CN110499350B - 一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用 - Google Patents

一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种丝胶蛋白水解方法，属于生物技术领域。本发明提供的方法包括如下步骤：(1)将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液；(2)将丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，调节混合液的pH值为7.5～8.5，得到待水解液；(3)向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h，得到初步水解液；(4)向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h，得到最终水解液。本发明提供的方法利用双酶水解，先使用胰蛋白酶处理，然后再加入木瓜蛋白酶；丝胶在双酶的共同作用下，能较传统方法实现更高效率的水解。

Description

一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用。
背景技术
丝胶蛋白是一种丝胶状蛋白质，为球蛋白的一种，常见于蚕丝中，约占蚕丝总重量的20％～30％。当蚕营茧时，丝胶起着黏合作用，使两根单丝包覆于一体构成茧丝，蚕丝中的杂质主要存在于丝胶中。丝胶蛋白含大量侧链带亲水基团的氨基酸如丝氨酸、天冬氨酸等，易溶于水。水洗法去丝胶是蚕农常用的传统方法。然而，水洗法一方面可能造成蚕丝中丝素的浪费，另一方面水解效率不高，不易将丝胶去除彻底。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种丝胶蛋白的水解方法，水解效率高。
本发明提供了一种丝胶蛋白水解方法，包括如下步骤：
(1)将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液；
(2)将所述丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，调节混合液的pH值为7.5～8.5，得到待水解液；
(3)向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h，得到初步水解液；
(4)向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h，得到最终水解液；
所述步骤(3)中胰蛋白酶的添加质量与所述待水解液的体积比为0.2～0.6g：40～60mL；氯化钙的添加质量与所述待水解液的体积比为0.15g～0.3g：100mL；
所述步骤(4)中木瓜蛋白酶的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.2～0.6g：40～60mL；硫代硫酸钠的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.3g～0.45g：100mL。
优选的，所述丝胶的制备方法包括如下步骤：
I，将蚕茧置于水中，110～130℃，0.08～0.12mPa条件下提取30～60min，固液分离，得到提取液；所述蚕茧与水的质量比为1：(15～25)；
II，将所述提取液与活性炭混合，70～90℃条件下脱色20～40min，固液分离，得到脱色后的提取液；
III，将所述脱色后的提取液冷冻干燥，得到丝胶。
优选的，所述步骤(1)中丝胶的质量与水的体积比为8～20g：100mL。
优选的，所述步骤(2)中调节pH的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的pH值为6～8。
优选的，所述丝胶水溶液与所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的体积比为2.5～3.5：1.5～2.5。
优选的，所述步骤(4)进一步反应后，还包括将所述最终水解液置于80～100℃处理3～8min，终止反应。
本发明提供了上述方法制备得到的水解液产品。
本发明提供了一种蚕丝加工方法，包括如下步骤：
(1)将蚕丝浸泡在水中，加入渗透剂JFC；再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值为7.5～8.5；然后加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h；再加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h；所述渗透剂JFC加入后的反应浓度为0.2～1g/L；胰蛋白酶加入后的反应浓度为5～10g/L；氯化钙加入后的反应浓度为1.5-3g/L；木瓜蛋白酶加入后的反应浓度为5～10g/L；硫代硫酸钠加入后的反应浓度为3-4.5g/L；
(2)将进一步反应后的蚕丝从反应液中取出，用清水冲洗干净后晾干，得到去除丝胶的蚕丝产品。
优选的，所述蚕丝与水的质量比为1：(20～50)。
优选的，所述步骤(2)清水冲洗前还包括皂洗，所述皂洗的温度为80～90℃，所述皂洗的时间为15～25min。
有益效果：本发明提供了一种丝胶蛋白水解方法，包括如下步骤：(1)将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液；(2)将所述丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，调节混合液的pH值为7.5～8.5，得到待水解液；(3)向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h，得到初步水解液；(4)向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h，得到最终水解液。本发明提供的方法利用双酶水解，先使用胰蛋白酶处理，然后再加入木瓜蛋白酶；丝胶在双酶的共同作用下，能较传统方法实现更高效率的水解，在提高丝胶蛋白水解率的同时，提高丝胶蛋白的水解程度。在pH＝8，丝胶水溶液浓度为15％(15g丝胶溶于100mL水)的条件下，利用本发明提供的方法进行丝胶蛋白的水解，丝胶蛋白的水解率可达到38.27％(实验测定水解为氨基酸的丝胶占丝胶的比例值为38.27％)。
具体实施方式
本发明提供了一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用，包括如下步骤：
(1)将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液；
(2)将所述丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，调节混合液的pH值为7.5～8.5，得到待水解液；
(3)向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h，得到初步水解液；
(4)向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h，得到最终水解液；
所述步骤(3)中胰蛋白酶的添加质量与所述待水解液的体积比为0.2～0.6g：40～60mL；氯化钙的添加质量与所述待水解液的体积比为0.15g～0.3g：100mL；
所述步骤(4)中木瓜蛋白酶的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.2～0.6g：40～60mL；硫代硫酸钠的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.3g～0.45g：100mL。
本发明先将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液。在本发明中，所述丝胶优选为丝胶粉。本发明对所述丝胶的来源不作特别限定，本领域常规市售产品(如澳特斯生物化工有限公司生产的丝胶粉，丝胶含量≥99％)或自行制备均可。
若采取自行制备，所述丝胶的制备方法优选包括如下步骤：
I，将蚕茧置于水中，110～130℃，0.08～0.12mPa条件下提取30～60min，固液分离，得到提取液；所述蚕茧与水的质量比为1：(15～25)；
II，将所述提取液与活性炭混合，70～90℃条件下脱色20～40min，固液分离，得到脱色后的提取液；
III，将所述脱色后的提取液冷冻干燥，得到丝胶。
本发明以蚕茧为原料制备丝胶，先将蚕茧置于水中，初步提取。在本发明中，所述蚕茧优选用剪刀剪成碎片，用水浸渍24小时。所述蚕茧与水的质量比优选为1：(15～25)，更优选为1：20。所述提取的温度为110～130℃，优选为120℃；提取的压力为0.08～0.12mPa，优选为0.1mPa；提取的时间为30～60min，优选为40～50min。
初步提取后，固液分离，得到提取液。在本步骤中，所述固液分离的方法优选为倾析法，本发明对所述倾析法的具体步骤不作特别限定，本领域常规操作即可。得到提取液后，本发明将所述提取液与活性炭混合，利用活性炭脱色。在本发明中，所述脱色的温度优选为70～90℃，更优选为80℃，所述脱色的时间优选为20～40min，更优选为30min。
脱色后，固液分离，得到脱色后的提取液。在本步骤中，所述固液分离的方法优选为抽滤，本发明对所述抽滤的具体步骤不作特别限定，本领域常规操作即可。在本发明中，所述抽滤在所述脱色结束后立即进行，有利于最终丝胶得率的提升。
得到脱色后的提取液后，本发明将所述脱色后的提取液冷冻干燥，得到丝胶。本发明对所述冷冻干燥的具体设备及方法不作特别限定，本领域常规设备(如田枫TF-FD-1L真空冷冻干燥机)和方法均可。
本发明将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液。在本发明中，所述丝胶的质量与水的体积比为8～20g：100mL，优选为10～17g：100mL，更优选为15g：100mL。在该浓度下，水解酶的活性中心能与底物最大程度的结合，水解效率最高。
配制得到丝胶水溶液后，本发明将丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，得到待水解液。在本发明中，所述调节pH的缓冲液优选为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的pH值优选为6～8，更优选为7。本发明对所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的来源不作特别限定，本领域常规市售产品或自行配制均可。在本发明的实施例中，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液购买自永大化学试剂有限公司。所述丝胶水溶液与所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的体积比优选为2.5～3.5：1.5～2.5，更优选为3：2。在本发明中，丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合后，所述混合液的pH值为7.5～8.5，优选为8。该pH条件下，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶对丝胶的水解效率最高。
得到待水解液后，本发明向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙CaCl2，进行初步水解反应。在本发明中，所述胰蛋白酶的添加质量与待水解液的体积比优选为0.2～0.6g：40～60mL，更优选为0.4g：50mL。所述氯化钙的添加质量与待水解液的体积比优选为0.15g～0.3g：100mL，更优选为0.2g：100mL。所述氯化钙对胰蛋白酶起到激活和稳定的作用，可有效减少酶用量，减少酶解时间。本发明对所述胰蛋白酶和氯化钙的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述胰蛋白酶购买自上海蓝季生物有限公司。在本发明中，所述初步水解的温度为36～38℃，优选为37℃；所述初步水解的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h。初步水解结束后，得到初步水解液。
得到初步水解液后，本发明向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠Na2S2O3，进行进一步水解反应。在本发明中，所述木瓜蛋白酶的添加质量与初步水解液的体积比优选为0.2～0.6g：40～60mL，更优选为0.4g：50mL。所述硫代硫酸钠的添加质量与待水解液的体积比优选为0.3g～0.45g：100mL，更优选为0.4g：100mL。所述硫代硫酸钠对木瓜蛋白酶起到激活和稳定的作用，可有效减少酶用量，减少酶解时间。本发明对所述木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述木瓜蛋白酶购买自上海蓝季生物有限公司。在本发明中，所述进一步水解的温度为48～52℃，优选为50℃；所述进一步水解的时间优选为0.5～1.5h，更优选为1h。
进一步水解结束后，本发明优选将水解产物置于高温水浴环境中终止反应。在本发明中，所述高温水浴的温度优选为80～100℃，更优选为90℃；所述水浴的时间优选为3～8min，更优选为5min。终止反应后，得到最终水解液。
本发明提供了上述方法制备得到的水解液产品。在本发明中，所述水解液产品主要为丝胶蛋白分解后的氨基酸和小分子多肽混合物。
本发明还提供了一种蚕丝加工方法，包括如下步骤：
(1)将蚕丝浸泡在水中，加入渗透剂JFC，再加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，调节pH值为7.5～8.5；然后加入胰蛋白酶和氯化钙，36～38℃条件下初步反应0.5～1.5h；再加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48～52℃条件下进一步反应0.5～1.5h；所述渗透剂JFC加入后的反应浓度为0.2～1g/L；胰蛋白酶加入后的反应浓度为5～10g/L；氯化钙加入后的反应浓度为1.5-3g/L；木瓜蛋白酶加入后的反应浓度为5～10g/L；硫代硫酸钠加入后的反应浓度为3-4.5g/L；
(2)将进一步反应后的蚕丝从反应液中取出，用清水冲洗干净后晾干，得到去除丝胶的蚕丝产品。
本发明先将蚕丝浸泡在水中，在本发明中，所述蚕丝与水的质量比优选为1：(20～50)，更优选为1：(30～40)。在本发明中，步骤(1)中所述渗透剂JFC的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。步骤(2)所述清水冲洗优选先用温水洗涤2次，后用冷水洗涤1次，以充分除去附着的已脱掉的丝胶。在步骤(2)所述清水冲洗前优选还包括皂洗，本发明对所述皂洗用洗液的具体来源不作特别限定，本领域常规市售皂洗液均可。例如：TF130A皂洗剂的主要成分为改性磷酸酯，TF130皂洗剂的主要成分为表面活性剂。TF130B皂洗剂的主要成分为表面活性剂。在本发明中，所述皂洗液的主要成分浓度优选为2g/L；所述皂洗的温度优选为80～90℃，所述皂洗的时间优选为15～25min，更优选为20min。
本发明利用上用丝胶水解方法对蚕丝表面的丝胶进行水解，能有效去除蚕丝表面丝胶，提高蚕丝的脱胶率，进而去除蚕丝杂质，改善蚕丝的光洁度和品质，避免酶脱胶后蚕丝的泛黄现象。其次，利用本发明方法，对蚕丝进行脱胶所产生的脱胶废液中，丝胶主要以水解物(氨基酸和小分子多肽)的形式存在，可以防止蚕丝脱胶产生的丝胶蛋白重新粘附到蚕丝表面，影响蚕丝的后续染色和整理效果，且脱胶废液中没有其它有害化学物质，有利于脱胶废液中丝胶的回收和利用。另外，利用本发明提供的方法对蚕丝进行加工，能在水解丝胶的同时，不损伤丝素，达到去除丝胶并保护丝素的目的。
下面结合实施例对本发明提供的一种丝胶蛋白水解方法及其产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以柞蚕茧为原料，将蚕茧用剪刀剪成碎片，后用水浸渍24小时。将蚕茧碎片在120℃，0.1mPa下提取丝胶。浴比1:20(蚕茧与水的比值)，时间30-60min。采用倾析法除去不溶性物质。将活性炭(重量比为5％)加入溶液中，加热80℃，脱色30分钟。后趁热抽滤，得到丝胶溶液。溶液进行冷冻干燥(田枫TF-FD-1L真空冷冻干燥机)，获得丝胶粉。
实施例2
(1)称取15g实施例1制备得到的丝胶粉，溶于100mL水中，制成15％浓度的丝胶水溶液；
(2)称取丝胶水溶液30mL，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液调节丝胶水溶液的pH至8，此时丝胶水溶液和缓冲溶液共50mL，放入锥形瓶中；
(3)将锥形瓶放入37℃恒温水浴锅中，向锥形瓶中加入0.5g胰蛋白酶和0.1g氯化钙，反应1h；然后将水浴锅温度调至50℃，加入0.5g木瓜蛋白酶和0.2g硫代硫酸钠，进一步反应1h。
(4)反应完全后，将水浴锅温度调至90℃，保持5min，终止反应。将锥形瓶中的液体放入离心机中进行差速离心，离心机购买自润联机械有限公司，设置转速3000rpm，离心5min。离心后提取得到上清液10mL，用甲醛滴定法进行滴定。
所述甲醛滴定法的原理如下：
由于氨基酸是两性电解质，故在水溶液中存在以下平衡：
Figure BDA0001996053640000081
在式中，由于NH3 +弱酸，完全解离时溶液pH值为11以上，故用碱滴定NH3 +所放出的氢离子来测定氨基酸，一般的指示剂变色域小于10，准确指示滴定终点比较困难。而在常温下，甲醛可以迅速与氨基酸的氨基结合为羟甲基化合物，使上式的平衡右移，令NH3 +释放氢离子，从而使得溶液的酸度增加，滴定中和的终点移动至酚酞的变色区域内(pH≈9.0)，因此可以采用酚酞溶液作为指示剂，并用标准的氢氧化钠溶液进行滴定。
其反应式为：
Figure BDA0001996053640000082
根据上述反应式，按如下公式计算出上清液中的氨基酸占丝胶蛋白原料的比例，即丝胶蛋白水解量。
Figure BDA0001996053640000083
式中，V滴表示滴定液消耗体积；V对表示空白对照组滴定液消耗体积；V液表示经过滤离心所得的上清液体积(10mL)；M为丝胶粉的质量(0.9g)；NNaOH标准氢氧化钠溶液的摩尔浓度(0.05mol/L)。
理论计算：30mL的15％的丝胶水溶液与20mL的缓冲溶液混合，在提取完上清液(10mL)后应有0.9g丝胶粉；经甲醛滴定法测算上清液中的氨基酸含量占丝胶粉水解原料总量的38.27％。
实施例3
称取10g纯度≥99％的市售丝胶粉，溶于100mL水中，制成浓度为10％的丝胶水溶液。量取丝胶水溶液30mL，加入20mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，此时溶液的pH值为8，溶液的总体积为50mL。
在37℃时，加入0.25g胰蛋白酶和0.08g氯化钙，反应30分钟，后在50℃时加入0.25g木瓜蛋白酶和0.15g硫代硫酸钠，反应30分钟，共反应1小时。
反应完全后，在90℃的恒温水浴锅中进行5分钟的终止反应。
经甲醛滴定法测定上清液中氨基酸含量占丝胶粉水解原料总量的32.76％。
实施例4
称取10g实施例1制备得到的丝胶粉，溶于100mL水中，制成浓度为10％的丝胶水溶液。量取丝胶水溶液30mL，加入20mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，此时溶液的pH值为8，溶液的总体积为50mL。
在37℃时先0.6g胰蛋白酶和0.15g氯化钙，反应1.5小时，后在50℃时加入0.6g木瓜蛋白酶和0.21g硫代硫酸钠，反应1.5小时，共反应3小时。
反应完全后，在90℃的恒温水浴锅中进行5分钟的终止反应。
经甲醛滴定法测定上清液中氨基酸含量占丝胶粉水解原料总量的38.10％
对比例1
称取10g丝胶粉，溶于100mL水中，制成浓度为10％的丝胶水溶液。量取丝胶水溶液30mL，加入20mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，此时溶液的pH值为8，溶液的总体积为50mL。在50℃时，加入木瓜蛋白酶0.5g，反应30分钟。反应完全后，在90℃的恒温水浴锅中进行5分钟的终止反应。
经甲醛滴定法测定上清液中氨基酸含量占丝胶粉水解原料总量的17.63％。
对比例2
称取15g丝胶粉，溶于100mL水中，制成浓度为15％的丝胶水溶液。量取丝胶水溶液30mL，加入20mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，此时溶液的pH值为8，溶液的总体积为50mL。在37℃时，加入胰蛋白酶0.5g，反应30分钟。反应完全后，在90℃的恒温水浴锅中进行5分钟的终止反应。
经甲醛滴定法测定上清液中氨基酸含量占丝胶粉水解原料总量的17.50％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种丝胶蛋白水解方法，其特征在于，由如下步骤组成：
（1）将丝胶溶于水中，配制成丝胶水溶液；
（2）将所述丝胶水溶液与调节pH的缓冲液混合，调节混合液的pH值为7.5~8.5，得到待水解液；
（3）向所述待水解液中加入胰蛋白酶和氯化钙，36~38℃条件下初步反应0.5~1.5h，得到初步水解液；
（4）向所述初步水解液中加入木瓜蛋白酶和硫代硫酸钠，48~52℃条件下进一步反应0.5~1.5h，得到最终水解液；
所述步骤（3）中胰蛋白酶的添加质量与所述待水解液的体积比为0.2~0.6g：40~60mL；氯化钙的添加质量与所述待水解液的体积比为0.15g~0.3g：100mL；
所述步骤（4）中木瓜蛋白酶的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.2~0.6g：40~60mL；硫代硫酸钠的添加质量与所述初步水解液的体积比为0.3g~0.45g：100mL；
所述步骤（1）中丝胶的质量与水的体积比为10~20g：100mL。
2.根据权利要求1所述的水解方法，其特征在于，所述丝胶的制备方法包括如下步骤：
I，将蚕茧置于水中，110~130℃，0.08~0.12mPa条件下提取30~60min，固液分离，得到提取液；所述蚕茧与水的质量比为1：（15~25）；
II，将所述提取液与活性炭混合，70~90℃条件下脱色20~40min，固液分离，得到脱色后的提取液；
III，将所述脱色后的提取液冷冻干燥，得到丝胶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中调节pH的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的pH值为6~8。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述丝胶水溶液与所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的体积比为2.5~3.5：1.5~2.5。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）进一步反应后，还包括将所述最终水解液置于80~100℃处理3~8min，终止反应。
6.权利要求1~5任一项所述方法制备得到的水解液产品。
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