、合計で１００重量部）にて、配合してヘアトリートメントを調製した
調製方法は次の通り。（１）ベヘントリモニウムクロリド、ジステアリルジモニウムクロリド、ステアリン酸グリセリル、セタノール、オレイルアルコール、低融点ワックス、オリーブ油、トコフェロール、ジメチコン、低分子量化セリシン水溶液、防腐剤を８０℃まで加温しながら均一にする。（２）精製水を８０℃まで加熱撹拌しながら上記（１）の液を加えて乳化する。（３）撹拌しながら３５℃まで冷却する。

本発明の低分子量セリシン水溶液は、主として化粧品用素材として用いることができ、その他にも、医薬、医薬部外品、食品、バイオなどの生態に関連する分野、繊維処理剤などの各種の分野に利用することができる。

Claims

アニオン界面活性剤で可溶化した重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素でセリシンを加水分解させて重量平均分子量５万未満の低分子量セリシン水溶液を調製する、セリシン水溶液の製造方法。
前記アニオン界面活性剤が、アミノ酸系活性剤及びポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩からなる群から選択される少なくとも一種のアニオン界面活性剤である、請求項１記載のセリシン水溶液の製造方法。
前記タンパク質分解酵素がシステインプロテアーゼであり、還元剤の存在下でセリシンを加水分解させる、請求項１又は２記載のセリシン水溶液の製造方法。
前記タンパク質分解酵素がアルカリプロテアーゼである、請求項１又は２記載のセリシン水溶液の製造方法。
アニオン界面活性剤で可溶化した重量平均分子量５万以上の高分子量セリシン水溶液に対し、ｐＨを７〜１１に維持しながら、タンパク質分解酵素でセリシンを加水分解させることで調製された重量平均分子量５万未満のセリシン水溶液。
請求項５記載のセリシン水溶液を配合した化粧品組成物。