FR2518573A1

FR2518573A1 - Saccharification of lignocellulosic material - involves pretreatment with delignifying solvent comprising an amine, pref. ethanolamine, and enzymatic hydrolysis

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Publication number: FR2518573A1
Application number: FR8123855A
Authority: FR
Original assignee: BP PLC
Current assignee: BP PLC
Priority date: 1981-12-21
Filing date: 1981-12-21
Publication date: 1983-06-24
Also published as: FR2518573B1

Abstract

Saccharification of lignocellulosic materials comprises a pretreatment followed by an enzymatic hydrolysis by means of celluloses, the improvement being that pretreatment is effected with a delignifying solvent comprising an amine, pref. an ethanolamine, esp. monoethanolamine. Ratio of amine/cellulosic materials is 3-15, pref. 5-10. Pretreatment is at 80-170, pref. 140-170, esp. 160 deg.C. The cellulase pref. originates from Trichoderma reesei. Concn. of lignocellulosic materials in the hydrolysis medium is pref. 0.5-30% by wt. (5-300 g/l.), esp. 1-10% (10-100 g/l.). The process is applicable to various lignocellulosic materials, esp. straw or wood, and results in enzymic degradation of cellulose and hemicelluloses in a relatively short time.

Description

Procédé de saccharification de matières lignocellulosiques au moyen d'un prétraitement par une amine et hydrolyse enzymatique.Process for saccharifying lignocellulosic materials by means of amine pretreatment and enzymatic hydrolysis.

L'invention concerne un procédé de saccharification de matières lignocellulosiques par un procédé en deux stades, comprenant (1) un prétraitement par une amine et (2) hydrolyse enzymatique. The invention relates to a process for saccharifying lignocellulosic materials by a two-stage process, comprising (1) an amine pretreatment and (2) enzymatic hydrolysis.

On connatt différents procédés de transformation de matières cellulosiques en sucre, dont les principaux sont l'hydrolyse acide et lthydrolyse enzymatique. Various processes are known for converting cellulosic materials into sugar, the main ones being acid hydrolysis and enzymatic hydrolysis.

L'hydrolyse acide peut etre mise en oeuvre par des acides dilués ou cohcentrés. The acid hydrolysis may be carried out by dilute or co-concentrated acids.

L'utilisation d'un acide peu concentré a une température de 140-1900C, comme dans le procédé Madison-Scholler permet d'obtenir des rendements en sucres de l'ordre de- 50% avec comme produit final une solution très diluée en sucre contenant des sous-produits gênants. L'augmentation du rendement peut être obtenue en utilisant des températures plus élevées, mais on ne dépasse pas un rendement de 70%. The use of a low concentrated acid has a temperature of 140-1900C, as in the Madison-Scholler process allows to obtain yields of sugars in the order of 50% with as a final product a very dilute solution in sugar containing annoying byproducts. The increase in yield can be achieved by using higher temperatures, but not more than 70% yield.

L'utilisation d'un acide concentré donne de meilleurs résultats, mais fait intervenir un recyclage de cet acide, triés coûteux en énergie. The use of a concentrated acid gives better results, but involves a recycling of this acid, sorted expensive in energy.

Les procédés d'hydrolyse acide posent en outre des problèmes de corrosion et nécessitent l'utilisation de matériaux coûteux. Acidic hydrolysis processes also pose corrosion problems and require the use of expensive materials.

L'hydrolyse enzymatique est nettement plus avantageuse, notamment elle est mise en oeuvre une température modérée, de l'ordre de 40-600C et donne de bons rendements de transformation en sucre. The enzymatic hydrolysis is clearly more advantageous, in particular it is carried out at a moderate temperature, of the order of 40-600C and gives good yields of sugar conversion.

L'application de l'hydrolyse enzymatique S la transformation des matériaux lignocellulosiques a fait l'objet de nombreux travaux. The application of enzymatic hydrolysis to the transformation of lignocellulosic materials has been the subject of much work.

Deux difficultés ont été mises en évidence dues d'une part à la structure cristalline de la cellulose qui gène l'attaque des liaisons glucosidiques par les enzymes et d'autre part à la présence de lignine qui protège la cellulose de l'attaque des enzymes. Two difficulties have been highlighted due firstly to the crystalline structure of the cellulose which blocks the attack of glucosidic bonds by the enzymes and secondly to the presence of lignin which protects the cellulose from the attack of the enzymes .

La difficulté due a la structure cristalline de la cellulose peut être résolue, comme l'a montré Reese, en utilisant les cellulases issues du champignon Trichoderma reesei En effet, la cellulase C1 obtenue a partir de ce champignon, détruit la structure cristalline de la cellulose et permet l'attaque des autres cellulases jusqu'a la dégradation finale en glucose
L'élimination de la lignine qui est nécessaire pour augmenter la surface de contact entre la cellulose et les enzymes peut s'accompagner, suivant le procédé employé, d'une réduction de la structure cristalline de la cellulose et peut etre obtenue de diverses manières On connaît notamment
(a) le traitement du-type fabrication de pite a papier;
(b) l'attaque microbienne de la lignine;
(c) l'utilisation de solvants sélectifs de la cellulose;;
(d) l'utilisation de solvants délignifiant;
Le prétraitement du type iabrication de pâte à papier, ne convient pas comme prétraitement pour la saccharification de la cellulose car il nécessite l'utilisation d'un autoclave, de températures et pressions élevées et est par conséquent cot- teux en frais d'installation et en énergie
L'attaque microbienne de la lignine présente l1inccnvé- nient d'être très lente
L'utilisation d'un solvant sélectif de la cellulose permet d'obtenir une cellulose facilement attaquée par hydrolyse enzymatique Ce procédé décrit par TSAO et LADISCH, dans l'article intitulé cellulose to sugars" in "SCIENCE" 201 (1978) 743-745 préconise comme solvant de la cellulose le "Cadoxène", obtenu en dissolvant 5% d'oxyde de cadmium dans 28% d'éthylènediamine en solution aqueuse Le "Cadoxène" détruit la structure cristalline de la cellulose; cependant un tel solvant se prête mal - une utilisation industrielle du fait de sa toxicité En outre, l'utilisation d'un solvant de la cellulose présente l'inconvénient de nécessiter une tape supplémentaire de reprécipitation de la cellulose dissoute
Le prétraitement utilisant un solvant délignifiant est décrit notamment dans le brevet U.8. 3-585*104*
Ce brevet préconise l'élimination de la lignine et des hémicelluloses par cuisson des matières lignocellulosiques au moyen d'alcools et/ou de cétones aliphatiques inférieures et de préférence au moyen de l'éthanol en solution aqueuse a 20-758,
Ce prétraitement favorise l'hydrolyse enzymatique, cependant une durée d'hydrolyse d'au moins 48 heures est nécessaire pour obtenir une conversion satisfaisante de la cellulose.The difficulty due to the crystalline structure of the cellulose can be solved, as Reese has shown, by using the cellulases derived from the fungus Trichoderma reesei. Indeed, the cellulase C1 obtained from this fungus destroys the crystalline structure of the cellulose. and allows the attack of other cellulases until the final degradation in glucose
The elimination of lignin which is necessary to increase the contact area between the cellulose and the enzymes can be accompanied, according to the method employed, by a reduction of the crystalline structure of the cellulose and can be obtained in various ways. especially knows
(a) the treatment of the type-making of paper pulp;
(b) microbial attack of lignin;
(c) the use of selective solvents of cellulose;
(d) the use of delignifying solvents;
Pretreatment of the paper pulp type is not suitable as pretreatment for the saccharification of cellulose because it requires the use of an autoclave, high temperatures and pressures and is therefore costly in installation costs. in energy
The microbial attack of lignin has the disadvantage of being very slow
The use of a selective cellulose solvent makes it possible to obtain a cellulose easily attacked by enzymatic hydrolysis. This process, described by TSAO and LADISCH, in the article entitled cellulose to sugars "in" SCIENCE "201 (1978) 743-745 recommends as a cellulose solvent "Cadoxene", obtained by dissolving 5% of cadmium oxide in 28% of ethylenediamine in aqueous solution "Cadoxene" destroys the crystalline structure of cellulose, however such a solvent is not suitable - In addition, the use of a cellulose solvent has the disadvantage of requiring an additional tape of reprecipitation of the dissolved cellulose.
Pretreatment using a delignifying solvent is described in particular in the U.8 patent. 3-585 * 104 *
This patent recommends the elimination of lignin and hemicelluloses by firing lignocellulosic materials with alcohols and / or lower aliphatic ketones and preferably using ethanol in aqueous solution at 20-758,
This pretreatment promotes enzymatic hydrolysis, however a hydrolysis time of at least 48 hours is necessary to obtain a satisfactory conversion of the cellulose.

La demanderesse a découvert qu'il est possible de réaliser la saccharification enzymatique des matières lignocellulosiques, pratiquement en 24 heures, en utilisant avant la saccharification un prétraitement par une amine et de préférence par une éthanolamine. The Applicant has discovered that it is possible to carry out the enzymatic saccharification of lignocellulosic materials, practically in 24 hours, using before pretreatment pretreatment with an amine and preferably with ethanolamine.

On entend par n saccharification de matières lignocellulosiques" la saccharification de la cellulose et des hemicelluloses se trouvant dans les matières lignocellulosiquesi
L'invention a par conséquent pour objet un procédé de saccharification de matières lignocellulosiques comprenant un prétraitement suivi d'une hydrolyse enzymatique au moyen de cellulases, caractérisé par le fait que le prétraitement est réalisé au moyen d'un solvant délignifiant, choisi parmi les amines et de préférence parmi les éthanolamines. "Saccharification of lignocellulosic materials" means the saccharification of cellulose and hemicelluloses in lignocellulosic materials.
The subject of the invention is therefore a process for the saccharification of lignocellulosic materials comprising pretreatment followed by enzymatic hydrolysis by means of cellulases, characterized in that the pretreatment is carried out using a delignifying solvent chosen from amines and preferably from ethanolamines.

Le prétraitement selon l'invention peut être appliqué à toute sorte de matières lignocellulosiques, notamment la paille ou au bois et permet d'obtenir une dégradation enzymatique de la cellulose et des hemicelluloses en un temps relativement très court. The pretreatment according to the invention can be applied to any kind of lignocellulosic material, in particular straw or wood, and makes it possible to obtain an enzymatic degradation of cellulose and hemicelluloses in a relatively very short time.

Le procédé selon l'invention est essentiellement caractérisé par le fait qu'on soumet la matière lignocellulosique à l'action d'un solvant délignifiant choisi parmi les amines et de préférence parmi les éthanolamines (monoéthanolamine, diéthanolamine et triéthanolamine) Ce prétraitement est suivi d'une hydrolyse enzymatique utilisant les cellulases provenant de bactéries ou de champignons. La mise en oeuvre d'un tel procédé permet d'obtenir, d'une manière tout a fait inattendue, un rendement en sucre de l'ordre de 908 à 95%, après seulement 24 heures d'hydrolyse enzymatique. The process according to the invention is essentially characterized by the fact that the lignocellulosic material is subjected to the action of a delignifying solvent chosen from amines and preferably from ethanolamines (monoethanolamine, diethanolamine and triethanolamine). This pretreatment is followed by enzymatic hydrolysis using cellulases from bacteria or fungi. The implementation of such a method makes it possible to obtain, quite unexpectedly, a yield of sugar of the order of 908 to 95%, after only 24 hours of enzymatic hydrolysis.

Un tel résultat est surprenant car les prétraitements appliqués jusqu'ici ne permettaient d'obtenir des rendements de cet ordre qu'après 48 heures ou plus d'hydrolyse enzymatique. Such a result is surprising because the pretreatments applied hitherto made it possible to obtain yields of this kind only after 48 hours or more of enzymatic hydrolysis.

Le prétraitement peut être effectué en présence d'une amine, -avantageusement d'une éthanolamine et de préférence en présence de monoéthanolamine, a une température de 80 a 170 C avantageusement de 1400 a 17O0C et plus avantageusement â 1600C, Le rapport en poids amine utilisée pour le prétraitement : matières lignocellulosiques, peut varier entre 3 : 1 et 15 : 1 et de préférence entre 5 : 1 et 10 : 1, suivant la nature et la taille des particules des matières lignocellulosiques mise en oeuvre. The pretreatment can be carried out in the presence of an amine, advantageously an ethanolamine and preferably in the presence of monoethanolamine, at a temperature of 80 to 170 ° C., advantageously from 1400 to 170 ° C. and more advantageously at 1600 ° C. The amine weight ratio used for pretreatment: lignocellulosic materials, can vary between 3: 1 and 15: 1 and preferably between 5: 1 and 10: 1, depending on the nature and size of the lignocellulosic material particles used.

Apres prétraitement, le produit de la réaction peut être séparé de l'amine par n'importe quel moyen approprié, par exemple par essorage ou filtration Le gateau obtenu peut éventuellement être lavé avec l'amine utilisée pour le pre- traitement, ce lavage étant suivi de plusieurs lavages l'eau Entre les différents lavages on procède avantageusement à un essorage ou une filtration. Avant l'essorage final, on effectue avantageusement un défibrage. After pretreatment, the product of the reaction can be separated from the amine by any suitable means, for example by dewatering or filtration. The cake obtained can optionally be washed with the amine used for the pre-treatment, this washing being followed by several washes water Between the different washes is advantageously carried out a spin or filtration. Before the final spin, it is advantageously carried out a defibration.

Le procédé selon l'invention sera mieux compris à l'aide des exemples non limitatifs ci-après
EXEMPLES DE PRETRAITEMENT
EXEMPLE 1
Dans un réacteur en acier inoxydable, muni d'un agitateur, on introduit successivement 500 g de paille de blé broyée (poids sec 450 g) et 5'kg de monoéthanolamine. La température est portée a 1600C, en l'espace de 2 heures, et on maintient S cette température pendant 1 heure.The process according to the invention will be better understood with the aid of the following nonlimiting examples
EXAMPLES OF PRETREATMENT
EXAMPLE 1
500 g of milled wheat straw (dry weight 450 g) and 5 kg of monoethanolamine are introduced successively into a stainless steel reactor equipped with an agitator. The temperature is raised to 1600 ° C. in the course of 2 hours, and this temperature is maintained for 1 hour.

Le produit obtenu est essoré 5000 tours/minute. Le gâteau est lavé avec 2,5 kg de monoéthanolamine puis essoré. The product obtained is drained at 5000 rpm. The cake is washed with 2.5 kg of monoethanolamine and then wrung.

Le gâteau est ensuite lavé avec 2,5 litres d'eau, puis essoré
Cette opération est effectuée deux fois.The cake is then washed with 2.5 liters of water and then wrung
This operation is performed twice.

Les produits- prétraités sont ensuite soumis a une hydrolyse enzymatique. The pretreated products are then subjected to enzymatic hydrolysis.

EXEMPLE 2
Dans un réacteur identique 9 celui de l'exemple 1, on introduit successivemment 1 kg de copeaux de bois de hêtre (ayant un poids sec de 900 g) et 10 kg de monoéthanolamine. On met en marche l'agitation a 500 tours/minute, on porte la température à 1600C, l'augmentation de température étant de 800C/heure. Ce traitement est poursuivi a cette température pendant 3 heures. Après refroidissement, le produit obtenu est essoré à 5000 tours/minute.EXAMPLE 2
In a reactor identical to that of Example 1, 1 kg of beech wood chips (having a dry weight of 900 g) and 10 kg of monoethanolamine are introduced successively. The agitation is started at 500 revolutions / minute, the temperature is raised to 1600C, the temperature increase being 800C / hour. This treatment is continued at this temperature for 3 hours. After cooling, the product obtained is drained at 5000 rpm.

On obtient un gâteau constitué principalement d'un mélange de matière cellulosique et d'amine. Ce gâteau est lavé avec 20 litres d'eau 9 la température ambiante puis essoré. A cake consisting mainly of a mixture of cellulosic material and amine is obtained. This cake is washed with 20 liters of water at room temperature and then wrung out.

Cette opération est effectuée quatre fois.This operation is performed four times.

HYDROLYSE ENZYMATIQUE
La température de l'hydrolyse enzymatique, choisie pour une activité optimale des enzymes utilisés, est généralement comprise entre 30 et 600C et de préférence entre 35 et 55 C
Les matières cellulosiques sont mises en suspens ion dans l'eau, une concentration de 0,1 a 50% en poids (1 a 500 g/l), avantageusement de 0,5 a 30% en poids (5 a 300 g/l) et de préférence de 1 a 10% en poids (10 a 100 g/l). ENZYMATIC HYDROLYSIS
The temperature of the enzymatic hydrolysis, chosen for optimum activity of the enzymes used, is generally between 30 and 600 ° C. and preferably between 35 and 55 ° C.
The cellulosic materials are suspended in water, a concentration of 0.1 to 50% by weight (1 to 500 g / l), preferably 0.5 to 30% by weight (5 to 300 g / l). ) and preferably from 1 to 10% by weight (10 to 100 g / l).

Les enzymes sont ajoutés S la suspension, sous forme de poudre ou de solution dans l'eau, de façon a obtenir- un rapport enzyme commercial : matières cellulosiques de 10-4 a 2, avantageusement de 10 à 1,5 et de préférence de 10-1 a 1. The enzymes are added to the suspension, in the form of a powder or a solution in water, so as to obtain a commercial enzyme ratio: cellulosic materials of 10-4 to 2, advantageously 10 to 1.5 and preferably 10-1 to 1.

L'hydrolyse est effectuée a un pH constant, compris entre 3,5 et 6 et de préférence entre 4 et 5,5. Cette acidité constante est maintenue au moyen de milieux tampons ou d'une neutralisation continue. The hydrolysis is carried out at a constant pH of between 3.5 and 6 and preferably between 4 and 5.5. This constant acidity is maintained by means of buffer media or continuous neutralization.

Afin d'éviter une dégradation par.attaque microbienne des sucres formés au cours de l'hydrolyse, la suspension de matière cellulosique peut être stérilisée avant l'hydrolyse ou être additionnée d'un antibiotique. In order to avoid degradation by microbial attack of the sugars formed during hydrolysis, the suspension of cellulosic material can be sterilized before hydrolysis or be supplemented with an antibiotic.

La progression de l'hydrolyse est suivie en dosant le glucose formé, par la méthode spécifique de Boehringer et les sucres réducteurs totaux (hexoses + pentoses) par la méthode a l'acide dinitro-3,5 salicylique (DNS). The progress of the hydrolysis is monitored by assaying the glucose formed, by the specific Boehringer method and the total reducing sugars (hexoses + pentoses) by the 3,5-dinitro-salicylic acid (DNS) method.

EXEMPLES 3 A 14
Dans un réacteur de 4 litres contenant 3 litres -d'eau distillée, on met en suspension des matieres cellulosiques provenant des prétraitements décrits dans les exemples 1 et 2. EXAMPLES 3 TO 14
In a 4-liter reactor containing 3 liters of distilled water, cellulosic materials from the pretreatments described in Examples 1 and 2 are suspended.

On utilise respectivement 1%, 3% et 10% en poids de matière cellulosique par rapport l'eau. 1%, 3% and 10% by weight of cellulosic material with respect to water are used respectively.

On utilise des cellulases. Trichoderma reesei (marques
MILES) contenant 490 mg de protéines par gramme d'enzyme commercial, sous forme de poudre, qu'on ajoute au milieu de manière a obtenir le rapport en poids enzyme : matière cellulosique désiré. Ce rapport est dans les exemples respectivement de 0,1 et i. Cellulases are used. Trichoderma reesei (marks
MILES) containing 490 mg of protein per gram of commercial enzyme, in powder form, which is added to the medium to obtain the desired enzyme: cellulosic material weight ratio. This ratio is in the examples respectively of 0.1 and i.

Le pH est maintenu 4,8 par un tampon au citrate de sodium. The pH is maintained at 4.8 by sodium citrate buffer.

La température est maintenue 500C pendant la durée de 1 'hydrolyse
L'évolution de l'hydrolyse est suivie pendant 48 heures en faisant des prélèvements et en dosant les sucres formés. The temperature is maintained at 500 ° C. for the duration of the hydrolysis
The evolution of the hydrolysis is monitored for 48 hours by taking samples and measuring the sugars formed.

Les conditions opératoires et les résultats figurent sur les tableaux 1 et 2. The operating conditions and results are shown in Tables 1 and 2.

Le taux de conversion indiqué correspond au rapport en poids sucres réducteurs totaux produits : sucres potentiels présents dans les matières cellulosiques utilises pour l'hydrolyse. The conversion ratio indicated corresponds to the ratio by weight of total reducing sugars produced: potential sugars present in the cellulosic materials used for the hydrolysis.

TABLEAU 1
Hydrolyse de paille prétraitée

TABLE 1
Hydrolysis of pretreated straw

<tb> Teneur <SEP> en <SEP> matières <SEP> i <SEP> <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> cellulosiques, <SEP> % <SEP> poids
<tb> Concentration <SEP> d'en
<tb> zymes, <SEP> % <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> ::matières
<tb> cellulosiques, <SEP> rap
<tb> port <SEP> en <SEP> poids
<tb> Taux <SEP> de <SEP> conversion
<tb> après <SEP> une <SEP> durée
<tb> d'hydrolyse <SEP> de
<tb> <SEP> 5 <SEP> heures <SEP> 0,50 <SEP> 0,85 <SEP> 0,60 <SEP> 0,93 <SEP> 0,32 <SEP> 0, <SEP> j
<tb> <SEP> 24 <SEP> heures <SEP> 0,90 <SEP> 0,98 <SEP> 0,74 <SEP> 0,97 <SEP> 0,42 <SEP> 0,8
<tb> <SEP> 48 <SEP> heures <SEP> 0,99 <SEP> 0,99 <SEP> 0,95 <SEP> 0,99 <SEP> 0,60 <SEP> 0,9
<tb>
TABLEAU 2
Hydrolyse de copeaux de bois prétraités

<tb> Content <SEP> in <SEP> materials <SEP> i <SEP><SEP> 3 <SEP> 10
<tb> cellulosic, <SEP>% <SEP> weight
<tb> Concentration <SEP> of en
<tb> zymes, <SEP>% <SEP> in <SEP> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> :: Materials
<tb> cellulosic, <SEP> rap
<tb> port <SEP> in <SEP> weight
<tb> Rate <SEP> of <SEP> conversion
<tb> after <SEP> one <SEP> duration
<tb> hydrolysis <SEP> of
<tb><SEP> 5 <SEP> hours <SEP> 0.50 <SEP> 0.85 <SEP> 0.60 <SEP> 0.93 <SEP> 0.32 <SEP> 0, <SEP> j
<tb><SEP> 24 <SEP> hours <SEP> 0.90 <SEP> 0.98 <SEP> 0.74 <SEP> 0.97 <SEP> 0.42 <SEP> 0.8
<tb><SEP> 48 <SEP> hours <SEP> 0.99 <SEP> 0.99 <SEP> 0.95 <SEP> 0.99 <SEP> 0.60 <SEP> 0.9
<Tb>
TABLE 2
Hydrolysis of pretreated wood chips

<tb> Teneur <SEP> en <SEP> matières
<tb> cellulosiques, <SEP> % <SEP> en
<tb> poids <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> Concentration <SEP> d'en
<tb> zymes <SEP> % <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> matières <SEP> cel
<tb> lulosiques, <SEP> rapport <SEP> en
<tb> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb> Taux <SEP> de <SEP> conversion
<tb> Taux <SEP> de <SEP> conversion
<tb> après <SEP> une <SEP> durée
<tb> d'hydrolyse <SEP> de
<tb> <SEP> 5 <SEP> heures <SEP> 0,40 <SEP> 0,78 <SEP> 0,52 <SEP> 0,90 <SEP> 0,35 <SEP> 0, <SEP> 65i <SEP>
<tb> <SEP> 24 <SEP> heures <SEP> 0,81 <SEP> 0,98 <SEP> 0,70 <SEP> 0,95 <SEP> 0,47 <SEP> 0,85
<tb> <SEP> 48 <SEP> heures <SEP> 0,98 <SEP> 0,98 <SEP> 0,94 <SEP> 0,98 <SEP> 0,65 <SEP> 0,9 <SEP>
<tb>
Afin de mieux mettre en évidence l'influence du prétraitement, selon l'invention, sur l'hydrolyse enzymatique, on a réalisé des essais comparatifs sur les mêmes-matières lignocellulosiques, en utilisant des prétraitements différents, à savoir broyage ou hydrolyse acide. L'influence de ces prétraitements sur les rendements de l'hydrolyse enzymatique est illustrée par les exemples 15 ci.27 ci-aprèas
EXEMPLES 15 A 26 (exemples de comparaison)
Les matériaux lignocellulosiques utilisés comme matière première dans les exemples 1 et 2 sont broyés pour obtenir des particules d'une taille moyenne de 1 mm qu'on soumet a une hydrolyse enzymatique, dans les mêmes conditions que dans les exemples 3 a 14. Les conditions utilisées et les résultats obtenus sont indiqués sur les tableaux 3 et 4 ci-dessous. <tb> Content <SEP> in <SEP> materials
<tb> cellulosic, <SEP>% <SEP> in
<tb> weight <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> Concentration <SEP> of en
<tb> zymes <SEP>% <SEP> in <SEP> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> materials <SEP> cel
<tb> lulosics, <SEP> report <SEP> en
<tb> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1
<tb> Rate <SEP> of <SEP> conversion
<tb> Rate <SEP> of <SEP> conversion
<tb> after <SEP> one <SEP> duration
<tb> hydrolysis <SEP> of
<tb><SEP> 5 <SEP> hours <SEP> 0.40 <SEP> 0.78 <SEP> 0.52 <SEP> 0.90 <SEP> 0.35 <SEP> 0, <SEP> 65i <September>
<tb><SEP> 24 <SEP> hours <SEP> 0.81 <SEP> 0.98 <SEP> 0.70 <SEP> 0.95 <SEP> 0.47 <SEP> 0.85
<tb><SEP> 48 <SEP> hours <SEP> 0.98 <SEP> 0.98 <SEP> 0.94 <SEP> 0.98 <SEP> 0.65 <SEP> 0.9 <SEP>
<Tb>
In order to better demonstrate the influence of the pretreatment, according to the invention, on enzymatic hydrolysis, comparative tests were carried out on the same lignocellulosic materials, using different pretreatments, namely grinding or acid hydrolysis. The influence of these pretreatments on the yields of the enzymatic hydrolysis is illustrated by examples 15 below.
EXAMPLES 15 TO 26 (Comparison examples)
The lignocellulosic materials used as raw material in Examples 1 and 2 are milled to obtain particles of an average size of 1 mm which are subjected to enzymatic hydrolysis, under the same conditions as in Examples 3 to 14. The conditions used and the results obtained are shown in Tables 3 and 4 below.

TABLEAU 3
Hydrolyse de la paille de blé prétraitée par broyage

TABLE 3
Hydrolysis of pretreated wheat straw by grinding

<tb> Teneur <SEP> en <SEP> matières
<tb> cellulosiques, <SEP> %
<tb> poids <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> Concentration <SEP> d'en
<tb> zymes, <SEP> % <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> ::matières
<tb> cellulosiques, <SEP> rap
<tb> port <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb> Taux <SEP> de <SEP> conversion
<tb> après <SEP> une <SEP> durée
<tb> d'hydrolyse <SEP> de
<tb> <SEP> 5 <SEP> heures <SEP> 0,01 <SEP> 0,02 <SEP> 0,01 <SEP> 0,03 <SEP> 0,02 <SEP> 0,0
<tb> <SEP> 48 <SEP> heures <SEP> 0,07 <SEP> 0,27 <SEP> 0,05 <SEP> 0,25 <SEP> 0,05 <SEP> 0,2
<tb>
TABLEAU 4
Hydrolyse de copeaux de bois de hêtre prétraités par broyage

<tb> Content <SEP> in <SEP> materials
<tb> cellulosic, <SEP>%
<tb> weight <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> Concentration <SEP> of en
<tb> zymes, <SEP>% <SEP> in <SEP> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> :: Materials
<tb> cellulosic, <SEP> rap
<tb> port <SEP> in <SEP> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1
<tb> Rate <SEP> of <SEP> conversion
<tb> after <SEP> one <SEP> duration
<tb> hydrolysis <SEP> of
<tb><SEP> 5 <SEP> hours <SEP> 0.01 <SEP> 0.02 <SEP> 0.01 <SEP> 0.03 <SEP> 0.02 <SEP> 0.0
<tb><SEP> 48 <SEP> hours <SEP> 0.07 <SEP> 0.27 <SEP> 0.05 <SEP> 0.25 <SEP> 0.05 <SEP> 0.2
<Tb>
TABLE 4
Hydrolysis of beech wood chips pretreated by grinding

<tb> Teneur <SEP> en <SEP> matières
<tb> cellulosiques, <SEP> % <SEP> en
<tb> poids <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb> <SEP> centration <SEP> d'en
<tb> <SEP> es, <SEP> % <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP> :<SEP> matières
<tb> cellulosiques,
<tb> Rapport <SEP> en <SEP> poids <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1 <SEP> 1
<tb> <SEP> 0,1 <SEP> 1 <SEP> 0,1
<tb> <SEP> 1
<tb> Taux <SEP> de <SEP> conversion
<tb> <SEP> d'hydrolyse <SEP> de
<tb> <SEP> 5 <SEP> heures <SEP> 0 <SEP> 0,02 <SEP> 0,01 <SEP> 0,02 <SEP> 0,01 <SEP> 0,02
<tb> <SEP> 48 <SEP> heures <SEP> 0,05 <SEP> 0,20 <SEP> 0,03 <SEP> 0,21 <SEP> 0,03 <SEP> 0,18
<tb>
On constate que l'hydrolyse enzymatique de matières lignocellulosiques n'ayant pas subi le prétraitement selon l'invention donne des rendements beaucoup plus faibles
EXEMPLE 27
Dans un réacteur en acier inoxydable, muni d'un agitateur, on introduit successivement 500 g de paille.de blé hachée, identique a celle utilisée pour l'exemple 1, et 5 litres d'acide sulfurique a 0,5t en poids.Le prétraitement acide est effectué pendant 2 heures à 1000C, Le produit obtenu est essoré puis lavé deux fois à l'eau. Après ce traitement, la paille contient-45,5% en poids de cellulose, 19% en poids d'hémicellulose et 17% en poids de lignine.<tb> Content <SEP> in <SEP> materials
<tb> cellulosic, <SEP>% <SEP> in
<tb> weight <SEP> 1 <SEP> 3 <SEP> 10
<tb><SEP> centration <SEP> of en
<tb><SEP> es, <SEP>% <SEP> in <SEP> weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.3 <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Enzymes <SEP>: <SEP> materials
<tb> cellulosic,
<tb> Ratio <SEP> in <SEP> Weight <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1 <SEP> 1
<tb><SEP> 0.1 <SEP> 1 <SEP> 0.1
<tb><SEP> 1
<tb> Rate <SEP> of <SEP> conversion
<tb><SEP> of hydrolysis <SEP> of
<tb><SEP> 5 <SEP> hours <SEP> 0 <SEP> 0.02 <SEP> 0.01 <SEP> 0.02 <SEP> 0.01 <SEP> 0.02
<tb><SEP> 48 <SEP> hours <SEP> 0.05 <SEP> 0.20 <SEP> 0.03 <SEP> 0.21 <SEP> 0.03 <SEP> 0.18
<Tb>
It is found that the enzymatic hydrolysis of lignocellulosic materials which have not undergone the pretreatment according to the invention gives much lower yields.
EXAMPLE 27
500 g of milled wheat straw, identical to that used for Example 1, and 5 liters of sulfuric acid at 0.5% by weight are introduced successively into a stainless steel reactor equipped with a stirrer. acid pretreatment is carried out for 2 hours at 1000C. The product obtained is drained and then washed twice with water. After this treatment, the straw contains 45.5% by weight of cellulose, 19% by weight of hemicellulose and 17% by weight of lignin.

La paille prétraitée est soumise ! un traitement d'hydrolyse enzymatique, dans des conditions identiques à celles utilisées dans les exemples 3 à 14. La teneur en matière cellulosique est de 1% en poids (10 g/l) et le rapport enzyme : matière cellulosique est de 1,
Après 24 heures d'hydrolyse, le taux de conversion des sucres potentiels, présents dans la paille prétraitée, en sucres réducteurs totaux est de 0,58. Pretreated straw is subject! an enzymatic hydrolysis treatment, under conditions identical to those used in Examples 3 to 14. The content of cellulosic material is 1% by weight (10 g / l) and the enzyme: cellulosic material ratio is 1,
After 24 hours of hydrolysis, the conversion rate of the potential sugars, present in the pretreated straw, into total reducing sugars is 0.58.

Les résultats obtenus par l'hydrolyse enzymatique des matières lignocellulosiques prétraitées par broyage ou par hydrolyse acide dans les exemples 15 à 27, montrent que même avec une faible teneur en matière cellulosique à hydrolyser et des rapports enzymes/matières cellulosiques élevés, les taux de conversion sont beaucoup plus faibles que par le procédé selon l'invention
Le mécanisme par lequel le procédé de prétraitement selon l'invention agit sur l'hydrolyse n'est pas tout à fait élucidé, cependant, on a découvert que les éthanolamines et plus particulièrement la monoéthanolamine favorisent, dans certaines conditions, la croissance des champignons Trichoderma reesei qui produit les cellulases utilisées au cours de la degrada- tion enzymatique. Cette action est illustrée par les exemples suivants dans lesquels plusieurs solvants délignifiants ont été essayés à diverses concentrations.The results obtained by the enzymatic hydrolysis of the lignocellulosic materials pretreated by grinding or by acid hydrolysis in Examples 15 to 27, show that even with a low content of cellulosic material to be hydrolysed and high ratios of enzymes / cellulosic materials, the conversion rates are much lower than by the method according to the invention
The mechanism by which the pretreatment process according to the invention acts on the hydrolysis is not fully understood, however, it has been found that ethanolamines and more particularly monoethanolamine favor, under certain conditions, the growth of Trichoderma mushrooms. reesei which produces the cellulases used during enzymatic degrada- tion. This action is illustrated by the following examples in which several delignifying solvents were tested at various concentrations.

EXEMPLES 28 A 39
Une souche de Trichoderma reesei est cultivée (inoculum 0,8 g/l) dans un milieu liquide contenant du malt, de l'extrait de levure et le solvant étudié
L'incubation est réalisée dans un incubateur orbital pendant 72 heures d 290C
L'effet des solvants sur la croissance est évalué par examen microscopique, par détermination de la vitalité et par mesure du poids sec par comparaison avec des cultures témoins effectuées en l'absence de solvant
L'influence des différents solvants est indiquée de la manière suivante dans le tableau 5 ci-après. EXAMPLES 28 TO 39
A strain of Trichoderma reesei is cultured (inoculum 0.8 g / l) in a liquid medium containing malt, yeast extract and the solvent studied
Incubation is performed in an orbital incubator for 72 hours of 290C
The effect of solvents on growth is evaluated by microscopic examination, vitality determination and dry weight measurement compared with control cultures in the absence of solvent.
The influence of the different solvents is indicated as follows in Table 5 below.

O sans influence
0+ influence légèrement favorable
0- influence légèrement défavorable
D influence défavorable
I inhibition de la croissance. O without influence
0+ slightly favorable influence
0- slightly unfavorable influence
D adverse influence
I inhibition of growth.

TABLEAU 5

TABLE 5

<tb> Concen <SEP> < <SEP> Solvant
<tb> tration <SEP> \ <SEP> testé
<tb> dans <SEP> le <SEP> milieu <SEP> Diméthyl <SEP> Ethylène <SEP> Monoétha
<tb> g/l <SEP> \ <SEP> sulfoxyde <SEP> diamine <SEP> nolamine
<tb> <SEP> 0,25 <SEP> 0- <SEP> D <SEP> 0+
<tb> <SEP> 0,5 <SEP> o~ <SEP> O- <SEP> D
<tb> <SEP> 1 <SEP> O- <SEP> D
<tb> <SEP> 5 <SEP> .<SEP> I <SEP> I
<tb>
Les résultats obtenus montrent, qu' certaines concentrations, la monoéthanolamine exerce, d'une manière inattendue, une influence favorable sur la croissance de Trichoderma reesei
Un autre avantage inattendu du procédé selon l'invention est par conséquent que l'on peut cultiver le champignon
Trichoderma-reesei sur les matières cellulosiques à hydrolyser et produire ainsi d'une manière plus économique des enzymes non contaminés et mieux a-daptés- aux matières cellulosiques å traiter
Les enzymes obtenus au cours de la culture peuvent-être utiliséS directement, après séparation du milieu, par tout moyen connu.<tb> Concen <SEP><<SEP> Solvent
<tb> tration <SEP> \ <SEP> tested
<tb> in <SEP> the <SEP> medium <SEP> Dimethyl <SEP> Ethylene <SEP> Monoetha
<tb> g / l <SEP> \ <SEP> sulfoxide <SEP> diamine <SEP> nolamine
<tb><SEP> 0.25 <SEP> 0- <SEP> D <SEP> 0+
<tb><SEP> 0.5 <SEP> o ~ <SEP> O- <SEP> D
<tb><SEP> 1 <SEP> O- <SEP> D
<tb><SEP> 5 <SEP>. <SEP> I <SEP> I
<Tb>
The results obtained show that, at certain concentrations, monoethanolamine unexpectedly has a favorable influence on the growth of Trichoderma reesei.
Another unexpected advantage of the process according to the invention is therefore that the mushroom can be cultivated.
Trichoderma-reesei on cellulosic materials to be hydrolysed and thus to produce more economically uncontaminated and better adapted enzymes for cellulosic materials to be treated
The enzymes obtained during the cultivation can be used directly, after separation of the medium, by any known means.

La production de cellulases partir du champignon
Trichoderma reesei peut être réalisée, en fioles à toxines aérées et agitées Selon un mode de réalisation préféré l'ae- ration est de 25 1/heurte pendant les quatre premiers jours puis de 15 1/heurte par la suite.Cellulase production from the fungus
Trichoderma reesei can be performed in aerated and agitated toxin flasks. According to a preferred embodiment the aeration is 25 1 / h for the first 4 days and then 1 h / h thereafter.

L'agitation peut être réalisée au moyen par exemple d'un agitateur à va-et-vient å raison de 40 cycles par minute. La température est avantageusement de 290C environ
Le milieu de culture peut être, par exemple de la paille prétraitée, dans les conditions de l'exemple 1, à une concentration d'environ 1% (10 g/I). Les solutions de cellulases sont avantageusement recueillies par filtration sur filtre
Millipore de diamètre 0,45 microns Stirring may be effected by means of, for example, a reciprocating shaker at the rate of 40 cycles per minute. The temperature is advantageously about 290 ° C.
The culture medium may be, for example pretreated straw, under the conditions of Example 1, at a concentration of about 1% (10 g / I). Cellulase solutions are advantageously collected by filter filtration
Millipore diameter 0.45 microns

Claims

Process for the saccharification of lignocellulosic materials comprising pretreatment followed by enzymatic hydrolysis by means of cellulases, characterized in that the pretreatment is carried out using a delignifying solvent chosen from amines and preferably from ethanolamines.

2. Method according to claim 1, characterized in that monoethanolamine is used as ethanolamine,

3. Process according to claims 1 and 2, characterized in that the amine: cellulosic material ratio is from 3 to 15 and preferably from 5 to 10.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that the pretreatment is carried out at a temperature of 80 to 1700C,

5. Method according to claim 4, characterized in that the pretreatment is carried out at a temperature of 140 to 1700C.

6. Process according to Claim 5, characterized in that the pretreatment is carried out at a temperature of approximately 1600 ° C,

7. Method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the enzymatic hydrolysis is carried out using cellulases from Trichoderma reesei

8. Process according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the concentration of the hydrolysis medium lignocellulosic materials is 0.5 to 30% by weight (5 to 300 g / l).

9. Process according to claim 8, characterized in that the concentration of the hydrolysis medium in lignocellulosic material is from 1 to 10% by weight (10 to 100 g / l).

Process according to any one of Claims 1 to 9, characterized in that during the enzymatic hydrolysis the enzyme: lignocellulosic material ratio is 10 -4 2.

he. Process according to Claim 10, characterized in that the enzyme: lignocellulosic material ratio is 10-2 to 1.5.

12. The method of claim 11, characterized in that the weight ratio enzyme: lignocellulosic materials is 10-1 to 1.

13. Process according to claims 1 to 12, characterized in that the hydrolysis temperature is 35 to 55 ° C.

14. Process according to claims 1 to 14, characterized in that the pH of the hydrolysis medium is 3.5 to 6.

15. The method of claim 14, characterized in that the pH of the hydrolysis medium is from 4 to 5.5.