CN116406246A - 重组丝组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了由稳定粉末形成的重组蜘蛛丝组合物，除了其它用途之外，所述重组蜘蛛丝组合物还用于皮肤的水合、清洁、防护、解毒、去除油光和/或去角质。

Description

重组丝组合物及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年7月23日提交的美国临时申请第63/055,894号的权益，所述美国临时申请特此通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及由稳定粉末形成的重组蜘蛛丝组合物，除了其它用途之外，所述重组蜘蛛丝组合物还用于皮肤的水合、清洁、防护、解毒、去除油光和/或去角质。

背景技术

丝是具有许多特性的结构蛋白，使其非常适合用于如护肤和化妆品等应用。最近的技术已经导致各种重组蜘蛛丝多肽和使用各种宿主生物源自重组蜘蛛丝多肽的多肽的可扩展生产。然而，在溶液中大规模水合回收的重组丝粉末以产生如全长基于丝的固体或半固体组合物等期望的调配物的困难一直是重大的挑战。

大多数含有丝的化妆品和护肤品使用水解成小氨基酸链的丝。然而，这些包括降解的丝蛋白片段的组合物失去了丝的期望特征。此外，在用于接触皮肤的丝调配物中使用有害溶剂是不期望的。

虽然产生丝胶蛋白减少的蚕丝(在本文中被称为“丝素蛋白”)的新方法已经产生了设法掺入全长(即非水解)丝蛋白的各种护肤品，但丝的自聚集性质会影响这些产物的保存稳定性。具体地，全长丝素蛋白分子倾向于聚集并从溶液中沉淀出来。此外，这些方法不可扩展，并且因此在商业上不可行。由于重组蜘蛛丝多肽形成与丝素蛋白类似的二级和三级结构，因此它同样适用于化妆品和护肤调配物，但也会由于自聚集而表现出类似的稳定性问题。

因此，需要增加重组蜘蛛丝多肽的保质期(例如原料储存)的稳定性和各种材料形式的丝调配物(例如，化妆品和护肤调配物)的稳定性的可扩展方法，所述方法不使用有害溶剂，提高美学价值，并保持全长丝蛋白的期望性质。

发明内容

在一些实施例中，本文提供了一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括：将包括中空核的重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒充当所述溶剂的载体，由此将所述重组丝颗粒转化为所述基于丝的组合物。

在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括所述外壳中的开口。在一些实施例中，所述重组蜘蛛颗粒呈干粉末的形式。在一些实施例中，将所述重组丝颗粒和溶剂混合使所述中空核扩展。

在一些实施例中，所述溶剂包括水性溶剂、醇、油基溶剂或硅酮。在一些实施例中，所述溶剂是水、甘油、去离子水、橄榄油、戊二醇或硅酮。在一些实施例中，所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体。

在一些实施例中，当与所述溶剂混合时，所述重组蜘蛛丝颗粒膨胀。在一些实施例中，当所述重组丝颗粒干燥时，所述外壳的直径为5μm至25μm。在一些实施例中，当与所述溶剂混合时，所述外壳的直径膨胀到至多120μm。在一些实施例中，所述外壳厚度是所述重组丝颗粒直径的20％以下、15％以下或10％以下。

在一些实施例中，所述组合物包括多个重组丝颗粒。在一些实施例中，所述重组丝颗粒以所述溶剂中1％至10％wt/wt的浓度存在于所述组合物中。

在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括重组蜘蛛丝。在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQ ID NO.:2。在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元。

在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括浓度为至少1重量％的多肽。

在一些实施例中，所述重组丝颗粒是水不溶性的。在一些实施例中，所述重组丝颗粒是珠粒。在一些实施例中，所述粉被喷雾干燥。

在一些实施例中，制备基于丝的组合物的方法进一步包括喷雾干燥包括重组丝多肽的组合物以形成包括所述重组丝颗粒的干粉末。在一些实施例中，制备基于丝的组合物的方法进一步包括将染料添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。在一些实施例中，制备基于丝的组合物的方法进一步包括将表面活性剂或湿润剂添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。

在一些实施例中，所述基于丝的组合物是化妆品或护肤调配物。在一些实施例中，所述基于丝的组合物改善皮肤的紧致、弹性、整体皮肤健康、伤口愈合和/或外观。

在一些实施例中，将所述基于丝的组合物应用于所述皮肤减少氧化应激。在一些实施例中，所述氧化应激选自由以下组成的组：基础水平的氧化应激、由蓝光辐射引起的氧化应激、污染诱导的氧化应激、UVA诱导的氧化应激和UVB氧化应激。在一些实施例中，将所述基于丝的组合物应用于皮肤使所述皮肤的表面去除油光。

在一些实施例中，本文还提供了一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括：将包括中空核的重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体，并且其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元，由此形成所述基于丝的组合物。

在一些实施例中，本文还提供了一种制备基于丝的固体或水凝胶的方法，所述方法包括：将包括中空核的重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒充当所述溶剂的载体，由此形成基于丝的组合物；将所述基于丝的组合物应用于表面；并且干燥所述基于丝的组合物以形成所述基于丝的固体或水凝胶。

在一些实施例中，所述表面包括皮肤、毛发或指甲。在一些实施例中，所述干燥的基于丝的组合物在所述表面上形成屏障。在一些实施例中，所述屏障是基本上均匀的。

在一些实施例中，所述基于丝的固体或水凝胶是珠粒。在一些实施例中，所述基于丝的固体或水凝胶是膜。在一些实施例中，所述基于丝的固体或水凝胶是化妆品或护肤调配物。

在一些实施例中，本文还提供了一种制备基于丝的调配物的方法，所述方法包括：提供包括丝蛋白粉末和溶剂的基于丝的调配物，其中重组丝粉末包括中空核并且是所述溶剂的载体。在一些实施例中，所述重组丝粉末是所述溶剂的载体。

在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括将染料添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括干燥所述基于丝的调配物以形成基于丝的固体或水凝胶。

在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括将所述基于丝的调配物混合到乳液中以形成基于丝的乳液。在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括干燥所述基于丝的乳液以形成基于丝的固体或水凝胶。

在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括将添加剂和所述基于丝的固体或水凝胶混合以形成富集的基于丝的调配物。在一些实施例中，制备基于丝的调配物的方法进一步包括凝结所述基于丝的调配物以在所述基于丝的调配物中形成聚集的丝。

在一些实施例中，所述基于丝的调配物包括凝胶相。在一些实施例中，所述丝蛋白粉末包括重组蜘蛛丝。在一些实施例中，所述重组蜘蛛丝包括全长丝蛋白。在一些实施例中，所述基于丝的调配物是护肤或化妆品调配物。在一些实施例中，所述醇是甘油。在一些实施例中，所述油基溶剂包括游离脂肪酸。在一些实施例中，所述游离脂肪酸包括橄榄油、葡萄籽油或甘油三酯。在一些实施例中，所述基于丝的调配物在与皮肤或水接触或轻轻摩擦时分散。

在一些实施例中，本文还提供了一种组合物，所述组合物包括重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括外壳和中空核。在一些实施例中，所述重组丝颗粒适于形成溶剂的载体。在一些实施例中，所述重组丝颗粒呈粉末的形式。在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括重组蜘蛛丝。

在一些实施例中，所述组合物使所述皮肤去角质。在一些实施例中，所述组合物进一步包括染料。

在一些实施例中，本文还提供了一种组合物，所述组合物包括重组丝颗粒和溶剂，其中所述重组丝颗粒包括外壳和中空核。在一些实施例中，所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体。

在一些实施例中，所述组合物包括表面活性剂或湿润剂。在一些实施例中，所述中空核通过所述溶剂扩展。在一些实施例中，所述组合物是化妆品或护肤调配物。在一些实施例中，所述组合物清洁所述皮肤。

在一些实施例中，本文还提供了一种丝化妆品或护肤品，其包括丝蛋白颗粒溶剂，其中所述丝蛋白颗粒包括中空核并携带所述溶剂。

在一些实施例中，所述丝蛋白颗粒是水不溶性的。在一些实施例中，所述丝化妆品或护肤品是固体、水凝胶或膜。

在一些实施例中，本文还提供了一种重组丝化妆品或护肤品，其包括半固体，其中所述半固体包括分散的非聚集重组丝蛋白和溶剂。

在一些实施例中，所述半固体在与皮肤接触时去除残余物。在一些实施例中，所述半固体是水凝胶。

在一些实施例中，本文还提供了一种组合物，所述组合物包括重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括中空核。在一些实施例中，所述重组丝颗粒是去角质剂。

根据一些实施例，本文还提供了一种改善皮肤外观的方法，所述方法包括将包括重组丝颗粒的组合物应用于所述皮肤，所述重组丝颗粒包括中空核。在一些实施例中，所述组合物包括约1wt％的重组丝蛋白。

在一些实施例中，改善的皮肤外观提供至少一种选自包括以下的组的结果：增加皮肤紧致度/丰满度、增加弹性、改善整体皮肤健康、增加水合作用、改善伤口愈合、降低氧化应激水平、减弱污染诱导的氧化应激、减弱UVA或UVB诱导的氧化应激及其任何组合。

在一些实施例中，本文还提供了一种清洁表面的方法，所述方法包括：将包括重组丝颗粒的组合物应用于表面以形成膜或珠粒，所述重组丝颗粒包括中空核；并且从所述表面去除所述膜或珠粒。

根据一些实施例，本文还提供了一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括干燥包括重组丝的组合物以形成包括重组丝颗粒的干燥粉末。在一些实施例中，所述重组丝颗粒包括外壳和中空核。

根据一些实施例，本文还提供了一种组合物，其包括干燥粉末，所述干燥粉末包括重组丝蛋白。在一些实施例中，所述干燥粉末包括重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括中空核和外壳。在一些实施例中，所述重组丝颗粒适于充当载体。

附图说明

如附图中所示，前述和其它目的、特征和优点将从以下对本发明特定实施例的描述中变得明显。

图1A示出了在干燥状态下具有18B多肽序列(SEQ ID NO:1)(“18B粉末”或“18B”)的完整和破裂重组丝粉末颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。图1B示出了通过光学和偏振显微镜在水合状态下的中空壳形态。

图2A示出了重新悬浮于各种不同溶剂中的18B粉末的光学显微镜图像。图2B示出了1g在干燥状态下的18B粉末和1g在饱和暴露于水性溶液之后的18B粉末的图像。

图3A示出了根据本发明的各种实施例产生的水、酸性纺织染料和18B粉末的混合物。图3B示出了在最终粉末状态下以及在应用于皮肤之后的染色的18B粉末。图3C示出了添加到乳膏乳液中的不同浓度的染色的18B粉末。图3D示出了在4℃下储存6个月之后的染色的18B粉末的色牢度的稳定性。

图4示出了将18B粉末溶液应用于皮肤、干燥并在表皮层的皮肤表面上形成薄的均匀屏障的示意图。

图5A示出了根据本发明的各种实施例将18B粉末溶液添加到底物的示意图以及当以2mg/cm²的单位表面积质量应用于底物时干燥的1wt％18B粉末溶液聚结成约1μm厚的薄膜的SEM图像。图5B示出了膜厚度随溶液浓度、体积和表面积的变化。该图像表示分配到4cm²面积上的各种不同质量的1wt％溶液。图5C示出了在21℃和40％湿度的环境条件下以2mg/cm²应用染色的2wt％18B粉末溶液并干燥(干燥5分钟)之前和之后的皮肤图像。

图6A示出了通过荧光标记蛋白来可视化的18B粉末蛋白屏障的图像。图6B示出了研究重复磨损对18B粉末蛋白屏障的作用的实验设计。图6C示出了与裸露皮肤(“对照”)相比，18B粉末蛋白屏障经受无摩擦、100次摩擦和600次摩擦的重复磨损的图像。图6D示出了在一至五次湿擦拭物擦拭之后皮肤上的18B粉末蛋白屏障的图像。图6E示出了多次擦拭之后的湿擦拭物图像。

图7A和7B示出了研究18B粉末溶液对碳颗粒的作用的污染等级研究的结果。图7C示出了与对照相比，使用水解丝和18B粉末溶液在聚氨酯材料或人造皮肤上进行污染洗涤的图像。图7D示出了与未经处理的对照相比，使用1％和2％18B粉末溶液对毛发进行污染洗涤的图像以及在洗涤之后所得的冲洗水。

图8A示出了包含在黑色眼影上摩擦皮肤的18B粉末、炭黑和米糠的各种干物质的图像以及用水冲洗之后的图像。图8B示出了与对照和其它标准成分相比，用作皮肤模拟物上的去角质剂的18B粉末的显微图像。图8C示出了与对照和水解丝溶液相比，用作皮肤替代物上的清洁剂的10wt％18B粉末溶液。图8D示出了与不含18B粉末的清洁剂调配物(图8E中列出的成分列表)相比，用作清洁剂添加剂的各种浓度的18B粉末溶液。图8E示出了根据本发明的一个实施例的18B粉末清洁剂的成分列表。

图9A示出了2wt％18B粉末溶液对皮肤紧致度和弹性的改善平均百分比。与t＝0周时的基线测量结果相比，对于t＝12周时基础皮肤乳膏中的2wt％18B粉末，*＝p<0.05。图9B示出了在8周的时间段内，2wt％18B粉末溶液提升面部中部、弹性、紧致度和整体皮肤健康外观方面的统计改善的图。与空媒剂相比，对于2wt％18B粉末溶液，*＝p<0.05。图9C示出了在受试者使用2wt％18B粉末溶液4周之后的主观小组成员问卷的皮肤结果的图。与空媒剂相比，对于2wt％18B粉末溶液，*＝p<0.05。

图10示出了在产生划痕48小时之后的角质细胞伤口划痕模型以及在用和不用100μg/mL的18B粉末温育细胞之后由计算机产生的伤口闭合的定量的光学显微镜图像。

图11A示出了与阳性对照相比，在划痕形成24小时之后的成纤维细胞伤口划痕模型以及在用和不用各种浓度的18B粉末(25μg/mL和50μg/mL)温育细胞之后的伤口闭合的定量的光学显微镜图像。图11B示出了与阳性对照相比，在用和不用各种浓度的18B粉末(25μg/mL和50μg/mL)温育细胞之后通过迁移成纤维细胞的受伤面积的覆盖率百分比的定量。

图12A示出了重新悬浮于不同溶剂中的18B粉末的另外的光学显微镜图像。图12B示出了通过图像分析确定的各种溶剂中的粉末直径的比较。图12C示出了各种溶剂中的粉末直径与累积百分比(％)的图形比较。

图13A示出了通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的各种重组18B蛋白粉末溶液的溶解度的定量。图13B示出了溶解度结果的表。

图14A示出了在第4天和第8天时间点处的未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品的组织学横截面。虚线指示原始伤口位点的位置(左侧虚线)和伤口闭合的程度(右侧虚线)。图14B示出了在第4天和第8天时间点处的样品的平均表皮舌长(μm)的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(**＝p<0.01，*＝p<0.05)。

图15A示出了未经处理的离体组织、空媒剂和2％重组18B蛋白样品用和不用蓝光辐射对其进行8-OHdG染色的组织学横截面。图15B示出了用和不用蓝光辐射并绘制为平均8-OHdG染色表面％+/-标准偏差的组织学结果的定量(**＝p<0.01)。

图16A示出了未经处理的离体组织、空媒剂和2％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于污染并对其进行Nrf2染色的组织学横截面。图16B示出了暴露于和未暴露于污染的Nrf2表达的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(**＝p<0.01)。图16C示出了未经处理的离体组织、空媒剂和2％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于污染并对其进行IL-1α染色的组织学横截面。图16D示出了暴露于和未暴露于污染的IL-1α表达的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(**＝p<0.01)。

图17A示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVB并用梅森氏三色(Mason's Trichrome)进行染色以可视化细胞活力的组织学横截面。图17B示出了暴露于UVB的晒伤细胞总数的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(*＝p<0.05)。图17C示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVB并对其进行胸腺嘧啶二聚体染色的组织学横截面。图17D示出了暴露于UVB的胸腺嘧啶二聚体表达的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(**＝p<0.01)。图17E示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVA并对其进行Nrf2染色的组织学横截面。图17F示出了暴露于UVA的Nrf2表达的定量结果。将数据绘制为平均值+/-标准偏差(#＝p<0.1)。

图18示出了当与空媒剂相比时，18B粉末对皮肤的去除油光作用。

具体实施方式

以下描述中列出了本发明的各种实施例的细节。根据描述，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见。除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另外要求，否则单数术语应该包含复数含义并且复数术语应该包含单数含义。除非上下文另外指明，否则术语“一个(a)”和“一种(an)”包含复数个指示物。通常，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学、蛋白质和核酸化学以及杂交结合使用的命名法和技术是本领域中熟知并且普遍使用的那些命名法和技术。

定义

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：

如本文关于丝蛋白所使用的术语“稳定性”是指产物不形成由于丝蛋白自聚集而引起的凝胶化、变色或混浊的能力。例如，美国专利公开第2015/0079012号(Wray等人)涉及使用湿润剂，包含增加包括全长丝素蛋白的护肤品的保存稳定性的甘油。美国专利公开第9,187,538号涉及包括保存稳定性为至多10天的全长丝素蛋白的护肤调配物。这两个公开通过引用整体并入本文。

术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度至少为10个碱基的核苷酸的聚合形式。所述术语包含DNA分子(例如，cDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如，mRNA或合成RNA)，以及含有非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或两者的DNA或RNA类似物。核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链体的、部分双链的、支链的、发夹的、环状的或呈挂锁构象。

除非另有说明，并且作为本文以通用格式“SEQ ID No:”描述的所有序列的实施例，“包括SEQ ID NO:1的核酸”是指一种核酸，其至少一部分具有(i)SEQ ID NO:1的序列，或(ii)与SEQ ID NO:1互补的序列。两者之间的选择由上下文决定。例如，如果将核酸用作探针，则两者之间的选择取决于探针与所需靶标互补的要求。

“分离的”RNA、DNA或混合聚合物是基本上与其天然宿主细胞中天然地伴随自然的多核苷酸的其它细胞成分分离，例如，基本上与其天然缔合的核糖体、聚合酶和基因组序列分离。

“分离的”有机分子(例如，丝蛋白)是基本上与其来源的宿主细胞的细胞成分(膜脂、染色体、蛋白质)分离的分子，或者是与培养宿主细胞的培养基分离的分子。所述术语不要求生物分子已与所有其它化学品分离，尽管某些分离的生物分子可以纯化至接近均质性。

术语“重组体”是指一种生物分子，例如基因或蛋白质，其(1)已从其天然存在的环境中移除，(2)与在自然界中发现的基因的多核苷酸的全部或部分不相关，(3)与其在自然界中不与其相连的多核苷酸可操作地连接，或(4)在自然界中不存在。术语“重组体”可用于指代克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物，以及由此类核酸编码的蛋白质和/或mRNA。

如果异源序列与内源核酸序列相邻放置，使得该内源核酸序列的表达顺序被改变，则生物体基因组中的内源核酸序列(或该序列的编码蛋白质产物)在本文中被认为是“重组体”。在此背景下，异源序列是不与内源核酸序列天然相邻的序列，无论异源序列本身是内源的(源自相同的宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。举例来说，可以用启动子序列取代(例如，通过同源重组)宿主细胞基因组中基因的天然启动子，使得该基因具有改变的表达模式。该基因现在将变成“重组体”，因为它与至少一些自然侧翼的序列分离。

如果核酸包含基因组中相应核酸不会自然发生的任何修饰，则所述核酸也被认为是“重组体”。例如，如果内源编码序列包含(例如通过人为干预)人工引入的插入、缺失或点突变，则它被认为是“重组体”。“重组核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。

如本文所使用的术语“肽”是指短多肽，例如，其长度通常小于约50个氨基酸，更通常小于约30个氨基酸。如本文所使用的术语涵盖模拟结构和因此生物功能的类似物和模拟物。

术语“多肽”涵盖天然存在和非天然存在的蛋白质及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体的或聚合的。此外，多肽可以包括许多不同的结构域，每个结构域具有一种或更多种不同的活性。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是一种蛋白质或多肽，由于其来源或衍生来源而(1)不以其天然状态与伴随其的天然缔合成分缔合，(2)以自然界中未发现的纯度存在，其中可以相对于其它细胞物质的存在来判定纯度(例如，不含来自相同物种的其它蛋白质)(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)自然界中不存在(例如，它是自然界中发现的多肽的片段，或者它包括自然界中未发现的氨基酸类似物或衍生物，或标准肽键以外的连接)。因此，化学合成或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将从其天然相关成分中“分离”。也可以使用本领域熟知的蛋白质纯化技术通过分离使多肽或蛋白质基本上不含天然缔合的成分。如因此所定义的，“分离的”不一定要求如此描述的蛋白质、多肽、肽或寡肽已经从其天然环境中物理地去除。

术语“多肽片段”是指与全长多肽相比具有缺失，例如氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在优选实施例中，多肽片段是连续序列，其中所述片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸长，优选地为至少12、14、16或18个氨基酸长，更优选地为至少20个氨基酸长，更优选地为至少25、30、35、40或45个氨基酸，甚至更优选地为至少50或60个氨基酸长，且甚至更优选地为至少70个氨基酸长。

如果编码蛋白质的核酸序列具有与编码第二蛋白质的核酸序列相似的序列，则蛋白质与第二蛋白质具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果两种蛋白质具有“相似”的氨基酸序列，则蛋白质与第二蛋白质具有同源性。(因此，术语“同源蛋白质”被定义为意味着两种蛋白质具有相似的氨基酸序列。)如本文所使用的，氨基酸序列的两个区之间的同源性(尤其是关于预测的结构相似性)被解释为暗示在功能上相似性。

当“同源”用于指代蛋白质或肽时，应认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或同源性程度以校正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如Pearson,1994,《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》24:307-31和25:365-89(通过引用并入本文)。

二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见《免疫学合成(ImmunologyASynthesis)》,Golub和Gren编辑,马萨诸塞州桑德兰的Sinauer Associates出版社(Sinauer Associates,Sunderland,Mass.),第2版1991)，所述文献通过引用并入本文。二十种常规氨基酸、非天然氨基酸如α-、α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸和其它非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包含：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手端对应于氨基末端，右手端对应于羧基末端。

以下六组中的每组都包含相互保守取代的氨基酸：1)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)，以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

多肽的序列同源性，有时也称为序列同一性百分比，通常使用序列分析软件测量。参见例如遗传计算机组(GCG)的序列分析软件包(the Sequence Analysis SoftwarePackage of the Genetics Computer Group(GCG))，威斯康星州麦迪逊大学大道910号威斯康星大学生物技术中心(University of Wisconsin Biotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wis.)，邮编53705。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰(包含保守氨基酸取代)的同源性测量来匹配相似序列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“Bestfit”之类的程序，它们可以使用默认参数来确定密切相关的多肽(例如来自不同物种的生物体)之间或者野生型蛋白质和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，6.1版GCG。

当将特定多肽序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，有用的算法是计算机程序BLAST(Altschul等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；Gish和States,《自然遗传学(Nature Genet.)》3:266-272(1993)；Madden等人,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》266:131-141(1996)；Altschul等人,《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》25:3389-3402(1997)；Zhang和Madden,《基因组研究(Genome Res.)》7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等人,《核酸研究》25:3389-3402(1997))。

BLASTp的优选参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；起始空位罚分：11(默认)；空位延伸罚分：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数：100(默认)；处罚矩阵：BLOWSUM62。

BLASTp的优选参数是：期望值：10(默认)；过滤器：seg(默认)；起始空位罚分：11(默认)；空位延伸罚分：1(默认)；最高比对：100(默认)；字长：11(默认)；描述数：100(默认)；处罚矩阵：BLOWSUM62。用于同源性比较的多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸残基，通常至少约20个残基，更通常至少约24个残基，通常至少约28个残基，优选多于约35个残基。在搜索包含来自大量不同生物的序列的数据库时，最好比较氨基酸序列。可以通过本领域已知的除blastp之外的算法来测量使用氨基酸序列的数据库搜索。例如，可以使用FASTA(GCG 6.1版的程序)比较多肽序列。FASTA提供了查询序列与搜索序列之间最佳重叠区的比对和百分比序列同一性。Pearson,《酶学方法》183:63-98(1990)(通过引用并入本文)。例如，氨基酸序列之间的序列同一性百分比可以是使用如GCG 6.1版所提供的FASTA以其默认参数(字长2和PAM250评分矩阵)来确定，所述程序通过引用结合在此。

在整个此说明书和权利要求中，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises和comprising)”等变体将被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。

如本文所使用的术语“玻璃化转变”是指物质或组合物从坚硬、刚性或“玻璃状”状态转变为更柔韧的“橡胶状”或“粘性”状态。

如本文所使用的术语“玻璃化转变温度”是指物质或组合物经历玻璃化转变的温度。

如本文所使用的术语“熔体转变”是指物质或组合物从橡胶态向有序度较低的液相的转变。

如本文所使用的术语“熔融温度”是指物质经历熔体转变的温度范围。

如本文所使用的术语“增塑剂”是指与多肽序列相互作用以防止多肽序列形成三级结构和键和/或增加多肽序列的移动性的任何分子。

如本文所使用的术语“粉末”是指以颗粒形式存在的组合物，其可以或可以不与如水或精华液等溶剂络合或附聚。术语“干粉末”可以与术语“粉末”互换使用；然而，除非另有说明，如本文所使用的“干粉末”仅指制粒材料的总体外观并且不旨在意味着所述材料完全不含络合或附聚的溶剂。干粉末可以通过喷雾干燥、冻干和/或根据本领域已知的方法产生。

术语“载体”是指用于表面水合、表面清洁、表面防护、表面解毒、表面去角质、表面改善、着色和/或向如皮肤、毛发或指甲等表面递送各种添加剂或溶剂的重组蛋白，所述添加剂或溶剂包含但不限于水、甘油、醇、硅氧烷、油、湿润剂、润肤剂、封闭剂、活性剂和/或化妆品佐剂。如本文所使用的载体包括外壳和中空核，例如18B蛋白。

如本文所使用的术语“化妆品”包含化妆、粉底、护肤、护发和指甲护理产品。

如本文所使用的术语“化妆品”是指在面部留下颜色的产品，包含粉底、黑色和棕色，即睫毛膏、遮瑕膏、眼线笔、眉毛颜色、眼影、腮红、唇色、粉末、固体乳液粉饼等。

本文所使用的术语“粉底”是指化妆品公司创造或重新引入的液体、乳膏、摩丝、湿粉饼、粉饼、遮瑕膏或类似产品，以均匀皮肤的整体颜色。

本文所使用的术语“护肤产品”是指用于处理或护理或以某种方式保湿、改善或清洁皮肤的产品。短语“护肤产品”所涵盖的产品包含但不限于乳膏、喷雾、精华液、清洁凝胶、安瓿、粘合剂、贴片、绷带、牙膏、无水封闭性保湿剂、止汗剂、除臭剂、个人清洁产品、粉末衣物洗涤剂、织物柔软剂毛巾、封闭性药物递送贴片、指甲油、粉末、纸巾、擦拭物、无水护发素、剃须膏等。

本文所使用的术语“下垂”意指由于皮肤弹性蛋白、肌肉和/或皮下脂肪的丢失、损伤、改变和/或异常而导致的皮肤疏松、松弛或类似状况。

本文所使用的术语“处理(treating或treatment)”是指处理(例如，缓解或消除症状和/或治愈)和/或防止或抑制病状(例如皮肤病状)或减轻症状。

下面描述了示例性方法和材料，尽管与本文描述的那些相似或等效的方法和材料也可以用于本发明的实践中并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文所提及的所有公开文献和其它参考文献通过引用以其整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包含定义)为准。所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。

重组丝蛋白

本公开描述了本发明的实施例，包含由合成蛋白质共聚物(即，重组多肽)合成的纤维。合适的蛋白质共聚物在于2016年8月45日公开的美国专利公开第2016/0222174号、于2018年4月26日公开的美国专利公开第2018/0111970号和于2018年3月1日公开的美国专利公开第2018/0057548号中讨论，所述美国专利公开中的每一个通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，合成蛋白质共聚物由丝样多肽序列制成。在一些实施例中，丝样多肽序列是1)通过混合和匹配源自丝多肽序列的重复结构域产生的嵌段共聚物多肽组合物和/或2)具有足够大的尺寸(约40kDa)以通过从工业可放大的微生物(industriallyscalable microorganism)中分泌形成有用的成型体组合物的嵌段共聚物多肽的重组表达。从丝重复结构域片段工程化的大(大约40kDa至大约100kDa)嵌段共聚物多肽可以在本文所描述的经修饰的微生物中表达，所述丝重复结构域片段包含来自几乎所有公开的丝多肽氨基酸序列的序列。在一些实施例中，丝多肽序列经匹配和设计以产生能够形成成型体的高度表达和分泌的多肽。

在一些实施例中，嵌段共聚物是经由跨越丝多肽序列空间的丝多肽结构域的组合混合物工程改造的。在一些实施例中，嵌段共聚物通过在可放大的生物体(例如酵母、真菌和革兰氏阳性细菌)中表达和分泌来制备。在一些实施例中，嵌段共聚物多肽包含0个或更多个N-末端结构域(NTD)、1个或更多个重复结构域(REP)和0个或更多个C-末端结构域(CTD)。在实施例的一些方面，嵌段共聚物多肽是>100个氨基酸的单一多肽链。在一些实施例中，嵌段共聚物多肽包含与国际公开第WO/2015/042164号“用于合成改善的丝纤维的组合物和方法(Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers)”(其通过引用整体并入本文)中公开的嵌段共聚物多肽的序列有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的结构域。

已经确定了几种类型的天然蜘蛛丝。每种天然纺丝类型的机械性质被认为与该丝的分子组成密切相关。参见例如Garb,J.E.等人,用蛛丝蛋白末端结构域揭示蜘蛛丝进化(Untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains),《BMC进化生物学(BMC Evol.Biol.)》,10:243(2010)；Bittencourt,D.等人,蜘蛛丝的蛋白家族、自然历史和生物技术方面(Protein families,natural history and biotechnologicalaspects of spider silk),《遗传学和分子研究(Genet.Mol.Res.)》,11:3(2012)；Rising,A.等人,蜘蛛丝蛋白：重组生产、结构-功能关系和生物医学应用的最新进展(Spider silkproteins:recent advances in recombinant production,structure-functionrelationships and biomedical applications),《细胞和分子生命科学(Cell.Mol.LifeSci.)》,68:2,第169-184页(2011)；以及Humenik,M.等人,蜘蛛丝：理解天然纤维的结构-功能关系(Spider silk:understanding the structure-function relationship of anatural fiber),《分子生物学和转化科学进展(Prog.Mol.Biol.Transl.Sci.)》,103,第131-85页(2011)。例如：

葡萄状腺(AcSp)丝往往具有高韧性，这是适度的高强度加上适度的高延展性的结果。AcSp丝的特征在于大嵌段(“整体重复”)尺寸，通常并入有多聚丝氨酸和GPX的基序。管状腺(TuSp或圆柱形)丝往往具有较大的直径，具有适度的强度和高延展性。TuSp丝的特征在于它们的聚丝氨酸和聚苏氨酸含量，以及短束的聚丙氨酸。大壶状腺(MaSp)丝往往具有高强度和适度的延展性。MaSp丝可以是两种亚型之一：MaSp1和MaSp2。MaSp1丝通常比MaSp2丝的延展性更小，并且特征在于聚丙氨酸、GX和GGX基序。MaSp2丝的特征在于聚丙氨酸、GGX和GPX基序。小壶状腺(MiSp)丝往往具有适度的强度和适度的延展性。MiSp丝的特征在于GGX、GA和poly A基序，并且通常包含大约100个氨基酸的间隔元件。鞭毛腺(Flag)丝往往具有非常高的延展性和适度的强度。Flag丝通常特征在于GPG、GGX和短间隔基序。

每种类型的丝的性质可能因物种而异，并且生活方式不同的蜘蛛(例如定栖织网者与流浪猎人)或进化上更古老的蜘蛛可能会产生不同于上述描述的性质的丝(关于蜘蛛多样性和分类的描述，参见Hormiga,G.和Griswold,C.E.,织球蜘蛛的系统学、系统发育和进化(Systematics,phylogeny,and evolution of orb-weaving spiders),《昆虫学年评(Annu.Rev.Entomol.)》59,第487-512页(2014)；以及Blackedge,T.A.等人,分子时代重建网络进化和蜘蛛多样化(Reconstructing web evolution and spider diversificationin the molecular era),《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》,106:13,第5229-5234页(2009))。然而，与天然丝蛋白的重复结构域具有序列相似性和/或氨基酸组成相似性的合成嵌段共聚物多肽可用于在商业规模上制造一致的成型体，其具有重现由天然丝多肽制成的相应成形体的性质的性质。

在一些实施例中，可以通过在GenBank中搜索相关术语来编译推定的丝序列列表，例如“蛛丝蛋白”“丝素蛋白”“MaSp”，并且可以将这些序列与通过独立测序工作获得的额外序列合并。然后将序列翻译成氨基酸，过滤重复条目，并手动拆分为结构域(NTD、REP、CTD)。在一些实施例中，将候选氨基酸序列反向翻译成优化用于在巴斯德(毕赤)酵母(Pichia(Komagataella)pastoris)中表达的DNA序列。DNA序列各自被克隆到表达载体中并转化到巴斯德(毕赤)酵母中。在一些实施例中，显示成功表达和分泌的各种丝结构域随后以组合方式组装以构建能够形成成型体的丝分子。

丝多肽特征性地由侧接非重复区(例如，C-末端和N-末端结构域)的重复结构域(REP)组成。在实施例中，C-末端和N-末端结构域的长度都在75-350个氨基酸之间。重复结构域呈现出层次架构，如图1所描绘。重复结构域包含一系列嵌段(也称为重复单元)。嵌段在整个丝重复结构域中重复，有时完美地重复有时不完美地重复(构成一个准重复结构域)。嵌段的长度和组成因不同的丝类型和不同的物种而异。表1A列出了来自选定物种和丝类型的嵌段序列的实例，其中另外的实例见于Rising,A.等人,蜘蛛丝蛋白：重组生产、结构-功能关系和生物医学应用的最新进展,《细胞和分子生命科学》,68:2,第169-184页(2011)；以及Gatesy,J.等人,蜘蛛丝素蛋白序列的极端多样性、保守性和趋同性(Extremediversity,conservation,and convergence of spider silk fibroin sequences),《科学(Science)》,291:5513,第2603-2605页(2001)。在一些情况下，嵌段可能以规则模式排列，形成在丝序列的重复结构域中出现多次(通常为2-8次)的更大的宏观重复体。重复结构域或宏观重复体内的重复嵌段，以及重复结构域内的重复的宏观重复体，可以由间隔元素分隔。在一些实施例中，嵌段序列包括富含甘氨酸的区，然后是polyA区。在一些实施例中，短(约1-10)个氨基酸基序在嵌段内多次出现。出于本发明的目的，在不参考环状排列的情况下，可以选择来自不同天然丝多肽的嵌段(即，丝多肽之间在其它方面相似的识别嵌段可能由于环状排列而不对齐)。因此，例如，为了本发明的目的，SGAGG(SEQ ID NO:494)的“嵌段”与GSGAG(SEQ ID NO:495)相同并且与GGSGA(SEQ ID NO:496)相同；其都只是彼此的循环排列。为给定的丝序列选择的特定排列最大程度上可以由便利性(通常以G开始)决定。从NCBI数据库获得的丝序列可以划分为嵌段和非重复区。

表1A：嵌段序列的样品

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根据本发明的某些实施例，来自嵌段和/或宏观重复结构域的成纤嵌段共聚物多肽描述于国际公开第WO/2015/042164号中，所述国际公开通过引用并入本文。按结构域(N-末端结构域、重复结构域和C-末端结构域)对从如GenBank等蛋白质数据库或通过de novo测序获得的天然丝序列进行分解。为了合成和组装成纤维或成型体的目的而选择的N-末端结构域和C-末端结构域序列包含天然氨基酸序列信息和本文所述的其它修饰。重复结构域被分解成含有代表性嵌段的重复序列，该嵌段通常为1-8个，具体取决于丝的类型，它们捕获关键的氨基酸信息，同时将编码氨基酸的DNA的大小减小为易于合成的片段。在一些实施例中，适当形成的嵌段共聚物多肽包括至少一个重复结构域，所述重复结构域包括至少1个重复序列，并且任选侧接N-末端结构域和/或C-末端结构域。

在一些实施例中，重复结构域包括至少一个重复序列。在一些实施例中，重复序列是150-300个氨基酸残基。在一些实施例中，重复序列包括多个嵌段。在一些实施例中，重复序列包括多个宏观重复体。在一些实施例中，一个嵌段或一个宏观重复体被分割成多个重复序列。

在一些实施例中，重复序列以甘氨酸开始，并且不能以苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、甲硫氨酸(M)或天冬氨酸(D)结束，以满足DNA组装要求。在一些实施例中，与天然序列相比，可以改变一些重复序列。在一些实施例中，可以改变重复序列，如通过向多肽的C末端添加丝氨酸(以避免其终止于F、Y、W、C、H、N、M或D)。在一些实施例中，可以通过用来自另一嵌段的同源序列填充不完整的嵌段来修饰重复序列。在一些实施例中，可以通过重新排列嵌段或宏观重复体的顺序来修饰重复序列。

在一些实施例中，可以选择非重复的N-和C-末端结构域用于合成。在一些实施例中，N-末端结构域可以通过去除前导信号序列来实现，例如，通过SignalP来鉴定(Peterson,T.N.等人,SignalP 4.0：从跨膜区区分信号肽(SignalP 4.0:discriminatingsignal peptides from transmembrane regions),《自然方法(Nat.Methods)》,8:10,第785-786页(2011)。

在一些实施例中，N-末端结构域、重复序列或C-末端结构域序列可以源自漏斗网蜘蛛(Agelenopsis aperta)、Aliatypus gulosus、哥斯达黎加斑马脚蜘蛛(Aphonopelmaseemanni)、短牙蛛种AS217(Aptostichus sp.AS217)、短牙蛛种AS220、十字园蛛、猫脸蜘蛛、大腹圆蛛、悦目金蛛(Argiope amoena)、银色金蛛(Argiope argentata)、横纹金蛛(Argiope bruennichi)、三带金蛛、Atypoides riversi、黄带粉趾(Aviculariajuruensis)、沟穴蛛属(Bothriocyrtumcalifornicum)、食人魔脸蜘蛛、灰色迪格蛛(Diguetia canities)、黑捕鱼蛛、Euagrus chisoseus、苗圃网络蜘蛛、乳突棘旗蜘蛛(Gasteracantha mammosa)、Hypochilus thorelli、南家蛛(Kukulcania hibernalis)、黑寡妇蜘蛛、Megahexura fulva、Metepeira grandiosa、金圆网蛛(Nephila antipodiana)、棒络新妇蛛、络新妇蛛、马达加斯加新妇蛛(Nephila madagascariensis)、斑络新妇蛛(Nephila pilipes)、Nephilengys cruentata、帕拉威夏双条纹蛛(Parawixiabistriata)、绿色猞猁蜘蛛(Peucetia viridans)、原始食肉蛛、印度华丽雨林蛛(Poecilotheria regalis)、长爪绿色突光蝴蛛或全異蟱蛛。

在一些实施例中，丝多肽核苷酸编码序列可以与α交配因子核苷酸编码序列可操作地连接。在一些实施例中，丝多肽核苷酸编码序列可以与另一内源或异源分泌信号编码序列可操作地连接。在一些实施例中，丝多肽核苷酸编码序列可以与3X FLAG核苷酸编码序列可操作地连接。在一些实施例中，丝多肽核苷酸编码序列与如6-8个His残基等其它亲和标签可操作地连接。

在一些实施例中，重组丝多肽基于源于MaSp2的重组蜘蛛丝蛋白片段序列，如来自横纹金蛛物种。在一些实施例中，合成纤维含有包含二至二十个重复单元的蛋白分子，其中每个重复单元的分子量大于约20kDa。在共聚物的每个重复单元内有超过约60个氨基酸残基，通常在60至100个氨基酸的范围内，它们被组织成许多“准重复单元”。在一些实施例中，本公开中描述的多肽的重复单元与MaSp2牵引丝蛋白序列具有至少95％的序列同一性。

形成具有良好机械性质的纤维的蛋白质嵌段共聚物的重复单元可以使用丝多肽的一部分来合成。这些多肽重复单元含有富含丙氨酸的区和富含甘氨酸的区，并且长度为150个氨基酸或更长。在共同拥有的PCT公开WO 2015/042164中提供了可以用作本公开的蛋白质嵌段共聚物中的重复序列的一些示例性序列，其通过引用整体并入，并且被证明使用毕赤酵母表达系统表达。

在一些实施例中，丝蛋白包括：至少两次出现的重复单元，所述重复单元包括：超过150个氨基酸残基并具有至少10kDa的分子量；具有6个或更多个连续氨基酸的富含丙氨酸的区，包括至少80％的丙氨酸含量；具有12个或更多个连续氨基酸的富含甘氨酸的区，包括至少40％的甘氨酸含量和少于30％的丙氨酸含量；并且其中所述纤维包括选自由以下组成的组的至少一种性质：大于550cN/tex的弹性模量、至少10％的延展性和至少15cN/tex的极限拉伸强度。

在一些实施例中，其中重组丝蛋白包括重复单元，其中每个重复单元与包括2至20个准重复单元的序列具有至少95％序列同一性；每个准重复单元包括{GGY-[GPG-X₁]_n1-GPS-(A)_n2}，其中对于每个准重复单元；X₁独立地选自由以下组成的组：SGGQQ、GAGQQ、GQGOPY、AGQQ和SQ；并且n1为4至8，并且n2为6-10。重复单元由多个准重复单元组成。

在一些实施例中，3个“长”准重复单元之后是3个“短”准重复单元。如上所述，短的准重复单元是其中n1＝4或5的那些准重复单元。长准重复单元定义为其中n1＝6、7或8的那些准重复单元。在一些实施例中，所有的短准重复在重复单元的每个准重复单元内的相同位置具有相同的X₁基序。在一些实施例中，6个中不超过3个准重复单元共享相同的X₁基序。

在另外的实施例中，重复单元由准重复单元组成，所述准重复单元在重复单元内的行中使用相同X₁不超过两次。在另外的实施例中，重复单元由准重复单元组成，其中，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个准重复在重复单元的单个准重复单元中使用相同的X₁不超过2次。

在一些实施例中，重组丝多肽包括SEQ ID NO:1的多肽序列(即，18B)。在一些实施例中，重复单元是包括SEQ ID NO:2的多肽。表1B中提供了这些序列：

表1B-重组蛋白和重复单元的示例性多肽序列

在一些实施例中，由所描述的重组丝多肽形成的纤维结构形成β-折叠结构、β-转角结构或α-螺旋结构。在一些实施例中，所形成的纤维的二级、三级和四级蛋白结构被描述为具有纳米结晶β-折叠区、无定形β-转角区、无定形α-螺旋区、嵌入非结晶基质中的随机空间分布的纳米结晶区或嵌入非结晶基质中的随机取向的纳米结晶区。不旨在受理论的限制，蜘蛛丝内的蛋白的结构性质理论上与纤维机械性质有关。纤维中的结晶区与纤维的拉伸强度有关，而无定形区与纤维的延展性有关。与鞭状丝相比，大壶腹腺(MA)丝往往具有比鞭状丝更高的强度和更小的延展性，并且MA丝具有更高的结晶区体积分数。此外，基于蜘蛛丝蛋白的结晶和无定形区的分子动力学的理论模型支持这样的断言，即结晶区与纤维的拉伸强度有关，而无定形区与纤维的延展性有关。另外地，理论模型支持二级、三级和四级结构对RPF的机械性质的重要性。例如，纳米晶体在随机、平行和连续空间分布中的组装以及无定形区内缠结链之间和无定形区与纳米结晶区之间的相互作用力的强度两者影响所得纤维的理论机械性质。

在一些实施例中，丝蛋白的分子量的范围可以为20kDa至2000kDa、或大于20kDa、或大于10kDa、或大于5kDa、或5至400kDa、或5至300kDa、或5至200kDa、或5至100kDa、或5至50kDa、或5至500kDa、或5至1000kDa、或5至2000kDa、或10至400kDa、或10至300kDa、或10至200kDa、或10至100kDa、或10至50kDa、或10至500kDa、或10至1000kDa、或10至2000kDa、或20至400kDa、或20至300kDa、或20至200kDa、或40至300kDa、或40至500kDa、或20至100kDa、或20至50kDa、或20至500kDa、或20至1000kDa、或20至2000kDa。

重组蜘蛛丝多肽粉末杂质及降解的表征

基于蛋白质形成的二级和三级结构的强度和稳定性，不同的重组蜘蛛丝多肽具有如熔融温度和玻璃化转变温度等不同的理化性质。丝多肽以单体形式形成β折叠结构。在存在其它单体的情况下，丝多肽形成β折叠结构的三维晶格。β折叠结构与多肽序列的无定形区分开并散布在其中。

β-折叠结构在高温下非常稳定——通过快速扫描量热法测量，β-折叠的熔融温度为大约257℃。参见Cebe等人,战胜热量——快速扫描熔体丝β折叠晶体(Beating theHeat–Fast Scanning Melts Silk Beta Sheet Crystals),《自然科学报告(NatureScientific Reports)》3:1130(2013)。由于β折叠结构被认为在丝多肽的玻璃化转变温度以上保持完整，因此假设在重组丝多肽的玻璃化转变温度下看到的结构转变是由于β折叠之间的无定形区的流动性增加。

增塑剂通过增加无定形区的流动性和潜在地破坏β折叠形成来降低丝蛋白的玻璃化转变温度和熔融温度。用于此目的的合适增塑剂包含但不限于水和多元醇(多元醇)，如甘油、三甘油、六甘油和十甘油。其它合适的增塑剂包含但不限于异山梨醇二甲醚；己二酸；二甲基氨基丙胺和辛酸/癸酸的酰胺；乙酰胺及其任何组合。

由于丝多肽的亲水部分可以结合作为湿气存在于空气中的环境水，因此水几乎总是存在，结合的环境水可以使丝多肽增塑。在一些实施例中，合适的增塑剂可以是甘油，单独存在或与水或其它增塑剂组合存在。上面讨论了其它合适的增塑剂。

另外，在通过发酵生产重组丝多肽并从中回收为重组丝多肽粉末的情况下，重组丝多肽粉末中可能存在充当增塑剂或以其它方式抑制三级结构的形成的杂质。例如，残留的脂质和糖可以充当增塑剂并且因此通过干扰三级结构的形成来影响蛋白的玻璃化转变温度。

各种成熟的方法可以用于评估重组丝多肽粉末或组合物的纯度和相对组成。尺寸排阻色谱法基于分子的相对尺寸分离分子并且可以用于分析其全长聚合和单体形式的重组丝多肽的相对量，以及重组丝多肽粉末中的高、低和中等分子量杂质的量。类似地，快速高效液相色谱法可以用于测量溶液中存在的各种化合物，如重组丝多肽的单体形式。离子交换液相色谱法可以用于评估溶液中各种微量分子的浓度，包含如脂质和糖等杂质。如色谱法等各种分子的其它色谱法和定量方法在本领域中已是公认的。

取决于实施例，重组丝多肽可以具有基于相对于重组丝多肽粉末的其它组分的单体形式的重组丝多肽的量(按重量计)计算的纯度。在各种情况下，取决于重组丝多肽的类型和用于回收、分离和加工后重组丝多肽粉末的技术，纯度的范围可以为50重量％至90重量％。

尺寸排阻色谱法和反相高效液相色谱法两者可用于测量全长重组丝多肽，这使得其成为用于通过比较加工前后组合物中的全长丝多肽的量来确定加工步骤是否已经降解重组丝多肽的有用技术。在本发明的各种实施例中，加工前后组合物中存在的全长重组丝多肽的量可能受到最小程度的降解。降解的量可以在0.001重量％至10重量％，或0.01重量％至6重量％，例如小于10重量％或8重量％或6重量％，或小于5重量％，小于3重量％或小于1重量％的范围内。

重组丝组合物

取决于实施例，重组丝组合物中重组丝多肽粉末的合适浓度(按重量计)的范围为：1重量％至25重量％、1重量％至30重量％、至70重量％、10重量％至60重量％、15重量％至50重量％、18重量％至45重量％或20重量％至41重量％。

不旨在受理论的限制，在本发明的各种实施例中，诱导重组丝组合物可以用于期望防止单体重组丝多肽聚集成其结晶聚合形式或在加工的后期阶段控制重组丝多肽转变成其结晶聚合形式的应用中。在其它实施例中，不需要此类诱导。

在一个具体实施例中，在将重组丝多肽与第二聚合物共混之前，重组丝组合物可以用于防止重组丝多肽聚集。在另一个具体实施例中，重组丝组合物可以用于产生化妆品或护肤品的碱基，其中重组丝多肽以其单体形式存在于碱基中。在该实施例中，在碱基中具有其单体形式的重组丝多肽允许单体在与皮肤接触时或通过各种其它化学反应受控聚集成其结晶聚合形式。

在各种实施例中，将加热重组丝组合物的温度将降到最低，以便最小化或完全防止重组丝多肽的降解。在具体实施例中，重组丝熔体将被加热到小于120℃、小于100℃、小于80℃、小于60℃、小于40℃或小于20℃的温度。在加工期间，熔体通常处于10℃至120℃、10℃至100℃、15℃至80℃、15℃至60℃、18℃至40℃或18℃至22℃的温度范围内。在其它实施例中，不加热重组丝组合物。在此类实施例中，形成重组丝组合物不需要存在热量。

可以使用各种技术测量重组丝多肽的降解量。如上所述，可以使用尺寸排阻色谱法测量重组丝多肽的降解量以测量全长重组丝多肽的存在量。在各种实施例中，组合物在形成成型体之后以小于6.0重量％的量降解。在另一个实施例中，组合物在成型之后以小于4.0重量％、小于3.0重量％、小于2.0重量％或小于1.0重量％的量降解，使得降解量可以在0.001重量％至10％、8重量％、6重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％或0.01重量％至6重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％的范围内。在另一个实施例中，组合物中的重组丝蛋白基本上是非降解的。在类似的实施例中，组合物中的重组丝蛋白在某个时间段内，至少1天、1个月、1年或5年基本上是非降解的。

在一些实施例中，重组丝组合物是物理上稳定的。在各种实施例中，组合物在延长的时间段内保持其材料形式，例如粉末，具有延长的保质期。在长期使用中，重组丝组合物保持基本上稳定。

在本发明的大多数实施例中，重组丝组合物是粉末。在一些实施例中，重组丝组合物被喷雾干燥。在其它实施例中，重组丝组合物被冷冻干燥或真空干燥。术语“喷雾干燥(spray-drying)”和“喷雾干燥的(spray-dried)”在本文中是为了简单起见而使用的，但是技术人员将会理解，冷冻干燥或冻干和真空干燥可以适当地代替喷雾干燥。这些组合物可以干燥储存。

18B蛋白在干燥形式下比在水性浆料中更稳定。在一些实施例中，喷雾干燥的重组丝如下获得：包括提取的重组丝的浆料组合物在干燥步骤期间保持冷却。所述浆料组合物被泵送到高型喷雾干燥器中，在所述高型喷雾干燥器中，所得粉末的水分含量被严格控制。由于蛋白粉末是吸湿性的，进行最终粉末收集和包装以最小化水分的再次进入。包装材料的设计应最小化水分和光暴露。

在一些实施例中，从细胞培养物中回收和分离重组丝多肽如下进行：i)提取和分离，ii)通过超滤去除尿素，iii)通过沉淀洗涤，iv)盐去除和蛋白浓缩，以及v)喷雾干燥。

在一些实施例中，为了冷冻干燥组合物，将其冷却直到其固化并置于减压下以使组合物中最易挥发的成分升华。固体残余物可能形成需要研磨以形成精细粉末的单个物质。典型的冷冻干燥粉末包括多孔的不规则形状的颗粒并且容易水合。由于冷冻干燥不需要强热量，因此用于产生包括挥发性成分的粉末。在一些实施例中，重组丝组合物在低于约-100℃的温度下深度冷冻干燥。

在重组丝组合物形成之后，重组丝组合物的结晶度可以增加，由此增强组合物。在一些实施例中，重组丝组合物保持不变或减少。在一些实施例中，通过X射线晶体学测量的重组丝组合物的结晶度指数为2％至90％。在一些其它实施例中，通过X射线晶体学测量的重组丝组合物的结晶度指数为至少3％、至少4％、至少5％、至少6％或至少7％。

在本发明的一些实施例中，重组丝组合物是固体或膜。在一些实施例中，重组丝组合物是粉末。在一些实施例中，固体或膜将基本上是均匀的，这意味着通过光学显微镜检查，材料具有少量或不具有任何夹杂物或沉淀物。在一些实施例中，光学显微镜可以用于测量双折射，所述双折射可以用作重组丝排列成三维晶格的代理。双折射是材料的光学性质，其折射率取决于光的偏振和传播。具体地，通过双折射测量的高度轴向顺序可以与高拉伸强度相关联。在一些实施例中，重组丝固体和膜将具有最小的双折射。在各种实施例中，固体是珠粒。在一些其它实施例中，固体充当去角质剂。重组丝固体可以呈用于皮肤的温和皮肤擦洗剂的形式。在一些实施例中，材料形式是卷、球粒、片材或薄片。

在一些实施例中，重组丝蛋白包括中空核和/或壳。在一些实施例中，重组丝蛋白的直径范围为约1μm至约30μm，约5μm至约20μm，或直径范围为约10μm至约50μm，而水中的重组丝蛋白的直径范围为约20至约80μm，约30μm至约70μm，或直径范围为约40μm至约100μm。

溶剂

在一些实施例中，丝多肽可以经受一种或多种溶剂。在此类实施例中，中空核含有如液态水或甘油等溶剂，或者呈液态水本身的形式，或者作为液态水性溶液、含有液态水的乳液或作为水性分散体。在某些实施例中，重组丝组合物包括至少1wt％、约2wt％、约3wt％、约4wt％、约5wt％、约6wt％、约7wt％、约8wt％、约9wt％、约10wt％、约15wt％或约20wt％的重组丝多肽。在一些实施例中，重组丝组合物包括约25wt％的甘油溶液。

在一些实施例中，溶剂是水。不旨在受理论的限制，将重组丝多肽置于如水等溶剂中导致已扩展或膨胀的重组丝多肽，其中蛋白质充当含有如水等溶剂的载体。这些组合物可以干燥储存并且可以在浸入水中之后部分再水合，以直接形成扩展颗粒的液体或半液体水性悬浮液。

在一些实施例中，重组丝蛋白可以使中空核的一部分扩展。在一些其它实施例中，重组丝蛋白可以扩展壳的一部分。在溶剂是水的实施例中，重组丝蛋白转化成水凝胶。在溶剂是水的其它实施例中，重组丝蛋白转化成糊剂。在各种实施例中，可以添加热量和/或压力以进一步加工重组丝蛋白组合物。

在一些实施例中，相对于重组丝多肽的总重量，溶剂通常以55重量％至90重量％的比例存在。该范围包含所有特定值和其间的子范围，包含60重量％、65重量％、70重量％、75重量％、80重量％和85重量％。在一些实施例中，重组丝蛋白不溶于各种溶剂，包含各种不同pH水平的水、甘油、醇、硅氧烷和油。

在一些实施例中，溶剂是水性类型的。在此类实施例中，溶剂是水。溶剂的pH范围可以为6至12。在一些实施例中，溶剂的pH为6。在一些其它实施例中，溶剂的pH范围为0至5、2至7、4至9、6至11、8至13或10至14。

在其它实施例中，溶剂包含各种挥发性有机溶剂的混合物，以便获得相对短的干燥时间。在一些实施例中，溶剂是醇。溶剂可以包含水、乙醇、甲苯、二氯甲烷、异丙醇、正丁醇、蓖麻油、有机聚硅氧烷油、乙二醇单乙醚、二乙二醇单丁醚、二乙二醇单乙醚、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺和四氢呋喃。

在一些实施例中，有机聚硅氧烷油可以是挥发性的、非挥发性的或者挥发性和非挥发性硅酮的混合物。如在该上下文中使用的术语“非挥发性”是指那些在环境条件下为液体并且闪点(在一个大气压下)大于或等于约100℃的硅酮。如在该上下文中使用的术语“挥发性”是指所有其它硅酮油。合适的有机聚硅氧烷可以选自具有宽范围挥发性和粘度的各种硅酮。合适的硅酮在于1991年12月3日公布的美国专利第5,069,897号中公开，所述美国专利通过引用整体并入本文。可以使用选自包括以下的组的有机聚硅氧烷：聚烷基硅氧烷、经烷基取代的二甲基硅氧烷、二甲基硅氧烷醇、聚烷基芳基硅氧烷及其混合物。可以使用聚烷基硅氧烷、二甲基硅氧烷和环甲基硅氧烷。

在一些实施例中，溶剂是植物油和氢化植物油。在一些实施例中，溶剂是游离脂肪酸。植物油和氢化植物油的实例包含红花油、蓖麻油、椰子油、棉籽油、鲱鱼油、棕榈仁油、棕榈油、花生油、大豆油、菜籽油、亚麻籽油、米糠油、松油、芝麻油、葵花籽油、来自前述来源的部分和完全氢化的油及其混合物。可以使用动物脂肪和油，例如鱼肝油、羊毛脂及其衍生物，如乙酰化羊毛脂和羊毛酸异丙酯。聚丙二醇的C₄-C₂₀烷基醚、聚丙二醇的C₁-C₂₀羧酸酯和二-C₈-C₃₀烷基醚也是有用的，其实例包含PPG-14丁基醚、PPG-15硬脂基醚、二辛基醚、十二烷基辛基醚及其混合物。

本发明的组合物可以基本上不含半固体烃，如凡士林、羊毛脂和羊毛脂衍生物、甾醇(例如乙氧基化大豆甾醇)、高分子量聚丁烯和可可脂。如本文所使用的“基本上不含”意指半固体烃的浓度小于10％、或小于5％、或小于2％或为0％。

作为化妆品调配物的重组丝蛋白

在各种实施例中，重组丝蛋白将被复合到丝化妆品或护肤品(例如，应用于皮肤或毛发的溶液)中。具体地，重组丝蛋白可以用作化妆品或护肤品的碱基，其中重组丝多肽以其单体或不太结晶形式存在于碱基中。在一些实施例中，重组丝蛋白可以用作化妆品或护肤品的碱基，其中重组丝多肽以半结晶形式存在于碱基中。在此类实施例中，重组丝多肽不以其单体形式存在于碱基中。

在大多数实施例中，化妆品调配物是物理上稳定的。在此类实施例中，重组丝蛋白和任何其它成分在其调配物中保持延长的时间段，具有延长的保质期。在长期使用中，重组丝组合物保持基本上稳定并且成分不会从调配物中沉淀出来。

通过使组合物与受试者的皮肤、指甲、毛发或粘膜接触，本发明的组合物可以用于将丝蛋白应用于皮肤、指甲、毛发或粘膜。优选地，本发明的组合物用于人类受试者。

在大多数实施例中，化妆品调配物对应用化妆品的受试者宿主是无毒的或者是非过敏性的。在本领域中还期望生产用于毛发和表皮接触的化妆品组合物，所述化妆品组合物不会永久性地污染组织并且可以通过用水性洗涤剂普通洗涤来去除。

在各种实施例中讨论的固体、膜、乳液、水凝胶和其它材料形式可以含有各种湿润剂、润肤剂、封闭剂、活性剂和化妆品佐剂，这取决于实施例和调配物的期望功效。在一些实施例中，重组丝蛋白充当载体。在一些实施例中，重组丝蛋白是将一种或多种试剂递送到如皮肤、毛发或指甲等表面的载体。

在一些实施例中，重组丝组合物中增塑剂的合适浓度(按重量计)的范围为：1重量％至60重量％、10重量％至60重量％、10重量％至50重量％、10重量％至40重量％、15重量％至40重量％、10重量％至30重量％或15重量％至30重量％。在一些实施例中，增塑剂是甘油。在一些实施例中，增塑剂是三乙醇胺、三甲二醇、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、蔗糖、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸。

在水用作增塑剂的情况下，重组丝组合物中水的合适浓度(按重量计)的范围为：5重量％至80重量％、15重量％至70重量％、20重量％至60重量％、25重量％至50重量％、19重量％至43重量％或19重量％至27重量％。在水与另一种增塑剂组合使用的情况下，所述浓度可以以5重量％至50重量％、15重量％至43重量％或19重量％至27重量％的范围存在。

在一些实施例中，合适的增塑剂可以包含多元醇(例如，甘油)、水、乳酸、抗坏血酸、磷酸、乙二醇、丙二醇、三乙醇胺、乙酸乙酯、丙烷-1,3-二醇或其任何组合。在各种实施例中，增塑剂的量可以根据重组丝蛋白的纯度和相对组成而变化。例如，较高纯度的粉末可能具有较少的杂质，如可以作为增塑剂的低分子量化合物，并且因此需要添加较高按重量计百分比的增塑剂。

在一些实施例中，重组丝组合物包括湿润剂或润肤剂。如本文所使用的术语“湿润剂”是指与水分子形成键的吸湿物质。合适的湿润剂包含但不限于甘油、丙二醇、聚乙二醇、戊二醇、银耳提取物、山梨醇、二氰胺、乳酸钠、透明质酸、芦荟提取物、α-羟基酸和吡咯烷酮羧酸盐(NaPCA)。

如本文所使用的术语“润肤剂”是指通过填充皮肤表面的裂缝为皮肤提供柔软或柔软外观的化合物。合适的润肤剂包含但不限于乳木果油、可可油、角鲨烯、角鲨烷、辛酸辛酯、芝麻油、葡萄籽油、含有油酸的天然油(例如甜杏仁油、摩洛哥坚果油、橄榄油、鳄梨油)、含有γ亚油酸的天然油(例如月见草油、琉璃苣油)、含有亚油酸的天然油(例如红花油、葵花籽油)或其任何组合。

术语“封闭剂”是指在皮肤表面形成屏障以保持水分的化合物。在一些情况下，润肤剂或湿润剂可能是封闭剂。其它合适的封闭剂可以包含但不限于蜂蜡、巴西棕榈蜡、神经酰胺、植物蜡、卵磷脂、尿囊素。不旨在受理论的限制，本文提出的重组丝组合物的成膜能力使得封闭剂形成水分保持屏障，因为重组丝多肽起到吸引水分子的作用并且还充当湿润剂。

术语“活性剂”是指在护肤调配物或防晒霜中具有已知有益作用的任何化合物。各种活性剂可以包含但不限于乙酸(即维生素C)、α羟基酸、β羟基酸、氧化锌，二氧化钛、视黄醇、烟酰胺、其它重组蛋白(作为全长序列或水解成子序列或“肽”)、铜肽、类姜黄素、乙醇酸、氢醌、曲酸、l-抗坏血酸、α硫辛酸、壬二酸、乳酸、阿魏酸、扁桃酸、二甲氨基乙醇(DMAE)、白藜芦醇、含有抗氧化剂的天然提取物(例如绿茶提取物、松树提取物)、咖啡因、α熊果苷、辅酶Q-10和水杨酸。

术语“化妆品佐剂”是指用于制造具有商业上期望的性质的化妆品的各种其它试剂，包含但不限于表面活性剂、乳化剂、防腐剂和增稠剂。

如下文所描述的，在各种实施例中，重组丝蛋白可以形成可分散的半固体或凝胶状结构。在将重组丝蛋白复合到护肤调配物中的各种实施例中，重组丝蛋白可以形成不可逆的三维结构，如凝胶或膜，其在皮肤表面上转化成可分散的液体。

在各种实施例中，重组丝蛋白可以悬浮于水中(“水性悬浮蛋白”)以形成可以掺入(即复合)到化妆品或护肤调配物中的膜、凝胶或碱基。取决于实施例，水性悬浮蛋白中重组丝蛋白与水的量可以变化，重组丝多肽粉末与重组丝蛋白中添加剂的相对比率也可以变化。在一些实施例中，蛋白组合物将包括10重量％-33重量％的重组丝多肽粉末。在一些实施例中，将使用不同于水的溶剂。在一些实施例中，将重组丝蛋白悬浮于水中以产生含有1％-40％重组丝蛋白和60％-99％水的水性悬浮蛋白。在具体实施例中，将蛋白组合物悬浮于水中以产生含有10重量％的重组丝多肽粉末、30重量％的添加剂和60重量％的水的水性悬浮蛋白。在具体实施例中，将蛋白悬浮于水中以产生含有6重量％的重组丝多肽粉末、18重量％的添加剂和76重量％的水的水性悬浮蛋白。在具体实施例中，将蛋白悬浮于水中以产生含有10重量％的重组丝多肽粉末和90重量％的水的水性悬浮蛋白。

取决于实施例，当水性悬浮蛋白重新悬浮于水中时可以任选地加热和搅拌。在一些实施方案中，加热和搅拌水性悬浮蛋白可以产生水性悬浮蛋白中重组丝多肽的相变。具体地，加热和搅拌水性悬浮蛋白质产生三个不同的相，所述相通过离心进行评估：1)与离心后的上清液不同的凝胶相；2)可以在离心后从上清液中过滤出来的胶体相；以及3)从上清液中过滤胶体相后剩余的溶液相。可以使用加热、搅拌和离心的各种组合，前提是为了防止重组丝多肽的降解，水性悬浮蛋白不能经受长时间的加热。在具体实施例中，将蛋白在90℃下温和搅拌5分钟并以16,000RCF离心30分钟。

在各种实施例中，可以将水性悬浮蛋白的各种相(即胶体相、凝胶相和溶液)或水性悬浮蛋白掺入到化妆品或护肤调配物中以提供重组丝蛋白的来源。取决于实施例，在掺入到护肤调配物中之前，水性悬浮蛋白可以在加热或不加热的情况下进行搅拌。任选地，可以通过离心和/或过滤在上述相中分离水性悬浮蛋白。取决于实施例，护肤调配物可以是乳液(例如乳膏或精华液)或主要是水性溶液(例如凝胶)。在某些实施例中，可以在不需要水性重新悬浮的情况下将重组丝蛋白掺入到任何上述化妆品、护肤或护发调配物中。在这些组合物中，匀浆器或类似设备可以用于确保重组丝蛋白均匀分布在组合物中。

在一些实施例中，水性悬浮蛋白可以经受加热和搅拌，然后浇铸到平坦表面上并干燥成膜。在一些实施例中，可以将水性悬浮蛋白浇铸到平坦表面上并且在不经受加热和/或搅拌的情况下干燥成膜。在此类实施例中，可以将水性悬浮蛋白浇铸到平坦表面上并且在不经受另外的加工的情况下干燥成膜。在一些实施例中，可以将水性悬浮蛋白掺入到乳液中，然后浇铸到平坦表面上并干燥成膜。取决于实施例，可以使用各种不同的干燥条件。合适的干燥条件包含在有和没有真空的情况下在60℃或80℃下干燥。在使用真空的实施例中，15Hg是合适的真空量。其它干燥方法在本领域中得到良好的确立。

在各种实施例中，仅包括水性悬浮蛋白的膜具有低熔融温度。在各种实施例中，仅包括水性悬浮蛋白的膜具有低于体温的熔融温度(约34-36℃)并且在与皮肤接触时熔融。不旨在受理论的限制，重组丝多肽形成足够的分子间相互作用以形成半固体结构(即膜)，然而该结构在皮肤接触时是可逆的并且在皮肤表面分散后可以重新形成。在各种实施例中，通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量，与重组丝蛋白或重组丝粉末相比，膜将具有降低的结晶度。在各种实施例中，包括水性悬浮蛋白的膜在与皮肤接触时不会熔融。在此类实施例中，膜充当屏障。在各种实施例中，膜是低密度的疏水膜。薄或屏障的厚度范围可以为约1μm至约50μm、约10μm至约30μm，或厚度范围为约20μm至约40μm。在与皮肤接触时，可以在表皮层的表面上形成屏障，实现对皮肤表面的牢固的非特异性粘附。在一些实施例中，膜的厚度取决于重组丝蛋白的浓度和应用的表面积而变化。

在一些实施例中，屏障是持久的并且防止一种或多种环境应激物，包含风、湿度、刺激性添加剂、污染、磨损、污垢和油脂。屏障可以经受相当于至少100次手动摩擦、至少200次摩擦、至少400次摩擦、至少600次摩擦或至少800次摩擦的磨损。

在一个具体实施例中，可以将水性悬浮蛋白或蛋白掺入(例如，均质化)到乳液中，然后浇铸在平坦表面上并冻干以产生多孔膜。取决于实施例，各种技术可以用于冻干，包含在-80℃下冷冻膜30分钟。其它冻干技术将是本领域技术人员熟知的。

在各种实施例中，上文所描述的膜可以用作局部护肤剂。该膜可以直接应用于皮肤并且可以再水合以形成掺入到皮肤中的可分散的粘性物质。如本文所讨论的，可以将各种润肤剂、湿润剂、活性剂和其它化妆品佐剂掺入到膜中。该膜可以直接应用于皮肤并且由于与皮肤接触或者在将膜轻轻摩擦到皮肤中之后而吸附到皮肤上。在一些实施例中，膜可以直接应用于皮肤并且在不需要另外的摩擦或接触的情况下吸附到皮肤上。在一些实施例中，重新悬浮于水性溶液中的蛋白可以应用于面部并且然后通过喷雾暴露于如丙二醇等凝结剂，以形成可凝胶的面膜。

取决于实施例，浇铸的膜可以是平坦膜(即没有表面可变性)或者可以浇铸在包含微结构的模具上。在具体的实施例中，将膜浇铸在包含微针结构的模具上，以刺穿皮肤表面并帮助活性剂的递送。

在替代实施例中，可以将水性悬浮蛋白添加到用作化妆品的乳液中。乳液可以应用于皮肤或毛发并且然后在干燥后允许在皮肤表面上形成膜。如下文所讨论的，可以将各种润肤剂、湿润剂、活性剂和其它化妆品佐剂掺入到乳液中。

在一些实施例中，重组丝组合物可以是液体或半固体，如乳膏、洗剂和凝胶。可用于本发明的组合物可以制成本领域已知的各种产品形式。这些包含但不限于粉末、洗剂、乳膏、凝胶、贴片、精华液、安瓿、粉末、棒、喷雾剂、软膏、糊剂、摩丝、软膏、液体、乳液、泡沫或气雾剂。这些产品形式可以包括若干种类型的添加剂，如下文进一步讨论的，包含但不限于溶液、气雾剂、乳液、凝胶、固体和脂质体。在本发明的组合物和方法中具有活性的化合物可以通过本领域技术人员已知的任何方式局部递送。

在一些其它实施例中，重组丝组合物可以是基础化妆品组合物，如面部清洁剂，如花露水、乳膏、精华素、清洁泡沫和清洁水、面膜和身体油，彩色化妆品组合物，如粉底、口红、睫毛膏和隔离霜，毛发产品组合物，如香波、冲洗剂、护发素和发胶、肥皂等。化妆品调配物可以用本领域已知的任何方法，使用本文所描述的重组丝组合物，任选地与至少一种载体和/或添加剂一起制备，其通常用于制备化妆品组合物的领域。

在一些实施例中，组合物包括至少一种美容剂。美容剂的实例包含润肤剂、湿润剂、着色剂、颜料、香料、保湿剂、粘度调节剂和任何其它化妆品形成剂。化妆品组合物中可以包含一种或多种美容剂。在另一个实施例中，也可以使用本领域已知的和本文所描述的另外的活性成分，包含但不限于皮肤柔软剂、皮肤渗透增强剂、着色剂、芳香剂、乳化剂和增稠剂。此外，为了改善物理性质的目的，化妆品组合物可以进一步包括香料、颜料、杀菌剂、抗氧化剂、防腐剂和保湿剂以及无机盐和合成聚合物。

组合物也可以通过洗剂局部递送。如洗剂和乳膏等水包油类型和油包水类型的单乳液护肤制剂在化妆品领域是众所周知的并且可用于本发明。如水包油包水类型等多相乳液组合物也可用于本发明。通常，此类单相或多相乳液含有水、润肤剂和乳化剂作为基本成分。

本发明的组合物也可以被调配成固体调配物(例如基于蜡的棒、肥皂条组合物、粉末、珠粒、去角质剂或含有液体或粉末的擦拭物)。

本发明的组合物可以被调配成凝胶(例如，使用合适的胶凝剂的水性凝胶)。适用于水性凝胶的胶凝剂包含但不限于天然胶、丙烯酸和丙烯酸酯聚合物和共聚物以及纤维素衍生物(例如羟甲基纤维素和羟丙基纤维素)。适用于油(如矿物油)的胶凝剂包含但不限于氢化丁烯/乙烯/苯乙烯共聚物和氢化乙烯/丙烯/苯乙烯共聚物。此类凝胶通常包括约0.1重量％至5重量％的此类胶凝剂。在一些实施例中，此类组合物包含重组丝蛋白、水(Aqua)、C14-16烯烃磺酸钠、甘油、可可甜菜碱、苯甲酸钠、氢氧化钠、葡萄糖酸钙、透明质酸钠、丙二醇、黄原胶、葡萄糖酸内酯和谷氨酸二乙酸钠的组合。在一些实施例中，组合物包括清洁洗涤剂、肥皂、精华液或调色剂。在具体实施例中，精华液是基于水的。在另一个具体实施例中，调色剂是基于醇的。

可用于本发明的组合物可以被调配成乳液。如果组合物是乳液，则组合物的约1％至约10％或约2％至约5％包括乳化剂。乳化剂可以是非离子型、阴离子型或阳离子型的。合适的乳化剂公开于例如《INCI手册(INCI Handbook)》,第1673-1686页。洗剂和乳膏可以被调配成乳液。

又另一种类型的组合物可以是软膏。软膏可以包括动物油或植物油或半固体烃的简单碱基。除了约0.1％至约2％的增稠剂之外，软膏还可以包括约2％至约10％的润肤剂。增稠剂的实例包含纤维素衍生物(甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、合成高分子量聚合物(例如，羧基乙烯基聚合物和聚乙烯醇)、植物水胶体(例如，卡拉亚胶和黄蓍胶)、粘土增稠剂(例如，胶态硅酸镁铝和膨润土)以及羧基乙烯基聚合物、羧酸聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、黄原胶及其混合物。

除了上述组分之外，可用于本发明的组合物还可以含有各种另外的油溶性材料和/或水溶性材料，所述材料通常以其现有技术水平用于皮肤、毛发和指甲的组合物中。

本发明的组合物可以直接应用于皮肤或者可以应用于其它递送工具上，如擦拭物、海绵、刷子等。组合物可以用于设计成留在皮肤上、从皮肤上擦去或从皮肤上冲洗掉的产品中。

在一些实施例中，组合物改善皮肤外观，如增加皮肤紧致度/丰满度、增加弹性、改善整体皮肤健康、增加水合作用、加速和/或改善伤口愈合、改善污染防护、减少皮肤衰老、降低皮肤脆弱性、防止和逆转胶原蛋白和/或弹性蛋白的损失、防止皮肤萎缩、促进/加速细胞周转、增加基因表达、改善皮肤质地、防止和减少细纹和皱纹、改善肤色、增加皮肤厚度、减少毛孔大小、最小化皮肤变色、恢复皮肤光泽、最小化疲劳迹象、改善皮肤屏障功能、最小化皮肤干燥、防止、减少或治疗色素沉着过多、改善皮肤的线粒体功能、改善去角质、降低毒性、使皮肤去除油光、降低氧化应激水平、减弱污染诱导的氧化应激、减弱UVA或UVB诱导的氧化应激及其任何组合。

各种实施例的组合物抵御污染物和其它刺激物。因此，许多皮肤病状，如痤疮、与酒渣鼻(成人痤疮)相关的发红以及其它炎症病状可以通过应用化妆品调配物来积极控制。

凝结剂

在一些实施例中，本文产生的基于丝的组合物暴露于凝结剂。这可以改变组合物的性质，以促进基于丝的组合物中丝的受控聚集。在一些实施例中，基于丝的组合物浸没在凝结剂中。在一些实施例中，基于丝的组合物暴露于凝结剂雾或蒸汽。在一个实施例中，水性蛋白组合物包括凝结剂或与所述凝结剂浸没或混合。在一些实施例中，如膜等基于丝的固体或半固体浸没在或暴露于包括凝结剂的蒸汽中。在一些实施例中，甲醇用作有效的凝结剂。

在一些实施例中，醇可以用作凝结剂或溶剂，如异丙醇、乙醇或甲醇。在一些实施例中，60％、70％、80％、90％或100％的醇用作凝结剂。在一些实施例中，盐可以用作凝结剂，如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠或在20至60℃的温度下有效的其它蛋白质沉淀盐。

在一些实施例中，水、酸、溶剂和盐中的一种或多种的组合可以用作凝结剂，所述组合包含但不限于以下类别的化学品：

-Lowry酸、路易斯酸、二元氢化物酸、有机酸、金属阳离子酸、有机溶剂、无机溶剂、碱金属盐和碱土金属盐。在一些实施例中，酸包括稀盐酸、稀硫酸、甲酸或乙酸。在一些实施例中，溶剂包括乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、乙酸乙酯、丙二醇或乙二醇。在一些实施例中，盐包括LiCl、KC1、BeC1₂、MgC1₂、CaC1₂、NaCl、ZnCl₂、FeCl₃、硫酸铵、硫酸钠、乙酸钠和硝酸盐、硫酸盐或磷酸盐的其它盐。在一些实施例中，凝结剂的pH为2.5至7.5。

其它添加剂

在一些实施例中，本文产生的基于丝的组合物暴露于其它添加剂。所述添加剂可以改变组合物的性质，因为其与皮肤相互作用。在一些实施例中，基于丝的组合物浸没在添加剂中。在一些实施例中，基于丝的组合物暴露于添加剂雾或蒸汽。在一个实施例中，水性蛋白组合物包括添加剂或与所述添加剂浸没或混合。在一些实施例中，如膜等基于丝的固体或半固体浸没在或暴露于包括添加剂的蒸汽中。在一些实施例中，在中空粉末形成之前，基于丝的凝胶暴露于添加剂(例如，将基于丝的凝胶和添加剂一起共喷雾干燥)。

添加剂本身可以是惰性的或者所述添加剂可以具有自身的皮肤病学益处。添加剂还应该在物理上和化学上与本文所描述的基本组分相容，并且不应该过度损害与本发明的组合物相关的稳定性、功效或其它使用益处。本发明中使用的添加剂类型取决于组合物所期望的产物形式的类型。在一些实施例中，添加剂是酸性纺织染料。

经常将颜料添加到化妆品调配物中以实现应用于皮肤的期望的颜色。此类颜料是已知的，并且实现期望的颜色所需的浓度是容易确定的。颜料可以是无机的或有机的。无机颜料包含氧化铁(红色、黑色、棕色)、锰紫、群青(绿色、蓝色、粉色、红色或紫色磺基硅酸铝)、海蓝宝石、铜粉、云母、粘土、二氧化硅和二氧化钛。由美国FDA认证的化妆品用有机染料通常具有前缀“D&C”以及颜色和数字的后缀(例如，D&C绿色#3)。

基于无水颜料重量，本发明的某些实施例含有约0％至约30％、约1％至约20％、约2％至约15％或约5％至约15％的着色剂。这些通常是铝、钡或钙盐或色淀。染料可以以约0％至约3％的浓度存在并且珠光剂等以0％至约10％的浓度存在。此类染料与重组丝蛋白组合是稳定的并且具有长的保质期。此类组合物的保质期可以是约6个月、约1年或约2年。在一些实施例中，此类组合物的保质期可以是至少5年。

对于组合物中使用的颜料、着色剂或填料粉末没有特别的限制。每种可以是身体颜料、无机白色颜料、无机有色颜料、珠光剂等。具体实例为滑石、云母、碳酸镁、碳酸钙、硅酸镁、硅酸铝镁、二氧化硅、二氧化钛、氧化锌、红色氧化铁、黄色氧化铁、黑色氧化铁、群青、聚乙烯粉末、甲基丙烯酸酯粉末、聚苯乙烯粉末、丝粉末、结晶纤维素、淀粉、钛化云母、氧化铁钛化云母、氯氧化铋等。

另外的颜料/粉末填料包含但不限于无机粉末，如树胶、白垩、漂白土、高岭土、绢云母、白云母、金云母、合成云母、红云母、黑云母、锂云母、蛭石、硅酸铝、淀粉、蒙脱石粘土、烷基和/或三烷基芳基铵蒙脱石、经化学改性的硅酸铝、经有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、气相铝淀粉辛烯基琥珀酸钡硅酸盐、硅酸钙、硅酸镁、硅酸锶、金属钨酸盐、镁、二氧化硅氧化铝、沸石、硫酸钡、煅烧硫酸钙(煅烧石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、陶瓷粉末、金属皂(硬脂酸锌、硬脂酸镁、肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙和硬脂酸铝)、胶体二氧化硅和氮化硼；如聚酰胺树脂粉末等有机粉末(尼龙粉末)、环糊精、聚甲基丙烯酸甲酯粉末、苯乙烯和丙烯酸的共聚物粉末、苯并胍树脂粉末、聚(四氟乙烯)粉末和羧乙烯基聚合物、如羟乙基纤维素和羧甲基纤维素钠等纤维素粉末、乙二醇单硬脂酸酯；如氧化镁等无机白色颜料。其它有用的粉末在于1997年11月18日公布的El-Nokaly等人的美国专利第5,688,831号中公开，所述美国专利公开通过引用整体并入本文。这些颜料和粉末可以独立地使用或组合使用。

除了丝蛋白之外，根据本发明的组合物可以进一步包括成膜物质。成膜物质的实例包含纤维素衍生物、硝化纤维素、丙烯酸聚合物或共聚物、丙烯酸、苯乙烯、丙烯酸酯-苯乙烯和乙烯基树脂、乙烯基共聚物、聚酯聚合物、芳基磺酰胺树脂和醇酸树脂。

在一些实施例中，组合物可以包含两性表面活性剂、磷脂或蜡。

其它添加剂的实例包含但不限于大麻二醇、发泡表面活性剂、脱色剂、反光剂、去缠结/湿梳理剂、氨基酸及其衍生物、抗微生物剂、过敏抑制剂、抗痤疮剂、抗衰老剂、抗皱剂、防腐剂、止痛剂、镇咳剂、止痒剂、局部麻醉剂、防脱发剂、毛发生长促进剂、毛发生长抑制剂、抗组胺药、抗感染药、炎症抑制剂、止吐剂、抗胆碱能药、血管收缩剂、血管扩张剂、伤口愈合促进剂、肽、多肽和蛋白质、除臭剂和止汗剂、药剂、皮肤润肤剂和皮肤保湿剂、皮肤紧致剂、护发素、毛发柔软剂、毛发保湿剂、维生素、鞣剂、亮肤剂、抗真菌剂、脱毛剂、剃须制剂、外用止痛剂、香水、抗刺激剂、痔疮药、杀虫剂、毒藤产品、毒橡树产品、烧伤产品、抗尿布疹剂、痱子剂、化妆调配物、维生素、草药提取物、类视黄醇、类黄酮、感觉剂、抗氧化剂、皮肤调理剂、毛发增亮剂、螯合剂、细胞周转增强剂、防晒霜、抗水肿剂、胶原蛋白增强剂及其混合物。

合适的维生素的实例非排他性地包含维生素B复合物，包含硫胺素、烟酸、生物素、泛酸、胆碱、核黄素、维生素B6、维生素B12、吡哆醇、肌醇、肉碱；维生素A、C、D、E、K及其衍生物，如维生素A棕榈酸酯和维生素原(即泛醇(维生素原B5)和泛醇三乙酸酯)及其混合物。

防晒剂的实例包含但不限于阿伏苯宗、二苯甲酮、冰片烯、丁基对氨基苯甲酸、肉桂酰丙基三甲基氯化铵、二苯乙烯基联苯二磺酸二钠、对氨基苯甲酸、甲氧基肉桂酸钾、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷、甲氧基肉桂酸辛酯、羟苯甲酮、辛丙烯、水杨酸辛酯、苯基苯并咪唑磺酸、羟丙基氨基苯甲酸乙酯、邻氨基苯甲酸薄荷酯、氨基苯甲酸、西诺沙酯、二乙醇胺甲氧基肉桂酸酯、氨基苯甲酸甘油酯、二氧化钛、氧化锌、羟苯甲酮、Padimate O、红色凡士林及其混合物。

与重组丝组合物组合的添加剂的量可以取决于例如添加剂渗透皮肤、毛发或指甲的能力、所选择的特定添加剂、期望的特定益处、使用者对添加剂的敏感性、健康状况、年龄以及使用者的皮肤、毛发和/或指甲状况等而变化。总之，添加剂以“安全且有效量”使用，所述量足够高以提供期望的皮肤、毛发或指甲益处，或改变待治疗的某种状况，但又足够低以避免严重的副作用，在合理的医学判断范围内具有合理的风险效益比。

在不存在非特定公开于本文中的任何组分、成分或步骤的情况下，可以适当地实践本文所说明性地公开的本发明。下文列出若干个实例以进一步说明本发明的性质和实施本发明的方式。然而，本发明不应被认为限于其细节。

实例

实例1：重组18B多肽粉末形态

具有FLAG标签的重组18B多肽(SEQ ID NO:1)通过各种批量的大规模发酵产生、回收并干燥成粉末。样品制备的细节如下。

具体地，经基因修饰的酵母细胞产生重组18B多肽，并且在需氧发酵罐中培养，如国际公开第WO/2015/042164号,“用于合成改善的丝纤维的方法和组合物(Methods andCompositions for Synthesizing Improved Silk Fibers)”中所公开的，所述国际公开通过引用整体并入本文。在该实例中，所用发酵罐的体积范围为3,000L至26,000L。发酵进行72小时并且过程含有温度变化，其中分批阶段在30℃下保持最初5-8小时，然后在触发葡萄糖进料时降低到25℃。发酵过程从15g/L的分批葡萄糖开始，其在最初5-8小时内被消耗。在葡萄糖耗尽之后，触发指数进料直到氧气摄取速率(OUR)达到115毫摩尔O₂/升/小时为止。然后相应地调节进料速率以将OUR维持在115-120毫摩尔O₂/升/小时。通过将呼吸商维持在约1.02来限制乙醇积累。另外，用搅拌级联将溶解氧也控制在5％的饱和度。在发酵72小时之后，产生含有18B多肽的全细胞肉汤(WCB)以及包含死酵母及其代谢产物的废培养基。将8M尿素与WCB组合以将18B多肽溶解到水相中。然后通过离心从细胞中分离出水相。将含有溶解的丝蛋白的分离物浓缩并通过超滤洗涤以去除尿素和一些杂质。使用10wt％硫酸钠溶液通过两个沉淀步骤进一步纯化蛋白。在每种情况下，沉淀靶蛋白，然后在重相中通过离心回收。将盐洗掉并通过超滤或微滤浓缩蛋白，得到水中的蛋白固体浆料。然后将浆料喷雾干燥成最终18B粉末形式。

如下进行喷雾干燥：通过双流体或气动喷嘴将冷却的滞留物进料到高型喷雾干燥器中。雾化的蛋白浆料用热干燥空气并流干燥并且大部分蛋白粉末在旋风分离器中收集。将旋风分离器的出口温度控制在99℃±2℃并且相对湿度<12％。这些条件确保旋风分离器中收集的粉末维持在等于或低于3wt％的水分。在旋风分离器中未被捕获的粉末在袋滤器中收集。

控制干燥器的操作参数以优化产率并产生大于20μm但小于50μm的中值粒度。这些参数包含但不限于雾化喷嘴处的空气与液体进料速率比率(ALR)、热空气入口温度和流速以及滞留物的固体浓度。与目标参数的偏差可能导致干燥不足、沉积在干燥器壁上的大量粉末流失或袋滤器的大量粉末流失。

在旋风分离之后，粉末通过60目筛以去除较大的颗粒，然后收集并装袋作为最终产物。在粉末冷却时，注意尽量减少暴露于潮湿的环境空气中。

与旋风分离器相比，从袋滤器收集的粉末通常质量不足，因为水分含量通常大于3％并且18B蛋白质含量较低。因此，袋滤器粉末与旋风分离器产物分开收集。

如图1A所示，在干燥和水合状态下的18B粉末作为中空颗粒存在。这种形态由扫描电子显微镜(SEM)和光学/偏振显微镜证实。SEM使用聚焦电子束通过二次电子来评估材料的形态。以光栅图案扫描电子束以收集1mm至10nm或10倍至100,000倍放大率的显微照片。SEM方法使用低真空(1托至10托)，避免了对生物样品进行脱水或溅射涂覆的需要。

偏振光学显微镜也用于检查粉末形态。使用具有4倍物镜的徕卡(Leica)DM750P偏振光学显微镜获得光学和偏振光学图像。显微镜与基于互补PC的图像分析徕卡应用套件LAS V4.9连接。对于偏振显微镜，通过将模块的下摇杆翻转到右侧(“A”位置/分析仪向内)，同时确保将分析仪/伯特兰透镜模块(Bertrand Lens Module)的上摇杆翻转到左侧(“O”位置/伯特兰透镜向外)来接合分析仪/伯特兰透镜模块。这种设置允许在“交叉偏振模式”下进行分析，所述交叉偏振模式是光学对准状态，其中允许通过偏振器和分析仪的光的振荡方向为90°。

图1A示出了在干燥状态下的完整和破裂粉末颗粒的SEM图像。当粉末颗粒裂开时，揭示了可视中空核和薄膜外壳。完整粉末颗粒的直径为大约100μm。

图1B示出了在水合状态下的18B粉末的中空壳形态的光学和偏振显微镜图像。仅在粉末颗粒的外边缘观察到马耳他十字(Maltese cross)。固体颗粒将在粉末颗粒的整个厚度上显示出马耳他十字。

为了评估18B粉末的降解，将18B粉末置于各种溶剂中。18B粉末不溶于水，这通过目视检查和尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)和反相(RP-HPLC)来确定。在该实施例中，18B粉末以1-10wt％分散在溶剂中。将溶液在22℃下温育24小时。将粉末在4℃下以16,000RCF离心15分钟而沉淀出来。从沉淀物中倒出上清液。用HPLC-SEC和反相测量上清液和沉淀物的18B粉末含量。对于HPLC-SEC，将样品溶解于5M硫氰酸胍中并注射到Yarra SEC-3000SEC-HPLC柱上以基于分子量分离成分。折射率用作检测模态。定量18B聚集体、18B单体、低分子量(1-8kDa)杂质、中等分子量杂质(8-50kDa)和高分子量杂质(110-150kDa)。相关组合物以质量％和面积％报告。BSA用作通用蛋白标准品，并假设所有蛋白中的>90％证明dn/dc值(折射率的应答因子)彼此相差约7％以内。聚(环氧乙烷)用作保留时间标准品，并且BSA校准器用作检查标准品，以确保方法的一致性能。因此，18B粉末不溶于水。

反相高效液相色谱法(“RP-HPLC”)用于测量粉末中18B多肽单体的量(按重量计)。使用5M硫氰酸胍(GdSCN)试剂溶解样品并注射到Agilent Poroshell 300SB C3 2.1×75mm5μm柱上以基于疏水性分离成分。检测模态是肽键在215nm(360nm参考)的UV吸光度。18B-FLAG单体的样品浓度通过与18B-FLAG粉末标准品进行比较来确定，对于所述粉末标准品，18B-FLAG单体浓度已经使用尺寸排阻色谱法(SEC-HPLC)预先确定。观察到高水平的非降解的18B单体。

实例2：重组18B多肽粉末在不同溶剂中的扩增

根据实例1中描述的方法产生的18B粉末取决于用于分散粉末的溶剂产生不同的扩展或膨胀。18B粉末可以分散在各种溶剂中，包含水性溶剂、油或硅酮。

取决于用于分散粉末的溶剂，粉末颗粒表现出不同的膨胀。图2A示出了与不含溶剂的18B粉末相比，重新悬浮于包含pH为6的水和甘油的各种不同溶剂中的18B粉末的光学显微镜图像。通过将18B粉末以1wt％水平悬浮于不同的溶剂中拍摄光学显微镜图像。为了制备溶液，将粉末聚集在秤上并且然后倒入混合容器中，如50mL锥形管。然后，使用移液管将溶剂分散在粉末上。然后用手、通过涡流或通过行星式混合器剧烈摇动混合容器。将18B粉末悬浮液的液滴装载到载玻片上并用玻璃盖玻片覆盖。使用具有10倍物镜的徕卡DM750P光学显微镜获得光学显微镜图像。显微镜与基于互补PC的图像分析徕卡应用套件LAS V4.9连接。

图2B示出了在干燥状态下的18B粉末和在暴露于水性溶液之后的18B粉末的照片。18B粉末明显扩展，在水中的重量为约其自身重量的6至10倍。水中的粉末直径百分比的定量也有所增加。使用ImageJ软件和颗粒分析仪功能进行粉末直径的定量。干粉末的直径范围为5μm至25μm，而水中的水合粉末的直径范围为20μm至80μm。

实例3：染色重组18B多肽粉末的产生

为了评估根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的染色，根据制造商的指示制备酸性纺织染料，与18B粉末混合并温育超过5分钟。为了冲洗掉多余的染料，将样品在4℃下以16,000RCF离心15分钟。倒出上清液并在试管底部沉淀染色粉末。将去离子(DI)水添加到沉淀物中并重新悬浮沉淀物。重复该过程若干次，直到上清液澄清为止。

图3A示出了使用水、酸性纺织染料和18B粉末的混合物产生染色的18B粉末的示意图。此类混合物产生染色的18B粉末，其容易且快速地吸收鲜艳的颜色。

图3B示出了可以在最终粉末状态下染色的18B粉末。18B粉末也在喷雾干燥或最终粉末状态之前被染色。直接应用于皮肤的彩色粉末浆料示出了颜色的活力。

图3C示出了添加到乳膏乳液中的不同浓度的染色的18B粉末(0wt％、1wt％和2wt％)。显然，染色的18B粉末可以向乳膏乳液添加颜色并且活力由18B粉末浓度确定。

图3D示出了在4℃下储存6个月之后的染色的18B粉末的色牢度的稳定性。在4℃下储存6个月之后没有观察到浸出。

实例4：由重组18B多肽粉末形成膜

为了评估根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的成膜，通过在温和摇动下将18B粉末以1wt％分散在DI水中来制备丝溶液。将膜浇铸在聚二甲基硅氧烷底物上并在环境条件(22℃和40％湿度)下放置过夜。使膜破裂并且然后通过SEM成像。根据实例3中描述的方法制备酸性纺织染料。

图4中的示意图表明，作为水合溶液的18B粉末，如1wt％18B粉末溶液在皮肤上变干以在表皮层的表面上形成薄的均匀屏障，所述均匀屏障对皮肤是高度实质性的(即对皮肤表面形成牢固的非特异性粘附)，并且这样做可以向皮肤提供防护(“18B粉末屏障”)。18B粉末作为屏障来增强和加强最外层真皮层的重要屏障功能。将这种机械模型与没有此类屏障的皮肤进行比较，在这种情况下，皮肤受到包含污染、磨损、污垢和油脂的环境应激物的损害。

图5A示出了该实例中描述的方法的示意图以及当以2mg/cm²应用于皮肤时干燥的1wt％18B粉末溶液聚结成约1μm厚的薄膜的SEM图像。随着水合18B粉末干燥，颗粒明显聚结成薄膜，如图5A中的箭头所指示的。

图5B示出了膜厚度随溶液浓度和表面积的变化。以50mg/cm²应用于皮肤的干燥1wt％18B粉末溶液产生厚度为约10μm的膜。以250mg/cm²应用于皮肤的干燥1wt％18B粉末溶液产生厚度为约20μm的膜。以500mg/cm²应用于皮肤的干燥1wt％18B粉末溶液产生厚度为约30μm的膜。

图5C示出了用纺织染料染色的2wt％18B粉末溶液以及以2mg/cm²应用染色的2wt％18B粉末并洗涤以去除未结合的颜色之前和之后的皮肤图像。具体地，当将2wt％18B粉末溶液以2mg/cm²应用于皮肤上，观察到均匀的涂层。

实例5：作为持久屏障的重组18B多肽粉末

为了评估根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的长期益处，通过荧光标记蛋白来可视化18B粉末屏障，如图6A中所示。

图6B示出了研究重复磨损对18B粉末屏障的作用的实验设计。将荧光标记的18B粉末屏障应用于皮肤并且干燥不超过10分钟。将200g的物质放在白色棉擦拭物上，并在手背上拖动指定次数(或“摩擦”)。

图6C示出了与裸露皮肤(“对照”)相比，18B粉末屏障经受无摩擦、100次摩擦和600次摩擦的重复磨损的图像。即使在暴露于反复磨损之后，18B粉末屏障对皮肤也非常重要。从图像中可以看出，在100次摩擦之后并且甚至在600次摩擦之后，18B粉末屏障可以被可视化，几乎基本上完好无损。

图6D示出了在一至五次湿擦拭物擦拭之后皮肤上的18B粉末屏障的图像。如图所示，18B粉末屏障在最小程度的洗涤之后很容易用水去除。

图6E示出了在最少且温和的多次擦拭之后的湿擦拭物的图像，包含第一、第二、第四和第五次擦拭。如图所示，湿擦拭物仅通过几次擦拭就完全去除基于丝的屏障。这些发现表明，基于丝的膜能够经受住模拟日常皮肤磨损的重复磨损损伤。不需要剧烈摩擦或刺激性溶剂来去除膜。这意味着膜不会随时间堆积或产生令人不快的美感。膜也不会破坏皮肤的天然屏障功能(例如，堵塞毛孔)。这些益处突出了18B蛋白屏障对磨损是牢固的，但也容易被擦拭掉，这指示所述蛋白屏障不会随时间堆积，这是一些聚合物的常见问题。

为了产生荧光丝粉末，将18B粉末与硼酸盐缓冲液组合(将25mg 18B粉末添加到5mL缓冲液中)。将NHS-荧光素(3mg，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))溶解于300uL DMSO中。将216uL DSMO染料溶液与丝溶液组合。将该混合物温育1小时并且然后相对于水透析24小时。收集透析的溶液并在4℃下以16,000RCF离心20分钟。倒出上清液并替换更多的水。通过剧烈摇动移出沉淀物以重新悬浮所述沉淀物。离心和上清液交换步骤总共重复四次以上。将所得丝沉淀物冻干并研磨成粉末。然后将18B粉末重新悬浮以在DI水中制备2wt％丝溶液并以2mg/cm²应用于手背上的区域并干燥5-10分钟。通过用蓝光(467-498nm)激发18B蛋白质屏障并用513-556nm过滤器观察反射光对手背上的区域进行成像。捕获的图像被转换成黑白图像以评估18B蛋白屏障的强度。为了评价18B蛋白屏障对皮肤的可洗性，将湿擦拭物(水擦拭物)在手背上的区域上擦拭多次。每次擦拭使用新的湿擦拭物。在每次擦拭之后，对手背和每个擦拭物进行成像。

实例6：重组18B多肽粉末用于改善污染洗掉的用途

为了评估根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的防护益处，进行了污染等级研究。确定18B粉末示出了用于改善污染洗掉的益处。

在研究中，共有5名年龄在35至56岁之间、具有Fitzpatrick皮肤类型I、II、III或IV的女性受试者被纳入研究。所有五名受试者成功完成了测试程序。在基线或应用后和冲洗前时，训练有素的技术人员在每个受试者的右前臂或左前臂上标记1.5in²的测试位点，并将大约0.3克的测试品或2wt％18B粉末水溶液应用于一个指定的测试位点并使其风干10分钟。测试品用DI水和1％防腐剂(Biotinistat)制备。然后将环境污染物或碳喷涂到含有测试品的测试位点上并且也喷涂到剩余的未经处理的对照测试位点上。技术人员应用足够量的碳或污垢覆盖每个测试位点，使得每个位点具有至少标记为水平3的可视污垢评分，如下所示。两个测试位点的评分必须相等。然后记录技术人员和受试者对可视污垢的评价。在应用后冲洗前评价之后，技术人员然后用温水冲洗每个测试位点45秒并重复评价。评价评分的降低指示可视污垢的改善或减少。增加指示恶化。

该试验中使用的等级水平如下：0＝无污垢；1＝存在轻微污垢；2＝存在中度污垢(中度可视)；3＝存在明显的污垢(非常可视)；4＝存在严重污垢(极其可视)。

图7A和7B示出了研究18B粉末溶液对碳颗粒的作用的污染等级研究的结果。在这项第三方、双盲、媒剂控制的临床研究中，18B粉末以2wt％18B粉末悬浮于DI水中，与基线相比，18B粉末溶液对技术人员观察到的可视碳颗粒表现出90％的改善，平均等级水平为0.4。这些发现与未经处理的位点和媒剂对照位点形成对比，与基线相比，所述未经处理的位点和媒剂对照位点对技术人员观察到的可视碳颗粒分别表现出40％和45％的改善。未经处理的位点的平均等级水平为2.4并且媒剂对照位点的平均等级水平为2.2。基于所述结果，18B粉末溶液在皮肤上形成透气屏障并且充当对抗环境应激物的重要防护。

图7C示出了与对照相比，使用水解丝和18B粉末溶液在聚氨酯材料或人造皮肤上进行污染洗涤的图像。具体地，将1wt％18B粉末溶液以2mg/cm²应用于人造皮肤并且然后干燥。之后，在表面上刷上2.5mg/cm²的碳颗粒。最后，冲洗人造皮肤并拍干。与水解丝不同，18B粉末表现出抗污染吸附的能力。涂覆在皮肤替代物上的18B粉末显示出更长的成膜时间、最小的污染吸附和改善的污染洗掉性质。

图7D示出了与对照相比，使用1wt％和2.5wt％18B粉末溶液对毛发进行污染洗涤的图像以及在洗涤之后所得的冲洗水。18B粉末提高了冲洗时从皮肤和毛发上去除污染物的能力。将1wt％和2.5wt％的18B粉末的两种溶液应用于毛发。然后，添加10mg碳。在冲洗之后，将冲洗水以16,000RCF离心15分钟并观察。从检查毛发颜色和冲洗水中的碳颗粒沉淀物大小可以明显看出，具有18B粉末的毛发示出随着18B粉末含量的增加而增加的污染去除。

实例7：调配成清洁剂的重组18B粉末

为了研究根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的清洁作用，使用黑色眼影(兰蔻(Lancome))、18B粉末和标准清洁剂进行了研究。将黑色眼影(兰蔻)均匀应用于前臂区域。将包含18B粉、炭黑和米糠的3/8茶匙去角质剂应用于眼影。用无名指顺时针和逆时针摩擦所述区域20次。标记为“去角质剂”的样品也在没有任何去角质剂的情况下进行摩擦，而“未经处理的”样品不进行摩擦。然后用自来水将区域中的每个区域冲洗45秒。图8A示出了包含在黑色眼影上摩擦皮肤的18B粉末、炭黑和米糠的各种干物质以及用水冲洗之后的图像。当在干燥状态下在皮肤上摩擦时，与如炭黑和米糠等标准成分相比，18B粉末有效地去除化妆品(例如黑色眼影)。

为了研究18B作为清洁剂的柔软性，将去角质剂放置在2g/mm²平坦表面与白色特氟隆胶带(Teflon tape)之间，使得去角质剂完全覆盖特氟隆胶带的表面(特氟隆胶带的表面直径为1cm并且去角质剂的用量为约1/4茶匙)，所述特氟隆胶带覆盖黑色背景。由于特氟隆非常柔软，当其暴露于如去角质剂等硬东西时会拉伸并变薄，由此暴露黑色背景。特氟隆胶带的表面用光学显微镜以反射模式成像。图8B示出了与对照和包含米糠、竹茎和荷荷巴珠粒等其它标准成分相比，用作皮肤替代物上的去角质剂的18B粉末的显微图像。18B粉末是独一无二的，因为其有效地清洁，同时也非常柔软。18B粉末的磨损性比标准成分小得多，这通过透过白色特氟隆示出的黑色少得多来确定。

为了研究18B粉末溶液作为清洁溶液的用途，通过将18B粉末添加到DI水中制备纯溶液。用碳颗粒(直径5μm)涂覆2cm²面积的人造革(聚氨酯材料)。冲走多余的颗粒。将200μl溶液应用于所述面积并在所有四个正交方向上总共摩擦14次。将样品在流动的DI水中冲洗45秒并且然后拍干。图8C示出了与对照和水解丝溶液相比，用作皮肤替代物上的清洁剂的10wt％18B粉末溶液。具体地，测试的条件包含阴性(无添加的污染)和阳性对照(无清洁或摩擦而添加的污染)、水、摩擦但无清洁剂、10wt％水解丝溶液和10wt％18B粉末溶液。值得注意的是，与水解丝相比，18B粉更有效地去除皮肤替代物的污染。

为了研究基础凝胶清洁剂调配物中18B粉末的清洁作用，将黑色眼线笔(丝芙兰(Sephora))应用于前臂并干燥10分钟。将前臂在自来水下保持45秒。将100μl测试品应用于眼线笔上方1cm宽区域。将测试品上下摩擦总共14次。最后，将样品在流动的DI水中冲洗45秒。图8D示出了与不含18B粉末的水相比，用作清洁剂的各种浓度的18B粉末溶液。具体地，18B粉甚至在添加到基础凝胶清洁剂调配物中之后也能改善清洁。另外，清洁作用不一定与丝浓度成比例。该实例中使用的18B粉末溶液的浓度为0wt％、1wt％、2wt％和5wt％。图8E示出了该实例中使用的18B粉末凝胶清洁剂的成分列表。

实例8：重组18B多肽粉末的抗衰老作用

为了探索根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的抗衰老作用，进行了临床试验。该研究涉及使用专家分级、仪器评价和主观小组成员问卷的第三方、双盲、媒剂控制的临床试验(n＝33)，如下文进一步所描述的。将2wt％18B粉末调配物与仅媒剂对照进行比较。除了2wt％18B丝成分之外，用于该研究的调配物还含有以下成分：水、辛酸/癸酸三酸甘油酯、橄榄油甘油聚醚-8酯、甘油、椰子烷、甲基葡萄糖聚醚-20、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、生育酚、甘草酸二钾、椰油醇-辛酸酯/癸酸酯、戊二醇、氯苯甘醚、辛甘醇、EDTA二钠、苯氧乙醇。

图9A示出了2wt％18B粉末溶液对皮肤紧致度和弹性的改善平均百分比的图。与基线测量结果相比，对于2wt％样品，*＝p<0.05。在12周时与基线相比，使用Cutometer测量紧致度R0和弹性R5的仪器测量结果显示出统计学上的改善。R0是表示皮肤对力的被动行为的参数。R5是表示净弹性的参数。对于2wt％18B粉末调配物，与基线相比，皮肤紧致度显示出10％平均改善。对于2wt％18B粉末调配物，与基线相比，皮肤弹性显示出25％平均改善。与基线相比，媒剂对照没有显示出统计学上的改善。与基线测量结果相比，对于2wt％18B粉末溶液，*＝p<0.05。

图9B示出了在8周的时间段内，2wt％18B粉末溶液提升面部中部、弹性、紧致度和整体皮肤健康外观方面的统计改善的图。与空媒剂对照相比，专家分级显示出在提升面部中部、紧致度、弹性和整体皮肤/健康外观方面的统计学上的改善。与基线测量结果相比，对于2wt％样品，*＝p<0.05。

图9C示出了在受试者使用2wt％18B粉末溶液4周之后的主观小组成员问卷的皮肤结果。与空媒剂对照相比，在4周时，主观小组成员问卷显示出在紧致度、下垂、细纹和皱纹、紧致皮肤和皮肤整体健康方面的统计学上的改善。在紧致度、下垂、细纹和皱纹以及紧致肌肤方面，存在约20％平均改善。在皮肤整体健康方面，存在约10％平均改善。

该研究是对两种面部皮肤处理的12周、双盲、媒剂控制的一元评价，简单的皮肤乳膏调配物(“空媒剂”)以及具有2wt％丝含量的简单皮肤乳膏调配物(“2％丝调配物”)。每个样本的小组规模为33人。对于空媒剂，平均年龄为59+/-6岁，并且Fitzpatrick皮肤类型为II、III、IV和V。对于2％丝调配物，平均年龄为58+/-6岁，并且Fitzpatrick皮肤类型为I、II、III、IV和V。仪器评估，包含Cutometer(MPA 580；德国科隆的Courage+Khazaka公司(Courage+Khazaka,Cologne Germany))，第0周(“基线”)、第4周、第8周和第12周。Cutometer MPA 580(德国的Courage+Khazaka公司)通过向皮肤表面应用吸力、将皮肤拉入探针的孔中并使用光学测量系统确定渗透深度来测量皮肤的粘弹性。使用R5(Ur/Ue)参数报告皮肤弹性，随着皮肤变得更有弹性，该值将增加。使用R0(Uf)参数报告皮肤紧致度，随着皮肤变得更紧致，该值将减少。在基线以及第4周、第8周和第12周进行临床分级。根据需要，所有受试者在同一房间内使用顶部照明和照明放大镜进行分级。房间内自然阳光被遮挡，以确保每个时间点处的照明条件相同。视觉模拟量表(VAS)通常用于临床研究，以测量无法直接测量的各种症状、主观特性或态度的强度或频率。VAS是可靠的量表并且比简单的顺序量表对微小的变化更敏感。当应答VAS项目时，专家分级者通过指示沿两个端点或锚应答之间的直线(10cm)的位置来指定其对陈述的同意程度。使用简单的VAS来评估功效参数，其中10cm水平线的末端被定义为从左(最好)到右(最差)取向的极限。使用主观问卷来评估受试者对治疗的看法以及在治疗4周、8周和12周之后对皮肤的作用。询问了受试者对五分量表的陈述的意见。

实例9：重组18B多肽粉的伤口愈合作用

为了评估根据实例1中描述的方法产生的18B粉末的伤口愈合作用，采用了伤口划痕模型。伤口划痕模型提供了测试材料的细胞迁移诱导潜力的体外定性估计。在第一模型中，使用角质细胞，其是在皮肤表皮中发现的主要类型。使正常新生人类表皮角质细胞(HEK目录号102-05n，加利福尼亚州圣地亚哥的细胞应用公司(Cell Applications,San Diego,CA))在角质细胞生长培养基(KGM；最佳生长条件)中或在96孔板中的(10％ KGM/90％DMEM；次优生长条件)中生长至汇合。之后，使用10μl移液管尖端刮擦单层，并且然后冲洗并与测试材料(在无菌蒸馏水中稀释至100μg/mL的18B粉末)一起温育48小时，一式两份。在实验结束时，将细胞固定在三氯乙酸中并用磺基罗丹明B染色。用EVOS 5000成像系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))拍摄显微照片。用Celleste 5.0软件(赛默飞世尔)分析划痕伤口闭合。

图10示出了在产生划痕48小时之后的角质细胞伤口划痕模型以及在用和不用100μg/mL的18B粉末温育细胞之后由计算机产生的伤口闭合的定量的光学显微镜图像。在有和没有18B粉末(100μg/mL)的情况下温育细胞并分析伤口闭合的程度。伤口闭合的定量显示在经18B粉末处理的样品中伤口闭合增加，这由通过计算机产生的定量在伤口中增加的噪声累积来指示。

在第二模型中，使用成纤维细胞。使正常新生人类真皮成纤维细胞(aHDF p.4目录号#106-05a，加利福尼亚州圣地亚哥的细胞应用公司)在DMEM(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))+10％FBS(圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis))和12孔板中的Pen/Strep/Fungizone溶液(瑞士的龙沙集团(Lonza,Switzerland))中生长至早期亚汇合。将实验培养基的日期改为仅含1wt％胎牛血清的一天，使用20μl移液尖端刮擦细胞培养物，冲洗并用在无菌蒸馏水中稀释至25μg/mL和50μg/mL的18B粉末温育24小时，一式两份。暴露于水和10wt％胎牛血清的细胞分别是阴性和阳性对照。在实验结束时，将细胞固定在三氯乙酸中并用磺基罗丹明B染色。用EVOS 5000成像系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA))拍摄显微照片。用Celleste5.0软件(赛默飞世尔)分析划痕伤口闭合。

图11A示出了与阳性对照相比，在划痕形成24小时之后的成纤维细胞伤口划痕模型以及在用和不用各种浓度的18B粉末(25μg/mL和50μg/mL)温育细胞之后的伤口闭合的定量的光学显微镜图像。在有和没有18B粉末(25μg/mL和50μg/mL)的情况下温育细胞并分析伤口闭合的程度。

图11B示出了与阳性对照相比，在用和不用各种浓度的18B粉末(25μg/mL和50μg/mL)温育细胞之后通过迁移成纤维细胞的受伤面积的覆盖率百分比的定量，与仅水24％相比，所述阳性对照产生53％的划痕覆盖率。用Celleste软件通过迁移成纤维细胞对受伤面积的覆盖率百分比进行定量。50μg/mL 18B粉末样品在经18B粉末处理的样品中显示出约12％的改善的划痕覆盖率。在经25μg/mL18B粉末处理的样品中测量到5％的轻微增加。该模型表明伤口愈合潜力的剂量依赖性。

实例10：重组18B粉在不同溶剂中的另外的膨胀特性

如实例2所描述的，取决于用于分散粉末的溶剂，粉末颗粒表现出不同的膨胀。通过将粉末以0.062％wt/wt水平悬浮于不同的溶剂中拍摄光学显微镜图像。将粉末悬浮液的液滴装载到载玻片上并用玻璃盖玻片覆盖。粒度数据和光学显微镜图像由BeVision M1颗粒分析仪拍摄，所述颗粒分析仪配备有金相显微镜、可编程电动载物台、自动聚焦功能、高分辨率CCD相机和Bettersize粒度测定软件。使用10倍物镜以0.5cm的半径设置圆形扫描区域。

去离子水(pH为6的DI)和PBS(pH为7.2的磷酸盐缓冲盐水)导致粉末扩展或膨胀，类似地其中50％的粒径小于50μm并且最大直径分别为118μm和116μm。相比之下，戊二醇、硅酮和甘油导致颗粒膨胀较小，其中100％的粒径小于75μm。橄榄油表现出不同的行为，其中50％的粉末直径小于30μm；然而，最大粒径与DI和PBS中的颗粒类似，为116μm。将这些发现与干燥的原样粉末进行比较，其中100％的粒径小于60μm。

图12A示出了在美容和个人护理调配物中使用的各种不同溶剂中重新悬浮之后用光学显微镜观察的代表性粉末形态。

图12B示出了通过图像分析确定的各种溶剂中的粉末直径的定量。数据以表格和图表的形式表示为每个直径仓中颗粒的累积百分比，如图12C所示。

实例11：重组18B粉末的溶解性

将不同浓度的重组18B蛋白粉末以1-10％wt分散在DI水中。将溶液在22℃下温育24小时。将重组18B粉末在4℃下以16,000RCF离心15分钟而沉淀出来。从沉淀物中倒出上清液。将上清液溶解于5M硫氰酸胍中并注射到Yarra SEC-3000SEC-HPLC柱上以基于分子量分离成分。折射率用作检测模态。定量重组18B(18B)聚集体、18B单体、低分子量(1-8kDa)杂质、中等分子量杂质(8-50kDa)和高分子量杂质(110-150kDa)。相关组合物以质量百分比报告。BSA用作通用蛋白标准品，并假设所有蛋白中的大于90％证明dn/dc值，折射率的应答因子，彼此相差约7％以内。聚(环氧乙烷)用作保留时间标准品，并且BSA校准器用作检查标准品，以确保方法的一致性能。

图13A示出了通过尺寸排阻色谱法(SEC)确定的各种重组18B蛋白粉末溶液的溶解度的定量。在50.6kDa与78.1kDa之间的区中发现全长18B蛋白分子。在大约113.2kDa处发现18B蛋白聚集体并且在2.6kDa与50.8kDa之间发现18B蛋白的较短长度版本。所有这些蛋白种类用于计算提取物中的18B蛋白溶解度。在水性提取物中测得的18B蛋白的量随溶液浓度而变化，指示没有达到最大溶解度。注意，DI水中的10％wt/wt 18B蛋白粉末大约是悬浮能力的上限(即高于DI水中的10％wt/wt 18B蛋白，粉末没有完全润湿)。图13B示出了溶解度结果的表。通过HPLC SEC确定，重组18B蛋白粉末在DI水中表现出有限的溶解度。将少于11％的蛋白分配到水性溶剂中。

实例12：重组18B粉末的加速伤口愈合作用

人皮肤从腹部整形手术获得，所述腹部整形手术从41岁高加索女性获得，基于Fitzpatrick分类，所述女性具有表型II。制备总共21个平均直径为11mm(±1mm)的人皮肤外植体和21个10×15mm大小的矩形皮肤外植体。将外植体保持在37℃下的湿度为5％的CO₂气氛的培养基中。在第0天，使用2mm直径的穿孔器在批次的每个外植体的中心进行机械伤口。在伤口之后的第0天、第1天、第4天和第6天，空媒剂(PBS+0.9％ Botanistat防腐剂)和重组18B蛋白样品(在PBS中的5％重组18B蛋白+0.9％ Botanistat防腐剂)或空媒剂样品(PBS+0.9％ Botanistat防腐剂)基于2mg/cm²的表面积局部应用并使用小刮刀铺开。除了更新培养基之外，未经处理的对照外植体不接受任何处理。在第1天、第4天和第6天更新一半培养基(1ml)。在第0天，从每个处理条件下收集三个外植体并切成两个部分。将一半样品在缓冲福尔马林溶液中固定并且将另一半样品在-80℃下冷冻。在第4天和第8天，从每个批次中收集三个外植体并以相同的方式处理。在缓冲福尔马林中固定24小时之后，使用徕卡PEARL自动脱水仪将样品脱水并浸渍在石蜡中。然后使用徕卡EG 1160包埋站包埋样品。使用徕卡RM 2125迈诺特型切片机制备5μm厚的切片，并且然后将切片固定在

组织学载玻片上。

使用徕卡CM 3050低温恒温器将冷冻样品切成7μm厚的切片。然后将切片固定在

plus硅烷化载玻片上。使用徕卡DMLB或奥林巴斯BX43显微镜进行显微镜观察。照片用带有CellSens存储软件的数字DP72奥林巴斯照相机数字化。在石蜡切片染色之后，根据马森氏三色(Masson's trichrome)，Goldner变体进行表皮和真皮结构中的细胞活力和伤口闭合测量。

结果，重组18B蛋白通过增加伤口位点中的细胞迁移，在离体人皮肤模型中支持加速伤口闭合。使人皮肤外植体受伤并用重组18B蛋白样品处理8天。

图14A示出了离体组织的组织学横截面。示出了在第4天和第8天两者时间点处，重组18B蛋白在表皮长度方面优于空媒剂和未经处理的对照。图14B示出了与空媒剂相比，重组18B蛋白在第4天诱导表皮舌长增加68％(与未经处理的和空媒剂对照相比，**＝p<0.01)。在第8天，与空媒剂相比，重组18B蛋白在第8天诱导表皮舌长增加42％(与未经处理的和空媒剂对照相比，*＝p<0.05)。

实例13：重组18B粉末降低氧化应激的基础水平和由蓝光辐射引起的氧化应激

二十七(27)个平均直径为12mm(±1mm)的人皮肤外植体在来自52岁高加索女性的腹部整形手术上制备，基于Fitzpatrick分类，所述女性具有表型II。将外植体保持在37℃下的湿度为5％的CO₂气氛的培养基中存活。所述研究是在供体书面知情同意之后对从手术残留物中获得的活检进行的。在蓝光辐射之前三十分钟的第0天、第1天和第4天，重组18B蛋白样品(在PBS中的2％重组18B蛋白+0.9％ Botanistat防腐剂)或空媒剂样品(PBS+0.9％Botanistat防腐剂)基于2mg/cm²的表面积局部应用并使用小刮刀铺开。除了更新培养基之外，未经处理的对照外植体不接受任何处理。培养基在第1天和第4天半更新(1mL每孔)。在第4天，将外植体用于蓝光辐射，放入1ml HBSS(汉克氏平衡盐溶液)中并使用

装置以63.75J/cm²的剂量用蓝光辐射3小时。在辐射过程期间，将未经处理的、未经辐射的对照外植体在黑暗中保持在1mL HBSS中。在辐射结束时，将所有批次放回培养基中。当样品准备好被牺牲时，将其收集并切成两个部分。将一半样品在缓冲福尔马林中固定并且将另一半样品在-80℃下冷冻。在缓冲福尔马林中固定24小时之后，使用徕卡PEARL自动脱水仪将样品脱水并浸渍在石蜡中。使用徕卡EG 1160包埋站包埋样品。使用徕卡RM 2125迈诺特型切片机制备5μm厚的切片，并且将切片固定在/>

组织学载玻片上。使用徕卡DMLB、奥林巴斯BX43或奥林巴斯BX63显微镜进行显微镜观察。照片用带有celSens存储软件的数字DP72或DP74奥林巴斯照相机数字化。在马森氏三色染色，Goldner变体之后，在甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)皮肤切片上观察表皮和真皮结构的细胞活力。通过显微镜观察评估细胞活力。用在PBS-BSA 0.3％中以1:400稀释的单克隆抗8-OHdG抗体(Gentaur，参考50-MOG，克隆N45-1)在FFPE皮肤切片上进行8-OHdG免疫染色，并使用Vectastain试剂盒载体扩增系统亲和素/生物素在室温下温育过夜，并通过VIP揭示，过氧化物酶的底物(载体实验室(Vector laboratories)，参考SK-4600)一旦被氧化就会产生紫色染色。人工进行免疫染色，通过显微镜观察进行评估并通过图像分析进行半定量。

半定量图像分析如下进行：首先，检测染色并选择与染色相对应的像素——将其分配给掩模1。然后，通过绘图选择ROI(即表皮层)并将其分配给另一个掩模2。接下来，将掩模的重叠(即免疫染色和ROI重叠的地方)分配给掩模3。最后，计算通过染色(即掩模3)覆盖的表皮(即掩模2)的百分比并将其称为“染色表面％”。图15A示出了重组18B蛋白降低氧化应激的基础水平，如通过核氧化(8-OHdG)的标志物的降低所测量的。此外，重组18B蛋白还减少蓝光诱导的核氧化(8-OHdG)。由于该碱基的高电离电势，核和线粒体DNA氧化最容易发生在鸟嘌呤残基处。8-氧代-2'-脱氧鸟苷(8-氧代-dG)或羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是人类自由基诱导的氧化病变的主要形式之一。羟基自由基与鸟嘌呤基C-8位置处的双键的相互作用导致8-OHdG的产生。这种稳定的经氧化修饰的DNA产物已被广泛用于反映DNA的氧化损伤的程度。

图15B示出了2％重组18B蛋白的简单溶液(悬浮在PBS和0.9％ Botanistat防腐剂中)导致8-OHdG染色与未经处理的样品相比降低37％并且与空媒剂相比降低42％(p<0.01)。蓝光辐射诱导未经处理的对照的8-OHdG染色增加18％(p<0.01)，而用2％重组18B蛋白溶液处理的样品的8-OHdG染色与蓝光辐射的未经处理的对照相比减少43％并且与蓝光辐射的空媒剂相比减少42％(p<0.01)。

实例14：重组18B粉末减弱污染诱导的氧化应激

三十五(35)个平均直径为12mm(±1mm)的人皮肤外植体在来自59岁白种女性的腹部整形手术上制备，基于Fitzpatrick分类，所述女性具有表型II-III。将外植体保持在37℃下的湿度为5％的CO2气氛的培养基中存活。所述研究是在供体书面知情同意之后对从手术残留物中获得的活检进行的。

在暴露于污染物之前的第0天、第3天和第4天，重组18B蛋白样品(在PBS中的2％重组18B蛋白+0.9％ Botanistat防腐剂)或空媒剂样品(PBS+0.9％ Botanistat防腐剂)基于2mg/cm²的表面积局部应用并使用小刮刀铺开。除了更新培养基之外，未经处理的对照外植体不接受任何处理。在暴露于污染物之后，培养基在第1天半更新(1mL每孔)并在第4天完全更新(2mL每孔)。在第4天，将计划进行污染暴露的外植体放置在每孔含有900μl HBSS的

系统上，并通过喷洒含有0.9％ NaCl的多环芳烃+重金属混合物(每ml污染溶液含有150μl NaCl 0.9％)1.5小时，使用总共3mL整个污染溶液进行暴露。将未经处理的对照外植体保持在1mL HBSS中。在污染物暴露结束时，将所有外植体放回2mL新鲜培养基中。当样品准备好被牺牲时，将其收集并切成三个部分。将一部分在缓冲福尔马林中固定，第二部分在-80℃下冷冻，并且最后部分放入RNA/>

中。在缓冲福尔马林中固定24小时之后，使用徕卡PEARL自动脱水仪将样品脱水并浸渍在石蜡中。使用徕卡EG 1160包埋站包埋样品。使用徕卡RM 2125迈诺特型切片机制备5μm厚的切片，并且将切片固定在/>

组织学载玻片上。使用徕卡CM 3050低温恒温器将冷冻样品切成7μm厚的切片。然后将切片固定在

plus硅烷化载玻片上。使用徕卡DMLB、奥林巴斯BX43或奥林巴斯BX63显微镜进行显微镜观察。照片用带有celSens存储软件的数字DP72或DP74奥林巴斯照相机数字化。在马森氏三色染色，Goldner变体之后，在甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)皮肤切片上观察表皮和真皮结构的细胞活力。通过显微镜观察评估细胞活力。使用Vectastain试剂盒载体扩增系统亲和素/生物素，用在PBS-BSA 0.3％-Tween 20(0.05％)中以1:400稀释的单克隆抗磷酸(S40)Nrf2抗体(艾博抗公司(Abcam)，参考ab76026，克隆EP1809Y)在室温下对FFPE皮肤切片进行Nrf2免疫染色一小时，并通过VIP揭示过氧化物酶的紫色底物(载体实验室，参考SK-4600)。

通过显微镜观察评估免疫染色。使用Vectastain试剂盒载体扩增系统亲和素/生物素，用在PBS-BSA0.3％-Tween 20(0.05％)中以1:200稀释的抗IL-1α抗体(诺伟思生物制品公司(Novus Biologicals)，NBP2-45400，克隆OTI2F8)在室温下对FFPE皮肤切片进行IL-1α免疫染色一小时，并通过VIP揭示过氧化物酶的紫色底物(载体实验室，参考SK-4600)。

通过显微镜观察评估免疫染色。人工进行免疫染色，通过显微镜观察进行评估并通过图像分析进行半定量。通过图像分析的半定量如下进行：首先，检测染色并选择与染色相对应的像素——将其分配给掩模1。然后，通过绘图选择ROI(即表皮层)并将其分配给另一个掩模2。接下来，将掩模的重叠(即免疫染色和ROI重叠的地方)分配给掩模3。最后，计算通过染色(即掩模3)覆盖的表皮(即掩模2)的百分比并将其称为“染色表面％”。

结果，重组18B蛋白减少污染诱导的细胞抗氧化系统和炎症的表达。在氧化应激下，触发细胞抗氧化系统。即，核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)被磷酸化激活并从细胞质转移到细胞核。一旦进入细胞核，Nrf2就在抗氧化反应元件(ARE)或人抗氧化反应元件(hARE)的位置与DNA结合，其是总抗氧化系统的主要调节因子。此外，在氧化应激下，触发炎症级联。在表皮中，白细胞介素1(IL-1)能够调节角质细胞增殖、免疫和抗微生物应答、炎症和脂质合成。通常，IL-1负责炎症的产生，以及发热和败血症的促进。在该研究中，研究了IL-1α。

图16A示出了未经处理的离体组织、空媒剂和2％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于污染的组织学横截面。图16B示出了与未经处理的(减少49％，p<0.01)和空媒剂(低40％，**p<0.01)样品相比，当暴露于污染时，悬浮于PBS和0.9％ Botanistat防腐剂中的2％重组18B蛋白溶液导致Nrf2表达(染色表面％)显著减少。注意，与未经处理的未暴露样品(p<0.01)相比，暴露于污染的未经处理的样品表现出68％的显著增加。此外，注意，当暴露于污染时，与未经处理的(低15％，p<0.01)样品相比，空媒剂减少Nrf2表达，但程度远低于2％重组18B蛋白样品。

图16C示出了未经处理的离体组织、空媒剂和2％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于污染的组织学横截面。图16D示出了与空媒剂相比，当暴露于污染时，与未经处理的(低19％，p<0.01)和空媒剂(低26％，**p<0.01)样品相比，2％重组18B样品诱导IL-1α表达的显著减少。注意，与未经处理的未暴露样品(p<0.01)相比，暴露于污染的未经处理的样品表现出47％的显著增加。

实例15：重组18B粉末减弱UVA/UVB诱导的氧化应激

三十(30)个平均直径为11mm(±1mm)的人皮肤外植体来自52岁高加索女性的腹部整形手术上制备，基于Fitzpatrick分类，所述女性具有表型II。将外植体保持在37℃下的湿度为5％的CO₂气氛的BEM培养基(BIO-EC的外植体培养基)中存活。在UV辐射之前的第0天、第1天和第4天，重组18B蛋白样品(在PBS中的2％重组18B蛋白+0.9％ Botanistat防腐剂)或空媒剂样品(PBS+0.9％ Botanistat防腐剂)基于2mg/cm²的表面积局部应用并使用小刮刀铺开。除了更新培养基之外，未经处理的对照外植体不接受任何处理。培养基在第1天半更新(1mL每孔)并在第4天完全更新(2mL每孔)。在第4天，使用UV模拟器VibertLourmat RMX 3W辐射“UVA”批次，UVA的剂量为18J/cm²，与4MED(最小红斑剂量)相对应。使用UV模拟器Vibert Lourmat RMX 3W辐射“UVB”批次，UVB的剂量为0.3J/cm2，与2MED(最小红斑剂量)相对应。将未受辐射的批次保持在暗处的HBSS中。在辐射结束时，将所有外植体放回2mL培养基中。当样品准备好被牺牲时，将其收集并切成两个部分。将一部分在缓冲福尔马林中固定，第二部分在-80℃下冷冻。在缓冲福尔马林中固定24小时之后，使用徕卡PEARL自动脱水仪将样品脱水并浸渍在石蜡中。使用徕卡EG 1160包埋站包埋样品。使用徕卡RM 2125迈诺特型切片机制备5μm厚的切片，并且将切片固定在

组织学载玻片上。使用徕卡CM 3050低温恒温器将冷冻样品切成7μm厚的切片。然后将切片固定在

plus硅烷化载玻片上。使用徕卡DMLB、奥林巴斯BX43或奥林巴斯BX63显微镜进行显微镜观察。照片用带有celSens存储软件的数字DP72或DP74奥林巴斯照相机数字化。在马森氏三色染色，Goldner变体之后，在甲醛固定的石蜡包埋(FFPE)皮肤切片上观察表皮和真皮结构的细胞活力。使用Vectastain试剂盒载体扩增系统亲和素/生物素，用在PBS-BSA0.3％-Tween 20(0.05％)中以1:400稀释的单克隆抗磷酸(S40)Nrf2抗体(艾博抗公司，参考ab76026，克隆EP1809Y)在室温下对FFPE皮肤切片进行Nrf2免疫染色一小时，并通过VIP揭示过氧化物酶的紫色底物(载体实验室，参考SK-4600)。使用自动载玻片处理系统(Autostainer，达科公司(Dako))进行免疫染色并通过显微镜观察进行评估。使用Vectastain试剂盒载体扩增系统亲和素/生物素，用在0.05％的PBS-BSA0.3％-Tween 20中以1:1600稀释的抗胸腺嘧啶二聚体抗体(Kamiya，参考MC-062，克隆KTM53)在室温下对FFPE皮肤切片进行胸腺嘧啶二聚体免疫染色并温育1小时，并通过VIP揭示，过氧化物酶的底物(载体实验室，参考SK-4600)一旦被氧化就会产生紫色信号。人工进行免疫染色，通过显微镜观察进行评估并通过图像分析进行半定量。

通过图像分析的半定量如下进行：首先，检测染色并选择与染色相对应的像素——将其分配给掩模1。然后，通过绘图选择ROI(即表皮层)并将其分配给另一个掩模2。接下来，将掩模的重叠(即免疫染色和ROI重叠的地方)分配给掩模3。最后，计算通过染色(即掩模3)覆盖的表皮(即掩模2)的百分比并将其称为“染色表面％”。为了定量晒伤细胞的数量，对具有嗜酸性细胞质和凋亡细胞核的细胞数量进行组织学计数。

结果，重组18B蛋白减弱与UVA/UVB暴露于表皮相关的负面效应，即细胞活力、胸腺嘧啶二聚体表达和Nrf2表达。紫外线被DNA中的胸腺嘧啶和胞嘧啶碱基的双键吸收。这种添加的能量打开了键并允许其与相邻的碱基发生反应。如果邻居是另一个胸腺嘧啶或胞嘧啶碱基，其可以在两个碱基之间形成共价键。

图17A示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVB的组织学横截面。图17B示出了与未经处理的和空媒剂样品相比，当暴露于UVB时，5％重组18B蛋白(悬浮于PBS和0.9％ Botanistat防腐剂中)导致相当有利的细胞活力。与未经处理的(低40％，*＝p<0.05)和空媒剂对照(低39％，*＝p<0.05)相比，重组18B蛋白样品减少晒伤细胞的数量；重组18B蛋白对由UVB暴露诱导的改变有轻微的保护作用。

图17C示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVB的组织学横截面。图17D示出了与未经处理的和空媒剂对照相比，5％重组18B蛋白(悬浮于PBS和0.9％ Botanistat防腐剂中)导致胸腺嘧啶二聚体的表达减弱。5％重组18B蛋白诱导胸腺嘧啶二聚体表达与未经处理的对照相比显著降低49％并且与空媒剂相比显著降低32％(**＝p<0.01)。与没有胸腺嘧啶二聚体的表达的未经处理的未辐射样品相比，用UVB辐射的未经处理的样品表现出20.4％的表皮表面对胸腺嘧啶二聚体免疫染色呈阳性。

图17E示出了未经处理的离体组织、空媒剂和5％重组18B蛋白样品暴露于和未暴露于UVA的组织学横截面。图17F示出了在暴露于UVA之后，5％重组18B蛋白(悬浮于PBS和0.9％ Botanistat防腐剂中)导致Nrf2染色的表达减弱。与未暴露的样品相比，UVA辐射诱导表皮中激活的Nrf2的表达显著增加(多40％，p<0.01)。与空媒剂(26％，*＝p<0.1)和未经处理的对照(53％，p<0.01)相比，5％重组18B蛋白在UVA暴露后表现出Nrf2表达降低。此外，当暴露于UVA时，与未经处理的(少36％，p<0.01)样品相比，空媒剂减少Nrf2染色，但程度小于2％重组18B蛋白样品。

实例16：重组18B粉末的去除油光作用

在9名受试者的研究中，与2％18B蛋白调配物相比，三分之二的受试者的空媒剂调配物的光泽度比基线有更大的提高。

在研究前就诊中，可能符合条件的志愿者到达时面部清洁(未化妆)并对油性额头进行目视筛查，如果所述志愿者符合条件，则完成同意过程。受试者由18至65岁(包含)的女性组成，基于Fitzpatrick分类，所述女性具有表型I-II并且通过

测量，前额上具有中度至重度皮脂。从符合入选/排除标准的健康女性中招募候选者。纳入标准如下：a)18-65岁的女性；b)Fitzpatrick皮肤类型I-II；c)能够阅读、理解并签署知情同意书；d)通过/>

测量，前额上具有中度至重度皮脂；e)愿意到达其PSV/DOT就诊时面部清洁(自其上次清洗后未应用化妆品或局部产品)；f)同意在就诊期间不戴帽子、假发或其它头部遮盖物，并佩戴或提供头带以便不让其毛发遮住前额；g)愿意并能够遵守所有研究要求和限制。

排除标准如下：a)通过访谈确定怀孕、哺乳或计划怀孕；b)对护肤品、化妆品、保湿剂、防晒霜、香料或IP中的任何成分有任何已知的敏感性或过敏；在测试位点有任何会干扰研究的纹身、标志物、疤痕、抓痕、痣或其它瑕疵；d)面部有油性皮肤以外的皮肤病状(例如银屑病、湿疹等)；e)在研究就诊之前30天内有确诊或疑似COVID-19感染史；f)在研究就诊之前14天内与COVID-19感染者有过接触；g)个人或个人家庭成员在研究就诊之前14天内进行过国际旅行；h)在研究就诊之前2周内出现以下任何自报的COVID-19症状；i)目前正在参与另一项研究或计划在该研究期间参与另一项研究；j)是Dermico实验室、主要研究者或研究主办方的员工、承包商或直系亲属；j)主要研究者或其正式指定的代表认为可能影响皮肤应答或测试结果解释的其它条件或因素。

光泽度的基线(BL)测量从前额上的三(3)个位点收集。位点中的两(2)个(每只眼睛上方一个)以随机方式进行处理，而鼻梁上方的中心位点保持不处理，用作对照。测试了两种产物，空媒剂乳膏调配物和2％18B蛋白调配物。媒剂对照含有以下成分：水(>50％)、辛酸/癸酸甘油三酯(5-15％)、橄榄油甘油聚醚-8酯(1-5％)、甘油(1-5％)、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物(1-5％)、苯氧乙醇(0.1-1％)、辛甘醇(0.1-1％)、氯苯甘醚(0.1-1％)、生育酚(0.1-1％)、EDTA二钠(0.01-0.1％)。

处理治疗程序如下：使用微量移液管将大约32mg的测试品应用于指定的4cm×4cm测试位点。使用干净的指套将产物涂抹在测试位点并按摩直到完全吸收为止。受试者在受控环境中等待大约30分钟并重复光泽度的测量。

表面的光泽通过测量发送到该表面的光的直接反射来表示。在GL 200探针头中，平行白光以0°角发送到将其以60°角反射到皮肤表面的反射镜。一部分光以相同的角度直接反射并且一部分光被表面吸收，以不同的角度散射和反射。直接反射的光从另一面镜子反射到光传感器。漫射散射光也由定向在皮肤上方并与皮肤成0°角的不同传感器测量。这种漫射散射光允许漫射散射校正(DSC)，所述漫射散射校正试图限制或消除由于不同个体皮肤的结构、亮度和颜色而导致的可变性。

图18示出了与空媒剂相比，重组18B粉末对皮肤具有去除油光作用。

Claims (127)

1.一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括：

将重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒包括外壳和中空核，由此形成所述基于丝的组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括所述外壳中的开口。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒呈干粉末的形式。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂包括水性溶剂、醇、油基溶剂或硅酮。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶剂选自由以下组成的组：水、甘油、去离子水、橄榄油、戊二醇和硅酮。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体。

7.根据权利要求1所述的方法，其中当与所述溶剂混合时，所述重组蜘蛛丝颗粒膨胀。

8.根据权利要求1所述的方法，其中当所述重组丝颗粒干燥时，所述外壳的直径为5μm至25μm。

9.根据权利要求8所述的方法，其中当与所述溶剂混合时，所述外壳的直径膨胀到至多120μm。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述外壳厚度是所述重组丝颗粒直径的20％以下、15％以下或10％以下。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包括多个重组丝颗粒。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组丝颗粒以所述溶剂中1％至10％wt/wt的浓度存在于所述组合物中。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括重组蜘蛛丝。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQIDNO.:2。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括至少1重量％的多肽。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒是水不溶性的。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组丝颗粒是珠粒。

19.根据权利要求1所述的方法，其中所述粉末被喷雾干燥。

20.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括喷雾干燥包括重组丝多肽的组合物以形成包括所述重组丝颗粒的干粉末。

21.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将染料添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。

22.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将表面活性剂或湿润剂添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。

23.根据权利要求1所述的方法，其中将所述重组丝颗粒和溶剂混合使所述中空核扩展。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于丝的组合物是化妆品或护肤调配物。

25.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于丝的组合物改善皮肤的紧致、弹性、整体皮肤健康、伤口愈合或外观。

26.根据权利要求1所述的方法，其中将所述基于丝的组合物应用于所述皮肤减少氧化应激。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述氧化应激选自由以下组成的组：基础水平的氧化应激、由蓝光辐射引起的氧化应激、污染诱导的氧化应激、UVA诱导的氧化应激和UVB氧化应激。

28.根据权利要求1所述的方法，其中将所述基于丝的组合物应用于皮肤使所述皮肤的表面去除油光。

29.一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括：

将包括中空核的重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体，并且其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元，由此形成所述基于丝的组合物。

30.一种制备基于丝的固体或水凝胶的方法，所述方法包括：

将包括中空核的重组丝颗粒和溶剂混合，其中所述重组丝颗粒充当所述溶剂的载体，由此形成基于丝的组合物；

将所述基于丝的组合物应用于表面；并且

干燥所述基于丝的组合物以形成所述基于丝的固体或水凝胶。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述表面包括皮肤、毛发或指甲。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述干燥的基于丝的组合物在所述表面上形成屏障。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述屏障是基本上均匀的。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述基于丝的固体或水凝胶是珠粒。

35.根据权利要求30所述的方法，其中所述基于丝的固体或水凝胶是膜。

36.根据权利要求30所述的方法，其中所述基于丝的固体或水凝胶是化妆品或护肤调配物。

37.一种制备基于丝的调配物的方法，所述方法包括：

提供包括丝蛋白粉末和溶剂的基于丝的调配物，其中重组丝粉末包括中空核并且是所述溶剂的载体。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述重组丝粉末是所述溶剂的载体。

39.根据权利要求37所述的方法，其进一步包括将染料添加到所述基于丝的组合物或所述重组丝颗粒中。

40.根据权利要求37所述的方法，其进一步包括干燥所述基于丝的调配物以形成基于丝的固体或水凝胶。

41.根据权利要求37所述的方法，其进一步包括将所述基于丝的调配物混合到乳液中以形成基于丝的乳液。

42.根据权利要求41所述的方法，其进一步包括干燥所述基于丝的乳液以形成基于丝的固体或水凝胶。

43.根据权利要求40或42所述的方法，其进一步包括将添加剂和所述基于丝的固体或水凝胶混合以形成富集的基于丝的调配物。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其进一步包括凝结所述基于丝的调配物以在所述基于丝的调配物中形成聚集的丝。

45.根据权利要求37所述的方法，其中所述基于丝的调配物包括凝胶相。

46.根据权利要求37所述的方法，其中所述丝蛋白粉末是重组蜘蛛丝。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述重组丝包括全长丝蛋白。

48.根据权利要求37所述的方法，其中所述基于丝的调配物是护肤或化妆品调配物。

49.根据权利要求37所述的方法，其中所述溶剂包括水性溶剂、醇、油基溶剂或硅酮。

50.根据权利要求49所述的方法，其中所述醇是甘油。

51.根据权利要求49所述的方法，其中所述油基溶剂包括游离脂肪酸。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述游离脂肪酸包括橄榄油、葡萄籽油或甘油三酯。

53.根据权利要求37所述的方法，其中所述基于丝的调配物在与皮肤或水接触或轻轻摩擦时分散。

54.一种组合物，其包括重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括外壳和在所述外壳内的中空核。

55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒适于形成溶剂的载体。

56.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒呈粉末的形式。

57.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括重组蜘蛛丝。

58.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括所述外壳中的开口。

59.根据权利要求54所述的组合物，其中所述组合物进一步包括溶剂。

60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述溶剂包括水性溶剂、醇、油基溶剂或硅酮。

61.根据权利要求79所述的组合物，其中所述溶剂选自由以下组成的组：水、甘油、去离子水、橄榄油、戊二醇和硅酮。

62.根据权利要求59所述的组合物，其中与干燥时相比，当与所述溶剂混合时，所述重组蜘蛛丝颗粒膨胀。

63.根据权利要求59所述的组合物，其中所述组合物包括多个重组丝颗粒。

64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述重组丝颗粒以所述溶剂中1％至10％wt/wt的浓度存在于所述组合物中。

65.根据权利要求54所述的组合物，其中当所述重组丝颗粒干燥时，所述外壳的直径为5μm至25μm。

66.根据权利要求65所述的组合物，其中当与所述溶剂混合时，所述外壳的直径膨胀到至多120μm。

67.根据权利要求54所述的组合物，其中所述外壳厚度是所述重组丝颗粒直径的20％以下、15％以下或10％以下。

68.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQID NO.:2。

69.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQID NO.:2的至少两个串联重复单元。

70.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒是水不溶性的。

71.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括壳。

72.根据权利要求54所述的组合物，其中所述粉末被喷雾干燥。

73.根据权利要求54所述的组合物，其中所述组合物使所述皮肤去角质。

74.根据权利要求54所述的组合物，其中所述重组丝颗粒被染色。

75.一种组合物，其包括：

重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括外壳和中空核；以及

溶剂。

76.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒是所述溶剂的载体。

77.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括所述外壳中的开口。

78.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒呈粉末的形式。

79.根据权利要求75所述的组合物，其中所述溶剂包括水性溶剂、醇、油基溶剂或硅酮。

80.根据权利要求79所述的组合物，其中所述溶剂选自由以下组成的组：水、甘油、去离子水、橄榄油、戊二醇和硅酮。

81.根据权利要求79所述的组合物，其中当与所述溶剂混合时，所述重组蜘蛛丝颗粒膨胀。

82.根据权利要求79所述的组合物，其中当所述重组丝颗粒干燥时，所述外壳的直径为5μm至25μm。

83.根据权利要求82所述的组合物，其中当与所述溶剂混合时，所述外壳的直径膨胀到至多120μm。

84.根据权利要求79所述的组合物，其中所述外壳厚度是所述重组丝颗粒直径的20％以下、15％以下或10％以下。

85.根据权利要求79所述的组合物，其中所述组合物包括多个重组丝颗粒。

86.根据权利要求85所述的组合物，其中所述重组丝颗粒以所述溶剂中1％至10％wt/wt的浓度存在于所述组合物中。

87.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQID NO.:2。

88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元。

89.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒是水不溶性的。

90.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒包括壳。

91.根据权利要求75所述的组合物，其中所述重组丝颗粒是珠粒。

92.根据权利要求75所述的组合物，其中所述粉末被喷雾干燥。

93.根据权利要求75所述的组合物，其中所述组合物包括表面活性剂或湿润剂。

94.根据权利要求75所述的组合物，其中所述中空核通过所述溶剂扩展。

95.根据权利要求75所述的组合物，其中所述组合物是化妆品或护肤调配物。

96.根据权利要求75所述的组合物，其中所述组合物清洁所述皮肤。

97.根据权利要求75所述的组合物，其中所述组合物进一步包括染料。

98.一种丝化妆品或护肤品，其包括丝蛋白颗粒溶剂，其中所述丝蛋白颗粒包括中空核并携带所述溶剂。

99.根据权利要求98所述的组合物，其中所述丝蛋白颗粒是水不溶性的。

100.根据权利要求98所述的组合物，其中所述丝化妆品或护肤品是固体、水凝胶或膜。

101.一种重组丝化妆品或护肤品，其包括半固体，其中所述半固体包括分散的非聚集重组丝蛋白和溶剂。

102.根据权利要求101所述的化妆品或护肤品，其中所述半固体在与皮肤接触时去除残余物。

103.根据权利要求101所述的化妆品或护肤品，其中所述半固体是水凝胶。

104.一种改善皮肤外观的方法，所述方法包括将根据权利要求54至103中任一项所述的组合物应用于所述皮肤。

105.根据权利要求104所述的方法，其中所述组合物包括约1wt％的重组丝蛋白。

106.根据权利要求104所述的方法，其中所述重组丝蛋白包括多肽，所述多肽包括SEQID NO.:2。

107.根据权利要求104所述的方法，其中改善的皮肤外观提供至少一种选自包括以下的组的结果：增加皮肤紧致度/丰满度、增加弹性、改善整体皮肤健康、增加水合作用、改善伤口愈合、降低氧化应激水平、减弱污染诱导的氧化应激、减弱UVA或UVB诱导的氧化应激及其任何组合。

108.一种清洁表面的方法，所述方法包括：

将根据权利要求54至103中任一项所述的组合物应用于表面以形成膜或珠粒；并且

从所述表面去除所述膜或珠粒。

109.一种制备基于丝的组合物的方法，所述方法包括：

干燥包括重组丝的组合物以形成包括重组丝颗粒的干燥粉末。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括外壳和中空核。

111.根据权利要求109或110所述的方法，其中所述重组丝颗粒适于充当载体。

112.一种组合物，其包括干燥粉末，所述干燥粉末包括重组丝蛋白。

113.根据权利要求112所述的组合物，其中所述干燥粉末包括重组丝颗粒，所述重组丝颗粒包括中空核和外壳。

114.根据权利要求112或113所述的组合物，其中所述重组丝颗粒适于充当载体。

115.一种制备包括重组丝颗粒的丝粉末的方法，所述方法包括：

获得纯化的丝蛋白溶液；并且

通过用热干燥空气喷雾所述溶液直到所述丝蛋白溶液的水分等于或低于3重量％来形成丝粉末，其中所述丝粉末包括重组丝颗粒。

116.根据权利要求115所述的方法，其进一步包括过滤所述丝粉末以从所述丝粉末中去除较大颗粒。

117.根据权利要求115或116所述的方法，其中所述重组丝颗粒的中值粒径为20μm至50μm。

118.根据权利要求115所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括外壳和中空核。

119.根据权利要求118所述的方法，其中所述外壳厚度是所述重组丝颗粒直径的20％以下、15％以下或10％以下。

120.根据权利要求118所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括所述外壳中的开口。

121.根据权利要求115所述的方法，其中当与溶剂混合时，所述重组丝颗粒膨胀。

122.根据权利要求121所述的方法，其中所述溶剂选自由以下组成的组：水、甘油、去离子水、橄榄油、戊二醇和硅酮。

123.根据权利要求115所述的方法，其中所述重组丝颗粒包括重组蜘蛛丝。

124.根据权利要求115所述的方法，其中重组丝颗粒包括多肽，所述多肽包括SEQIDNO.:2。

125.根据权利要求124所述的方法，其中所述多肽包括SEQ ID NO.:2的至少两个串联重复单元。

126.根据权利要求115所述的方法，其中所述重组丝颗粒是水不溶性的。

127.根据权利要求115所述的方法，其中所述重组丝颗粒是珠粒。

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