JP3906927B2 - 絹タンパク由来機能性ポリペプチドの製造と利用 - Google Patents

Description

本発明は、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物、その製造法及びそのスキンケア用素材としての医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の分野への利用に関する。

絹糸は手術糸として古くから使われてきたことから、絹タンパクは生体適合性素材と考えられ、最近では衣服以外の分野へ絹糸を新しく利用するための開発が盛んになっている。
例えば、利用分野としては、絹糸を溶解して絹タンパク水溶液とした後に、これを凝固・乾燥・粉砕等により粉末化することにより、化粧用添加材として、また絹タンパク水溶液を平板上でキャスト等によりフィルム状物することにより、細胞培養床や創傷被覆材及びコーティング材として、また絹タンパク水溶液をゲル状物とし、食品や化粧品として利用するための開発が進められている（特許文献１−１１参照）。

このように絹素材は、絹糸を絹タンパク水溶液とした後に、粉末、フィルム、ゲル等の形に加工して利用されている。
これら絹素材の加工においては、絹糸を溶解するのに、主に中性塩が用いられているが、絹糸タンパクの中性塩水溶液がヒトの細胞生育促進性を有することについては言及されていない。
さらに絹新素材開発が進む過程で、絹タンパクは細胞生育性、抗酸化性、抗菌性、アルコール消化性、抗血液凝固性等、多様な機能を有すると言われるようになってきた。

本発明者らは絹タンパクの有する細胞生育機能に注目し、繭糸または絹糸を溶解した後に、これを粉末、フィルム、ゲル等に変えることで、これらをスキンケア素材として創傷被覆材や化粧品として利用するための開発と機能解明の研究を進めてきた（特許文献１２−１４参照）。

さらに、細胞生育機能が絹タンパクのどのような部位、または構造に起因するかについて、絹タンパクを構成する成分の分離、精製、回収と機能評価を行ってきた。その結果、絹タンパクを構成するフィブロインのＨ鎖（特許文献１５参照）とＬ鎖（特許文献１６参照）及びセリシンのａ成分(特許文献１７参照）には正常なヒト皮膚由来の線維芽細胞を生育促進する作用のあることが分かった。
それらは、細胞生育過程において、細胞接着性に特に優れている。
フィブロインのＨ鎖とＬ鎖がＳＳ結合した分子量３７万及び分子量４０万のセリシンａを未分解絹タンパクという。

一方、絹糸は繊維として衣服以外の分野でも医療（手術用縫合糸）や化粧（パフ）等の分野で利用されている。
最近、このような繭や生糸の加工工程で絹タンパクの分子量は低下することが分かってきた。
また、繭糸や絹糸を粉末、フィルム、ゲル等に変える加工工程（特に繭糸や絹糸の溶解工程）においても絹タンパクの分子量は低下することが分かってきた（特許文献１８、１９参照）。

このような従来の絹加工工程で分子量が低下した絹タンパクの電気泳動像は分子量約１万から２０万の間に１つのスメアー（Ｓｍｅａｒ) でブロード（ｂｒｏａｄ）なバンドが見えるのみである。
分子量約５，０００程度以下の絹タンパク分解物は透析等の工程で除外されるため、加工工程における分子量低下はアミノ酸やペプチド程度にまで低下していると考えられる。
ここでポリペプチドとはアミノ酸残基数３０程度以上、ペプチドとはそれ未満を言う。

さらに、このようにして分子量が低下した絹タンパクは、ヒト細胞生育促進性を低下することが分かってきた（特許文献１４参照) 。
絹フィブロイン、セリシンの細胞生育率は未分解の状態が最高の値を示し、平均分子量が２０万程度に低下すると、細胞生育率は未分解時の約半分になり、分子量が２〜４万に低下すると細胞生育促進性はほとんど示さなくなる。
このことは、分子量低下と共に細胞生育阻害物質が生成しているものと考えられる。

絹タンパクの細胞生育阻害については、一般にタンパクは酸やアルカリ、光（紫外線、放射線等）、熱等でそのペプチド結合が複雑に、または不均一に切断されて低分子化すること、あるいはその際にアミノ酸残基側鎖の修飾（酸化、ハロゲン化、脱アミド化等）が起きること等のためと考えられる。

つまり、未分解フィブロイン、セリシンは細胞生育促進性が優れているにもかかわらず、絹加工工程における酸やアルカリ、光、熱等の処理で、不特定のペプチド結合切断による分子量低下とともに細胞生育阻害が増加している。
したがって、絹タンパクの細胞生育促進機能を利用するためには未分解の絹フィブロイン、セリシンあるいはフィブロインのＨ鎖（分子量約３５万）、Ｌ鎖またはセリシンａ（分子量約４０万）等を利用することが好ましい。

しかし、絹タンパクを物性の面から見た場合、水溶液におけるフィブロインやセリシンは高分子量であるほど振動や攪拌時のずり(ｓｈｅａｒ) により繊維化（結晶化）し易い性質を有している。
繊維化物は水不溶性の塊状物となる。

特に、未分解の絹タンパク（フィブロイン及びまたはセリシン）はずりが無くても水溶液の状態でゲル（水を含んだゆるやかな結晶）化が起きやすい。
中性塩で溶解した分子量２０万以上の絹タンパク溶液は、脱塩途中にゲル化する。
ゲル化物も除々に固くなり、また、ゲル化物を攪拌するとさらに固くなる。
このように僅かなずり（ｓｈｅａｒ)によって容易に微細な繊維化が起きるので、軟膏や化粧料（クリーム、乳液、化粧水等）としての使用感（手触り、展延性）を低下させる原因となり、スキンケア素材には使えない。

例えば、未分解のフィブロイン水溶液または分子量約３０万程度以上のフィブロイン水溶液を手の上で軽く摩擦しても容易に水不溶性で０．５〜２ｍｍ程度の塊状物が出現し、強く摩擦すると分子量２０万程度以上でも塊状物が現れ、展延性に全く欠けている。
ところが、絹タンパクは分子量が低下するとともに、摩擦等による繊維化は起きなくなる。

特に絹タンパクの分子量が２０万未満、特に５〜１０万になると絹タンパク水溶液を強く摩擦しても繊維化した玉状の塊状物ができないため、化粧等の素材として物性面では優れた素材となる。
しかし、従来の繭加工で得られる絹織物等の絹糸においては、フィブロインのＨ鎖は確認できないし、Ｌ鎖はほとんど確認できない程度に分解している。

このようなフィブロインの細胞生育促進性は未分解フィブロインの約半分またはそれ以下である。
絹タンパクの細胞生育性に関する機能は未分解絹タンパクの１/ ２以下と、非常に低下してしまうが、フィブロインやセリシンは絹加工工程等で分子量が低下したまま使われてきたのである。
つまり、従来の絹フィブロインやセリシンの利用は、細胞生育性の観点よりも使いやすさ、使用感を主眼にして、分子量２０万未満、主に分子量１０万以下のものを使用してきたといえる。

特公昭４０−２４９２０号公報 特開昭６２−４１５号公報 特公平１−４４３２０号公報 特開平１−２５４１６４号公報 特開平１−２５６３５１号公報 特公平４−２０２４３５号公報 特公平５−８３２９２号公報 特公平６−４６７９号公報 特開平８−１４３５９５号公報 特開平１１−１３９９８６号公報 特開平１１−２７６８７６号公報 特許第２９９７７５８号 特許第２９９０２３９号 特願２００２−２３０６５６号 特開２００１−１６３８９９号公報 特願２００１−１８０１６９号（WO０２／１０２８４５Ａ１国際公開公報） 特開２００２−１２８６９１号公報 H. Yamada ら著：Materials Science & Engineering C,14,P.41-46(2001) 坪内紘三、山田弘生、高須陽子：日本蚕糸学会誌、７１巻、１号、P.1-5(2002)

本発明は、未分解絹フィブロイン、セリシンまたはフィブロインＨ鎖、Ｌ鎖やセリシンのａ成分が有する優れた細胞生育促進性と、分子量２０万未満のフィブロイン、セリシンが有する優れた手触り、展延性等とを併せ持つ絹タンパク由来ポリペプチド組成物を提供することを目的とする。
特に、上記の優れた特性を有する絹タンパク由来ポリペプチド水溶液を、医薬品、医薬部外品、化粧品などの素材や食品用素材等として利用することを目的とする。

本発明者らは、先に、絹フィブロインの特定の部位のペプチド鎖に細胞生育促進機能があることを突きとめ、家蚕の絹タンパクのＨ鎖を構成するＮ末端部（Ｉ）、非結晶部（Ａ）及びＣ末端部（ａ）の各ペプチド鎖、並びに天蚕の絹フィブロインの非結晶部のペプチド鎖から選ばれる１又は２以上のペプチド鎖の特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が細胞生育促進機能を有するものであるという知見を得ており、これを現在出願中である。
この知見から、上記細胞生育促進機能を有する特定のアミノ酸配列を有するペプチド鎖が残存してさえいれば、たとえ絹タンパクの分子量を２０万未満に低下させても、細胞生育促進機能があまり低下することがないことを見出し、本発明を完成するに至ったものである。

すなわち、本願の第１の発明は、（１）家蚕又は天蚕由来の絹タンパク原料であって、該絹タンパク原料の平均分子量が２０万以上であり、家蚕由来の絹タンパク原料の場合には、絹フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖及びセリシンａの少なくとも一部又は全部が分解しないで残存している絹タンパク原料を、中性塩水溶液に溶解し、（２）次いで、ペプチド結合切断物質であるヒドロキシルアミンを０．１〜３Ｍとなるように添加し、アルカリで溶解液をｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０にし、３０〜５０℃で３０分〜６時間処理して、絹タンパクの特異的アミノ酸残基間のペプチド結合であるＡｓｎ−Ｇｌｙ結合を切断し、切断処理後は反応を止めるため、溶解液を希酸でｐＨ２〜３とすることを特徴とする、平均分子量が１万以上２０万未満であり、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法に存する。

本願の第２の発明は、絹タンパク原料が、家蚕又は天蚕の吐糸した繭糸、繭糸の加工物である生糸もしくは絹糸、絹織編物の未精練物、半精練物もしくは精練物から選ばれる１種以上からなる絹タンパク原料であることを特徴とする、上記第１の発明に記載の絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法に存する。

本願の第３の発明は、絹タンパク原料の中性塩水溶液を、ペプチド結合切断物質を用いて処理した後、得られたポリペプチド組成物を脱塩処理に付すことを特徴とする、上記第１の発明に記載の絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法に存する。

本願の第４の発明は、平均分子量が１万以上２０万未満であり、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物が、水溶液の形態であることを特徴とする、上記第１の発明に記載の機能性ポリペプチド組成物の製造方法に存する。

本発明の、絹フィブロイン由来ポリペプチドは平均分子量は１〜２０万未満にあり、未分解絹タンパクと同程度に優れた皮膚細胞生育促進性を有する。
しかも、その水溶液は未分解絹タンパクと異なり、摩擦等のずりを加えても塊状物が現れず、優れた展延性を有している。
また乳化剤としても使用することができる。
そのために、この絹フィブロイン由来ポリペプチドから得られるフィルム、粉末、水溶液、ゲル及びその乳化物はスキンケア素材として医薬品、医薬部外品、化粧品などに極めて有用である。

本発明の絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物は、基本的に次の（１）〜（３）の工程を経て製造される。
（１）家蚕又は天蚕由来の未分解絹タンパク、又は平均分子量が２０万以上であり、家蚕由来の絹フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖及びセリシンａの少なくとも一部又は全部が分解しないで残存している絹タンパク原料を、中性塩水溶液に溶解する。
（２）次いで、上記絹タンパクの中性塩水溶液にペプチド結合切断物質（酵素、ヒドロキシルアミン及び希酸）を添加して処理し、絹タンパクの特異的アミノ酸残基間のペプチド結合（Ａｓｎ−Ｇｌｙ結合）を切断して平均分子量が１万以上２０万未満のポリペプチドに低分子化する。
（３）平均分子量が１万以上２０万未満に低分子化したポリペプチドの中性塩水溶液を、脱塩処理に付して精製する。
得られたポリペプチド水溶液は、使用目的に応じ、フィルム状或いは粉末状に成形し、あるいはゲル状または乳化状等にして使用する。

本発明においては、絹タンパク原料と特異的なペプチド結合の切断条件が重要な要素であるので、先ずこの点について、以下に詳細に説明する。
絹タンパクの細胞生育促進性を利用するため、フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖及びセリシンａ成分が残っている絹タンパクを原料とする。
このような絹タンパクをその特異的なアミノ酸残基間で切断して、絹タンパクの分子量を低下する。
つまり、このことは、絹タンパクにおけるペプチド結合の複雑な切断を起こさないこと、またはできるだけ起こさないことにある。

絹タンパクの切断が特異的なアミノ酸残基間で起きる酵素やその他の化学物質を使うことが好ましい。
一般に、タンパク分解酵素によるタンパクの切断は、穏和な条件下でおこなわれるため、アミノ酸残基側鎖の修飾が起こらないと言われている。
また、非特異的切断による断片の複雑化をさけることもできる。
したがって、アミノ酸あるいはそれに近い状態にまで分解することはほとんどない。

このような酵素には、
リジルエンドペプチターゼ、セリンプロテアーゼ、メタロエンドペプチターゼ、アルギニルエンドペプチターゼ、メタロプロテアーゼ、キモトリプシン、パパイン、アルカラーゼ、ペプシン、レンニン、パンクレアチン、エラスターゼ、カルボキシペプチターゼ、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ等がある。

酵素の他にも化学物質によっては、特異性の高いポリペプチド鎖の切断法がある。
特異性の高い化学的切断法に使われる化学物質としては臭化シアン、Ｎ−ブロモスクシンイミド、ＢＮＰＳ−スカトール（２−(２−ニトロフェニルスルフェニル)−３−メチル−３−ブロモインドール）、ジメチルスルホキシド、Ｏ−ヨードソ安息香酸、ヒドロキシルアミン、希酸等がある。

通常の絹加工工程における低分子化は電気泳動像ではスメアーでブロードなバンドとなるが、酵素あるいは酵素以外の化学物質で切断され、低分子化した絹タンパクは、絹タンパクの構成成分以外にシャープなバンドが新たに確認できる。
好ましくはシャープなバンドが複数以上確認できる。
このようにして低分子化した絹タンパクは未分解絹タンパクの細胞生育性がほとんど維持される。

例えば、家蚕絹フィブロインのＨ鎖の分子量は約３５万であるが、Ｈ鎖がその特異的なアミノ酸残基間で切断されれば、電気泳動像では新たにＨ鎖より低分子のバンドが元のＨ鎖と同程度にシャープなバンドとして複数現れる。
つまり、電気泳動像では、通常の繭加工工程で絹タンパクの分子量が低下した場合のようにスメアーでブロードなバンドのみが現れるのでなく、Ｈ鎖やＬ鎖と同程度にシャープなバンドとして１本、好ましくは複数（２本以上）現れることが重要である。
一般に、酵素の分子量は １０，０００程度以上である。
一方、ペプチド切断に特異性のある化学物質の分子量は１０，０００程度以下である。

絹タンパクのペプチド結合を切断するのに使う物質の分子量が低いことは、課題を解決するのにより好ましい。
例えば透析により絹タンパクと切断物質を分離する場合、切断された絹タンパク由来ポリペプチドの分子量は主に１０，０００程度以上であることから、切断物質の分子量が１０，０００程度以下であることは切断物質と切断された絹タンパク由来ポリペプチドとを分子量で容易に分離できる。

このような点から、酵素による切断より分子量１０，０００程度以下の物質で絹タンパクのペプチド結合を均一に切断することが好ましい。
ヒドロキシルアミン（ＮＨ_２ＯＨ）や希酸は特に好ましい。
酵素は分子量約１０，０００以上であるが、酵素でペプチド結合切断後は、酵素を変性して、失活させればよい。
酵素はタンパク質であることから、例えば高温（９０℃程度）で処理して変性させる。
その方法は各酵素によって多少異なるが、失活した酵素が絹タンパク由来ポリペプチドに含まれていても、スキンケア素材としての機能には問題ない。

次に、このように絹タンパクのペプチド結合を特異的なアミノ酸残基間で切断し、その水溶液が摩擦や振動等によるずりによっても塊状物が現れないようにするには、平均分子量は２０万未満がよい。
１５〜２０万ではゆるやかなずりでは塊状物はほとんど現れない。さらに好ましくは１５万以下がよい。
分子量１〜１５万では強いずりでもほとんど塊状物は現れない。

一方、切断された絹タンパク由来ポリペプチド水溶液のゲル化が透析後に効率よく起きるため、また非結晶性フィルムを作りやすく、さらにそのフィルムが強度や柔軟性を有するためには、分子量は１万以上、好ましくは４万以上がよい。

そこで、本発明ではペプチド結合の酵素切断法や化学的切断法を用いて、フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖及びセリシンのａ成分が有している細胞生育促進機能を損なうことなく、絹タンパクの分子量を１万〜２０万未満、好ましくは４〜１５万に低下し、その水溶液に摩擦等のずりを加えても塊状物の出現しない手触りに優れた絹タンパク由来ポリペプチド水溶液を製造し、スキンケア素材として利用する。
また、これを粉末化、フィルム化、ゲル化等を行い、また乳化を行い創傷被覆剤、化粧用素材として提供する。

ペプチド結合の切断は中性塩が存在する溶解物、あるいは溶解物の透析過程または透析後のいづれの段階で行ってもよい。
絹タンパクが溶解状態（溶液中で絹タンパクは非結晶性、あるいはアモルファス状態）であるときに、ペプチド結合切断物質を作用させることが好ましい。
また、切断物質は複数作用させてもよい。
切断物質として酵素を使う場合は切断後に酵素を失活する事が好ましい。
以上の方法を以下に詳しく述べる。

Ａ．原料
一般に蚕は体内の絹糸腺腔に絹を分泌し、この絹は液状絹と言われる。
家蚕の液状絹はフィブロインとセリシンから成り（これらを絹タンパクという。）、家蚕の液状フィブロインは分子量約３７万である[(Tasiro Yutaka and Otsuki Eiichi, Journal of Cell Biology, Vol,46,P1(1970)]。
これを未分解フィブロインという。
また、分子量約３７万のフィブロインは分子量約３５万（Ｈ鎖）と約２．５万（Ｌ鎖）に分けられる。

セリシンは４成分から成り、細胞生育促進性に優れたａ成分の分子量は４０万である（特許文献１８参照）。
この分子量のセリシンを未分解セリシンという。
また、セリシンを主に、あるいは９９％以上セリシンから成る繭を作るセリシン蚕（例えばセリシンホープ）の繭糸も原料とできる。
セリシン蚕は家蚕の突然変異体であるが、正常体と突然変異体のセリシンタンパクには差がない。

一方、野蚕の絹タンパクも原料とすることができる。
野蚕としてはクリクラ蚕、エリ蚕、サク蚕（インドサク蚕等も含む）、天蚕等、Antheraea に属するものは同様の絹タンパク成分から成っている。
例えばクリクラ蚕の絹タンパク[H. Yamada and K. Tsubouchi, International Journal of wild Silkmoth & Silk, Vol.6, P.47-51(2001)]はフィブロインは約１８万の分子量のものがＳ−Ｓ結合し、３５万の分子量としての物性を示す。

一方、セリシンは約４０万の分子量から成っている。
蚕は営繭時に液状絹を吐糸して繭（繭糸と蛹で構成）を作る。
繭糸には中心部にフィブロイン、周囲にセリシンが存在し、存在比は７０〜８０％（フィブロイン）：２０〜３０％（セリシン）であることが知られている。

生糸は繭糸を数本から数１０本集合して作られる。
生糸で織った織物を生織という。
本発明の原料物質は繭糸、生糸、絹糸織編物、絹糸（フィブロイン繊維）、それらの残糸またはそれらの未精練物、半精練物、精練物、及びそれらを原料とした繊維、粉末、フィルム等、家蚕及び野蚕等の絹糸虫類が吐糸する蛋白質繊維すべてを対象とすることができる。

しかし、これらの原料には家蚕のフィブロインＨ鎖、セリシンのａまたはそれらに相当する成分等の一部が未分解の状態で存在する必要がある。
Ｈ鎖やａ成分の確認は電気泳動像で、それぞれに相当するバンドの存在を確認することで行う。
そのため原料絹タンパクの分子量（重量平均）は、２０万以上のものを使用する。

繭糸、生糸又は生織からセリシンを除去する工程を精練といい、精練後の繊維が、絹糸又はフィブロイン繊維である。
ただし、セリシン蚕繭の精練は行わない。
絹糸は、まず、養蚕農家で生産された繭を乾繭、煮繭後に繰糸して生糸を作製し、次いで、生糸又は生織の精練を行い、絹糸また絹織物とする。
これらの工程で生じる屑が残糸である。

乾繭は繭を１１５〜１２０℃の温度から５〜６時間かけて８０℃程度の温度に徐々に下げて行う。
煮繭では１００〜１０５℃の水蒸気及び熱水で約１０分間処理され、繭を熱水で満たす。
このような従来の生糸生産工程（繭加工）を経るとフィブロインのＨ鎖の半分程度以上は分解されてしまう。

Ｂ．精練
精練は原料からセリシンを除くために行い、その方法としては、アルカリ性ナトリウム塩や石鹸を含む水溶液中で煮沸する場合（アルカリセッケン精練）が最も一般的な方法である。
その他、アルカリ性ナトリウム塩のみで精練する場合（アルカリ精練）、加圧熱水（例えば１２０℃の熱水）に浸漬して精練する場合（高圧精練）、酵素で精練する場合（酵素精練）等がある。

水のみで煮沸精練する場合もあるが、セリシンの残留が多く一般的ではない。このような精練によって絹糸を得る。
しかし、生糸を一般的なアルカリセッケン精練する場合（例えば炭酸ナトリウム０．０５％水溶液、９５〜９９℃で２時間）、フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖はほとんど分解され、分子量は約５〜１０万に低下している。

以上のような従来の繭加工処理により絹タンパクのペプチド結合が不均一に切断されて、分子量低下することは、絹タンパクの細胞生育促進性の低下となるので、本発明では従来のような処理による分子量低下は避ける必要がある。
精練を行っていない場合は未精練、精練が完全でない場合は半精練といわれる。半精練で得られた物も通常は絹糸というが、フィブロイン繊維とはいわない。
ここでは９９％以上フィブロインである場合をフィブロイン繊維という。
これらも繭加工工程の一部である。

本発明において、原料を精練する時に用いるアルカリ水溶液としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ性ナトリウム塩の水溶液が挙げられる。
アルカリ精練の場合、炭酸ナトリウム水溶液は適度なバッファー効果があるため、好ましい。

また、本発明における精練ではセリシンが残留してもよい。
これは半精練や未精練に相当する。
また、セリシンの比率を増加するためにセリシン蚕繭糸を溶解の時に加えてもよい。
重要なことはフィブロインのＨ鎖やセリシンのａ成分が原料に残っていることである。
したがって、セリシンの残留している原料を得るためにはセリシンのａ成分が残るような温和な精練を行う（特許文献１７参照）。

温和な精練として例えば繭糸を中性付近の水（ｐＨ６〜８）に１時間程度、煮沸浸漬するか、これに相当する処理を行う。
例えば、炭酸ナトリウムを使う場合は濃度を０．０５％程度とし、１０分程度よく攪拌しながら煮沸する。
一方、セリシンをほとんど除く場合（９９％以上フィブロイン）は、フィブロインのＨ鎖ができるだけ分解しないで残るような精練を行う（特許文献１５参照）。
例えば、繭糸を０．０５％炭酸ソーダ水溶液で煮沸精練する場合は、精練時間は３０分程度以内、好ましくは約１０分以内で行う。
他の場合は、これに相当する条件で行う。

Ｃ．原料の溶解
本発明の絹タンパク由来ポリペプチドは上記の原料を以下のように溶解して得る。
原料絹糸の溶解剤である中性塩としては、例えば塩化カルシウム、銅エチレンジアミン、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸リチウム、臭化リチウム、硝酸マグネシウム等の中性塩が挙げられる。
当該中性塩においても飽和水溶液又は５０％〔重量(ｇ) ／容量（ｍＬ）〕飽和以上の濃度が好ましい。
フィブロインとセリシンが含まれている場合、例えば繭糸や未精練物、半精練物等は上記中性塩で絹糸と同様に溶解する。

一方、セリシン蚕繭糸のようにセリシンが９８％以上の場合は８Ｍ尿素で、７０〜９０℃、１０分程度以内で溶解する。
あるいは７Ｍ以上の濃度の臭化リチウムで４５℃の場合は２０分程度以内で溶解する。
原料を中性塩溶液に溶解する工程では、中性塩にメチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコール等のアルコールを添加してもよい。

中性塩として塩化カルシウムを使う場合は９４℃以下の温度で、望ましくは７５〜８５℃程度の温度で行う。
臭化リチウムを使う場合は５０℃程度以下の温度で原料を溶解する等、中性塩によって溶解条件は異なるが、フィブロインのＨ鎖、セリシンのａ成分が残るような、または分子量が２０万以上となるような溶解方法を行う。

この場合、
１）攪拌することにより溶解を促進することができる。
２）溶解温度が低いと溶解しにくい。
３）溶解温度が高いと溶解し易いが、分子量低下が激しく起きる。

原料を中性塩で溶解した溶解液には、フィブロインあるいはフィブロインとセリシンの混合物のほかに中性塩、アルコール等が含まれている。
この溶解液から、まず不溶物を除去し、次いで透析膜や透析装置を用いて分子量約１万以下を除外する。
ただし、分子量約１万で分離する透析膜を用いても、分子の形にもよるが、分子量５，０００前後のものも分離されないで残る場合がある。
このような透析によって絹タンパク水溶液を得る。
この絹タンパク水溶液には、中性塩が０．００１〜０．２Ｍ程度残されていてもよい。

Ｄ．ペプチド結合の切断
中性塩等の溶解剤で絹タンパクが溶解している溶解液に、ペプチド結合を特異的に切断する物質を添加することでペプチド結合の切断を行う。
この場合、複数の切断物質を使ってもよい。
切断物質としては酵素、希酸やヒドロキシルアミン等の化学物質を使う。
希酸としては２Ｎ以下の塩酸や硫酸でもよいが、ギ酸が好ましい。
ヒドロキシルアミンを使う場合は、０．１〜３Ｍとなるように添加する。
この場合、ヒドロキシルアミンが希薄であると、ペプチド結合の切断が起きる場合や起きない場合があり、切断が均一にならない。
高濃度であるとペプチド結合切断の特異性が乱れる。

切断条件としては、アルカリ（例えば１Ｎ ＮａＯＨ) で溶解液をｐＨ９程度（ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０) にし、約４５℃（３０〜５０℃）で４時間（３０分〜６時間、好ましくは３〜５時間）処理して、絹タンパクのアスパラギン（Ａｓｎ) −グリシン( Ｇｌｙ) のペプチド結合の切断を行う。
切断処理後は反応を止めるため、希酸（例えばギ酸）でｐＨ２〜３とする。
以上によって、絹タンパクのＡｓｎ−Ｇｌｙ間で特異的に切断されたいくつかのポリペプチド断片が得られる。

ところで、絹フィブロインの前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）タンパクとしてのアミノ酸配列は、Ｈ鎖の場合はジーンバンクＮｏ．Ｐ０５７９０、Ｌ鎖の場合はジーンバンクＮｏ．Ｐ２１８２８として登録されている。

Ｈ鎖は特にグリシン(Ｇ) 、アラニン(Ａ) 、セリン(Ｓ) を中心とした結晶部と言われる部分とそれ以外のアミノ酸残基が多い非結晶部と言われる部分との繰り返しから成っている。
Ｈ鎖に占める結晶部の領域は非常に大きく、結晶部を比較的結晶性の高い部分と比較的結晶性の低い部分に分けている場合もあるが、いづれも(Ｇ−Ｘ) の繰り返しが主であるので（この場合のＸは主にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌが主である）、ここでは区別しないで結晶部と考えている。

非結晶部のアミノ酸残基数は２８〜３２で、Ｈ鎖に１１ケ所の非結晶部があり、その内の８ケ所にＡｓｎ−Ｇｌｙ結合が存在する。
したがって、前駆体のフィブロインが正確に８ケ所のＡｓｎ−Ｇｌｙ結合で切断されれば、計算上はアミノ酸残基数が６８８，１２５９，９８５，６４４，５３９，３９１，３４７，６０７，３７８の９断片の集合となる。

ただし、前駆体フィブロインのＮ末端側にあるイニシアルペプチドは、どのアミノ酸残基まで繭糸タンパクとなっているかは分かっていない。
また、Ｃ末端側の断片のアミノ酸残基数１１６はＬ鎖とＳ−Ｓ結合している。
したがって、Ａｓｎ−Ｇｌｙで１００％切断されたとしても、切断された９残基の内の６８８の残基数はさらに少ない残基数となり、１１６の残基数はさらに多くの残基数となる。

これらの断片はアミノ酸１残基の分子量を約１１０とすれば、各断片の分子量は主に約４万〜１０万の範囲に入り、電気泳動像ではその間に９本のシャープなバンドとなる。
しかし、すべてのＡｓｎ−Ｇｌｙ結合が１００％切断しなくても、５０％あるいはそれ以上切断された結果、絹タンパクを構成する各成分以外に構成成分と同程度にシャープなバンドが電気泳動像で１本以上あり、平均分子量が１〜２０万未満となればよい。

酵素によるペプチド結合の切断では、リジルエンドペプチターゼ、キモトリプシン、パパイン、ペプシン、トリプシン、サーモリシン等が好ましい。
リジルエンドペプチターゼ（ＬｙｓｙｌＥｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ) の場合はリジン残基のカルボキシル基側のペプチド結合を特異的に切断する。
絹タンパクは水溶液の状態、あるいは４Ｍ以下のウレア水溶液に溶解中に酵素処理する。

酵素は絹タンパクの１％（重量）を添加し、３０〜４０℃、ｐＨ８．０〜１０、３０分間〜４時間処理する。
また、この酵素（リシルエンドペプチターゼ）は５０℃以上でかなり不安定となり、７０℃以上では失活する。

絹タンパクのペプチド結合切断において重要な点は、
１）切断された絹タンパク断片が未分解絹タンパクの優れた細胞生育促進性を残していること、つまり、絹フィブロイン、セリシン由来のポリペプチドの細胞生育率はそれぞれ未分解フィブロイン、未分解セリシンの細胞生育率の５０％以上であること、
２）その水溶液は摩擦等のずりによっても塊状物が生じないこと、
である。
更に好ましくは、
３）その水溶液を静置しておくと数日（１〜７日間）以内でゲル化すること、
である。

そのためには、切断による断片全体の分子量が主に１〜２０万の間となり、電気泳動像で分子量２０万未満に、未分解絹タンパクを構成する各成分とは別のシャープなバンドが確認できることである。

Ｅ．絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の作成
ペプチド結合の切断処理後、この溶解液から絹タンパク由来ポリペプチド以外の物を脱塩等で除外する。
酵素でペプチド結合を切断した場合は、脱塩後の絹タンパク由来ポリペプチド水溶液を７０〜９０℃にすることで失活させる。

脱塩はカラム( ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５) で行ってもよい。
水で透析する場合、透析は溶解液の約５０倍量の水を透析外液として２〜４時間毎に、水を４回以上変えるか、これに相当する方法を用いて透析する。
このようにして、絹タンパクが低分子化されても未分解絹タンパクの優れた細胞生育促進性を残し、しかもそのポリペプチド水溶液はずりによっても容易に塊状物を生じない、絹タンパク由来のポリペプチド水溶液が得られる。

ペプチド結合の切断は脱塩の途中の絹タンパク溶解液に切断物質を添加してもよい。
また、脱塩後の絹タンパク水溶液に切断物質を添加してもよい。
切断方法は切断物質によって異なるが、いづれにしても切断後に、塩や切断物質（希酸やＮＨ_２ＯＨ）等を透析等で除く必要がある。酵素切断の場合は酵素を失活させたほうが好ましい。
脱塩の判定は中性塩として塩化カルシウムを用いた場合は、透析外液の一部に硝酸銀を一滴加え、滴下部分がほとんど白色にならなくなった時点で脱塩されたとした。
また、透析外液の導電性測定で判定してもよい。

Ｆ．フィルム、粉末、ゲルの製造
非結晶性状態で溶解している絹タンパク由来のポリペプチド水溶液からフィルム、粉末、ゲル等を作る。
得られたフィルム、粉末、ゲル等はスキンケア用の素材として使用する。

１）フィルム化
ペプチド結合切断物質で絹タンパクの特異的なペプチド結合が切断された前記Ｅ．のポリペプチド水溶液を平板上に流し、送風しながら乾燥すればフィルムとして得られる。
ポリペプチド水溶液の濃度、または平板状に流す時の単位面積当たりのポリペプチド水溶液量等を変えることでフィルムの厚さを変えることができる。
非結晶性のフィルムとするにはフィルムの厚さが１００μｍ、好ましくは６０μｍ程度以下となるようにする。
厚くなると乾燥に時間がかかり結晶化する。

特に、非結晶性フィルムは創傷被覆材等のスキンケア素材として優れている。
一方、結晶化してもよいが、結晶化したフィルムは創傷被覆材としては使えない。
このようにして得た非結晶性フィルムや結晶化したフィルムを粉砕すれば、絹タンパク由来ポリペプチドの非結晶性粉末や結晶性粉末となる。

２）粉末化
前記Ｆ．１）のフィルムを粉砕するだけでなく、前記Ｅ．のポリペプチド水溶液をスプレードライ、凍結乾燥後に粉砕、攪拌やアルコール添加、凍結処理等で沈澱させた後に乾燥、粉砕等によって非結晶性の粉末が得られる。

３）ゲル化
ゲル化は、絹タンパク由来ポリペプチド水溶液をそのまま放置（静置）して行うことが好ましい。
ポリペプチドの水性ゲルは、ポリペプチド濃度が一定以上になると、ポリペプチド鎖と近隣の他のポリペプチド鎖との間で水素結合をつくり、水を含有し、緩く絡み合って三次元網目状を形成することにより出現するものと推定される。
ゲル化は多くの水を含んだポリペプチドの結晶(β) 化であり、水性ゲルと考えられる。

この水性ゲルは非常に脆い状態であるために、外力で容易にゲル状態は壊れる。
このようなゲルの一部は攪拌によって、一部は水に溶解する性質があり、これを水性ゲルという。
水性ゲルを作るため、絹タンパク由来ポリペプチド水溶液をそのまま静置する場合、室温（３０℃程度以下）より温度を高くするとゲル化は促進されるが、１００℃以上では分子量低下が起きやすい。
また、沸騰させることはポリペプチドにずりが加わるために避けた方がよい。

ゲル化温度としては４０〜９０℃、好ましくは５０〜８０℃がよい。
また、絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の濃度が高いほどゲル化は早いので、０．１％以上、好ましくは３％以上がよい。
一方、濃度は２５％以上にはできない。

それは、原料の溶解、ペプチド結合の切断、脱塩等の工程で液体状態とならないため、効率的に工程を進めることができないからである。
ポリペプチド水溶液の濃度は０．１〜１５％、好ましくは３〜１０％がよい。
絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の水性ゲルは、例えば等電点法やポリペプチド水溶液のポリペプチドの結晶化をわずかに促進する方法等によっても得ることができるが、スキンケア素材として利用するには、そのまま静置でゲル化することが好ましい。

Ｇ．絹タンパク由来ポリペプチド水溶液またはその水性ゲルの乳化
上記ポリペプチド水溶液及びその水性ゲルの乳化は、それらの油成分を加えて攪拌することで可能となる。
乳化に用いる油性分としてはオリーブ油、椿油、アボガド油、カカオ油、サンフラワー油、パーシック油、パーム油、ヒマシ油等の植物性油やその他動物性油、さらにホホバ油、ミツロウ等のロウ類等、化粧品原料基準に収載されている油やロウ等の油性分を使用する。
油性分の種類によって乳化物の性状に大差はない。

１）絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の乳化
絹タンパク由来ポリペプチド水溶液は乳化剤として使えることが分かった。
その乳化においては、ポリペプチド水溶液の濃度と量に対する油性分の割合を適宜調製することにより目的とする乳化物を作成する。
ポリペプチド水溶液と油性分を混合し、乳化させる方法としては攪拌法、すりまぜ法等があるが、いづれでもよい。

乳化用の機械はポリペプチド水溶液の濃度や油の割合によって使い分けることが望ましい。
乳化物の粘性は絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の濃度によって変わる。
ポリペプチド水溶液の濃度が薄いとポリペプチドによる細胞生育性が低い。
したがって、乳化のためのポリペプチド水溶液の濃度は０．１％以上、好ましくは０．５％以上である。
一方、ポリペプチド水溶液の濃度が高いと皮膚上での伸び（延展性）が低下し、使用感が低下する。
従って、その濃度は１５％以下、好ましくは１０％以下がよい。

乳化物は絹タンパク由来ポリペプチド水溶液の濃度が低い（３％程度以下）場合は液状となるので、乳液として使える。
ポリペプチド水溶液の濃度が高くなる（３％程度以上）に従って、粘性を帯びクリームや軟膏として使える。
ポリペプチド水溶液の濃度が低いと細胞生育率が低いこと、ポリペプチド水溶液の濃度が高いと伸びが低下することなどは、次に述べる水性ゲルの乳化の場合にも同様である。

２）ポリペプチド水性ゲルの乳化
絹タンパク由来のポリペプチド水性ゲルは油性分と混合するとき、乳化剤として作用することが分かった。

乳化方法は、前記１）ポリペプチド水溶液の乳化の場合と同じである。
ゲルにおけるポリペプチドの濃度が６％程度以上になると、ゲルと油性分を混合し、これを攪拌することは難しくなる。
濃度が濃くなるにつれて、攪拌時に水を添加すると攪拌しやすく、乳化は容易となる。
水はポリペプチドと等量から２倍程度の量が必要である。
つまり、濃度１０％のゲル１００ｇには５〜２０ｇの水を添加して攪拌するとよい。

ポリペプチド水溶液による乳化の場合と比べて、ポリペプチド水溶液をゲル化した後に乳化することは、ゲル化の工程が多く、工業的には不利である。
しかし、ポリペプチドの水性ゲルを乳化する場合には、ポリペプチド水溶液の場合より油性分の割合が少なくても乳化することができるという利点がある。
すなわち、同じ含水率の場合、ポリペプチドの水溶液より水性ゲルを用いた方が油性分とポリペプチドの割合を広範囲に変えることができるため、性質の違う乳化物を得ることができるという利点がある。
この理由は、ポリペプチド水溶液のゲル化によってポリペプチドはすでに分子間でゆるく結合しているため、すべてのポリペプチド鎖が油性分と結合しなくてもよいことによるものと推定される。

本発明の絹タンパク由来ポリペプチドの乳化物には、本発明の作用・効果を損なわない範囲で、必要に応じて、油やロウ等の油成分、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、保湿剤、殺菌剤、抗炎症剤、色素、香料、酸化防止剤、紫外線吸収剤、ビタミン、有機もしくは無機の粉体、アルコール、糖類等、軟膏や化粧料等にスキンケア用として通常に使用される成分を適宜配合することができるこというまでもない。

Ｈ．絹タンパク由来ポリペプチドの利用
未分解絹タンパクの優れた細胞生育促進性を残した絹タンパク由来のポリペプチドが、上記の方法で水溶液、フィルム、粉末、ゲル及び乳化物の状態で得られる。
これらは皮膚細胞を生き生きとし、生育を促進することから、特に次のような利用に効果的である。

（１）コーティング材
細胞生育促進性の低下した絹（例えばアルカリ処理で得られる結晶性絹粉末）、及びその他の素材（例えばタルク等の体質粉体、及びセラミック粉末等の有機、無機粉体、さらに眼鏡、時計、指輪、ピアス、注射針など、生体に接触する部分や生体に接触する手術用器具などの医療器具）のコーティング材として使用できる。

コーティング材として使用する場合は、絹タンパク由来ポリペプチド水溶液にこれらの素材を浸漬することで、それらの表面に絹タンパク由来ポリペプチドを被膜し、素材本来の特性に細胞生育促進性の機能を加えて、素材の改質を行う。 このような機能を付与するための膜厚としては０．０１〜３ｍμ、好ましくは０．１〜１ｍμである。

また、絹タンパク由来ポリペプチドの付着性を上げるため、コーティングにバインダーを用いてもよい。
このようにして得た改質粉末はボディパウダーやファンデーションとしても優れている。
またピアス、注射針などでは皮膚など生体の炎症を抑えることができる。

（２）フィルム
非結晶性フィルムは水や消毒液等を吸収して、溶解あるいは一部溶解することから、単独で、あるいは布帛やフィルムと複合し、スキンケア素材として、あるいは皮膚に付着させたり溶液として塗布、あるいは創傷被覆剤として利用できる。
また、皮膚上で水分を吸収した非結晶性フィルムは体温等で水分を放散して１０〜３０分程度で乾燥する。
乾燥したフィルムには皮膚表面上の不要な油、ゴミ等を含んでいるので、フェースマスク等に利用すると皮膚表面のミクロな不要物まで除去できる。
また、皮膚上に薄く残り、摩擦でも剥離しないような場合はそのままにしておく。

（３）粉末
前記の改質粉末やフィルムを粉砕して得られた粉末はスキンケア用粉末として、創傷治療用や化粧用に単独で、また、他の創傷治癒剤や化粧料に添加して用いる。

（４）ゲル
食品に添加して、またはゲル化剤やゲル状食品に添加して用いる。

（５）乳化物
スキンケア用の創傷治癒剤や化粧用に単独であるいは添加剤として用いる。
特に、軟膏やクリーム、乳液、化粧水用の素材として、本発明の絹タンパク由来ポリペプチドの乳化物は皮膚細胞の生育促進に、また手触りや付着性、伸びに優れている。

乳化物として利用する場合の絹タンパク由来ポリペプチド、油性分、水の重量割合は絹タンパク由来ポリペプチドの濃度が１％の時、油性分は１％〜２０％、水は８０％〜９０％の範囲で、好ましくは油性分３％〜４５％、水５５％〜９７％の範囲で、さらに好ましくは油性分７％〜３０％、水７０％〜９３％の範囲で混合する。

絹タンパク由来ポリペプチドの濃度が１０％のとき、油性分１５％〜５０％、水５０％〜８５％の範囲で、好ましくは油性分２０％〜３５％、水７５％〜８０％の範囲で混合する。
その他の割合はこれらの配合率から適宜決めることができる。
これらの配合割合は特願２００１−３６４４８９（特許文献１４参照）とほぼ同様である。

しかし、本発明の絹タンパク由来ポリペプチドの細胞生育率は未分解フィブロインの５０％以上、主に７５％以上である。
一方、先述の特願２００１−３６４４８９の細胞生育率は未分解フィブロインの５０％未満であり、本発明は細胞生育性に優れている。

本発明の乳化物を使用して製造することができる乳化化粧料または医薬部外品としては、例えば、清浄用化粧品（化粧石けん，洗顔料，シャンプー，リンス等）・頭髪化粧品（染毛料，頭髪用化粧品等）・基礎化粧品（一般クリーム・乳液，ひげそり用クリーム，化粧水・オーデコロン，ひげそり用ローション，化粧油，パック等）・メークアップ化粧品（ファンデーション，眉墨，アイクリーム・アイシャドウ・マスカラ等）・芳香化粧品（香水等）・日焼け・日焼け止め化粧品（日焼け・日焼け止めクリーム，日焼け・日焼け止めローション，日焼け・日焼け止めオイル等）・爪化粧品（爪クリーム等）・アイライナー化粧品（アイライナー等）・口唇化粧品（口紅・リップクリーム等）・口腔化粧品（歯みがき等）・入浴用化粧品（浴用化粧品等）等が挙げられる。
また、医薬品としては軟膏のような創傷被覆剤として使用できる。
また、本発明の絹タンパク由来ポリペプチドによる水溶液、フィルム、粉末、ゲル、及び乳化物は皮膚細胞を生き生きさせるため、従来のスキンケア素材に添加すると効果的である。
本発明の作用・効果を損なわない範囲で、必要に応じて、油やロウ等の油成分、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、保湿剤、殺菌剤、抗炎症剤、色素、香料、酸化防止剤、紫外線吸収剤、ビタミン、有機もしくは無機の粉体、アルコール、糖類等、軟膏や化粧料等にスキンケア用として通常に使用される成分を適宜配合することができるこというまでもない。

絹タンパクにおけるＡｓｎ−Ｇｌｙ結合のヒドロキシアミン(ＮＨ_２ＯＨ) による切断と切断物の電気泳動像と平均分子量測定
家蚕が営繭して１週間後の生繭を原料とした。これを「試料１」とする。
また、この生繭の繭層(１００ｇ) を４，０００ｇの８Ｍ尿素、８０℃に７分浸漬、精練した。
この間よく攪拌してセリシンを除いた。
この間の重量減（練減）は２４．７％であった。
セリシン残留程度を調べるため、この精練繭層を炭酸ソーダ０．０５％の水溶液４，０００ｇ中で６０分煮沸したところ練減は０．７％であった。
その結果８Ｍ尿素で精練して得た繭層は９９％以上がフィブロイン繊維（絹糸）と考えられる。
これを「試料２」とする。

次に、８Ｍ尿素で精練して得た絹糸の内の１５ｇを９Ｍ ＬｉＳＣＮ ２００ｍｌに入れ室温(２５℃) で溶解した。
この溶解液に５０％ヒドロキシルアミン約３０ｍｌを入れ、次いで１Ｎ ＮａＯＨを約６ｍｌをいれてｐＨ９とし、溶解液を４５℃に上げ、４時間置いた。
その後、溶解液に９９％ギ酸１６ｍｌを加え、溶解液をｐＨ２にしてヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ結合切断を止め、この溶解液を水（室温）で透析した。
透析膜はＵＣ３６−３２−１００（三光純薬株式会社製）を用い、溶解液の１００倍量の水を透析外液とし、３時間ごとに５回水を変えて透析した。
この間水をよく攪拌した。
得られたフィブロイン由来ポリペプチドを「試料３」とする。

一方、前記と同様に８Ｍ尿素で精練して得た絹糸の内の１５ｇを９Ｍ ＬｉＳＣＮ ２００ｍｌに入れ、室温で溶解した。
この溶解液を透析膜に入れ水で透析した。得られたフィブロイン水溶液に、前記と同様に５０％ヒドロキシルアミン約３０ｍｌを入れ、次いで１Ｎ ＮａＯＨでｐＨ９とした。
この溶解液を４５℃に４時間置き、ギ酸でｐＨ２とした後に水で透析した。
ここで得られたフィブロイン由来ポリペプチドを「試料４」とする。

試料２〜試料４を９Ｍ ＬｉＳＣＮに溶解後、８Ｍ尿素で置換し、２−メルカプトエタノールでＳ−Ｓ結合を切断して電気泳動用試料とした。
絹タンパクのＡｓｎ−Ｇｌｙ結合が切断された断片の分子量は次のように電気泳動像とゲルクロマトグラフィーカラムを用いて測定した。
電気泳動用のゲルは２−１５％のアクリルアミドグラジェンドゲルを用い、電気泳動後のゲルはＣＢＢ（染色液）で染色し、電気泳動像におけるバンドを、対照のマーカーの分子量と比較しながら観察した。

その電気泳動像を図１に示す。
図１の試料２にはフィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖のバンドが明確に認められる。試料３にはＨ鎖、Ｌ鎖のバンドが認められず、Ｈ鎖やＬ鎖と異なる分子量の部分で、Ｈ鎖やＬ鎖と同程度にシャープないくつかのバンドが認められる。
通常の繭加工工程、例えば絹糸を炭酸ソーダ等で精練した場合、また絹糸を塩化カルシウムのような中性塩で溶解した場合等の電気泳動像はスメアーでブロードなバンドのみで、試料３の電気泳動像とは異なる。

試料３には明確には７つのバンドが確認され、分子量の大きい方から各バンドはほぼ１４０、８５、７５、３５、２４、２２及び９ｋＤａに相当する。
その他に分子量２０万以下にスメアーでブロードなバンドがわずかに認められるが、試料３の電気泳動像から、フィブロインにおけるＡｓｎ−Ｇｌｙの結合はほぼ切断されている。

一方、試料４は試料３に比べて、Ａｓｎ−Ｇｌｙの切断によるバンドが明確ではないが８５及び９ｋＤａのバンドが認められる。
試料３と試料４の電気泳動像からＡｓｎ−Ｇｌｙ結合のヒドロキシルアミンによる切断は、絹糸の溶解剤としてＬｉＳＣＮを使う場合、絹タンパクがＬｉＳＣＮで溶解中に行う方がより均一に切断されることがわかる。
分子量測定はゲルクロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｐｒｅｐｇｒａｄｅファルマシア）を用い、試料を８Ｍ尿素／４０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４（ｐＨ８）で溶出し（０．６ｍｌ／ｍｉｎ）、２７５ｎｍでモニターした。
その重量平均分子量の結果を表１に示す。

試料２〜試料４を９Ｍ ＬｉＳＣＮに溶解後、透析膜に入れ、水で透析して得た絹タンパクまたは絹タンパク由来ポリペプチド水溶液を手にとって摩擦すると、試料２の水溶液は玉状の塊状物ができたが、試料３と試料４の水溶液は玉はできず手触りに優れていた。

絹タンパク由来ポリペプチドの細胞生育性
[実施例１] の試料１〜試料４の細胞生育性を次のように測定した。
まず、各試料を細胞培養容器へ次のようにコートした。
各試料０．０１ｇを９Ｍ ＬｉＳＣＮ １ｍｌに溶解し、溶解液を５０倍量の水で４回透析し、各試料の水溶液とした。
各試料の水溶液の０．００２５％溶液１ｍｌを細胞培養用のシャーレ（３５ｍｍφ、ファルコン）に入れ、風乾し、ＰＢＳ２ｍｌで３回洗ったのち再度風乾し、７０％エタノールで浸漬して滅菌した。

細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞（クラボウ株式会社製）を使用した。
培地は、皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地(クラボウ株式会社製, Ｍｅｄｉｕｍ１０６Ｓ ５００ｍｌにＬＳＧＳ １０ｍｌを添加）を使用した。
培養は試料をコートしたシャーレ１枚につき培地２ｍｌを入れ、７万の細胞を接種して３日間培養した。
細胞数の測定はシャーレ１枚につき培地２ｍｌ、アラマブルー（IWAKI ）０．１ｍｌを入れ、３７℃で２時間培養後に５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算した色素の還元量を細胞生育数とした。

試料をコートしなかったシャーレの細胞生育数を対照区（１００％）とし、試料をコートしたシャーレの細胞生育率を表２に示した。
表２において、試料１、試料２、試料３はともにほとんど同じ程度の極めて優れた細胞生育促進性を示している。
試料４の細胞生育率は他の試料と比べてわずかに低いが、試料１、試料２、試料３に近い値を示し、いづれも細胞生育促進性に優れている。

絹タンパク由来ポリペプチドのゲル化と乳化
実施例１における試料２、試料３、試料４の各水溶液の一部について、濃度を５％に調整した後に、７０℃に置いた。
試料２の水溶液は、透析修了時にはゲル化していた。
一方、試料３、試料４の各水溶液は、７０℃に置いた状態で２〜３日後にゲル化した。

ゲル化物を手で軽く摩擦すると、試料２のゲルは直ちに玉状の小さい塊状物が現れたが、試料３と試料４には塊状物が現れなかった。
そこで、試料３、試料４の各ゲル７０ｇにオリーブ油２０ｇを加え、コーヒーミキサー［パーソナルミルＳＣＭ−４０Ａ（柴田科学器械工業株式会社製）］で３０秒間攪拌したところ、試料３と試料４のいづれもクリーム状の乳化物となった。
これらの乳化物を皮膚上に強く摩擦しながら塗っても玉状の塊状物は現れず、伸び、付着性、手触り等に極めて優れていた。

塩化カルシウム溶解絹糸の脱塩中におけるＮＨ_２ＯＨ処理
家蚕が吐糸後の生繭層２００ｇを炭酸ソーダ４ｇ、水８ｋｇの混合した煮沸液（約１００℃）に１０分間浸漬し、精練した（「試料５」）。
この間、よく攪拌した。
絹糸（試料５）の内の５０ｇを約８０℃の塩化カルシウム１６０ｇ、エタノール１３３ｇ、水２０７ｇの混合液に浸漬し、よく攪拌した。
絹糸は２０分間で溶解した。
この溶解液を透析膜に入れ水で透析した。

透析の間、溶解液の２０倍量の水を透析外液とし３０分ごとに水を３回変えた。
この時点は透析の途中で、脱塩は約１／２程度終えた段階である。
この透析中のフィブロイン溶液（濃度約６％）１００ｇ（４５℃) に５０％ＮＨ_２ＯＨを１０ｃｃ加え、さらに１Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ９にした。
そのまま４時間置いた後に、ギ酸を加えｐＨ２とし、透析膜に入れこの液を水で透析した。

透析修了後に水溶液をプラスチック板上に流し、乾燥してフィルムとした。これを「試料６」とする。
試料５と試料６について、［実施例１］と同じ方法で分子量を電気泳動で調べた。
試料５にはフィブロインのＨ鎖とＬ鎖が［実施例１］の試料２と同程度に明確に確認された。
試料６の電気泳動像には８５，７５，９ｋＤａのバンドが確認できた。
また、試料６の水溶液を７０℃に置いて、ゲル化した。
ゲル化物にオリーブ油と水を加え［実施例３］と同様の乳化を行ったところ、手触り、伸び、付着性等に優れた乳化物が得られた。

８Ｍ臭化リチウム（ＬｉＢｒ) で溶解した絹糸のＮＨ_２ＯＨ処理
［実施例４］の絹糸の５０ｇを４５℃の８Ｍ ＬｉＢｒ ４００ｇに浸漬し、よく攪拌したところ、約１０分で絹糸は溶解した。
溶解液を透析膜に入れ、水で透析し、フィブロイン水溶液とした。このフィブロイン水溶液を４５℃にし、５０％ ＮＨ_２ＯＨ５０ｍｌを加え、さらに１ＮＮａＯＨで溶解液をｐＨ９にして、４時間置いた。
その後、ギ酸でｐＨ２とし、透析膜に入れ水で透析した。
透析後に得られた絹フィブロイン由来ポリペプチドの分子量を［実施例１］と同じように電気泳動で調べた。

その結果、８５、７５、３５、２２、９ＫＤａの各バンドが確認できた。
また、透析終了後に、この水溶液の一部を濃度５％に調整し、７０℃に置いたところ、２日後にゲル化した。
ゲル化物５０ｇにオリーブ油１５ｇを加えて、コーヒーミキサーで攪拌したところ、クリーム状の乳化物が得られ、手触り、伸び、付着性に優れていた。
また透析後に、この水溶液の一部をアクリル板上に流し、室温で風乾して製膜した。
得られたフィルム（厚さ約４０μｍ）は水溶性（９６％重量以上が室温の水に溶解した）を示し、非結晶性のフィブロイン由来ポリペプチドのフィルムとなった。

省略
〔参考例１〕
絹セリシンの不均一なペプチド結合切断による分子量低下と細胞生育性
家蚕の繭（生繭）繭層２０ｇを８０℃の８Ｍ尿素１００ｃｃに１５分間浸漬し、この間よく攪拌して繭セリシンを溶解した。
繭層の練減は２１．２％であった。
繭セリシン溶解液を透析膜にいれ、４０倍量の水（６０℃) を透析外液として透析した。
透析は２日間で水を８回変えて行った。
透析後のセリシン水溶液を煮沸(１００℃) し、炭酸ソーダ(Ｎａ_２ＣＯ_３)の濃度が０．０５％となるように添加した。

炭酸ソーダ添加後の煮沸時間が０、２、５、１０、３０分の各時点にセリシン水溶液を分収し、透析膜に入れ、水で透析して分子量測定試料とした。
また、細胞培養試料とした。
分子量及び細胞生育率は実施例１及び実施例２と同様に行って得た。
絹タンパクの成分無添加の場合を対照区（１００％）とした。
結果を表３に示す。

セリシン蚕繭層のＮＨ_２ＯＨ処理
セリシン蚕（セリシンホープ）繭層４ｇを９Ｍ ＬｉＢｒ ２００ｃｃに入れ、約４５℃でよく攪拌して約１５分で溶解した。
溶解液は非常に粘性がある。
この溶解液の１／３を透析膜に入れ水で透析した。
この溶解液は透析開始後１日以内で透析中にゲル化した。
このゲル化したものを「試料７」とした。

残りの２／３の溶解液に５０％ＮＨ_２ＯＨを１０ｃｃ加え、さらに１Ｎ ＮａＯＨを加えてｐＨ９とした後にこの液を二分し、４５℃に置いた。
４５℃に置いてから１時間後と４時間後に、ギ酸でそれぞれの液をｐＨ２とし、これを透析膜に入れ、水で透析し（室温）、脱塩した。
１時間後にギ酸でｐＨ２とした場合は透析修了時にはゲル化していた。
このゲル化したものを「試料８」とした。

４時間後にギ酸でｐＨ２とした場合は、透析修了時にゲル化は見られなかった。
この溶解液中のポリペプチドを「試料９」とした。

試料７〜試料９の電気泳動像を図２に示す。
電気泳動像は実施例１と同様にして得た。
試料７の電気泳動像にはセリシンのａ、ｄ、ｂ、ｃの各成分が確認できる。
試料８にはセリシンａ、ｄ、ｂの各成分は確認できないが、その外にもシャープなバンドが見えない。
試料９には３６，１４，６ｋＤａに相当する部分にシャープなバンドが確認される。

透析中の試料７〜試料９を手にとって摩擦したところ、試料７と試料８には玉状の塊が出現したが、試料９には玉状の塊はできなかった。
機能性ポリペプチドとして利用可能な試料９の細胞生育性を［実施例２］と同様の方法で測定したところ、細胞生育率（％）は対照区を１００％とした時、２４７％を示し、優れた線維芽細胞の生育促進性を示す絹セリシン由来ポリペプチドが得られた。
また、試料９の水溶液３０ｇにオリーブ油１０ｇを入れコーヒーミキサーで３０秒攪拌したところ柔らかなクリーム状を示し、手触り、皮膚への伸び、付着性に優れていた。

コーティング材
結晶性絹超微粉末を次のように製造した。
家蚕の生糸を生糸の５０倍量の０．１％炭酸ナトリウム水溶液で１時間煮沸精練し、絹糸とした。
この絹糸１００ｇを炭酸ナトリウム５０ｇ、水２，５００ｇ、ハイドロサルファイトナトリウム５ｇの液に浸漬し、１１０℃（１．４６気圧）に５時間おいた。
その後、水洗、乾燥して粉砕した。
粉砕は回転式衝撃粉砕器（不二電気工業株式会社製サンプルミルＫＩ−１）に１ｍｍφのフィルターを取り付けて粉砕し、さらに０．１ｍｍ間隔の金網をフィルターに取り付けて粉砕した。
次に、攪拌擂潰装置（石川式）で摩砕した後、気流式粉砕器（日清製粉株式会社製カレントジェットＣＪ−１０）で粉砕したところ、平均粒子径２．２μｍの結晶性絹超微粉末を得た。
この結晶性絹超微粉末５０ｇと前記［実施例１］のフィブロイン由来ペプチド（試料３）の水溶液（濃度４％）５０ｇを混合し、乾燥し、粉砕した。
粉砕は回転式衝撃粉砕機［サンプルミルＫＩ−１（不二電気工業社製）］に１ｍｍφのフィルターを取り付ケて粉砕し、次いで摩砕（攪拌擂潰装置）し、さらに０．１ｍｍ間隔の金網をフィルターに取り付けて粉砕した。
得られた粉末の平均粒子径は２．９μｍであり、手触り、付着性、成形性に優れていた。

絹フィブロインの酵素分解物の細胞生育活性
（１）絹タンパクを酵素で分解、分離、分収
家蚕の繭を切開して蛹を除き、繭層（２０ｇ）を３０倍量の８Ｍ尿素、９０℃に１０分浸漬し、セリシンを除外した。
抽出残さは水洗、乾燥し、これをフィブロインとした。

フィブロイン１０ｇを９Ｍ ＬｉＳＣＮ １００ｍｌに浸漬して溶かし、これに蒸留水１００ｍｌ加えて、これを３，０００ｒｍｐ、１０分間遠沈した。
上清液を５０倍量の水に対して透析した。
透析は半透膜を用い３０分ごとに水をかえて４回行った。
透析後に液を再び遠沈し、上清液に０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム（ｐＨ８．５）を加え、ｐＨを７から８に調整した。
そこにフィブロイン量の１００分の１量のキモトリプシンを入れ、４０℃で１時間置いた。
このときの上清液のタンパクを「試料１０」とした。
上清液はそのままタンパク量を測定した。

（２）細胞培養容器へコーティング
試料１０の水溶液を０．０２５％の濃度になるように７０％エタノールを加えて調整し、それをポリスチレンのシャーレ（３５ｍｍφ、ファルコン）に１ｍｌ入れて風乾した。
対照区用シャーレは７０％エタノールのみを１ｍｌ入れて風乾した。

（３）細胞培養
細胞は、成人由来の凍結ヒト皮膚線維芽細胞（三光純薬株式会社製）を使用した。
培地は、ヒト皮膚線維芽細胞増殖用低血清培地（クラボウ株式会社製）を使用した。
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌを入れ、８万ケの細胞を接種し、３日間培養した。

（４）アラマーブルー色素での生細胞数の測定
シャーレ１枚に付き培地２ｍｌ、アラマーブルー（IWAKI)０．１ｍｌの割合で入れ、３７℃、２時間培養したのち、５７０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度から計算したアラマーブルー色素の還元量を生細胞数とした。
以上の細胞生育率に関する測定は、実施例１と同様に行った。

（５）分子量
試料１０の分子量は実施例１と同様にして測定した。
絹タンパクの成分無添加の場合を対照区(１００％) とした、試料１０をコートしたシャーレでのヒト皮膚線維芽細胞の生育率と分子量を表４に示す。

絹タンパク成分をコートしたシャーレでの細胞生育率は対照区と比べて高く、未分解フィブロインとほぼ同じ値を示した。
上記（１）、試料１０の上清液のタンパク濃度を３．５％に調整し、８０℃に置いたところ、３日後にゲル化した。
一方、この上清液（濃度３．５％) に試料９の液を３０％（重量）混合し、室温に置いたところ、２日後にゲル化した。
これらのゲル化物、各５０ｇにオリーブ油１２ｇを加えて攪拌したところ、玉状物はできず、手触りのよいクリーム状物が得られた。

添加材としての絹タンパク由来機能性ポリペプチド
生糸（１５０ｇ）を炭酸ソーダ（２０ｇ）、漂白剤（ハイドロサルファイト：１．５ｇ）、金属封鎖剤（クレワットＫ、帝国化学産業株式会社：２ｇ）、及び水（６，０００ｇ）の煮沸液（約１００℃）で１時間処理し、水洗乾燥し絹糸（A）とした。
この絹糸（A：５０ｇ）を塩化カルシウム（１３１ｇ）、水（１７０ｇ）、エチルアルコール（１０８ｇ）の溶解液（約８０℃）に１時間で溶解し、次いで水による透析で脱塩を行い、フィブロイン水溶液（試料１１）とした。

一方、カイコが吐糸した後、５日以内の加熱等の処理をしていない繭の繭糸（１００ｇ）を炭酸ソーダ（２ｇ）、水（４，０００ｇ）の煮沸液（約１００℃）で１０分間処理し、水洗乾燥し絹糸（Ｂ）とした。
この絹糸（Ｂ：２０ｇ）を９Ｍ臭化リチウム（２００ｍｌ）に４５℃で３０分間で溶解し、５０％ヒドロキシルアミン（５ｍｌ）を添加し、ついで１規定苛性ソーダを加えてｐＨ９とした。
これを４５℃に４時間置いた後、ギ酸でｐＨ２とした後、半透膜に入れ水中で透析し、フィブロイン水溶液（試料１２）とした。
試料１２は本発明の絹タンパク由来機能性ポリペプチドである。

試料１１と試料１２の濃度を約５％とし、試料１１、１５ｇと試料１２、５ｇを混合し（試料１３）、プラスチック平板上で風乾した。
得られたフィルムは水溶性である。
このフィルムを水に溶解した液は皮膚上で優れた伸びと泡立ちを示した。

これらの電気泳動像は、試料１１ではフィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖、共に確認できず、平均分子量は１０万程度であった。
絹糸ＢではフィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖、共に確認でき、平均分子量は２５万程度であった。
試料１２ではフィブロインのＨ鎖は確認できず、Ｌ鎖は僅かに確認できるが、それ以外には、約５万、２．２万、１．５万、９千等に新たなバンドが確認できた。

絹タンパク由来機能性ポリペプチドへの添加
カイコが吐糸した後、５日以内の加熱等の処理をしていない繭の繭糸３０ｇを炭酸ソーダ０．５ｇ、水１、０００ｍｌ（約１００℃）で１０分間煮沸して、繭糸を精練した。
精練液を半透膜に入れ水中で透析し、セリシン水溶液（試料１４）とした。
セリシンを保湿剤として利用するため、このセリシン水溶液（試料１４）２ｇを、フィブロイン水溶液（試料１２）１０ｇに添加し、混合した後、プラスチック平板上で風乾した。
得られたフィルムは水溶性を示した。

また、この混合液及びこのフィルムを水に溶解した液は皮膚上で優れた伸びと泡立ちを示す共に、しっとり感が向上した。
また、スクワラン１ｇをフィブロイン水溶液（試料１２）２０ｇに添加し、それらを混合した後、プラスチック平板上で風乾した。
得られたフィルムは水溶性を示した。
この場合も混合液及びフィルムを水に溶解した液は皮膚上で優れた伸びと泡立ちを示すと共に、しっとり感に優れていた。

本発明は、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物、その製造法及びそのスキンケア用素材としての医薬品、医薬部外品、化粧品、食品等の分野への利用に関するものであるが、その本質を逸脱しない限り、その他のバイオ等の分野にも適用可能である。

図１は、試料２〜試料４の電気泳動像を示す図である。 図２は、試料７〜試料９の電気泳動像を示す図である。

Claims (4)

1. 家蚕又は天蚕由来の絹タンパク原料であって、該絹タンパク原料の平均分子量が２０万以上であり、家蚕由来の絹タンパク原料の場合には、絹フィブロインのＨ鎖、Ｌ鎖及びセリシンａの少なくとも一部又は全部が分解しないで残存している絹タンパク原料を、中性塩水溶液に溶解し、次いで、ペプチド結合切断物質であるヒドロキシルアミンを０．１〜３Ｍとなるように添加し、アルカリで溶解液をｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０にし、３０〜５０℃で３０分〜６時間処理して、絹タンパクの特異的アミノ酸残基間のペプチド結合であるＡｓｎ−Ｇｌｙ結合を切断し、切断処理後は反応を止めるため、溶解液を希酸でｐＨ２〜３とすることを特徴とする、平均分子量が１万以上２０万未満であり、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法。
2. 絹タンパク原料が、家蚕又は天蚕の吐糸した繭糸、繭糸の加工物である生糸もしくは絹糸、絹織編物の未精練物、半精練物もしくは精練物から選ばれる１種以上からなる絹タンパク原料であることを特徴とする、請求項１記載の絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法。
3. 絹タンパク原料の中性塩水溶液を、ペプチド結合切断物質を用いて処理した後、得られたポリペプチド組成物を脱塩処理に付すことを特徴とする、請求項１記載の絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物の製造方法。
4. 平均分子量が１万以上２０万未満であり、細胞生育促進性、展延性等にすぐれた絹タンパク由来の機能性ポリペプチド組成物が、水溶液の形態であることを特徴とする、請求項１記載の機能性ポリペプチド組成物の製造方法。

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