CN110698555A - 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法 - Google Patents

一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110698555A
CN110698555A CN201911065450.8A CN201911065450A CN110698555A CN 110698555 A CN110698555 A CN 110698555A CN 201911065450 A CN201911065450 A CN 201911065450A CN 110698555 A CN110698555 A CN 110698555A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
silk fibroin
silk
aqueous solution
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201911065450.8A
Other languages
English (en)
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changsha Kaize Engineering Design Co Ltd
Original Assignee
Changsha Kaize Engineering Design Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changsha Kaize Engineering Design Co Ltd filed Critical Changsha Kaize Engineering Design Co Ltd
Priority to CN201911065450.8A priority Critical patent/CN110698555A/zh
Publication of CN110698555A publication Critical patent/CN110698555A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J5/00—Manufacture of articles or shaped materials containing macromolecular substances
    • C08J5/18—Manufacture of films or sheets
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/43504—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates
    • G01N2333/43552—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from insects
    • G01N2333/43578—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworm

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Processes Of Treating Macromolecular Substances (AREA)

Abstract

本发明提供了一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤制得一种家蚕丝素蛋白溶液，水解步骤是将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝进行冻融处理和微波处理，然后加入溶解液中进行加热加压处理。本发明在水解过程中不使用强酸，避免了对蚕丝结构的破坏，保留优异的机械性能，另一方面，通过冻融处理、微波处理充分打开纠缠的纤维，结合后续溶解液的作用，使得充分水解，省略了繁琐的透析步骤。

Description

一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别地，涉及一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法。
背景技术
家蚕蚕丝为纤维状，而生物医用材料要求支架形状具有多样性与可塑性，因此，对天然丝素纤维的再生加工是拓宽其应用范围的必要步骤。目前蚕丝蛋白脱胶溶解后可以被加工成绳索、再生长丝、纳米纤维膜、丝素膜、多孔膜、水凝胶等，其中脱胶蚕丝的溶解是非常关键的一步，其影响着后续丝素蛋白材料的性能，特别是力学性能，从而关系到丝素蛋白材料的应用性能。蚕丝主要由丝胶和丝素两种蛋白质组成，丝胶蛋白在外，丝素蛋白在内，其中丝素蛋白含量为70～80％，丝素蛋白是由重链(H链，分子量350kDa)、轻链(L链，分子量25.8kDa)及糖蛋白P25(分子量23.55kDa，另加三个寡糖链)组成。再生丝素蛋白可制备成多种形式的生物材料，如薄膜、凝胶、支架和颗粒等，用于药物载体、组成工程修复和固定化酶制备等。
再生丝素蛋白的制备包括脱胶和溶丝两步：蚕丝脱胶的方法概括起来有五种：沸水法、皂煮法、有机酸法、酶法和碱法，其中碱法为生物材料制备用丝素蛋白过程中最常用的方法。至于溶丝步骤，高浓度强酸强碱虽然可以溶解蚕丝，但会显著降低丝蛋白分子量，甚至不能进行再次加工，因而未被广泛采用。高浓度的中性盐溶液可以溶解脱胶蚕丝，并且不会引起丝素蛋白分子量的显著降低，因而被作为蚕丝纤维的良性溶剂受到了广泛而深入的研究，如常用的有氯化钙、乙醇和水三元溶剂、溴化锂水溶液等。但是采用高浓度的中性盐溶液溶解蚕丝后，还需要将丝素蛋白盐溶液置于透析袋中进行长时间的透析(一般3天以上)，进而获得再生丝素蛋白水溶液，并干燥成膜或冻干成多孔支架，该过程较为复杂、周期长、蚕丝的制得率低，并且再生制备的丝素蛋白支架的力学性质较差，特别表现在处理后的材料脆性大，强度低，因此极大地限制了蚕丝蛋白再生制备的工业化生产及其广泛应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法，以解决现有再生丝素蛋白溶液获得的再生丝素蛋白材料机械性能欠佳的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种家蚕丝素蛋白溶液的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤，即得所述的一种家蚕丝素蛋白溶液，其中，水解步骤的具体方法是：
(1)先将氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸以质量比1：0.5～0.6：6～8：2～3：4～5：0.8～1混合得到溶解液，备用；
(2)然后将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝先后进行冻融处理和微波处理；
(3)最后将步骤(2)处理后的蚕丝加入4～6倍重量的溶解液中，70～80℃和0.5～0.6MPa条件下处理5～8小时即可。
优选的，脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于4～6倍重量的质量浓度0.5～1％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理30～40分钟，重复3～4次，捞出后用去离子水洗涤2～3次即可。
优选的，去杂的具体方法是：以5000～6000转/分钟离心处理8～10分钟。
优选的，灭菌的具体方法是：121℃和0.1MPa条件下处理30～40分钟。
优选的，步骤(1)中，所述溶解液的制备方法如下：先将氯化钙和硫氰化钠溶于1/3配方量的蒸馏水中，得到第一部分水溶液，然后将聚乙二醇300加入剩余配方量的蒸馏水中，加热至80～90℃，加入二乙烯三胺五乙酸，搅拌至溶解并冷却至室温(25℃)，得到第二部分水溶液，接着将第一部分水溶液与第二部分水溶液混合，超声波振荡20～30分钟，加入1,2,4-丁三醇，继续超声波振荡30～40分钟，即得。
优选的，步骤(2)中，冻融处理的具体方法是：先在-10～-5℃条件下冷冻处理8～10小时，然后室温(25℃)融化解冻，接着-20～-15℃条件下冷冻处理4～5小时，最后室温(25℃)融化解冻。
优选的，步骤(2)中，微波处理的具体方法是：先以300～450W微波辐照20～30s，然后以500～750W微波辐照5～10s，再以300～450W微波辐照10～15s。
利用上述制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白溶液。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液在制备丝素蛋白膜、凝胶、粉末、薄膜支架和薄膜纤维中的应用。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液的鉴定方法，先将丝素蛋白溶液加入5～8倍重量的5～7mol/L甘氨酸水溶液中，35～37℃孵育20～30分钟，离心收集上清液，然后柱层析分离所述上清液，并利用蛋白标记物进行鉴定；其中，柱层析分离所使用洗脱剂为甘氨酸-尿素水溶液，洗脱时间为20～30分钟，所述甘氨酸-尿素水溶液是将甘氨酸、尿素和蒸馏水以质量比1：2～3：8～10混合溶解得到。
优选的，利用蛋白层析纯化仪进行鉴定，层析柱Superdex 20010/300GL，洗脱剂流速为0.5～0.6mL/分钟，上样环为50～80μL上样环。
优选的，所述蛋白标记物包括：伴清蛋白75kDa、铁蛋白440kDa、甲状腺球蛋白669kDa。
本发明具有以下有益效果：
本发明以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤制得一种家蚕丝素蛋白溶液，水解步骤是将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝进行冻融处理和微波处理，然后加入溶解液中进行加热加压处理。本发明在水解过程中不使用强酸，避免了对蚕丝结构的破坏，保留优异的机械性能，另一方面，通过冻融处理、微波处理充分打开纠缠的纤维，结合后续溶解液的作用，使得充分水解，省略了繁琐的透析步骤。
溶解液是由氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸配制而成，由于丝素蛋白本身具有丰富的氨基、羟基，基于相似相溶原理，1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸更加有利于丝素蛋白溶解。由于二乙烯三胺五乙酸具有5个羧基，具有一定的酸性，但不至于酸性过强，溶解丝素蛋白的同时不会破坏其纤维结构。醇的作用有利于蛋白质沉降，进而被溶解液中的其他组分溶解，故醇的用量不能太大，本发明选择1,2,4-丁三醇，三个羟基可以共同作用于丝素蛋白的某一段，以免独立作用造成纤维断裂，进而影响最终所得产品的机械强度。
氯化钙、硫氰化钠均为中性盐，可以增加水的离子量，而丝素蛋白表面大量氨基、羧基可与中性盐的离子形成离子键，从而促进丝素蛋白溶解。氯化钙与硫氰化钠的离子半径不一，有助于与丝素蛋白不同位置不同大小基团的结合，促进丝素蛋白的更好溶解。
在加入溶解液前进行冻融处理和微波处理，冷冻时由外至内形成冰晶，解冻时冰晶融化为水，伴随着冰晶的形成和融化，结合微波处理，加速分子振动，有助于纤维的充分舒展，促进充分水解。
本发明在鉴定时先用甘氨酸水溶液孵育，然后用甘氨酸-尿素水溶液洗脱，由于丝素蛋白本身就包括各种氨基酸，本发明引入甘氨酸，更有助于丝素蛋白的洗脱，可快速实现洗脱，缩短鉴定耗时。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例1：
一种家蚕丝素蛋白溶液的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤，即得所述的一种家蚕丝素蛋白溶液，其中，水解步骤的具体方法是：
(1)先将氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸以质量比1：0.5：8：2：5：0.8混合得到溶解液，备用；
(2)然后将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝先后进行冻融处理和微波处理；
(3)最后将步骤(2)处理后的蚕丝加入6倍重量的溶解液中，70℃和0.6MPa条件下处理5小时即可。
脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于6倍重量的质量浓度0.5％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理40分钟，重复3次，捞出后用去离子水洗涤3次即可。
去杂的具体方法是：以5000转/分钟离心处理10分钟。
灭菌的具体方法是：121℃和0.1MPa条件下处理30分钟。
步骤(1)中，所述溶解液的制备方法如下：先将氯化钙和硫氰化钠溶于1/3配方量的蒸馏水中，得到第一部分水溶液，然后将聚乙二醇300加入剩余配方量的蒸馏水中，加热至90℃，加入二乙烯三胺五乙酸，搅拌至溶解并冷却至室温(25℃)，得到第二部分水溶液，接着将第一部分水溶液与第二部分水溶液混合，超声波振荡20分钟，加入1,2,4-丁三醇，继续超声波振荡40分钟，即得。
步骤(2)中，冻融处理的具体方法是：先在-10℃条件下冷冻处理10小时，然后室温(25℃)融化解冻，接着-20℃条件下冷冻处理5小时，最后室温(25℃)融化解冻。
步骤(2)中，微波处理的具体方法是：先以300W微波辐照30s，然后以500W微波辐照10s，再以300W微波辐照15s。
利用上述制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白溶液。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液在制备丝素蛋白膜、凝胶、粉末、薄膜支架和薄膜纤维中的应用。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液的鉴定方法，先将丝素蛋白溶液加入5倍重量的7mol/L甘氨酸水溶液中，35℃孵育30分钟，离心收集上清液，然后柱层析分离所述上清液，并利用蛋白标记物进行鉴定；其中，柱层析分离所使用洗脱剂为甘氨酸-尿素水溶液，洗脱时间为20分钟，所述甘氨酸-尿素水溶液是将甘氨酸、尿素和蒸馏水以质量比1：3：8混合溶解得到。
利用蛋白层析纯化仪进行鉴定，层析柱Superdex 20010/300GL，洗脱剂流速为0.6mL/分钟，上样环为50μL上样环。蛋白标记物包括：伴清蛋白75kDa、铁蛋白440kDa、甲状腺球蛋白669kDa。
实施例2：
一种家蚕丝素蛋白溶液的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤，即得所述的一种家蚕丝素蛋白溶液，其中，水解步骤的具体方法是：
(1)先将氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸以质量比1：0.6：6：3：4：1混合得到溶解液，备用；
(2)然后将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝先后进行冻融处理和微波处理；
(3)最后将步骤(2)处理后的蚕丝加入4倍重量的溶解液中，80℃和0.5MPa条件下处理8小时即可。
脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于4倍重量的质量浓度1％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理30分钟，重复4次，捞出后用去离子水洗涤2次即可。
去杂的具体方法是：以6000转/分钟离心处理8分钟。
灭菌的具体方法是：121℃和0.1MPa条件下处理40分钟。
步骤(1)中，所述溶解液的制备方法如下：先将氯化钙和硫氰化钠溶于1/3配方量的蒸馏水中，得到第一部分水溶液，然后将聚乙二醇300加入剩余配方量的蒸馏水中，加热至80℃，加入二乙烯三胺五乙酸，搅拌至溶解并冷却至室温(25℃)，得到第二部分水溶液，接着将第一部分水溶液与第二部分水溶液混合，超声波振荡30分钟，加入1,2,4-丁三醇，继续超声波振荡30分钟，即得。
步骤(2)中，冻融处理的具体方法是：先在-5℃条件下冷冻处理8小时，然后室温(25℃)融化解冻，接着-15℃条件下冷冻处理4小时，最后室温(25℃)融化解冻。
步骤(2)中，微波处理的具体方法是：先以450W微波辐照20s，然后以750W微波辐照5s，再以450W微波辐照10s。
利用上述制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白溶液。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液在制备丝素蛋白膜、凝胶、粉末、薄膜支架和薄膜纤维中的应用。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液的鉴定方法，先将丝素蛋白溶液加入8倍重量的5mol/L甘氨酸水溶液中，37℃孵育20分钟，离心收集上清液，然后柱层析分离所述上清液，并利用蛋白标记物进行鉴定；其中，柱层析分离所使用洗脱剂为甘氨酸-尿素水溶液，洗脱时间为30分钟，所述甘氨酸-尿素水溶液是将甘氨酸、尿素和蒸馏水以质量比1：2：10混合溶解得到。
利用蛋白层析纯化仪进行鉴定，层析柱Superdex 20010/300GL，洗脱剂流速为0.5mL/分钟，上样环为80μL上样环。蛋白标记物包括：伴清蛋白75kDa、铁蛋白440kDa、甲状腺球蛋白669kDa。
实施例3：
一种家蚕丝素蛋白溶液的制备方法，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤，即得所述的一种家蚕丝素蛋白溶液，其中，水解步骤的具体方法是：
(1)先将氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸以质量比1：0.55：7：2.5：4.5：0.9混合得到溶解液，备用；
(2)然后将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝先后进行冻融处理和微波处理；
(3)最后将步骤(2)处理后的蚕丝加入5倍重量的溶解液中，75℃和0.55MPa条件下处理6小时即可。
脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于5倍重量的质量浓度0.8％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理35分钟，重复3次，捞出后用去离子水洗涤2次即可。
去杂的具体方法是：以6000转/分钟离心处理9分钟。
灭菌的具体方法是：121℃和0.1MPa条件下处理35分钟。
步骤(1)中，所述溶解液的制备方法如下：先将氯化钙和硫氰化钠溶于1/3配方量的蒸馏水中，得到第一部分水溶液，然后将聚乙二醇300加入剩余配方量的蒸馏水中，加热至85℃，加入二乙烯三胺五乙酸，搅拌至溶解并冷却至室温(25℃)，得到第二部分水溶液，接着将第一部分水溶液与第二部分水溶液混合，超声波振荡25分钟，加入1,2,4-丁三醇，继续超声波振荡35分钟，即得。
步骤(2)中，冻融处理的具体方法是：先在-8℃条件下冷冻处理9小时，然后室温(25℃)融化解冻，接着-18℃条件下冷冻处理4小时，最后室温(25℃)融化解冻。
步骤(2)中，微波处理的具体方法是：先以400W微波辐照25s，然后以600W微波辐照8s，再以400W微波辐照12s。
利用上述制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白溶液。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液在制备丝素蛋白膜、凝胶、粉末、薄膜支架和薄膜纤维中的应用。
上述一种家蚕丝素蛋白溶液的鉴定方法，先将丝素蛋白溶液加入6倍重量的6mol/L甘氨酸水溶液中，36℃孵育25分钟，离心收集上清液，然后柱层析分离所述上清液，并利用蛋白标记物进行鉴定；其中，柱层析分离所使用洗脱剂为甘氨酸-尿素水溶液，洗脱时间为25分钟，所述甘氨酸-尿素水溶液是将甘氨酸、尿素和蒸馏水以质量比1：2.5：9混合溶解得到。
利用蛋白层析纯化仪进行鉴定，层析柱Superdex 20010/300GL，洗脱剂流速为0.55mL/分钟，上样环为60μL上样环。蛋白标记物包括：伴清蛋白75kDa、铁蛋白440kDa、甲状腺球蛋白669kDa。
对比例1
略去步骤(1)中的硫氰化钠，其余同实施例1。
对比例2
将步骤(1)中的二乙烯三胺五乙酸替换为甲酸，其余同实施例1。
对比例3
略去步骤(1)中的1,2,4-丁二醇，其余同实施例1。
对比例4
略去步骤(1)中的聚乙二醇300，其余同实施例1。
对比例5
略去步骤(2)中的冻融处理，其余同实施例1。
对比例6
略去步骤(2)中的微波处理，其余同实施例1。
试验例
将实施例1～3或对比例1～6所得家蚕丝素蛋白溶液，根据鉴定方法检测分子量(丝素蛋白理论分子量为405kDa)，然后将家蚕丝素蛋白溶液浇注于聚苯乙烯模具中，在温度25℃、湿度80％的条件下鼓风干燥，待平衡后得到丝素蛋白膜。检测丝素蛋白膜的机械性能，结果见表1。
表1.分子量鉴定及机械性能考察
Figure BDA0002259196010000071
由表1可知，实施例1～3所得丝素蛋白溶液的分子量在440～669kDa之间，与天然丝素蛋白相仿。对比例1略去步骤(1)中的硫氰化钠，对比例2将步骤(1)中的二乙烯三胺五乙酸替换为甲酸，对比例3略去步骤(1)中的1,2,4-丁二醇，对比例4略去步骤(1)中的聚乙二醇300，对比例5略去步骤(2)中的冻融处理，对比例6略去步骤(2)中的微波处理，会对丝素蛋白造成损伤，导致分子量变小，机械强度变差。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种家蚕丝素蛋白溶液的制备方法，其特征在于，以家蚕蚕丝为原料，依次经脱胶、水解、去杂和灭菌步骤，即得所述的一种家蚕丝素蛋白溶液，其中，水解步骤的具体方法是：
(1)先将氯化钙、硫氰化钠、蒸馏水、1,2,4-丁三醇、聚乙二醇300、二乙烯三胺五乙酸以质量比1：0.5～0.6：6～8：2～3：4～5：0.8～1混合得到溶解液，备用；
(2)然后将脱胶步骤后所得脱胶蚕丝先后进行冻融处理和微波处理；
(3)最后将步骤(2)处理后的蚕丝加入4～6倍重量的溶解液中，70～80℃和0.5～0.6MPa条件下处理5～8小时即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，脱胶处理的具体方法是：将蚕丝浸泡于4～6倍重量的质量浓度0.5～1％碳酸钠水溶液中，边搅拌边煮沸处理30～40分钟，重复3～4次，捞出后用去离子水洗涤2～3次即可。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，去杂的具体方法是：以5000～6000转/分钟离心处理8～10分钟。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，灭菌的具体方法是：121℃和0.1MPa条件下处理30～40分钟。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶解液的制备方法如下：先将氯化钙和硫氰化钠溶于1/3配方量的蒸馏水中，得到第一部分水溶液，然后将聚乙二醇300加入剩余配方量的蒸馏水中，加热至80～90℃，加入二乙烯三胺五乙酸，搅拌至溶解并冷却至室温(25℃)，得到第二部分水溶液，接着将第一部分水溶液与第二部分水溶液混合，超声波振荡20～30分钟，加入1,2,4-丁三醇，继续超声波振荡30～40分钟，即得。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，冻融处理的具体方法是：先在-10～-5℃条件下冷冻处理8～10小时，然后室温(25℃)融化解冻，接着-20～-15℃条件下冷冻处理4～5小时，最后室温(25℃)融化解冻。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，微波处理的具体方法是：先以300～450W微波辐照20～30s，然后以500～750W微波辐照5～10s，再以300～450W微波辐照10～15s。
8.利用权利要求1～7中任一项所述制备方法得到的一种家蚕丝素蛋白溶液。
9.权利要求8所述一种家蚕丝素蛋白溶液在制备丝素蛋白膜、凝胶、粉末、薄膜支架和薄膜纤维中的应用。
10.权利要求8所述一种家蚕丝素蛋白溶液的鉴定方法，其特征在于，先将丝素蛋白溶液加入5～8倍重量的5～7mol/L甘氨酸水溶液中，35～37℃孵育20～30分钟，离心收集上清液，然后柱层析分离所述上清液，并利用蛋白标记物进行鉴定；其中，柱层析分离所使用洗脱剂为甘氨酸-尿素水溶液，洗脱时间为20～30分钟，所述甘氨酸-尿素水溶液是将甘氨酸、尿素和蒸馏水以质量比1：2～3：8～10混合溶解得到。
CN201911065450.8A 2019-11-04 2019-11-04 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法 Withdrawn CN110698555A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911065450.8A CN110698555A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911065450.8A CN110698555A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110698555A true CN110698555A (zh) 2020-01-17

Family

ID=69204158

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911065450.8A Withdrawn CN110698555A (zh) 2019-11-04 2019-11-04 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110698555A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114249907A (zh) * 2021-12-31 2022-03-29 西南大学 一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2750306B2 (ja) * 1989-05-24 1998-05-13 ポーラ化成工業株式会社 固定化低分子プロテインａの製造法
CN101168763A (zh) * 2007-11-09 2008-04-30 重庆工学院 一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法
CN104672316A (zh) * 2015-02-11 2015-06-03 苏州丝美特生物技术有限公司 一种家蚕丝素蛋白溶液制备及鉴定方法
CN108424440A (zh) * 2018-05-04 2018-08-21 杨恒智 丝素蛋白、制备方法及其在化妆品护肤、织物柔软整理中的应用
KR20190003077A (ko) * 2017-06-30 2019-01-09 인하대학교 산학협력단 파이로프로틴 기반의 다공성 탄소 소재의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 파이로프로틴 기반의 다공성 탄소 소재

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2750306B2 (ja) * 1989-05-24 1998-05-13 ポーラ化成工業株式会社 固定化低分子プロテインａの製造法
CN101168763A (zh) * 2007-11-09 2008-04-30 重庆工学院 一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法
CN104672316A (zh) * 2015-02-11 2015-06-03 苏州丝美特生物技术有限公司 一种家蚕丝素蛋白溶液制备及鉴定方法
KR20190003077A (ko) * 2017-06-30 2019-01-09 인하대학교 산학협력단 파이로프로틴 기반의 다공성 탄소 소재의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 파이로프로틴 기반의 다공성 탄소 소재
CN108424440A (zh) * 2018-05-04 2018-08-21 杨恒智 丝素蛋白、制备方法及其在化妆品护肤、织物柔软整理中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHONGMIN CHEN: "Preparation of polyvinyl alcohol film inlaid with silk fibroin peptide nano-scale particles and evaluation of its function to promote cell growth", 《SHENG WU YI XUE GONG CHENG XUE ZA ZHI》 *
李鹏飞: "可溶性丝素蛋白溶液高效节能脱盐工艺及其应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114249907A (zh) * 2021-12-31 2022-03-29 西南大学 一种发光且可拉伸的丝素蛋白/聚乙烯醇水凝胶的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106220896B (zh) 一种柔韧和高含水量纤维素/壳聚糖基复合凝胶、其对应的复合膜和应用
CN111870740B (zh) 一种复合蛋白膜及其制备方法
CN108641100B (zh) 一种高离子电导率纳米纤维素/聚乙烯醇水凝胶膜的制备方法
JP5761736B2 (ja) セリシンナノファイバーおよびその製造方法、金属イオン吸着材、染色機能増強材、耐薬品増強材、ならびにセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法
You et al. The degradation behavior of silk fibroin derived from different ionic liquid solvents
CN107840973B (zh) 一种丝胶蛋白水凝胶及其制备方法和应用
CN110256693B (zh) 一种高韧性丝素蛋白凝胶的制备方法
CN107118361B (zh) 一种丝素蛋白/羧甲基壳聚糖复合凝胶及其制备方法
CN104711702A (zh) 具有抗菌/抑菌功能的胶原集合体复合型医用纤维
JP2006257013A (ja) 魚鱗由来コラーゲンゲルとその作成方法
Guo et al. Oxidized sodium alginate crosslinked silk fibroin composite scaffold for skin tissue engineering
CN115109145A (zh) 一种去端肽胶原蛋白及其制备方法和应用
CN110698555A (zh) 一种家蚕丝素蛋白溶液的制备及鉴定方法
CN102836462A (zh) 一种胶原蛋白组织工程皮肤的制备方法
CN101760027B (zh) 再生丝素蛋白膜及其制备方法
CN116693921A (zh) 一种疏水改性诱导丝素/丝胶复合膜的制备方法
CN106902398B (zh) 阳离子化丝素蛋白材料、其制备方法及应用
CN112940150A (zh) 一种由肝素钠制备肝素钙的方法
CN112898629A (zh) 一种超疏水全生物质基油水分离材料的制备方法
CN115198528B (zh) 羧甲基纤维素纳米纤维膜/海藻酸钠/石墨烯复合材料的制备方法
Zhang SDS-PAGE for silk fibroin protein
CN114588309A (zh) 一种双交联的多重微孔止血海绵的制备方法
CN113735936B (zh) 一种提高丝蛋白基水溶液浓度的方法及由所述方法制备的丝蛋白基水溶液
JP2009173678A (ja) コラーゲンタンパク質からのエンドトキシン除去方法
RU2825392C1 (ru) Способ приготовления регенерирующего раствора, содержащего белки паутины пауков спидроин, фиброин, серицин

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200117