TW202404999A - 重組角蛋白及其生產 - Google Patents

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傑佛瑞 Ｒ 麥林
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克里斯托 Ｌ 奧斯汀
巴爾斯洛斯 喬斯 Ｍ 梅洛
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Abstract

本發明提供重組角蛋白及其生產方法及用途。角蛋白多肽係與溶解度增加胺基酸序列一起生產，使得能夠由重組系統可溶性表現及容易純化。重組角蛋白可用於例如個人護理產品，諸如皮膚護理產品、化妝品、指甲護理產品、頭皮產品或頭髮護理產品中。

Description

重組角蛋白及其生產
角蛋白為一種由脊椎動物中之上皮細胞產生的中間絲。角蛋白向人類之組織，諸如皮膚、毛髮及指甲提供機械強度，且另外在某些動物之爪及鱗片中提供機械強度。人類基因體含有約54個不同角蛋白基因，其中有許多僅在毛囊的各個隔室中表現。人類上皮細胞中存在約28種類型的角蛋白，且有約17種類型之角蛋白特定位於毛髮中。
角蛋白對於個別上皮細胞及整個組織之機械穩定性至關重要。在個別細胞內，角蛋白可被捆綁成跨細胞質的絲束，形成保護細胞之支架網狀結構。其亦附著至上皮細胞-細胞連接(細胞間橋體)以增加整個組織之穩定性。在一些情況下，其亦參與非機械功能(諸如細胞內信號傳導路徑及其他調節功能)。角蛋白亦可參與諸如傷口癒合、細胞凋亡及保護免受壓力之不同功能。在脊椎動物中，角蛋白形成毛髮、皮膚外層、角、指甲、羊毛、羽毛、爪及蹄。
經分離之角蛋白亦在商業上，例如在個人護理行業中有用。頭髮之美麗及健康視外表皮之健康而定，該外表皮可用角蛋白處理。因此，角蛋白亦適用作頭髮產品的添加劑，以產生較濃密、較有光澤的頭髮。頭髮之角蛋白添加物可修復受損頭髮且可拉直捲髮。角蛋白可在沙龍的角蛋白處理時使用，其中角蛋白與熱處理組合，得到較濃密，亦較直的個別頭髮，該程序之效果持續若干個月。
角蛋白可用作特定疾病，諸如癌症之標記。針對某些角蛋白的抗體在病理學實驗室中在組織病理學分析期間用於診斷癌症。因此，需要經分離之角蛋白來引發抗體的產生。
傳統上，商業上使用之角蛋白係自諸如羊毛及雞毛之動物副產品分離出。角蛋白亦已自諸如山羊角的角材料分離。自動物來源製備角蛋白為一個耗時且昂貴的過程，通常需要研磨步驟及與添加界面活性劑組合之酶萃取步驟。最終的角蛋白產品亦將可能包括其他蛋白質及不合需要之污染物。此外，以此方式生產之角蛋白具有與人類角蛋白不同的胺基酸序列。
在過去，已生產過重組角蛋白。Basit等人(「Health improvement of human hair and their reshaping using recombinant keratin K31」; Biotechnology reports, 2018)在大腸桿菌中生產過重組角蛋白。然而，該蛋白質存在於細菌細胞中之不可溶包涵體中。在細菌包涵體中生產所關注蛋白質需要額外的耗時步驟作為任何所需蛋白質純化步驟之一部分，該等步驟有使細胞壁破裂、分離包涵體、使來自包涵體之蛋白質展開、使蛋白質再摺疊。
角蛋白通常不存在於非動物來源，諸如植物、酵母及細菌中，其通常來源於基於生物之來源，諸如來源於肉類生產行業之副產品。非動物來源之角蛋白多肽將適用於個人護理行業。因為角蛋白難以製備及純化，且通常在重組製造時最終會進入細菌包涵體中，所以需要另一種製備角蛋白的方式。
本文中描述了製備角蛋白多肽之改良方法。根據本文所描述之方法生產之角蛋白多肽具有改善之特性，諸如在整個表現及純化期間之純度及溶解度。所得角蛋白多肽具有規定的胺基酸組成及分子量，提供一致的產品概況。因此，現可出於多種目的使用本文所描述之方法有效生產角蛋白。
在一個態樣中，提供一種非天然存在之多肽，其包含(a)溶解度增進胺基酸序列；及(b)至少50個胺基酸長的與角蛋白多肽之對應區具有至少80%序列一致性的目標胺基酸序列，其中溶解度增進胺基酸序列由(Gly-X-Y) n之三聯體胺基酸模式組成，其中n=8-300，且X及Y為任何胺基酸殘基。在一些情況下，對於至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為相同胺基酸殘基。在一些情況下，對於至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為不同胺基酸殘基。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體不同。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體相同。在一些情況下，非天然存在之多肽為融合蛋白。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之N端融合。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之C端融合。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列包含與該目標胺基酸序列之N端融合的第一溶解度增進胺基酸序列及與該目標胺基酸序列之C端融合的第二溶解度增進胺基酸序列。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列中存在之胺基酸殘基之數目與該目標胺基酸序列中存在之胺基酸殘基之數目的比率為至少0.5:1。在一些情況下，角蛋白多肽為I型角蛋白或II型角蛋白。在一些情況下，I型角蛋白係選自由以下組成之群：上皮角蛋白、毛囊特異性上皮角蛋白及毛髮角蛋白。在一些情況下，角蛋白多肽為選自由K31、K32、K33a、K33b、K34、K35、K36、K37、K38、K39及K40組成之群的毛髮角蛋白。在一些情況下，角蛋白多肽為選自由K9、K10、K12、K13、K14、K15、K16、K17、K18、K19、K20、K23及K24組成之群的上皮角蛋白。在一些情況下，II型角蛋白係選自由以下組成之群：上皮角蛋白、毛囊特異性上皮角蛋白及毛髮角蛋白。在一些情況下，角蛋白多肽為選自由K81、K82、K83、K84、K85及K86組成之群的毛髮角蛋白。在一些情況下，角蛋白多肽為選自由K1、K2、K3、K4、K5、K6a、K6b、K6c、K7、K8、K76、K77、K78、K79及K80組成之群的上皮角蛋白。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列及該目標胺基酸序列直接藉由肽鍵連接。在一些情況下，溶解度增進胺基酸序列及該目標胺基酸序列經由連接序列連接。在一些情況下，連接序列係選自由以下組成之群：可撓性連接子、剛性連接子及可裂解連接子。在一些情況下，可裂解連接子包含蛋白酶裂解位。在一些情況下，溶解度增進序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 18-31或119中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 18-31或119中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，目標胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 2-12中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 2-12中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性的胺基酸序列。在一些情況下，非天然存在之多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 56-74、76、78、80-82、84、86、88、90、92、94、96、102、104、106、108-113或118中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 56-74、76、78、80-82、84、86、88、90、92、94、96、102、104、106、108-113或118中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性的胺基酸序列。
在另一態樣中，提供一種產生非天然存在之多肽的方法，該方法包含：(a)培養包含編碼前述任一者之非天然存在之多肽的聚核苷酸的宿主細胞；及(b)回收非天然存在之多肽，由此產生非天然存在之多肽。
在另一態樣中，提供一種產生目標多肽之方法，該方法包含：(a)培養包含編碼前述任一者之非天然存在之多肽的聚核苷酸的宿主細胞，(b)回收非天然存在之多肽，及(c)將溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列分離，由此產生目標多肽。
在一些實施例中，本文方法中所述之宿主細胞可為微生物細胞或真核細胞。在一些實施例中，微生物宿主細胞可為細菌細胞。在一些實施例中，細菌細胞可為大腸桿菌。在一些實施例中，真核細胞可為哺乳動物細胞。
在又一態樣中，提供一種重組多肽，其包含具有50個胺基酸至400個胺基酸之總截短的全長人類角蛋白31 (K31)之胺基酸序列。在一些情況下，總截短係50個胺基酸至350個胺基酸、50個胺基酸至300個胺基酸、50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸。在一些情況下，總截短包含N端截短、C端截短、內部截短或其任何組合。在一些情況下，總截短為N端截短。在一些情況下，N端截短係50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸。在一些情況下，總截短為C端截短。在一些情況下，C端截短係50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸。在一些情況下，總截短為N端截短及C端截短兩者。在一些情況下，N端截短係50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸，且該C端截短係50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸。在一些情況下，重組多肽具有小於75%的該全長K31之胺基酸序列。在一些情況下，重組多肽具有小於70%、小於65%、小於60%、小於55%、小於50%、小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%、小於20%或小於15%之該全長K31之胺基酸序列。在一些情況下，重組多肽包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，重組多肽包含SEQ ID NO: 7、9或10中之任一者之胺基酸序列；或與SEQ ID NO: 7、9或10中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。在一些情況下，重組多肽由SEQ ID NO: 7或9-11中之任一者之胺基酸序列組成；或由與SEQ ID NO: 7或9-11中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列組成。
在又一態樣中，提供非天然存在之多肽，其包含膠原蛋白多肽之至少9個連續胺基酸殘基及角蛋白多肽之至少25個連續胺基酸殘基，其中該膠原蛋白多肽之該等至少9個連續胺基酸殘基包含至少三個(Gly-X-Y)三聯體重複序列。
在另一態樣中，提供一種組合物，其包含0.005%至30% w/w之前述任一者之非天然存在之多肽、前述任一者之目標多肽或前述任一者之重組多肽。
在另一態樣中，提供一種組合物，其包含重組多肽，其中該重組多肽包含與全長角蛋白多肽之對應區具有至少80%序列一致性的胺基酸序列，該全長角蛋白多肽具有至少50個胺基酸之截短，其中經高效液相層析或質譜分析量測，該重組多肽具有至少80%之純度。
在一些情況下，前述組合物中之任一者經調配以用於局部施加。在一些情況下，前述組合物中之任一者為用於施加至皮膚、頭髮、頭皮或指甲的個人護理產品。
在又一態樣中，提供一種用於治療個體之皮膚或指甲或向其提供美容益處之方法，該方法包含向個體之皮膚或指甲投與或施加前述任一者之組合物，由此治療該個體之皮膚或指甲或向其提供該美容益處。在一些情況下，投與或施加的結果為減少皮膚損傷、促進受損皮膚修復、保護皮膚免受UV傷害、保護皮膚細胞免受暴露於城市粉塵之影響、增加皮膚細胞存活率、增加纖維母細胞存活率、增加角質細胞存活率、增加原膠原合成、減少發炎性細胞介素之產生、修復或強化甲板、修復乾燥或受損指甲、防止指甲受傷、改善指甲強度或生長或其任何組合。
在又一態樣中，提供一種用於治療個體之頭髮或向其提供美容益處之方法，該方法包含向個體之頭髮投與或施加前述任一者之組合物，由此治療該個體之頭髮或向其提供該美容益處。在一些情況下，投與或施加的結果為改善頭髮強度；改善頭髮光澤度、順滑度、柔韌度、梳理性、捲髮控制、光感或觸感；改善頭髮可梳理性或可管理性；改善頭髮柔順性；增加髮束直徑；改善細胞群存活率，促進頭髮及頭皮健康；就頭髮護理而言提供傷口癒合益處；就皮膚護理而言提供傷口癒合益處；就生物醫學而言提供傷口癒合益處；強化頭髮；修復分叉末梢；修復因大氣因素而受損之頭髮；修復因機械或化學處理而受損或變脆弱之頭髮；保護頭髮結構蛋白免受氧化壓力；減少角蛋白變性；保護頭髮免受熱傷害；保護頭髮免受大氣因素、機械或化學處理傷害；或其任何組合。
本文描述一種自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法。自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法包含(a)提供或獲得包含該重組多肽及宿主細胞或宿主細胞溶解物之混合物；(b)將該混合物分離成包含該重組多肽之第一可溶部分及第一不可溶部分；(c)將該第一可溶部分之pH調節至5或更小之pH，以產生pH經調節之混合物；及(d)將該pH經調節之混合物分離成包含該重組多肽之第二可溶部分及第二不可溶部分，其中該重組多肽佔該第二可溶部分中之蛋白質的至少50%。
在一些態樣中，重組多肽可包含溶解度增進胺基酸序列。在一些態樣中，重組多肽不包含溶解度增進胺基酸序列。
在一些態樣中，宿主細胞可為微生物細胞。在一些態樣中，微生物細胞可為細菌細胞。在一些態樣中，細菌細胞可為革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacterium)。在一些態樣中，革蘭氏陰性細菌可為大腸桿菌。在一些態樣中，步驟(c)中之分離混合物可包含離心、超速離心、過濾、超過濾或其組合。
在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將酸添加至第一可溶部分。在一些態樣中，酸可為弱酸或強酸。在一些態樣中，酸可為H 2SO 4。在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將第一可溶部分之pH調節至4或更小之pH。在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將第一可溶部分之pH調節至3或更小之pH。
在一些態樣中，自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法可進一步包含步驟(e)將第二可溶部分之pH調節至比(c)之該pH低的pH以產生第二pH經調節之混合物；及(f)將第二pH經調節之混合物分離成包含重組多肽之第三可溶部分及第三不可溶部分。在一些態樣中，該方法可進一步包含步驟(g)將第三可溶部分之pH調節至比(e)之該pH低的pH以產生第三pH經調節之混合物；及(h)將第三pH經調節之混合物分離成包含重組多肽之第四可溶部分及第四不可溶部分。
在一些態樣中，重組多肽之純度在第三可溶部分中比在第二可溶部分中高；且其中重組多肽之純度在第四可溶部分中比在第三可溶部分中高。在一些態樣中，重組多肽或其部分為第二可溶部分中存在之蛋白質的至少55%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。
在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物不含宿主細胞碎片。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多50%、至多45%、至多40%、至多35%、至多30%、至多25%、至多20%、至多15%、至多10%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%或至多1%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物不含內源性宿主細胞蛋白。
根據以下詳細說明，本發明之其他態樣及優點對於熟習此項技術者將變得顯而易見，其中僅展示及描述本發明之說明性實施例。應認識到，本發明能夠具有其他及不同實施例，且其若干細節能夠在各種顯而易見的方面進行修改，該等修改皆不偏離本發明。因此，附圖及說明在本質上應視為說明性而非限制性的。
交叉參考
本申請案主張2022年4月14日申請之美國臨時申請案第63/330,894號之權益，該申請案以全文引用之方式併入本文中。 定義
本文所用之術語僅出於描述特定個案之目的且不希望具有限制性。如本文所用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」亦意欲包括複數形式。此外，就實施方式及/或申請專利範圍中使用術語「包括(including)」、「包括(includes)」、「具有(having)」、「具有(has)」、「具有(with)」或其變化形式之程度而言，此類術語意欲以類似於術語「包含」之方式為包括性的。
術語「約」或「大致」意謂由一般熟習此項技術者測定的特定值在可接受誤差範圍內，其將部分取決於如何量測或測定該值，例如量測系統之侷限性。舉例而言，根據指定值之實務，「約」可意謂在1或大於1個標準差內。在申請案及申請專利範圍描述特定值的情況下，除非另有說明，否則應假設術語「約」意謂特定值之可接受誤差範圍。
術語「個體」、「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。該等術語中無一者要求或受限於以健康照護工作者(例如醫生、註冊護士、護士從業者、醫師助理、護理員或臨終關懷工作者)之監督(例如持續或間歇監督)為特徵的情形。
如本文所用，術語「包含」或其變化形式(諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」)解讀為指示包括任何所述特徵但不排除任何其他特徵。在本文中所提供之組合物及方法中之任一者的一些實施例中，「包含」可替換為「基本上由...組成」或「由...組成」。片語「基本上由...組成」在本文中用於要求指定特徵以及不實質上影響所主張之本發明的特點或功能之特徵。如本文所用，術語「組成」僅用於指示所述特徵之存在。
如本文中所使用之術語「基因」通常指編碼特定蛋白質之聚核苷酸，且其可指代單獨的編碼區或可包括編碼序列之前(5'非編碼序列)及之後(3'非編碼序列)的調節序列。
術語「重組」係指藉由基因重組(例如分子選殖)之實驗室方法，自多個來源彙集遺傳物質，產生原本不會存在於基因體中之序列，從而形成核酸或蛋白質。重組融合蛋白為藉由組合編碼兩種或更多種組成蛋白質之序列，使得其表現為單一多肽而產生的蛋白質。重組融合蛋白可在活體內表現於各種類型之宿主細胞中，包括細菌細胞、真菌細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等。
如本文所用，術語「溶解度增進胺基酸序列」係指能夠例如在表現、分泌及/或純化期間增加目標胺基酸序列之溶解度(諸如藉由在不同範圍或類型之pH、離子強度、鹽、鹽濃度、溫度、極性、緩衝液、溶劑等下改變溶解度)的胺基酸序列。當目標胺基酸序列與溶解度增進胺基酸序列一起表現時與單獨表現(亦即，無溶解度增進胺基酸序列)時相比具有較大的溶解度時，該目標序列之溶解度增進。
如本文所用，關於核酸序列、區、元件或域之「可操作地連接」意謂核酸區在功能上彼此相關。在另一實施例中，啟動子可經可操作地連接至編碼多肽之核酸，其中啟動子調節或介導核酸之轉錄。
如本文所用，「表現」係指藉由聚核苷酸之轉錄及轉譯產生多肽的方法。多肽之表現量可使用此項技術中已知之任何方法評定，包括例如測定由宿主細胞產生之多肽之量的方法。此類方法可包括例如凝膠電泳後的庫馬斯藍染色、勞立蛋白質分析(Lowry protein assay)及布拉德福蛋白質分析(Bradford protein assay)。
如本文所用，「載體」為可複製核酸，當載體轉型至適當宿主細胞時，自該核酸可表現一或多種異源蛋白質。提及之載體包括可通常藉由限制消化及接合引入編碼多肽或其片段之核酸的載體。提及之載體亦包括含有編碼所關注多肽之核酸的載體。載體用於將編碼多肽之核酸引入宿主細胞中以用於擴增核酸或用於表現/呈現由核酸編碼之多肽。載體通常保持游離型，但可經設計以實現基因或其部分整合成基因體之染色體。亦涵蓋作為人工染色體(諸如酵母人工染色體及哺乳動物人工染色體)之載體。此類媒劑之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。
如本文所用，「表現載體」包括能夠表現與調節序列(諸如能夠實現此類DNA片段之表現的啟動子區)以可操作方式連接之DNA的載體。此類其他區段可包括啟動子及終止子序列，且視情況可包括一或多個複製起點、一或多個可選標記、強化子、聚腺苷酸化信號及其類似者。表現載體一般衍生自質體或病毒DNA，或可含有此兩個元件。因而，表現載體係指在引入適當宿主細胞時表現所選殖之DNA的重組DNA或RNA構築體，諸如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體。適當表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括在原核細胞及/或真核細胞中可複製之表現載體以及保持游離型之表現載體或整合至宿主細胞基因體中之表現載體。
表現載體可經設計用於在如本領域中已知的多個表現系統中表現所關注蛋白質，該等表現系統為諸如使用原核細胞(例如革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌，諸如大腸桿菌或古菌)或真核細胞(例如昆蟲細胞(諸如Sf9或Sf21細胞)、酵母(諸如畢赤酵母屬( Pichia)、酵母菌屬( Saccharomyces)或克魯維酵母屬( Kluyveromyces)物種)、植物(諸如整株植物、植物組織系統或植物細胞系統)、海藻(諸如衣藻屬( Chlamydomonas)或聚球藻屬( Synechococcus)物種)、禽類細胞(諸如胚胎細胞或纖維母細胞)或哺乳動物細胞(諸如CHO、HeLa、Vero或HEK 293細胞))的表現系統。
術語「啟動子」或「轉錄調節區」係指影響或促進轉錄起始之核酸序列。啟動子通常被認為包括調節區，諸如強化子或誘導子元件。啟動子一般將適合於表現目標基因之宿主細胞。一般而言，轉錄及轉譯調節序列包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位、轉錄起始及終止序列、轉譯起始及終止序列及強化子或活化子序列。
術語「調節序列」意欲包括啟動子、強化子、及控制基因之轉錄或轉譯之其他表現控制元件(例如聚腺苷酸化信號)。調節序列包括引導核酸在許多類型細胞中之組成性表現的調節序列、引導核酸僅在某些細胞中表現的調節序列(例如組織特異性調節序列)及引導核酸在用特定藥劑刺激後表現的調節序列(例如誘導性調節序列)。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可取決於諸如待轉型細胞之選擇、所需蛋白質之表現量等因素。
術語「連接序列」、「連接子」或「間隔子」通常指可排列在蛋白質序列之不同區段之間的一個至若干個胺基酸。兩個蛋白質序列可在兩個蛋白質序列之間含有例如剛性或可撓性連接子胺基酸序列。可撓性連接子一般富含小型或極性胺基酸，諸如Gly及Ser，以提供良好的可撓性及溶解度。可撓性連接序列可為例如甘胺酸-絲胺酸肽序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) n(SEQ ID NO: 1)。剛性連接子藉由採用α-螺旋結構或藉由含有多個Pro殘基而呈現相對堅固的結構。在許多情形下，其比可撓性連接子更有效地分離功能域，且當空間分離保持穩定性或活性時有用。連接序列之長度可為例如一個胺基酸至約15個胺基酸。連接序列亦可含有蛋白酶裂解位。可裂解連接子可適用於例如在純化過程期間自所關注重組蛋白移除標籤。實例包括可酶促裂解或可化學裂解或可光裂解連接子。舉例而言，溶解度增進胺基酸序列可經由可裂解連接子(諸如可酶促裂解或可化學裂解連接子)接合至目標胺基酸序列，且接著可使用裂解步驟(諸如酶促培育步驟)使溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列分離，產生單獨的經純化目標多肽。
術語「目標多肽」廣泛地指備受關注之胺基酸序列。「目標多肽」可採用許多實施例。舉例而言，在一些實施例中，「目標多肽」可為內源蛋白。在一些實施例中，「目標多肽」可為重組蛋白。在一些實施例中，「目標多肽」可為全長蛋白。在一些實施例中，「目標多肽」可為截短蛋白。在一些實施例中，「目標多肽」可為融合蛋白。在一些實施例中，「目標多肽」可為融合蛋白之片段。在一些實施例中，「目標多肽」可指蛋白質內之特定胺基酸序列。在一些實施例中，「目標多肽」可指蛋白質內之特定域。
術語「蛋白酶裂解位」通常指藉由特定蛋白酶裂解之胺基酸序列。
術語「組胺酸標籤」通常係指重組多肽上2-30個相鄰之一系列組胺酸殘基。
術語「分泌標籤」或「信號肽」通常係指募集宿主細胞之細胞機構以將所表現蛋白質轉運至宿主細胞之特定位置或細胞器的胺基酸序列。
如本文所用，「肽」係指長度為2至約或40個胺基酸之多肽。
如本文所用，「多肽」係指共價接合的兩個或更多個胺基酸。術語「多肽」與「蛋白質」在本文中可互換使用。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指由複數種由單一核酸序列表現之多肽組分構成的蛋白質。融合蛋白可為兩種、三種或甚至四種或更多種不同蛋白質或多肽之組合。融合蛋白可為例如兩個或更多個異源胺基酸序列之融合物。融合蛋白可由多肽接合以異源多肽組成，該異源多肽可為例如另一蛋白質或多肽、異源靶向序列、連接子、抗原決定基標籤、可偵測融合搭配物(諸如螢光蛋白)、分泌信號序列、純化助劑(諸如His標籤)、蛋白酶目標位點、溶解度增進胺基酸序列及其類似物。融合蛋白可具有一或多個添加至蛋白質之N端、C端及或中間(內部)部分之異源域。若融合蛋白之兩個部分為「異源的」，則其在其天然狀態下不為同一蛋白質之一部分。舉例而言，目標胺基酸序列或多肽可與溶解度增進胺基酸序列產生為融合蛋白，且隨後視情況在生產之後分離成個別多肽。
術語「宿主細胞」通常指經工程改造以表現引入之外源性聚核苷酸的細胞。宿主細胞可為真核生物或原核生物。宿主細胞可為例如微生物細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、藻類細胞或植物細胞。
術語「角質細胞」通常指產生存在於皮膚之表皮層中之角蛋白的細胞。
如本文所用，術語「非天然存在」係指基因、多肽或蛋白質，例如角蛋白多肽通常未在自然界中發現。非天然存在的角蛋白可以重組方式製備。非天然存在之多肽包含例如溶解度增進胺基酸序列及包含角蛋白多肽之目標胺基酸序列。角蛋白多肽可為全長角蛋白多肽或其區域或截短。
在整個本發明中，各種實施例係以範圍形式呈現。應理解，呈範圍形式之描述僅為了方便及簡潔起見，且不應解釋為對任何實施例之範疇的固定限制。因此，除非上下文另外清楚指示，否則範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及至下限十分位之該範圍內之任何個別數值。舉例而言，諸如1至6之範圍描述應視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等之子範圍以及該範圍內之任何個別值，例如1.1、2、2.3、5及5.9。不論範圍之廣度如何，此均適用。此等中間範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍內且亦涵蓋於本發明內，在所陳述的範圍內受到任何特別排除的限值。除非上下文另外清楚指示，否則當規定範圍包括一個或兩個界限值時，不包括彼等所包括之界限值中之任一者或兩者之範圍亦包括在本發明中。
如本文所用之術語「截短」係指序列(胺基酸、DNA或RNA)比參考全長序列，例如天然存在之序列短。如本文中所使用，術語「截短」可與術語「片段」互換。如本文所用之術語「截短多肽」通常指短於全長(例如天然)多肽之多肽，其中全長(例如天然)多肽之一或多個部分不存在。本文提供之非天然存在之多肽可在C端、N端截短、藉由移除全長多肽序列之內部部分截短(例如內部截短)、在C端與N端兩處截短或可具有C端截短及N端截短以及內部截短中之一者或兩者。
當用於指代胺基酸位置時，「截短」包括該胺基酸位置。舉例而言，在相對於全長多肽胺基酸位置100處之N端截短意謂自全長多肽之N端截短100個胺基酸(亦即截短多肽遺失全長多肽之胺基酸位置1至100)。類似地，在全長多肽(假設全長多肽為1000個胺基酸)之胺基酸位置901處的C端截短意謂自C端截短100個胺基酸(亦即，截短多肽遺失全長多肽之胺基酸位置901至1000)。類似地，在胺基酸位置101及200處之內部截短意謂內部截短全長多肽之100個胺基酸(亦即，截短多肽遺失全長多肽之胺基酸位置101至200)。
如本文所用之術語「類膠原蛋白(collagen-like protein)」為包含(Gly-X-Y)n之膠原重複三聯體序列的多肽或蛋白質序列，其中X及Y可為任何胺基酸。該術語涵蓋類膠原蛋白之變異體及片段。
本文中所使用之章節標題係僅出於組織目的且不應理解為限制所描述之主題。 角蛋白多肽及針對重組生產之設計
角蛋白係一類中間絲(IF)，一種10 nm纖維之超家族，且通常為以捲曲螺旋方式纏結形成10 nm細絲之次單位結構的豐富α-螺旋多肽。來自不同角蛋白之細絲具有不同物理特性，表明不同表現經調適以適合拉伸強度、可撓性及動力學之組織特異性結構要求。角蛋白被歸類為與其他IF，包括肌間線蛋白、波形蛋白(vimentin)、神經纖毛蛋白及膠質纖維酸蛋白不同。
所有IF蛋白質具有中心a-螺旋域，由非螺旋頭(胺基端)及尾部(羧基端)域側接的棒。兩條多肽鏈之棒以捲曲螺旋方式纏結。在整個a-螺旋序列中為呈特徵性七肽重複模式的疏水性胺基酸重複序列，使得每七個殘基中之第一及第四殘基常常為非極性的。此在螺旋表面上提供疏水性密封，使得兩個IF多肽之間能夠成卷。
通常，在角蛋白中，棒域內之連接域(L1、L12、L2)以及α-螺旋捲曲盤繞形成IF蛋白質所特有的域1A、1B、2A及2B中之明顯可區分的七肽重複序列很明顯。此外，亞域2B通常含有七肽重複序列的中斷或間斷，此可在捲曲螺旋經歷應變時展開/解開方面發揮重要作用。
角蛋白二聚體通常為由兩種不同的相關α-螺旋蛋白組裝之異二聚體。組裝條件，諸如pH及形成IF之寡聚物結構可在IF間不同，其中角蛋白具有標籤組裝單位(單位長度細絲)。
若干種類型角蛋白蛋白質存在於人體中。人類及動物毛髮例如具有兩種主要類型之角蛋白：I型(酸性，pI=4-6)及II型(鹼性，pI=6-8)。角蛋白之特徵在於較高半胱胺酸含量，其在總胺基酸殘基之7%至20%範圍內變化。毛髮之機械強度歸因於存在分子內及分子間二硫鍵。已在所有類別之脊椎動物中發現I型及II型角蛋白。角蛋白樣IF蛋白已發現於較低等脊索動物中。線形成角蛋白為另一種在若干種硬骨魚類及兩棲動物中發現的類型。已經在一些類型之植物細胞中鑑別出與在動物細胞中發現之IF極其類似的10 nm長絲，且其主要組分為角蛋白。
形態上，人類毛髮纖維由三種主要組分構成：表皮、皮質及髓質。角蛋白31為毛髮之皮質組分之主要組分。例如在化學處理、暴露於太陽等期間對毛髮造成之傷害可在此層毛髮中引起損傷。對毛髮施加角蛋白現對個人護理及毛髮護理行業修復及保護受損毛髮具有商業重要性。
因此，基於角蛋白的個人護理及毛髮護理產品具有商業重要性。然而，此等角蛋白蛋白質目前在工業上大部分來源於動物副產品，諸如羊毛及雞毛。
具有可在微生物細胞中大量產生且之後容易地且以低成本純化之人類角蛋白蛋白質序列將為獲得不來源於動物的且純素並且可持續的工業量之角蛋白的有用方式，特別適用於毛髮護理及個人護理行業。
為減輕動物來源產品之問題，膠原蛋白與角蛋白均可由其他真核或原核生物體產生。然而，微生物產生之角蛋白尤其極難以大量純化。此為獲得大量純化的非動物來源角蛋白之前景造成了障礙。
在某些實施例中，本發明角蛋白多肽可衍生自此項技術中已知的54種角蛋白類型中之任一者，如以下表1中所概述。 表 1 . 角蛋白類型 .
角蛋白類型 類型 I 類型 II
上皮角蛋白 K9, K10, K12, K13, K14, K15, K16, K17, K18, K19, K20, K23, K24 K1, K2, K3, K4, K5, K6a, K6b, K6c, K7, K8, K76, K77, K78, K79, K80
毛囊特有上皮角蛋白(根鞘) K25, K26, K27, K28 K71, K72, K73, K74, K75
毛髮角蛋白 K31, K32, K33a, K33b, K34, K35, K36, K37, K38, K39, K40 K81, K82, K83, K84, K85, K86
在較佳實施例中，角蛋白可為用於例如個人護理產品，諸如頭髮護理產品中的毛髮角蛋白。在其他較佳實施例中，角蛋白可為用於例如個人護理產品(諸如皮膚或指甲產品)中之上皮角蛋白。
54種角蛋白類型中之各者之成員的例示性序列及描述藉由下表2中所提供之UniProt知識庫(KB)識別符可見。在www.uniprot.org/uniprot/上可獲得UniProtKB。其他適合的角蛋白序列在此項技術中可容易地被鑑別出。 表 2 . 例示性人類角蛋白 .
UniProtKB識別符 登錄名稱 蛋白質名稱 基因名稱 長度
P35527 K1C9_HUMAN I型細胞骨架角蛋白9 (細胞角蛋白-9) (CK-9) (角蛋白-9) (K9) KRT9 623
P13645 K1C10_HUMAN I型細胞骨架角蛋白10 (細胞角蛋白-10) (CK-10) (角蛋白-10) (K10) KRT10 KPP 584
Q99456 K1C12_HUMAN I型細胞骨架角蛋白12 (細胞角蛋白-12) (CK-12) (角蛋白-12) (K12) KRT12 494
P13646 K1C13_HUMAN I型細胞骨架角蛋白13 (細胞角蛋白-13) (CK-13) (角蛋白-13) (K13) KRT13 458
P02533 K1C14_HUMAN I型細胞骨架角蛋白14 (細胞角蛋白-14) (CK-14) (角蛋白-14) (K14) KRT14 472
P19012 K1C15_HUMAN I型細胞骨架角蛋白15 (細胞角蛋白-15) (CK-15) (角蛋白-15) (K15) KRT15 KRTB 456
P08779 K1C16_HUMAN I型細胞骨架角蛋白16 (細胞角蛋白-16) (CK-16) (角蛋白-16) (K16) KRT16 KRT16A 473
Q04695 K1C17_HUMAN I型細胞骨架角蛋白17 (39.1) (細胞角蛋白-17) (CK-17) (角蛋白-17) (K17) KRT17 432
P05783 K1C18_HUMAN I型細胞骨架角蛋白18 (細胞增殖誘導基因46蛋白) (細胞角蛋白-18) (CK-18) (角蛋白-18) (K18) KRT18 CYK18 PIG46 430
P08727 K1C19_HUMAN I型細胞骨架角蛋白19 (細胞角蛋白-19) (CK-19) (角蛋白-19) (K19) KRT19 400
P35900 K1C20_HUMAN I型細胞骨架角蛋白20 (細胞角蛋白-20) (CK-20) (角蛋白-20) (K20) (蛋白質IT) KRT20 424
Q9C075 K1C23_HUMAN I型細胞骨架角蛋白23 (細胞角蛋白-23) (CK-23) (角蛋白-23) (K23) KRT23 422
Q2M2I5 K1C24_HUMAN I型細胞骨架角蛋白24 (細胞角蛋白-24) (CK-24) (角蛋白-24) (K24) (I型角蛋白-24) KRT24 KA24 525
Q7Z3Z0 K1C25_HUMAN I型細胞骨架角蛋白25 (細胞角蛋白-25) (CK-25) (角蛋白-25) (K25) (角蛋白-25A) (K25A) (I型內根鞘特有角蛋白-K25irs1) KRT25 KRT25A 450
Q7Z3Y9 K1C26_HUMAN I型細胞骨架角蛋白26 (細胞角蛋白-26) (CK-26) (角蛋白-25B) (K25B) (角蛋白-26) (K26) (I型內根鞘特有角蛋白-K25irs2) KRT26 KRT25B 468
Q7Z3Y8 K1C27_HUMAN I型細胞骨架角蛋白27 (細胞角蛋白-27) (CK-27) (角蛋白-25C) (K25C) (角蛋白-27) (K27) (I型內根鞘特有角蛋白-K25irs3) KRT27 KRT25C 459
Q7Z3Y7 K1C28_HUMAN I型細胞骨架角蛋白28 (細胞角蛋白-28) (CK-28) (角蛋白-25D) (K25D) (角蛋白-28) (K28) (I型內根鞘特有角蛋白-K25irs4) KRT28 KRT25D 464
Q15323 K1H1_HUMAN I型角質層角蛋白Ha1 (I型毛髮角蛋白Ha1) (角蛋白-31) (K31) KRT31 HHA1 HKA1 KRTHA1 416
Q14532 K1H2_HUMAN I型角質層角蛋白Ha2 (I型毛髮角蛋白Ha2) (角蛋白-32) (K32) KRT32 HHA2 HKA2 KRTHA2 448
O76009 KT33A_HUMAN I型角質層角蛋白Ha3-I (I型毛髮角蛋白Ha3-I) (角蛋白-33A) (K33A) KRT33A HHA3-I HKA3A KRTHA3A 404
Q14525 KT33B_HUMAN I型角質層角蛋白Ha3-II (I型毛髮角蛋白Ha3-II) (角蛋白-33B) (K33B) KRT33B HHA3-II HKA3B KRTHA3B 404
O76011 KRT34_HUMAN I型角質層角蛋白Ha4 (I型毛髮角蛋白Ha4) (角蛋白-34) (K34) KRT34 HHA4 HKA4 KRTHA4 436
Q92764 KRT35_HUMAN I型角質層角蛋白Ha5 (I型毛髮角蛋白Ha5) (角蛋白-35) (K35) KRT35 HHA5 HKA5 KRTHA5 455
O76013 KRT36_HUMAN I型角質層角蛋白Ha6 (I型毛髮角蛋白Ha6) (角蛋白-36) (K36) KRT36 HHA6 HKA6 KRTHA6 467
O76014 KRT37_HUMAN I型角質層角蛋白Ha7 (I型毛髮角蛋白Ha7) (角蛋白-37) (K37) KRT37 HHA7 HKA7 KRTHA7 449
O76015 KRT38_HUMAN I型角質層角蛋白Ha8 (I型毛髮角蛋白Ha8) (角蛋白-38) (K38) KRT38 HHA8 HKA8 KRTHA8 456
Q6A163 K1C39_HUMAN I型細胞骨架角蛋白39 (細胞角蛋白-39) (CK-39) (角蛋白-39) (K39) (I型毛髮角蛋白Ka35) KRT39 KA35 491
Q6A162 K1C40_HUMAN I型細胞骨架角蛋白40 (細胞角蛋白-40) (CK-40) (角蛋白-40) (K40) (I型毛髮角蛋白Ka36) KRT40 KA36 431
P04264 K2C1_HUMAN II型細胞骨架角蛋白1 (67 kDa細胞角蛋白) (細胞角蛋白-1) (CK-1) (毛髮α蛋白) (角蛋白-1) (K1) (II型角蛋白Kb1) KRT1 KRTA 644
P35908 K22E_HUMAN II型表皮細胞骨架角蛋白2 (細胞角蛋白-2e) (CK-2e) (上皮角蛋白-2e) (表皮角蛋白-2) (角蛋白-2e) (K2e) (II型角蛋白Kb2) KRT2 KRT2A KRT2E 639
P12035 K2C3_HUMAN II型細胞骨架角蛋白3 (65 kDa細胞角蛋白) (細胞角蛋白-3) (CK-3) (角蛋白-3) (K3) (II型角蛋白Kb3) KRT3 628
P19013 K2C4_HUMAN II型細胞骨架角蛋白4 (細胞角蛋白-4) (CK-4) (角蛋白-4) (K4) (II型角蛋白Kb4) KRT4 CYK4 520
P13647 K2C5_HUMAN II型細胞骨架角蛋白5 (58 kDa細胞角蛋白) (細胞角蛋白-5) (CK-5) (角蛋白-5) (K5) (II型角蛋白Kb5) KRT5 590
P02538 K2C6A_HUMAN II型細胞骨架角蛋白6A (細胞角蛋白-6A) (CK-6A) (細胞角蛋白-6D) (CK-6D) (角蛋白-6A) (K6A) (II型角蛋白Kb6) (過敏原Hom s 5) KRT6A K6A KRT6D 564
P04259 K2C6B_HUMAN II型細胞骨架角蛋白6B (細胞角蛋白-6B) (CK-6B) (角蛋白-6B) (K6B) (II型角蛋白Kb10) KRT6B K6B KRTL1 564
P48668 K2C6C_HUMAN II型細胞骨架角蛋白6C (細胞角蛋白-6C) (CK-6C) (細胞角蛋白-6E) (CK-6E) (角蛋白K6h) (角蛋白-6C) (K6C) (II型角蛋白Kb12) KRT6C KRT6E 564
P08729 K2C7_HUMAN II型細胞骨架角蛋白7 (細胞角蛋白-7) (CK-7) (角蛋白-7) (K7) (肌膜角蛋白(Sarcolectin)) (II型角蛋白Kb7) KRT7 SCL 469
P05787 K2C8_HUMAN II型細胞骨架角蛋白8 (細胞角蛋白-8) (CK-8) (角蛋白-8) (K8) (II型角蛋白Kb8) KRT8 CYK8 483
Q01546 K22O_HUMAN II型口腔細胞骨架角蛋白2 (細胞角蛋白-2P) (CK-2P) (K2P) (角蛋白-76) (K76) (II型角蛋白Kb9) KRT76 KRT2B KRT2P 638
Q7Z794 K2C1B_HUMAN II型細胞骨架角蛋白1b (細胞角蛋白-1B) (CK-1B) (角蛋白-77) (K77) (II型角蛋白Kb39) KRT77 KRT1B 578
Q8N1N4 K2C78_HUMAN II型細胞骨架角蛋白78 (細胞角蛋白-78) (CK-78) (角蛋白-5b) (角蛋白-78) (K78) (II型角蛋白Kb40) KRT78 K5B KB40 520
Q5XKE5 K2C79_HUMAN II型細胞骨架角蛋白79 (細胞角蛋白-79) (CK-79) (角蛋白-6-樣) (角蛋白-6L) (角蛋白-79) (K79) (II型角蛋白Kb38) KRT79 K6L KB38 KRT6L 535
Q6KB66 K2C80_HUMAN II型細胞骨架角蛋白80 (細胞角蛋白-80) (CK-80) (角蛋白-80) (K80) (II型角蛋白Kb20) KRT80 KB20 452
Q3SY84 K2C71_HUMAN II型細胞骨架角蛋白71 (細胞角蛋白-71) (CK-71) (角蛋白-71) (K71) (II型內根鞘特有角蛋白-K6irs1) (角蛋白6 irs) (hK6irs) (hK6irs1) (II型角蛋白Kb34) KRT71 K6IRS1 KB34 KRT6IRS1 523
Q14CN4 K2C72_HUMAN II型細胞骨架角蛋白72 (細胞角蛋白-72) (CK-72) (角蛋白-72) (K72) (II型內根鞘特有角蛋白-K6irs2) (II型角蛋白Kb35) KRT72 K6IRS2 KB35 KRT6 KRT6IRS2 511
Q86Y46 K2C73_HUMAN II型細胞骨架角蛋白73 (細胞角蛋白-73) (CK-73) (角蛋白-73) (K73) (Type II內根鞘特有角蛋白-K6irs3) (II型角蛋白Kb36) KRT73 K6IRS3 KB36 KRT6IRS3 540
Q7RTS7 K2C74_HUMAN II型細胞骨架角蛋白74 (細胞角蛋白-74) (CK-74) (角蛋白-5c) (K5C) (角蛋白-74) (K74) (II型內根鞘特有角蛋白-K6irs4) (II型角蛋白Kb37) KRT74 K6IRS4 KB37 KRT5C KRT6IRS4 529
O95678 K2C75_HUMAN II型細胞骨架角蛋白75 (細胞角蛋白-75) (CK-75) (毛囊角蛋白-6) (hK6hf) (角蛋白-75) (K75) (II型角蛋白-K6hf) (II型角蛋白Kb18) KRT75 K6HF KB18 551
Q14533 KRT81_HUMAN II型角質層角蛋白Hb1 (毛髮角蛋白K2.9) (基礎毛髮角蛋白1) (角蛋白-81) (K81) (轉移性淋巴結137基因蛋白) (MLN 137) (II型角蛋白Hb1) (II型角蛋白Kb21) (ghHKb1) (ghHb1) KRT81 KRTHB1 MLN137 505
Q9NSB4 KRT82_HUMAN II型角質層角蛋白Hb2 (角蛋白-82) (K82) (II型角蛋白Hb2) (II型角蛋白Kb22) KRT82 KRTHB2 513
P78385 KRT83_HUMAN II型角質層角蛋白Hb3 (毛髮角蛋白K2.10) (角蛋白-83) (K83) (II型角蛋白Hb3) (II型角蛋白Kb23) KRT83 KRTHB3 493
Q9NSB2 KRT84_HUMAN II型角質層角蛋白Hb4 (角蛋白-84) (K84) (II型角蛋白Hb4) (II型角蛋白Kb24) KRT84 KRTHB4 600
P78386 KRT85_HUMAN II型角質層角蛋白Hb5 (毛髮角蛋白K2.12) (角蛋白-85) (K85) (II型角蛋白Hb5) (II型角蛋白Kb25) KRT85 KRTHB5 507
O43790 KRT86_HUMAN II型角質層角蛋白Hb6 (毛髮角蛋白K2.11) (角蛋白-86) (K86) (II型角蛋白Hb6) (II型角蛋白Kb26) KRT86 KRTHB6 486
角蛋白可以為全長角蛋白或截短角蛋白。角蛋白胺基酸序列可衍生自人類角蛋白序列，或其可來自另一生物體，例如另一哺乳動物。在較佳實施例中，角蛋白來源於人類角蛋白，諸如K12、K31、K33a或K33b。此類人類角蛋白的全長角蛋白蛋白質序列列於下表3中。角蛋白可為同系物或其任何片段及/或可包含與表3中所列角蛋白序列中的任一者或其任何片段具有至少約70%序列一致性的胺基酸序列。 表 3 . 例示性全長人類角蛋白序列 .
名稱 胺基酸序列
K12 (人類) MDLSNNTMSLSVRTPGLSRRLSSQSVIGRPRGMSASSVGSGYGGSAFGFGASCGGGFSAASMFGSSSGFGGGSGSSMAGGLGAGYGRALGGGSFGGLGMGFGGSPGGGSLGILSGNDGGLLSGSEKETMQNLNDRLASYLDKVRALEEANTELENKIREWYETRGTGTADASQSDYSKYYPLIEDLRNKIISASIGNAQLLLQIDNARLAAEDFRMKYENELALRQGVEADINGLRRVLDELTLTRTDLEMQIESLNEELAYMKKNHEDELQSFRVGGPGEVSVEMDAAPGVDLTRLLNDMRAQYETIAEQNRKDAEAWFIEKSGELRKEISTNTEQLQSSKSEVTDLRRAFQNLEIELQSQLAMKKSLEDSLAEAEGDYCAQLSQVQQLISNLEAQLLQVRADAERQNVDHQRLLNVKARLELEIETYRRLLDGEAQGDGLEESLFVTDSKSQAQSTDSSKDPTKTRKIKTVVQEMVNGEVVSSQVQEIEELM (SEQ ID NO: 2)
K31 (人類) MPYNFCLPSLSCRTSCSSRPCVPPSCHSCTLPGACNIPANVSNCNWFCEGSFNGSEKETMQFLNDRLASYLEKVRQLERDNAELENLIRERSQQQEPLLCPSYQSYFKTIEELQQKILCTKSENARLVVQIDNAKLAADDFRTKYQTELSLRQLVESDINGLRRILDELTLCKSDLEAQVESLKEELLCLKSNHEQEVNTLRCQLGDRLNVEVDAAPTVDLNRVLNETRSQYEALVETNRREVEQWFTTQTEELNKQVVSSSEQLQSYQAEIIELRRTVNALEIELQAQHNLRDSLENTLTESEARYSSQLSQVQSLITNVESQLAEIRSDLERQNQEYQVLLDVRARLECEINTYRSLLESEDCNLPSNPCATTNACSKPIGPCLSNPCTSCVPPAPCTPCAPRPRCGPCNSFVR (SEQ ID NO: 3)
K33a (人類) MSYSCGLPSLSCRTSCSSRPCVPPSCHGCTLPGACNIPANVSNCNWFCEGSFNGSEKETMQFLNDRLASYLEKVRQLERDNAELENLIRERSQQQEPLVCASYQSYFKTIEELQQKILCSKSENARLVVQIDNAKLASDDFRTKYETELSLRQLVESDINGLRRILDELTLCRSDLEAQVESLKEELLCLKQNHEQEVNTLRCQLGDRLNVEVDAAPTVDLNQVLNETRSQYEALVETNRREVEQWFATQTEELNKQVVSSSEQLQSYQAEIIELRRTVNALEIELQAQHNLRDSLENTLTESEARYSSQLSQVQRLITNVESQLAEIRSDLERQNQEYQVLLDVRARLECEINTYRSLLESEDCKLPSNPCATTNACDKSTGPCISNPCGLRARCGPCNTFGY (SEQ ID NO: 4)
K33b (人類) MPYNFCLPSLSCRTSCSSRPCVPPSCHGYTLPGACNIPANVSNCNWFCEGSFNGSEKETMQFLNDRLASYLEKVRQLERDNAELENLIRERSQQQEPLLCPSYQSYFKTIEELQQKILCSKSENARLVVQIDNAKLAADDFRTKYQTEQSLRQLVESDINSLRRILDELTLCRSDLEAQMESLKEELLSLKQNHEQEVNTLRCQLGDRLNVEVDAAPAVDLNQVLNETRNQYEALVETNRREVEQWFATQTEELNKQVVSSSEQLQSYQAEIIELRRTVNALEIELQAQHNLRYSLENTLTESEARYSSQLSQVQSLITNVESQLAEIRSDLERQNQEYQVLLDVRARLECEINTYRSLLESEDCKLPSNPCATTNACEKPIGSCVTNPCGPRSRCGPCNTFGY (SEQ ID NO: 5)
在其他實施例中，角蛋白可為與人類角蛋白相當的全長或截短角蛋白多肽。適合之可比人類角蛋白序列包括例如以下蛋白質NCBI寄存編號：AAB30058.2、AAB59562.1、CAA73943.1、BAA09320.1、CAA31695.1、P13647.3、P04264.6、P35908.2、Q14533.3、P05787.7、P48668.3、P02538.3、O43790.1、P78385.2、P78386.1、NP_002272.2、P12035.3、Q3SY84.3、O95678.2及NP_002274.1。在替代實施例中，角蛋白可來源於動物角蛋白，諸如其他哺乳動物。
在其他實施例中，角蛋白可為與雞角蛋白或其他家禽角蛋白(諸如來自包括雞、火雞、鵝及鴨的家禽)相當之全長或截短角蛋白多肽。來自原雞(雞)之適合的相當角蛋白(或其截短)序列包括NCBI寄存編號P02450.2、P20308.2、P20307.2、P04458.3、P04459.3、P25692.2、AAO85139.1、NP_001264675.1、AAA48932.1、AAA48931.1、XP_040510675.1、NP_001075171.2及NP_990263.2。
在其他實施例中，角蛋白可為與來自歐洲牛(Bos taurus) (牛)之角蛋白或角蛋白截短相當的全長或截短角蛋白多肽，包括例如以下NCBI蛋白質寄存編號：Q148H8.1、A0JND2.1、A7YWK3.1、Q5XQN5.1、A4FUZ0.1、Q148H4.1、Q148H7.1、Q29S21.1、P05786.3、Q148H5.1、Q08D91.1、A3KN27.1及A6QNX5.1
在某些較佳實施例中，本文提供之非天然存在之多肽的角蛋白區段與全長角蛋白或其截短或片段之對應區具有至少約70%、至少70%、至少約75%、至少75%、至少約80%、至少80%、至少約85%、至少85%、至少約90%、至少90%、至少約91%、至少91%、至少約92%、至少92%、至少約93%、至少93%、至少約94%、至少94%、至少約95%、至少95%、至少約96%、至少96%、至少約97%、至少97%、至少約98%、至少98%、至少約99%或至少99%序列一致性。在一些情況下，天然胺基酸序列之一或多個部分缺失，但序列之其餘部分實質上與天然胺基酸序列類似或一致。在某些較佳實施例中，非天然存在之多肽的角蛋白區段為來源於全長角蛋白之一部分，且序列一致性%係相對於全長角蛋白之對應區。
在一些實施例中，角蛋白區段為短於全長(例如天然)角蛋白的角蛋白多肽，其中不存在該全長(例如天然)角蛋白之一或多個部分(例如內部及/或末端部分)。在各種情況下，本文提供之非天然存在之多肽包含滿足如下之角蛋白，其在C端、N端截短、藉由移除全長角蛋白多肽之內部部分截短(例如內部截短)、在C端及N端兩處截短或包含C端截短及N端截短以及內部截短中之一者或兩者。在一些情況下，術語「截短角蛋白」可與術語「角蛋白片段」互換使用。在一些情況下，截短角蛋白包括為全長天然或天然存在之對應角蛋白的至少約10%、至少10%、至少約15%、至少15%、至少約20%、至少20%、至少約25%、至少25%、至少約30%、至少30%、至少約35%、至少35%、至少約40%、至少40%、至少約45%、至少45%、至少約50%、至少50%、至少約55%、至少55%、至少約60%、至少60%、至少約65%、至少65%、至少約70%、至少70%、至少約75%、至少75%、至少約80%、至少80%、至少約85%、至少85%、至少約90%、至少90%、至少約95%或至少95%的任何連續角蛋白胺基酸殘基。在一些情況下，截短角蛋白(例如K31)包括小於全長天然或天然存在之對應角蛋白(例如K31)的約15%、小於15%、小於約20%、小於20%、小於約25%、小於25%、小於約30%、小於30%、小於約35%、小於35%、小於約40%、小於40%、小於約45%、小於45%、小於約50%、小於50%、小於約55%、小於55%、小於約60%、小於60%、小於約65%、小於65%、小於約70%、小於70%、小於約75%或小於75%的任何連續角蛋白胺基酸殘基。截短角蛋白包括具有角蛋白多肽之至少25個胺基酸、至少30個胺基酸、至少35個胺基酸、至少40個胺基酸、至少45個胺基酸、至少50個胺基酸、至少55個胺基酸、至少60個胺基酸、至少65個胺基酸、至少70個胺基酸、至少75個胺基酸、至少80個胺基酸、至少85個胺基酸、至少90個胺基酸、至少95個胺基酸、至少100個胺基酸、至少110個胺基酸、至少120個胺基酸、至少130個胺基酸、至少140個胺基酸、至少150個胺基酸、至少160個胺基酸、至少170個胺基酸、至少180個胺基酸、至少190個胺基酸、至少200個胺基酸、至少210個胺基酸、至少220個胺基酸、至少230個胺基酸、至少240個胺基酸、至少250個胺基酸、至少260個胺基酸、至少270個胺基酸、至少280個胺基酸、至少290個胺基酸或至少300個胺基酸的多肽。
在一些實施例中，角蛋白多肽經製備成包含重組多肽之組合物，其中重組多肽包含與全長角蛋白之對應區具有至少約70%、至少70%、至少約75%、至少75%、至少約80%、至少80%、至少約85%、至少85%、至少約90%、至少90%、至少約91%、至少91%、至少約92%、至少92%、至少約93%、至少93%、至少約94%、至少94%、至少約95%、至少95%、至少約96%、至少96%、至少約97%、至少97%、至少約98%、至少98%、至少約99%或至少99%序列一致性的胺基酸序列，該全長角蛋白具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸的截短(亦即，截短角蛋白)。在較佳實施例中，重組多肽在藉由高效能液相層析或質譜分析量測時具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之純度(例如，在組合物中)。
本文提供之截短角蛋白可經截短(例如，總截短) 50個胺基酸至600個胺基酸、50個胺基酸至550個胺基酸、50個胺基酸至500個胺基酸、50個胺基酸至450個胺基酸、50個胺基酸至400個胺基酸、50個胺基酸至350個胺基酸、50個胺基酸至300個胺基酸、50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸或50個胺基酸至100個胺基酸(例如相對於全長角蛋白)。在另一個實施例中，截短角蛋白經截短至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸(例如相對於全長角蛋白)。
在一些實施例中，截短角蛋白可在C端經截短(相對於全長角蛋白)任何適合數目之胺基酸殘基，諸如10至600、10至550、10至500、10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、50至600、50至550、50至500、50至450、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100及其類似數目。在一些情況下，本文提供之截短角蛋白可在C端經截短(相對於全長角蛋白)至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸。
在一些實施例中，截短角蛋白可在N端經截短(相對於全長角蛋白)任何適合數目之胺基酸殘基，諸如10至600、10至550、10至500、10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、50至600、50至550、50至500、50至450、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100及其類似數目。在一些情況下，本文提供之截短角蛋白可在N端經截短(相對於全長角蛋白)至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸。
在一些實施例中，截短角蛋白可在N端及C端兩處經截短(相對於全長角蛋白)任何適合數目之組合胺基酸殘基，諸如10至600、10至550、10至500、10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、50至600、50至550、50至500、50至450、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100及其類似數目。在一些情況下，本文提供之截短角蛋白可具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸之組合N端及C端截短(相對於全長角蛋白)。
在一些實施例中，本文提供之截短角蛋白可具有50至100個胺基酸之N端截短及50至100個胺基酸之C端截短、50至100個胺基酸之N端截短及50至150個胺基酸之C端截短、50至100個胺基酸之N端截短及50至200個胺基酸之C端截短、50至100個胺基酸之N端截短及50至250個胺基酸之C端截短、50至100個胺基酸之N端截短及50至300個胺基酸之C端截短、50至100個胺基酸之N端截短及50至350個胺基酸之C端截短或50至100個胺基酸之N端截短及50至400個胺基酸之C端截短。
在一些實施例中，本文提供之截短角蛋白可具有50至100個胺基酸之C端截短及50至150個胺基酸之N端截短、50至100個胺基酸之C端截短及50至200個胺基酸之N端截短、50至100個胺基酸之C端截短及50至250個胺基酸之N端截短、50至100個胺基酸之C端截短及50至300個胺基酸之N端截短、50至100個胺基酸之C端截短及50至350個胺基酸之N端截短或50至100個胺基酸之C端截短及50至400個胺基酸之N端截短。
在一些實施例中，本文提供之截短角蛋白可具有50至250個胺基酸之N端截短及50至100個胺基酸之C端截短、50至250個胺基酸之N端截短及50至150個胺基酸之C端截短、50至250個胺基酸之N端截短及50至200個胺基酸之C端截短、50至250個胺基酸之N端截短及50至250個胺基酸之C端截短、50至250個胺基酸之N端截短及50至300個胺基酸之C端截短、50至250個胺基酸之N端截短及50至350個胺基酸之C端截短或50至250個胺基酸之N端截短及50至400個胺基酸之C端截短
在一些實施例中，本文提供之截短角蛋白可具有50至250個胺基酸之C端截短及50至100個胺基酸之N端截短、50至250個胺基酸之C端截短及50至150個胺基酸之N端截短、50至250個胺基酸之C端截短及50至200個胺基酸之N端截短、50至250個胺基酸之C端截短及50至250個胺基酸之N端截短、50至250個胺基酸之C端截短及50至300個胺基酸之N端截短、50至250個胺基酸之C端截短及50至350個胺基酸之N端截短或50至250個胺基酸之C端截短及50至400個胺基酸之N端截短。
在一些實施例中，截短角蛋白可在內部經截短(相對於全長角蛋白)任何適合數目之胺基酸殘基，10至600、10至550、10至500、10至450、10至400、10至350、10至300、10至250、10至200、10至150、10至100、50至600、50至550、50至500、50至450、50至400、50至350、50至300、50至250、50至200、50至150、50至100及其類似數目。在一些情況下，截短角蛋白可在內部經截短(相對於全長角蛋白)至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590或600個胺基酸。
在一些實施例中，角蛋白多肽可為截短K12、K31、K33a或K33b多肽。在某些實施例中，角蛋白多肽可為下文提供之序列或其片段。
具有179個胺基酸之截短人類角蛋白12型.
具有147個胺基酸之截短人類角蛋白31型(亦稱為1型角質層Ha1).
具有125個胺基酸之截短人類角蛋白31型(亦稱為1型角質層Ha1). .
具有100個胺基酸之截短人類角蛋白31型(亦稱為1型角質層Ha1).
具有75個胺基酸之截短人類角蛋白31型(亦稱為1型角質層Ha1).
具有50個胺基酸之截短人類角蛋白31型(亦稱為1型角質層Ha1).
具有147個胺基酸之截短人類角蛋白33a型(亦稱為1型角質層Ha31). 溶解度增進胺基酸序列
角蛋白多肽難以在重組系統，諸如經由傳統微生物系統，諸如大腸桿菌中表現。表現重組角蛋白之嘗試通常結果為不可溶角蛋白多肽，且表現角蛋白多肽之嘗試通常結果為包涵體。包涵體阻礙可溶性及功能性重組蛋白之生產，尤其在商業規模下之生產。本發明之方法提供克服重組系統，尤其微生物表現系統中之角蛋白表現問題的解決方案。然而，本發明之方法亦可適用於真核表現系統，諸如哺乳動物細胞中。在一個實施例中，本發明提供可與角蛋白多肽序列一起使用以產生重組非天然存在之多肽的溶解度增進胺基酸序列。
如本文提供之溶解度增進胺基酸序列(亦稱為「溶解度增進多肽」或「溶解度增進標籤」)可經許多類型的以重組方式產生之角蛋白表現以改善蛋白質表現、溶解度及/或純化。如本文中所示，可設計及使用多種溶解度增進序列，且可使用所揭示之方法表現多種目標多肽序列。
在一些實施例中，可使用溶解度增進胺基酸序列作為改善所關注多肽之溶解度的方法，該方法包含在溶解度增進胺基酸序列存在下表現所關注多肽，其中該溶解度增進胺基酸序列在長度上包含至少24個胺基酸且包含至少25% Gly胺基酸殘基，其中與在不存在溶解度增進胺基酸序列時相比，在存在溶解度增進胺基酸序列時，該所關注多肽之溶解度得以改善。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列具有至少15%選自由Asp、Glu、Arg、Ser及其組合組成之群的胺基酸殘基。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列具有Asp、Glu、Arg及Ser中之至少一者。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列具有小於15%選自由以下組成之群的胺基酸殘基：Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp、Tyr及其組合。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列具有小於15%之Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp及Tyr。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列無Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp及Tyr中之任一者。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列由(Gly-X-Y) n之三聯體胺基酸模式組成，其中X及Y為任何胺基酸殘基且n=8-300。在一些實施例中，至少一個(Gly-X-Y)三聯體、X及Y為相同胺基酸殘基。在一些實施例中，至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為不同胺基酸殘基。在一些實施例中，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體不同。在一些實施例中，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體相同。在一些實施例中，所關注多肽表現為與溶解度增進胺基酸序列之融合多肽。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列與所關注多肽之N端融合。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列與所關注多肽之C端融合。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列包含融合至所關注多肽之N端的第一溶解度增進胺基酸序列及融合至所關注多肽之C端的第二溶解度增進胺基酸序列。在一些實施例中，該溶解度增進胺基酸序列及該所關注多肽直接藉由肽鍵連接。在一些實施例中，該溶解度增進胺基酸序列及該所關注多肽經由連接序列連接。在一些實施例中，連接序列係選自由以下組成之群：可撓性連接子、剛性連接子及可裂解連接子。在一些實施例中，可裂解連接子包含蛋白酶裂解位。在一些實施例中，所關注多肽及溶解度增進胺基酸序列表現為分開的多肽。在一些實施例中，僅表現所關注多肽。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列與膠原蛋白多肽之片段具有至少80%序列一致性。在一些實施例中，膠原蛋白多肽為人類膠原蛋白多肽。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列與全長人類I型α1膠原蛋白多肽之對應區具有至少80%序列一致性且長度為至少50個胺基酸。在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列之長度為50-300個胺基酸。在一些實施例中，膠原蛋白多肽為非人類動物膠原蛋白多肽。在一些實施例中，該方法可進一步包含在培養基中培養宿主細胞，其中宿主細胞包含一或多個編碼以下之外源性聚核苷酸：(i)溶解度增進胺基酸序列；(ii)所關注多肽；或(iii)此兩者。在一些實施例中，宿主細胞表現溶解度增進胺基酸序列、所關注多肽或此兩者。在一些實施例中，宿主細胞以融合多肽形式表現溶解度增進胺基酸序列及所關注多肽。在一些實施例中，宿主細胞以分開的多肽形式表現溶解度增進胺基酸序列及所關注多肽。在一些實施例中，宿主細胞不表現溶解度增進胺基酸序列。在一些實施例中，該方法可進一步包含使溶解度增進胺基酸序列與所關注多肽分開，由此產生所關注目標多肽。在一些實施例中，該所關注多肽及該溶解度增進胺基酸序列表現為融合多肽，該融合多肽包含將該所關注多肽與該溶解度增進胺基酸序列連接的可裂解連接子，且該分開包含裂解該可裂解連接子以使該所關注多肽與該溶解度增進胺基酸序列分開。在一些實施例中，該方法可進一步包含自培養基回收所關注多肽。在一些實施例中，該方法可進一步包含純化所關注多肽。在一些實施例中，宿主細胞為微生物宿主細胞。在一些實施例中，微生物宿主細胞係細菌細胞。在一些實施例中，細菌細胞為大腸桿菌。在一些實施例中，所關注多肽不表現或不存在於包涵體中。在一些實施例中，宿主細胞係真核宿主細胞。在一些實施例中，真核宿主細胞係哺乳動物細胞。在一些實施例中，所關注多肽自宿主細胞分泌至培養基中。在一些實施例中，所關注多肽以可溶多肽形式存在於培養基中。
在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列可與角蛋白多肽融合，例如以增加或增進角蛋白多肽之表現、溶解度及/或純化。溶解度增進多肽融合物可尤其有助於改善對原本難以使用傳統方法純化其自身之多肽或蛋白質的純化。在一個實施例中，與本文提供之溶解度增進標籤一起表現之角蛋白胺基酸序列在低pH下提供增加之溶解度。當根據本文中之方法使角蛋白多肽表現且分泌至培養基中時，可隨後將培養基酸化至致使污染蛋白質「破裂(crash out)」或沈澱，同時使角蛋白多肽留在溶液中之pH水平。由此提供純化角蛋白多肽之簡單純化步驟。在另一實施例中，與本文提供之溶解度增進標籤一起表現之角蛋白序列在不同範圍之鹽，諸如硫酸銨下呈現微差沈澱(differential precipitation)。此提供不同且簡單的純化方法。在另一實施例中，根據本文中之方法使角蛋白多肽表現且分泌於培養基中，可隨後使培養基經歷致使污染蛋白質沈澱，同時使角蛋白多肽留在溶液中之溫度梯度。
在較佳實施例中，溶解度增進胺基酸序列由(Gly-X-Y) n之三聯體胺基酸模式組成，其中Gly表示胺基酸甘胺酸，且X及Y各自表示任何胺基酸殘基。在一些情況下，X及Y可為相同胺基酸殘基。在其他情況下，X及Y可為不同胺基酸殘基。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為相同胺基酸殘基。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為不同胺基酸殘基。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體不同。在一些情況下，至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體相同。存在於Gly-X-Y三聯體中之胺基酸殘基可為以下中之任一者：蛋白質中天然存在之標準胺基酸殘基，及/或蛋白質中非天然不存在之任何非標準胺基酸殘基，及/或任何經修飾之胺基酸殘基。
三聯體模式(Gly-X-Y)用任何匹配Gly-X-Y模式之三聯體重複「n」次，其中n為至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300。在其他較佳實施例中，三聯體模式重複「n」次，其中n為3-10、3-15、3-20、5-10、5-15、5-20、10-15、10-20、15-20、10-100、15-100、20-100、25-100、30-100、35-100、40-100、45-100、50-100、55-100、60-100、65-100、70-100、75-100、80-100、85-100、90-100、95-100、10-200、15-200、20-200、25-200、30-200、35-200、40-200、45-200、50-200、55-200、60-200、65-200、70-200、75-200、80-200、85-200、90-200、95-200、100-200、110-200、120-200、130-200、140-200、150-200、160-200、170-200、180-200、190-200、20-80、25-80、30-80、35-80、40-80、45-80、50-80、55-80、60-80、65-80、70-80、75-80、20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、8-300、10-300、20-300、30-300、40-300、50-300、60-300、70-300、80-300、90-300、100-300、110-300、120-300、130-300、140-300、150-300、160-300、170-300、180-300、190-300或200-300。應理解，「n」可變化以最大化溶解度增進功能，且「n」可為3與300之間的任何整數，或任何具有最小數3至最大數300的範圍。
在某些實施例中，溶解度增進功能可例如藉由減少包涵體中存在之多肽、藉由增加分泌至培養基中之多肽、藉由改變多肽之結構特性或摺疊及其類似方法來在表現階段中提供增加的可溶多肽含量。在其他實施例中，溶解度增進功能可例如藉由以下方法在純化階段中提供增加的可溶多肽含量：在自培養基分離細胞後增加相對於細胞集結粒部分的可溶上清液部分中存在之多肽；在純化步驟後增加可溶部分中存在之多肽，該純化步驟具有各種過濾步驟、各種化學分離步驟、各種物理分離步驟、各種用於分離多肽部分之處理，例如用酸或鹼處理以改變pH，或用各種鹽處理以改變離子組合物及其類似方法；或在任何此類處理期間減少多肽之沈澱(例如由不溶性引起)。因此，可根據本文提供之方法藉由測試與目標蛋白組合之各種溶解度增進胺基酸序列來改善溶解度增進功能，該目標蛋白在根據本文提供之方法用於目標蛋白的典型表現及純化之情形下表現。
在某些實施例中，可根據本文提供之三聯體模式完全重新設計溶解度增進胺基酸序列。在其他實施例中，溶解度增進胺基酸序列可衍生自天然存在之序列，諸如膠原蛋白多肽或其片段，其中維持所得溶解度增進胺基酸序列三聯體模式。在某些實施例中，溶解度增進胺基酸序列為天然存在之膠原蛋白多肽之子序列，其與全長膠原蛋白多肽之對應區具有至少約40%、至少40%、至少約50%、至少50%、至少約60%、至少60%、至少約70%、至少70%、至少約75%、至少75%、至少約80%、至少80%、至少約85%、至少85%、至少約90%、至少90%、至少約91%、至少91%、至少約92%、至少92%、至少約93%、至少93%、至少約94%、至少94%、至少約95%、至少95%、至少約96%、至少96%、至少約97%、至少97%、至少約98%、至少98%、至少約99%或至少99%序列一致性。
在某些實施例中，溶解度增進胺基酸之長度為60-300個胺基酸、60-291個胺基酸、60-282個胺基酸、60-273個胺基酸、60-264個胺基酸、60-255個胺基酸、60-246個胺基酸、60-237個胺基酸、60-228個胺基酸、60-219個胺基酸、60-210個胺基酸、60-201個胺基酸、60-192個胺基酸、60-183個胺基酸、60-174個胺基酸、60-165個胺基酸、60-156個胺基酸、60-147個胺基酸、60-138個胺基酸、60-129個胺基酸、60-120個胺基酸、60-111個胺基酸、60-102個胺基酸、60-93個胺基酸、60-84個胺基酸或60-75個胺基酸。在某些實施例中溶解度增進胺基酸殘基之此長度對應於天然存在之膠原蛋白多肽之子區段。
在某些實施例中，溶解度增加胺基酸之長度為9-99個胺基酸、9-96個胺基酸、9-93個胺基酸、9-90個胺基酸、9-87個胺基酸、9-84個胺基酸、9-81個胺基酸、9-78個胺基酸、9-75個胺基酸、9-72個胺基酸、9-69個胺基酸、9-66個胺基酸、9-63個胺基酸、9-60個胺基酸、9-57個胺基酸、9-54個胺基酸、9-51個胺基酸、9-48個胺基酸、9-45個胺基酸、9-42個胺基酸、9-39個胺基酸、9-36個胺基酸、9-33個胺基酸、9-30個胺基酸、9-27個胺基酸、9-24個胺基酸、9-21個胺基酸、9-18個胺基酸、9-15個胺基酸，或9-12個胺基酸。此類長度可尤其適用於增加較短目標多肽或肽之溶解度。
在某些較佳實施例中，溶解度增加胺基酸序列之長度為至少9個胺基酸、至少12個胺基酸、至少15個胺基酸、至少18個胺基酸、至少21個胺基酸、至少24個胺基酸、至少27個胺基酸、至少30個胺基酸、至少33個胺基酸、至少36個胺基酸、至少39個胺基酸、至少42個胺基酸、至少45個胺基酸、至少48個胺基酸、至少51個胺基酸、至少54個胺基酸、至少57個胺基酸、至少60個胺基酸、至少63個胺基酸、至少66、至少69個胺基酸、至少72個胺基酸、至少75個胺基酸、至少78個胺基酸、至少81個胺基酸、至少84個胺基酸、至少87個胺基酸、至少90個胺基酸、至少93個胺基酸、至少96個胺基酸、至少99個胺基酸、至少102個胺基酸、至少105個胺基酸、至少108個胺基酸、至少111個胺基酸、至少114個胺基酸、至少117個胺基酸、至少120個胺基酸、至少123個胺基酸、至少126個胺基酸、至少129個胺基酸、至少132個胺基酸、至少135個胺基酸、至少138個胺基酸、至少141個胺基酸、至少144個胺基酸、至少147個胺基酸、至少150個胺基酸、至少153個胺基酸、至少156個胺基酸、至少159個胺基酸、至少162個胺基酸、至少165個胺基酸、至少168個胺基酸、至少171個胺基酸、至少174個胺基酸、至少177個胺基酸、至少180個胺基酸、至少183、至少186個胺基酸、至少189個胺基酸、至少192個胺基酸、至少195個胺基酸、至少198個胺基酸、至少201個胺基酸、至少204個胺基酸、至少207個胺基酸、至少210個胺基酸、至少213個胺基酸、至少216個胺基酸、至少219個胺基酸、至少222個胺基酸、至少225個胺基酸、至少228個胺基酸、至少231個胺基酸、至少234個胺基酸、至少237個胺基酸、至少240個胺基酸、至少243個胺基酸、至少246個胺基酸、至少249個胺基酸、至少252個胺基酸、至少255個胺基酸、至少258個胺基酸、至少261個胺基酸、至少264個胺基酸、至少267個胺基酸、至少270個胺基酸、至少273個胺基酸、至少276個胺基酸、至少279個胺基酸、至少282個胺基酸、至少285個胺基酸、至少288個胺基酸、至少291個胺基酸、至少294個胺基酸、至少297個胺基酸，或至少300個胺基酸。在某些實施例中，此長度之溶解度增加胺基酸殘基對應於天然存在之膠原蛋白多肽之子區段。
膠原蛋白為存在於體內，包括肌腱、韌帶、皮膚及毛髮中的各種結締組織中之豐富蛋白質。膠原蛋白或膠原蛋白補充劑在醫學、化妝及/或健康用途(例如刺激皮膚生長、促進傷口癒合、強化指甲或關節等)方面流行。天然膠原蛋白之結構可為三螺旋，其中三個多肽股共同形成螺旋線圈。個別多肽股由命名為GLY-X-Y之重複三聯體胺基酸序列構成，其中X及Y可為任何胺基酸，且第一胺基酸為甘胺酸。在膠原蛋白中發現呈高濃度之胺基酸脯胺酸及羥脯胺酸。天然存在之膠原蛋白中最常見的三聯體為甘胺酸-脯胺酸-羥脯胺酸(Gly-Pro-Hyp)，佔膠原蛋白中之三聯體之大致10.5%。
在某些實施例中，溶解度增進胺基酸殘基對應於天然存在之膠原蛋白多肽之子區段。在某些較佳實施例中，膠原蛋白為人類膠原蛋白。在其他實施例中，膠原蛋白為動物膠原蛋白，諸如雞膠原蛋白。例示性膠原蛋白描述於表4中。 表 4 . 例示性膠原蛋白類型 .
膠原蛋白分類    膠原蛋白類型
纖維型    I, II, III, V, XI
非纖維型 具有中斷的三重螺旋之小纖維相關膠原蛋白(FACIT) IX, XII, XIV, XIX, XXI
非纖維型 短鏈 VIII, X
非纖維型 基底膜 IV
非纖維型 有中斷之多個三重螺旋域-多工(multiplexin) XV, XVIII
非纖維型 微纖維形成 VI
非纖維型 錨定原纖維 VII
各種人類膠原蛋白類型之成員之例示性序列及描述藉由下表5中所提供之UniProt知識庫(KB)識別符可見。在uniprot.org/uniprot/上可獲得UniProtKB。其他適合的膠原蛋白序列在此項技術中可容易地被鑑別出。 表 5 . 例示性人類膠原蛋白 .
UniProtKB識別符 登錄名稱 蛋白質名稱 基因名稱 長度
P02452 CO1A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(I)鏈(α-1 I型膠原蛋白) COL1A1 1464
P08123 CO1A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(I)鏈(α-2 I型膠原蛋白) COL1A2 1366
P02458 CO2A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(II)鏈(α-1 II型膠原蛋白) [裂解成：膠原蛋白α-1(II)鏈；軟骨鈣結合蛋白(Chondrocalcin)] COL2A1 1487
P02461 CO3A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(III)鏈 COL3A1 1466
P02462 CO4A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(IV)鏈[裂解成：Arresten] COL4A1 1669
P08572 CO4A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(IV)鏈[裂解成：血管能抑素(Canstatin)] COL4A2 1712
Q01955 CO4A3_HUMAN 膠原蛋白α-3(IV)鏈(古巴士德氏症(Goodpasture)抗原) [裂解成：腫瘤抑素(Tumstatin)] COL4A3 1670
P53420 CO4A4_HUMAN 膠原蛋白α-4(IV)鏈 COL4A4 1690
P29400 CO4A5_HUMAN 膠原蛋白α-5(IV)鏈 COL4A5 1685
Q14031 CO4A6_HUMAN 膠原蛋白α-6(IV)鏈 COL4A6 1691
P20908 CO5A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(V)鏈 COL5A1 1838
P05997 CO5A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(V)鏈 COL5A2 1499
P25940 CO5A3_HUMAN 膠原蛋白α-3(V)鏈 COL5A3 1745
P12109 CO6A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(VI)鏈 COL6A1 1028
P12110 CO6A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(VI)鏈 COL6A2 1019
P12111 CO6A3_HUMAN 膠原蛋白α-3(VI)鏈 COL6A3 3177
A8TX70 CO6A5_HUMAN 膠原蛋白α-5(VI)鏈(膠原蛋白α-1(XXIX)鏈) (含馮威里氏因子(von Willebrand factor) A域之蛋白4) COL6A5 COL29A1 VWA4 2615
A6NMZ7 CO6A6_HUMAN 膠原蛋白α-6(VI)鏈 COL6A6 2263
Q02388 CO7A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(VII)鏈(長鏈膠原蛋白) (LC膠原蛋白) COL7A1 2944
P27658 CO8A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(VIII)鏈(內皮膠原蛋白) [裂解成：Vastatin] COL8A1 C3orf7 744
P25067 CO8A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(VIII)鏈(內皮膠原蛋白) COL8A2 703
P20849 CO9A1_HUMAN 膠原蛋白α-1(IX)鏈 COL9A1 921
Q14055 CO9A2_HUMAN 膠原蛋白α-2(IX)鏈 COL9A2 689
Q14050 CO9A3_HUMAN 膠原蛋白α-3(IX)鏈 COL9A3 684
Q03692 COAA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(X)鏈 COL10A1 680
P12107 COBA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XI)鏈 COL11A1 COLL6 1806
P13942 COBA2_HUMAN 膠原蛋白α-2(XI)鏈 COL11A2 1736
Q99715 COCA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XII)鏈 COL12A1 COL12A1L 3063
Q5TAT6 CODA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XIII)鏈(COLXIIIA1) COL13A1 717
Q05707 COEA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XIV)鏈(粗纖維調節素(Undulin)) COL14A1 UND 1796
P39059 COFA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XV)鏈[裂解成：休眠蛋白(Restin) (內皮抑素-XV) (與內皮抑素相關) (休眠蛋白-I)；休眠蛋白-2 (休眠蛋白-II)；休眠蛋白-3 (休眠蛋白-III)；休眠蛋白-4 (休眠蛋白-IV)] COL15A1 1388
Q07092 COGA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XVI)鏈 COL16A1 FP1572 1604
Q9UMD9 COHA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XVII)鏈(180 kDa大皰性類天疱瘡抗原2) (大皰性類天疱瘡抗原2) [裂解成：120 kDa線狀IgA病抗原(120 kDa線狀IgA皮膚病抗原) (線狀IgA病抗原1) (LAD-1)；97 kDa線狀IgA病抗原(97 kDa線狀IgA大皰性皮膚病抗原) (97 kDa LAD抗原) (97-LAD) (97 kDa線狀IgA大皰病抗原) (LABD97)] COL17A1 BP180 BPAG2 1497
P39060 COIA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XVIII)鏈[裂解成：內皮抑素；非膠原域1 (NC1)] COL18A1 1754
Q14993 COJA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XIX)鏈(膠原蛋白α-1(Y)鏈) COL19A1 1142
Q9P218 COKA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XX)鏈 COL20A1 KIAA1510 1284
Q96P44 COLA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXI)鏈 COL21A1 COL1AL FP633 957
Q8NFW1 COMA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXII)鏈 COL22A1 1626
Q86Y22 CONA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXIII)鏈 COL23A1 540
Q17RW2 COOA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXIV)鏈 COL24A1 1714
Q9BXS0 COPA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXV)鏈(阿茲海默症澱粉樣相關蛋白) (AMY) (CLAC-P) [裂解成：膠原蛋白樣阿茲海默症澱粉樣斑塊成分(CLAC)] COL25A1 654
Q96A83 COQA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXVI)鏈(α-1型XXVI膠原蛋白) (含EMI域之蛋白2) (含彈性蛋白微纖維界面蛋白(Emilin)及多聚蛋白(multimerin)域之蛋白2) (Emu2) COL26A1 EMID2 EMU2 441
Q8IZC6 CORA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXVII)鏈 COL27A1 KIAA1870 1860
Q2UY09 COSA1_HUMAN 膠原蛋白α-1(XXVIII)鏈 COL28A1 COL28 1125
在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列可衍生自人類I型α1膠原蛋白多肽、人類I型α2膠原蛋白多肽、人類21型α1膠原蛋白多肽、雞21型膠原蛋白多肽或人類III型α1膠原蛋白多肽或其中任一者之截短或片段，或基於與其任何全長多肽之區域之一致性%的類似序列。在某些實施例中，膠原蛋白多肽可衍生自以下提供之序列、同系物或其片段。
人類全長膠原蛋白21型α1 (957 aa) (NCBI AAI43866.1)：
人類全長膠原蛋白I型α1 (1464 aa) (NCBI AAH36531.1)：
人類全長膠原蛋白I型α2 (1366 aa) (NCBI AAH42586.1)
人類全長膠原蛋白III型α1 (1466 aa) (NCBI AGL34959.1)
原雞(雞) 21型α1全長膠原蛋白(957 aa) (XP_004940520.2)
在某些實施例中，溶解度增進胺基酸殘基對應於天然存在之膠原蛋白多肽之子區段。以下提供之胺基酸序列或其片段可適用作例示性溶解度增進胺基酸序列：
來自原雞(雞)的具有211個胺基酸的截短膠原蛋白21型α1多肽.
來自原雞(雞)的具有188個胺基酸的截短膠原蛋白21型α1多肽. (GL21)
來自原雞(雞)的具有141個胺基酸的截短膠原蛋白21型α1多肽. (GL21) ).
來自原雞(雞)的具有93個胺基酸的截短膠原蛋白21型α1多肽. (GL21) .
來自原雞(雞)的具有47個胺基酸的截短膠原蛋白21型α1多肽. (GL21) .
來自施氏鱘( Acipenser schrenckii) (日本鱘魚)的具有199個胺基酸的截短膠原蛋白II型α1多肽.
具有187個胺基酸的截短人類膠原蛋白21型α1.
具有200個胺基酸的截短人類膠原蛋白III型α1.
具有262個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. (HsCol1a1-27)
具有225個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. (Cdel15) .
具有219個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1：
具有196個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. (Cdel25) .
具有130個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. (Cdel50) .
具有64個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. (Cdel75) .
具有25個胺基酸的截短人類膠原蛋白I型α1. 。
在一些態樣中，本文提供之非天然存在之多肽的溶解度增進區段可含有或可不含有一或多個來自天然膠原蛋白之域(例如，馮威里氏因子(vWA)域、層黏連蛋白G域、纖維狀膠原蛋白C端域)。在一些態樣中，本文提供之非天然存在之多肽的溶解度增進區段可含有一或多個膠原蛋白三重螺旋重複域。
在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列以與角蛋白多肽之胺基酸融合物形式存在。在其他實施例中，溶解度增進胺基酸序列可在同一細胞中表現，但表現為與角蛋白多肽分開的蛋白質，例如來自不同核苷酸序列及/或不同表現載體。因此，儘管其不融合至一個蛋白質中，但在醱酵後培養液中存在溶解度增進序列以及角蛋白多肽可例如經由分子內締合幫助角蛋白多肽溶解。
在其他實施例中，分開製備溶解度增進胺基酸序列，且隨後將其添加至含有角蛋白多肽之溶液中以增加其溶解度特性。添加溶解度增進多肽可用於增加角蛋白多肽在儲存期間的穩定性。
在另一實施例中，分開製備溶解度增進胺基酸序列及角蛋白多肽，但在分離、純化或調配過程期間之某個時刻將其融合。可使用任何適合之融合方法。融合可存在於兩個多肽之胺基酸側鏈之間，或可來自例如分子內肽鍵或N端與C端胺基酸殘基之間的醯胺鍵。可使用化學交聯方法。溶解度增進胺基酸序列因此可有助於角蛋白多肽在其製備之多個階段溶解。
在另一實施例中，溶解度增進胺基酸序列除其增加角蛋白多肽之溶解度的能力之外，亦可具有額外的次功能。次功能可為例如能夠將所關注蛋白質結合至另一部分，諸如另一蛋白質、基板、表面、金屬、紙、過濾器、活體內或離體骨架、塑膠、容器表面、純化標籤、螢光標籤、化合物、有機基質及其類似物。次功能可為可逆的，或其可為不可逆的。次功能可例如藉由特定變化，諸如鹽、pH、溫度或其他化合物之存在來誘導。
在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列及角蛋白多肽之融合蛋白可具有來源於溶解度增進胺基酸序列及角蛋白多肽兩者的有用特性。此類功能可為互補或協同的，例如用作個人護理產品之組合物中的膠原蛋白與角蛋白之組合。 包含溶解度增進胺基酸序列及角蛋白衍生之目標胺基酸序列的多肽
在本發明之一些實施例中，非天然存在之多肽包含溶解度增進胺基酸序列及衍生自角蛋白多肽之目標胺基酸序列。在某些實施例中，溶解度增進胺基酸及目標胺基酸序列藉由肽鍵直接連接，例如作為融合蛋白。如本文所提供，相較於目標蛋白自身，溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之組合使得表現、分離及純化目標蛋白之容易度增加。
在一些實施例中，溶解度增進胺基酸序列包含至少9個胺基酸、至少12個胺基酸、至少15個胺基酸、至少18個胺基酸、至少21個胺基酸、至少24個胺基酸、至少27個胺基酸、至少30個胺基酸、至少33個胺基酸、至少36個胺基酸、至少39個胺基酸、至少42個胺基酸、至少45個胺基酸、至少48個胺基酸、至少51個胺基酸、至少54個胺基酸、至少57個胺基酸、至少60個胺基酸、至少63個胺基酸、至少66、至少69個胺基酸、至少72個胺基酸、至少75個胺基酸、至少78個胺基酸、至少81個胺基酸、至少84個胺基酸、至少87個胺基酸、至少90個胺基酸、至少93個胺基酸、至少96個胺基酸、至少99個胺基酸、至少102個胺基酸、至少105個胺基酸、至少108個胺基酸、至少111個胺基酸、至少114個胺基酸、至少117個胺基酸、至少120個胺基酸、至少123個胺基酸、至少126個胺基酸、至少129個胺基酸、至少132個胺基酸、至少135個胺基酸、至少138個胺基酸、至少141個胺基酸、至少144個胺基酸、至少147個胺基酸、至少150個胺基酸、至少153個胺基酸、至少156個胺基酸、至少159個胺基酸、至少162個胺基酸、至少165個胺基酸、至少168個胺基酸、至少171個胺基酸、至少174個胺基酸、至少177個胺基酸、至少180個胺基酸、至少183、至少186個胺基酸、至少189個胺基酸、至少192個胺基酸、至少195個胺基酸、至少198個胺基酸、至少201個胺基酸、至少204個胺基酸、至少207個胺基酸、至少210個胺基酸、至少213個胺基酸、至少216個胺基酸、至少219個胺基酸、至少222個胺基酸、至少225個胺基酸、至少228個胺基酸、至少231個胺基酸、至少234個胺基酸、至少237個胺基酸、至少240個胺基酸、至少243個胺基酸、至少246個胺基酸、至少249個胺基酸、至少252個胺基酸、至少255個胺基酸、至少258個胺基酸、至少261個胺基酸、至少264個胺基酸、至少267個胺基酸、至少270個胺基酸、至少273個胺基酸、至少276個胺基酸、至少279個胺基酸、至少282個胺基酸、至少285個胺基酸、至少288個胺基酸、至少291個胺基酸、至少294個胺基酸、至少297個胺基酸或至少300個胺基酸；且角蛋白多肽包含角蛋白多肽之至少25個胺基酸、至少30個胺基酸、至少35個胺基酸、至少40個胺基酸、至少45個胺基酸、至少50個胺基酸、至少55個胺基酸、至少60個胺基酸、至少65個胺基酸、至少70個胺基酸、至少75個胺基酸、至少80個胺基酸、至少85個胺基酸、至少90個胺基酸、至少95個胺基酸、至少100個胺基酸、至少110個胺基酸、至少120個胺基酸、至少130個胺基酸、至少140個胺基酸、至少150個胺基酸、至少160個胺基酸、至少170個胺基酸、至少180個胺基酸、至少190個胺基酸、至少200個胺基酸、至少210個胺基酸、至少220個胺基酸、至少230個胺基酸、至少240個胺基酸、至少250個胺基酸、至少260個胺基酸、至少270個胺基酸、至少280個胺基酸、至少290個胺基酸或至少300個胺基酸。
在某些實施例中，溶解度增進胺基酸序列及目標胺基酸序列經由連接序列連接。如此項技術中已知，此連接序列可為可撓性連接子、剛性連接子或可裂解連接子。剛性連接子之實例為Pro ( 6 )或「聚脯胺酸」連接子系統。此類型之連接子允許多肽區段彼此物理上分開。亦可使用可撓性連接子。適合的可撓性連接子之兩個實例為二肽序列Gly-Ser以及(GGGGS) 3(SEQ ID NO: 32)。兩個多肽區段之間的連接子亦可為可裂解的，例如含有蛋白酶裂解序列。
在某些實施例中，非天然存在之多肽可進一步包含提供額外功能之額外胺基酸序列，諸如純化標籤(例如組胺酸標籤)、標記或偵測標籤(例如螢光標籤或其結合位)、結合標籤(例如抗體結合位)、分泌標籤及其類似物。任何適合之分泌信號序列(例如，疏水性信號傳導肽、Sec信號肽、Tat信號肽等)可誘導非天然存在之多肽分泌至周質及/或細胞外空間(例如，當在重組宿主細胞中產生時)。例示性分泌信號序列包括具有SEQ ID NO: 37、39、41、43、45、47、49、51、53及55中之任一者之胺基酸序列的肽。分泌信號序列較佳位於非天然存在之多肽的N端。然而，經考慮，分泌信號序列可位於N端以外的保持分泌信號序列功能性之地方。
在一些實施例中，非天然存在之多肽包含蛋白酶裂解位。蛋白酶裂解位可適用於例如自目標胺基酸序列分離或移除溶解度增進胺基酸序列。此可藉由例如在自培養基回收多肽之後，使多肽與對應於多肽中之蛋白酶裂解位的蛋白酶接觸來進行。蛋白酶裂解位亦可用於移除如本文提供之某些添加之胺基酸序列，諸如有助於產生蛋白質、有助於純化製程之胺基酸序列或其他序列。蛋白酶可包含內切蛋白酶、外切蛋白酶、絲胺酸蛋白酶、半胱胺酸蛋白酶、蘇胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、麩胺酸蛋白酶及金屬蛋白酶。例示性蛋白酶裂解位包括藉由凝血酶、菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶、因子Xa、腸肽酶、鼻病毒3C蛋白酶及其類似物裂解之胺基酸。
例示性蛋白酶裂解系統為TEV蛋白酶系統。TEV蛋白酶識別特定胺基酸序列ENLYFQS (SEQ ID NO: 33)或ENLYFQG (SEQ ID NO: 34)。當用TEV蛋白酶處理時，含有此特異性胺基酸序列之蛋白質在以上識別位點之Q與G/S殘基之間裂解。另一例示性蛋白酶裂解系統為腸激酶裂解系統。腸激酶為高度特異性絲胺酸蛋白酶，其識別特定胺基酸序列DDDDKX (SEQ ID NO: 35)且在K與X殘基之間裂解含有此類序列之蛋白質(其中X為任何胺基酸)。類似商業上製備之蛋白酶系統為此項技術中熟知，諸如FLAG ®蛋白質表現系統(Sigma, St. Louis, Missouri)。
例示性純化胺基酸序列為組胺酸標籤，其為可輔助重組蛋白之純化的胺基酸親和力標籤系統。組胺酸標籤通常由所關注蛋白質之任一端處之6-10個連續組胺酸殘基構成，通常由蛋白酶裂解位分開。組胺酸殘基藉由容易地結合於固定於珠粒上之某些金屬陽離子(諸如Ni 2 +或Co 2 +)或用於純化之樹脂而實現蛋白質之低成本但快速的純化。不合需要之蛋白質及其他雜質可自該系統中快速洗出，且接著含有組胺酸標籤之經結合蛋白質可經溶離。組胺酸標籤序列可隨後視需要(諸如藉由蛋白酶裂解位)移除，或其可保留於最終蛋白質上。
在一些實施例中，分泌標籤為分泌信號序列，其使重組宿主細胞將多肽分泌至培養基中。在一些實施例中，分泌標籤為分泌信號序列，其使重組宿主細胞將多肽分泌至周質中。在一些實施例中，分泌標籤為分泌信號序列，其使重組宿主細胞將多肽分泌至細胞外空間。可使用之例示性分泌標籤包括例如DsbA、PelB、OmpA、TolB、MalE、lpp、TorA或HylA、DegP、Skp(Ec)、PhoE、NucB、DegP(Rn)、DsbA(Ec)、LamB、eco、OmpF、PhoA、TolB信號序列及其類似者。類似分泌標籤可易於見於此項技術中，且與各別宿主配對，例如，如此項技術中已知的用於在酵母宿主細胞系統中表現及分泌的酵母分泌標籤。
以下揭示編碼Skp(Ec)分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼PhoE分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼NucB分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼DegP(Rn)分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼DsbA(Ec)分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼LamB分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼eco分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼OmpF分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼PhoA分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
以下揭示編碼TolB分泌序列之核苷酸序列：
對應於以上核苷酸序列之胺基酸序列為：
在某些實施例中，非天然存在之多肽包含溶解度增進胺基酸序列，其為截短膠原蛋白多肽及角蛋白衍生之目標胺基酸序列。此組合之例示性序列提供於下。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白12型多肽(K12，179個胺基酸)：
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)：
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白33a型多肽(K33，147個胺基酸)：
截短人類膠原蛋白III型α1多肽(200個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(225個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(196個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(130個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短雞膠原蛋白21型多肽(188個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短雞膠原蛋白21型多肽(141個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短雞膠原蛋白21型多肽(93個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短雞膠原蛋白21型多肽(47個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，100個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，75個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(262個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，50個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(196個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，100個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(196個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，50個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(64個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，100個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(64個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，50個胺基酸)： 。
截短人類膠原蛋白I型α1多肽(25個胺基酸)及截短角蛋白31型多肽(K31，147個胺基酸)： 。
在某些實施例中，溶解度增進胺基酸序列長度與目標胺基酸序列長度(經相對胺基酸長度所量測)之比率可變化。舉例而言，溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之比率可為至少15:1、至少14:1、至少13:1、至少12:1、至少11:1、至少10:1、至少9:1、至少8:1、至少7:1、至少6:1、至少5:1、至少4:1、至少3:1、至少2:1、至少1.5:1、至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:3或至少1:4。溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之比率可為例如約4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、1:1、1:1.25、1:1.5或1:2。在某些實施例中，溶解度增進胺基酸序列相對於目標胺基酸序列之比率為1:1至1.25:1、1:1至1.5:1、1:1至1.75、1:1至2:1、1:1至2.25:1、1:1至2.5:1、1:1至2.75:1、1:1至3:1、1:1、to 3.25:1、1:1至3.5:1、1:1至3.75:1、1:1至4:1、1:1至4.25:1、1:1至4.5:1、1:1至4.75:1、1:1至5:1、1.5:1至1.75:1、1.5:1至2:1、1.5:1至2.25:1、1.5:1至2.5:1、1.5:1至2.75:1、1.5:1至3:1、1.5:1至3.25:1、1.5:1至3.5:1、1.5:1至3.75:1、1.5:1至4:1、1.5:1至4.25:1、1.5:1至4.5:1、1.5:1至4.75:1、1.5:1至5:1、2:1至2.25:1、2:1至2.5:1、2:1至2.75:1、2:1至3:1、2:1至3.25:1、2:1至3.5:1、2:1至3.75:1、2:1至4:1、2:1至4.25:1、2:1至4.5:1、2:1至4.75:1、2:1至5:1、2.5:1至3:1、2.5:至3.25:1、2.5:至3.5:1、2.5:至3.75:1、2.5:至4:1、2.5:至4.25:1、2.5:至4.5:1、2.5:至5:1、3:1至3.25:1、3:1至3.5:1、3:1至3.75:1、3:1至4:1、3:1至4.25:1、3:1至4.5:1、3:1至4.75:1、3:1至5:1、3.5:1至3.75:1、3.5:1至4:1、3.5:1至4.25:1、3.5:1至4.5:1、3.5:1至4.75:1、3.5:1至5:1、4:1至4.25:1、4:1至4.5:1、4:1至4.75:1、4:1至5:1、4.5:1至4.75:1、4.5:1至5:1。在某些實施例中，溶解度增進胺基酸序列與目標胺基酸序列之比率愈高，給定融合蛋白在低pH下可溶的可能性愈大。此可能變化，例如視諸如目標胺基酸序列之類型及溶解度特性、溶解度增進胺基酸序列之胺基酸含量的變化、對目標序列中胺基酸之轉譯後修飾之存在、分離混合物之pH、混合物中污染物之存在(及量)、混合物之鹽度、額外助溶劑之存在及混合物之溫度等因素而定。
在一些實施例中，非天然存在之多肽可包括以任何順序排列的一或多個溶解度增進胺基酸序列(S)以及一或多個角蛋白衍生之胺基酸序列(K)。舉例而言，S-K、K-S、S-K-S、K-S-K等。在某些實施例中，非天然存在之多肽可包括一或多個溶解度增進胺基酸序列，該一或多個溶解度增進胺基酸序列為以任何順序排列的截短膠原蛋白多肽(C)以及一或多個角蛋白衍生之目標胺基酸序列(K)。舉例而言，C-K、K-C、C-K-C、K-C-K等。此等序列可經由如本文提供之連接序列直接連接或組合。 包含溶解度增進胺基酸序列及 角蛋白衍生之 目標胺基酸序列的多肽之表現及純化
載體 .可經由編碼非天然存在之多肽的核酸序列表現或產生如本文所述之非天然存在之多肽。因此，本發明之另一態樣包括載體，例如表現載體，其包含編碼非天然存在之多肽的核酸序列。在一些實施例中，表現載體為細菌表現載體。在一些實施例中，表現載體為酵母表現載體。在一些實施例中，表現載體為昆蟲細胞表現載體。在其他實施例中，表現載體為哺乳動物表現載體或病毒轉染載體。可誘導來自編碼非天然存在之多肽的插入核酸之蛋白質表現的任何適合的表現載體可用於對應宿主細胞中。例示性細菌表現載體可包括pGEX載體，其中麩胱甘肽S-轉移酶用作融合搭配物且基因表現處於tac啟動子之控制下；或pET載體(例如pET28載體等)，其使用T7啟動子。例示性酵母表現載體可包括pPIC載體，其使用甲醇可誘導之AOX1啟動子。例示性哺乳動物細胞表現載體可包括pcDNA TM3.1 (+)載體，其使用巨細胞病毒(CMV)強化子-啟動子元件；pcDNA TM5/TO載體，其使用CMV強化子-啟動子元件偶合以用於四環素調節之表現的四環素抗性操縱子；或慢病毒或反轉錄病毒表現載體，其可依賴於強組成型EF-1α啟動子。在一些實施例中，表現載體呈質體形式(例如包括細菌人工染色體形式等)，其獨立地存在於宿主細胞(例如表現重組多肽之細胞)中。在一些實施例中，表現載體經由隨機或靶向整合而穩定整合至宿主細胞之染色體中。
在一些實施例中，表現載體可包括一或多種選拔劑。選拔劑包括某些糖(包括含有半乳糖之糖)或抗生素(包括安比西林(ampicillin)、潮黴素、G418及其他)。用於賦予選拔劑抗性之酶包括氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)或β-內醯胺酶。替代地及/或另外，表現載體包括誘導型啟動子或組成型啟動子(例如CMV啟動子等)，使得編碼重組蛋白之核酸以可操作方式連接至誘導型啟動子或組成型啟動子。舉例而言，表現載體可包括四環素誘導型啟動子pTET、araC-ParaBAD誘導型啟動子或IPTG誘導型lac啟動子。如本文所用，「以可操作方式連接」的啟動子及核酸意謂核酸之表現(例如轉錄、轉譯等)至少處於啟動子之部分控制下。
編碼非天然存在之多肽或其部分的核苷酸序列可以藉由此項技術中已知之任何適當方式選殖入表現載體中。此類製備之表現載體可用於產生經基因工程改造或修飾之生物體，或重組細胞以產生本文所述之非天然存在之多肽。較佳地，重組細胞含有至少一個質體複本或編碼非天然存在之多肽的穩定整合之異源核酸序列。在一些實施例中，重組細胞為微生物細胞。舉例而言，在表現載體為細菌表現載體的情況下，表現載體可插入至(例如經由任何適合的轉型方法)用於蛋白質表現的細菌細胞中(例如包括BL-21細胞的大腸桿菌等)，以獨立地存在於細菌的細胞質中(例如作為質體形式)或至少暫時及/或穩定地整合至細菌染色體中。可使用此項技術中已知之任何適當方式進行載體至宿主細胞中之引入。
宿主細胞 .在一些實施例中，編碼非天然存在之多肽的核酸序列經密碼子最佳化以在異源宿主細胞中，較佳在微生物細胞，例如細菌細胞中表現。如本文所用，「密碼子最佳化」意謂針對在異源宿主細胞(例如微生物細胞、細菌細胞等)中之表現，密碼子組合物藉由在不改變所編碼之胺基酸序列的情況下改變核苷酸序列以更貼切地反映宿主之密碼子使用，從而得到改善。
重組多肽可自非動物來源產生，諸如自多種宿主細胞類型產生。在一些實施例中，宿主細胞可為例如動物細胞、禽類細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、來自海洋物種之細胞、植物細胞、藍綠藻類細胞、微生物細胞、細菌細胞、藻類細胞、酵母細胞或真菌細胞。各種宿主細胞類型之轉型及生長的各別條件為此項技術中所熟知。
適合的細菌宿主細胞包括但不限於埃希氏菌屬( Escherichia)、變形桿菌屬( Proteus)、芽孢桿菌屬( Bacillus)、羅爾斯通氏菌屬( Ralstonia)、乳桿菌屬( Lactobacillus)、乳球菌屬( Lactococcus)、假單胞菌屬( Pseudomonas)、葡萄球菌屬( Staphylococcus)及鏈黴菌屬( Streptomyces)之細胞。適合的細菌物種之細胞包括但不限於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌( Bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌( Bacillus megaterium)、短乳桿菌( Lactobacillus brevis)、綠膿桿菌( Pseudomonas aeruginosa)、螢光假單胞菌( Pseudomonas fluorescens)、施氏假單胞菌( Pseudomonas stutzerei)、肉葡萄球菌( Staphylococcus carnosus)、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis)、富養羅爾斯通氏菌( Ralstonia eutropha)、奇異變形桿菌( Proteus mirabilis)及青紫鏈黴菌( Streptomyces lividans)之細胞。
適合的酵母宿主細胞包括但不限於酵母菌(諸如粟酒裂殖酵母( S. pombe)及釀酒酵母( S. cerevisiae))細胞、裂殖酵母屬( Schizosaccharomyces)、念珠菌屬( Candida)、漢遜酵母屬( Hansenula)、畢赤酵母屬、克魯維酵母屬、耶氏酵母屬( Yarrowia)及法夫酵母屬( Phaffia)。
適合的絲狀真菌屬宿主細胞包括但不限於枝頂孢屬( Acremonium)、麴菌屬( Aspergillus)、金擔子菌屬( Aureobasidium)、黑管菌屬( Bjerkandera)、擬蠟菌屬( Ceriporiopsis)、金黃孢菌屬( Chrysoporium)、一夜蕈屬( Coprinus)、革蓋菌屬( Coriolus)、棒囊孢殼屬( Corynascus)、毛殼菌屬( Chaertomium)、隱球菌屬( Cryptococcus)、線黑粉菌屬( Filobasidium)、鐮刀菌屬( Fusarium)、赤黴菌屬( Gibberella)、腐殖菌屬( Humicola)、稻瘟菌屬( Magnaporthe)、白黴菌屬( Mucor)、毀絲黴屬( Myceliophthora)、新美鞭菌屬( Neocallimastix)、脈孢菌( Neurospora)、擬青黴菌屬( Paecilomyces)、青黴菌屬( Penicillium)、原毛平革菌屬( Phanerochaete)、射脈菌屬( Phlebia)、梨囊鞭菌屬( Piromyces)、側耳屬( Pleurotus)、柱孢黴屬( Scytaldium)、裂褶菌屬( Schizophyllum)、孢子絲菌屬( Sporotrichum)、籃狀菌屬( Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬( Thermoascus)、梭孢殼屬( Thielavia)、彎頸黴屬( Tolypocladium)、栓菌屬( Trametes)及木黴屬( Trichoderma)之細胞。
可使用之適合的禽類宿主細胞類型之實例包括但不限於EB66細胞。
哺乳動物細胞之實例包括但不限於HEK 293細胞、A549細胞、Vero細胞、CHO細胞、BHK細胞、HeLa細胞、COS細胞、MRC 5細胞、FS4細胞及MDCK細胞。
植物細胞之實例包括但不限於來源於例如胡蘿蔔、番茄、水稻、芥菜及菸草之植物細胞培養物及植物細胞株。
昆蟲細胞之實例包括但不限於供使用之Sf21、Sf9及BTI-TN-5B1-4 (High Five)、AcNPV桿狀病毒系統及黑腹果蠅( Drosophila melanogaster)施奈德(Schneider) 2 (S2)。
例示性生長條件 .在某些較佳實施例中，宿主細胞為大腸桿菌。在一些實施例中，經轉型細胞可隨後被轉移至較大體積之生長培養基(例如，基本培養基)中且生長至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少7小時、至少8小時、5至10小時、5至9小時、6至9小時及/或替代地直至培養基中之細胞密度達到所需光密度(OD)。
此外，可在22℃至37℃範圍內之各種溫度下進行醱酵過程。在一些實施例中，可將醱酵之溫度維持在恆定溫度下，且緊接在醱酵完成後，可純化非天然存在之多肽。替代地，可在所需時間段內維持醱酵溫度，且當OD600之細胞密度達到10-20時，則可降低溫度以誘導蛋白質產生。在此類實施例中，溫度通常自28℃降低至25℃。在醱酵期間，細菌中之蛋白質表現可藉由添加誘導試劑來誘導。舉例而言，在表現載體含有lac啟動子且編碼非天然存在之多肽之核酸處於lac啟動子控制下的情況下，核酸之表現可藉由添加濃度在0.1-1.5 mM、0.1-1.0 mM或0.1-0.5 mM範圍內之異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘發。醱酵可持續20-24小時，或在一些實施例中，持續40-60小時。
經考慮，此類所產生之重組細胞(例如經表現載體轉型之重組細菌)在細胞內表現由表現載體中之核酸編碼之非天然存在之多肽。此類細胞內表現之多肽接著可被分泌(經由分泌信號序列)至細胞外空間(例如培養基中)。因此，在一些實施例中，培養基可含有所分泌的由核酸編碼之重組蛋白。
重組多肽之回收 .在一些實施例中，重組多肽自培養基純化，在該培養基中重組宿主細胞生長且向其中分泌重組多肽。在一些實施例中，重組多肽例如使用純化標籤自細胞溶解物或勻漿純化。在一些實施例中，重組多肽與標籤(例如組胺酸標籤)偶合，使得重組多肽可使用稱為固定金屬親和層析(IMAC)的親和純化來純化。替代地，重組多肽可經由管柱層析純化。在一些實施例中，重組多肽可藉由在酸化步驟中對均質化生長培養基進行酸處理來純化。重組細胞隨後使用離心分離，得到集結粒及上清液部分。在此純化步驟中，本文所揭示之重組多肽尤其宜添加溶解度增進胺基酸序列。如本文所揭示，與缺乏溶解度增進胺基酸序列的通常在降低pH之酸化步驟期間易發生沈澱或「破裂」的類似多肽相比，包含溶解度增進胺基酸序列之多肽在此等純化步驟之後部分分離出上清液。因此，多肽被分泌至細胞外培養基中且在較低酸性範圍，例如pH 3下保持可溶，與在此類pH範圍下主要不可溶之其他污染蛋白質形成對比。可改變pH水平以例如藉由將pH降低至6、5.5、5、4.5、4、3.5、3或2.5，且監測可溶部分中重組多肽相對於集結粒或沈澱部分之回收，使重組多肽之回收達最佳。此允許快速且低本高效地純化重組多肽。可在聚丙烯醯胺凝膠上測試酸化培養液之上清液且判定其是否含有與起始集結粒相比相對較高豐度之重組多肽。
酸化步驟可例如在約5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5至約2.0之pH下進行。酸化步驟可在此等數值中之各者之間的任何pH下進行。混合物可在攪拌或不攪拌之情況下，且在室溫下或在約4℃至約40℃之溫度範圍下經pH處理。可使用任何適合的酸降低pH。低pH處理可為約5秒、30秒、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘或更久。在較佳實施例中，生長培養基(例如醱酵培養液)之pH可使用5-50%硫酸降低至3至3.5。
在一些情況下，此酸化步驟係最終純化。在其他情況下，接著藉由一或多種額外手段純化pH分離蛋白質。在所關注蛋白質產生後，其可藉由此項技術中已知用於分離或純化蛋白質之任何方法分離或純化，例如藉由層析(例如離子交換、親和力，尤其藉由對特異性抗原之親和力，藉由蛋白質A及篩分管柱層析)、離心、差異溶解度，或藉由任何其他用於分離或純化蛋白質之標準技術。經純化重組多肽可接著在SDS-PAGE凝膠上分析。可進一步使用逆相及尺寸排阻HPLC層析法進行效價及純度之定量。較佳地，經純化重組多肽之純度為至少約80%、至少80%、至少約85%、至少85%、至少約90%、至少90%、至少約95%、至少95%、至少約99%或至少99%。由此產生之純化蛋白質(亦即重組多肽)不含動物成分且可以融合形式利用(例如若如此設計，則具有膠原蛋白及角蛋白兩者之特徵)，或若設計成具有裂解連接子，則隨後可裂解成組分多肽，且視需要進一步經純化。 重組多肽之功能
本文提供之非天然存在之多肽通常不見於自然界中。一般而言，本文所述之非天然存在之多肽呈現出與天然存在之角蛋白的一或多種差異。在一些情況下，非天然存在之多肽可具有與天然存在之角蛋白不同的結構。類似地，若膠原蛋白多肽用作溶解度增進胺基酸序列，則其可呈現出與天然存在之膠原蛋白不同的結構或功能。天然膠原蛋白之四級結構為三重螺旋，通常由三個多肽構成。在一些態樣中，本文所述之非天然存在之多肽可不形成與天然生物體中會形成的膠原蛋白、角蛋白或此兩者之結構相同的結構。在一些態樣中，本文所述之非天然存在之多肽為單體及/或在普通生物情形下不形成多聚體結構。在其他態樣中，本文所述之非天然存在之多肽可在一些情況下與相同單體形成多聚結構(例如均二聚體、均三聚體等)。本文揭示之非天然存在之多肽通常具有與其單體結構相關之有利特性及/或缺乏能夠與其他多肽股交聯之胺基酸，例如缺乏羥脯胺酸殘基。另外，與全長或天然蛋白質或多肽相比，本文揭示之非天然存在之多肽之水解產物通常維持增加之溶解度。
一般而言，本文提供之非天然存在之多肽可具有與天然或全長多肽類似或實質上類似之某功能及/或提供與其類似或實質上類似的益處(例如如本文所提供)。在一些情況下，與天然或全長多肽相比，本文提供之非天然存在之多肽可具有改善或增加之功能及/或益處(例如如本文提供)。在一些實施例中，本文提供之非天然存在之多肽與天然或全長多肽相比可具有一或多種不同功能。目標序列可根據本文提供之方法經生物設計以獲得所需功能特性。
在一些實施例中，本文提供之非天然存在之多肽能夠提供膠原蛋白樣特徵及/或功能與角蛋白樣特徵及/或功能兩者(所有均在一種融合蛋白中)。舉例而言，此類多肽之局部施加可提供通常與膠原蛋白相關之皮膚益處，以及通常與角蛋白相關之皮膚益處。另外，將含有融合蛋白之調配物施加至毛髮可具有通常與膠原蛋白相關之益處，外加通常與角蛋白相關之益處。
在一些實施例中，非天然存在之多肽可提供諸如以下之功能：減少皮膚損傷、促進受損皮膚修復、保護皮膚免受UV傷害、保護皮膚細胞免受暴露於城市粉塵之影響、增加皮膚細胞存活率、增加纖維母細胞存活率、增加角質細胞存活率、增加原膠原合成、減少發炎性細胞介素之產生、修復或強化甲板、修復乾燥或受損指甲、防止指甲受傷、改善指甲強度或生長或其任何組合。
在一些實施例中，非天然存在之多肽可提供諸如以下之功能：改善頭髮強度；改善頭髮光澤度、順滑度、柔韌度、光感或觸感；改善頭髮可梳理性或可管理性；改善頭髮柔順性；增加髮束直徑；強化頭髮；修復分叉末梢；修復受化學劑傷害之頭髮；修復因機械或化學處理而受損或變脆弱之頭髮；保護頭髮免受大氣因素、機械或化學處理傷害；或其任何組合。 重組多肽之組合物及調配物
在各種態樣中，本文提供包含本發明多肽及一或多種額外成分的組合物及調配物。本發明之組合物及調配物可包括或可被併入至所有類型之媒劑及載劑中。媒劑或載劑可為化妝品或皮膚病學上可接受之媒劑或載劑。組合物可調配用於局部施加，例如用於施加至皮膚、頭髮、頭皮或指甲之個人護理產品。局部施加包括施加在皮膚及/或角蛋白組織上。角蛋白組織包括安置為哺乳動物之最外部保護覆蓋物的含角蛋白層，且包括但不限於嘴唇、皮膚、毛髮及指甲。媒劑或載劑之非限制性實例包括水、甘油、酒精、油、含矽化合物、聚矽氧化合物及蠟。調配物及變化形式及其他適當媒劑對於熟習此項技術者將為顯而易見的且適合用於本發明之組合物及調配物中。在一些實施例中，調配物或個人護理產品可為敷膜(mask)、皮膚清潔劑、清潔膏、潔膚露、洗面奶、清潔乳、清潔面撲(cleansing pad)、洗面乳、面霜、化妝水、身體霜、身體乳、面部保濕劑、身體保濕劑、面部精華液、面膜、身體敷膜、面部爽膚水、面部噴霧、眼霜、去角質配方、護唇膏、口紅、護甲劑(nail treatment)、洗髮精、護髮素、沐浴露、護髮精華、頭皮精華、美髮噴霧、髮膠、眼影、遮瑕膏、睫毛膏及其類似物。頭髮護理產品之實例包括頭皮或頭髮藥物、頭皮或頭髮生長調節劑或刺激劑、頭皮或頭髮清潔劑、頭皮或頭髮護髮素、精華液、梳理乳膏(combing cream)、定型慕斯(styling mousse)、洗劑、存留型染髮劑、噴霧劑、乳膏、凝膠、粉末及其類似物。
在某些態樣中，化合物、成分及試劑之濃度及組合可以使得該等組合在化學上相容且不形成自製成品沈澱之複合物的方式選擇。
本文某些實施例中提供包含一或多種本文提供之非天然存在之多肽的(例如，局部)組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，用於化妝用途)。在一些實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品提供任何適合量的本文提供之多肽，諸如以任何適合量(例如適合於在給與或施加至個體或細胞時提供益處之量)。在一些特定實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品包含適合於在(例如局部)施加至個體皮膚時對個體皮膚、頭髮、頭皮及/或指甲提供有益作用的量。在特定實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品包含約0.001%至約30% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)，諸如本文所提供。在更具體實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品包含諸如本文提供之約0.001%至約20% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約10% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約5% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約4% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約3% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約2% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約1% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)、諸如本文提供之約0.001%至約0.5% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)及諸如本文提供之約0.001%至約0.2% w/w之多肽(或非天然存在之重組多肽)。
在各種實施例中，本文提供之非天然存在之多肽於本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品中的濃度或量係以任何合適的量且可例如視用途或調配物(例如凝膠、膠囊、液體、粉末等)而變化。非天然存在之多肽(例如重組蛋白)在組合物、調配物及/或個人護理產品中之例示性濃度可為至少約0.01%、至少約0.05%、至少約0.1%、至少約0.2%、至少約0.5%、至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98% (w/v或w/w)。替代地及/或另外，非天然存在之多肽在組合物、調配物及/或個人護理產品中之例示性濃度可為約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.2%、約0.5%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約98% (w/v或w/w)。替代地及/或另外，非天然存在之多肽在組合物、調配物及/或個人護理產品中之例示性濃度的範圍可為約0.01%至約99%、約0.05%至約99%、約0.1%至約99%、約0.1%至約99%、約0.5%至約99%、約0.1%至約10%、約1%至約99%、約5%至約99%、約10%至約99%、約15%至約99%、約20%至約99%、約25%至約99%、約30%至約99%、約35%至約99%、約40%至約99%、約45%至約99%、約50%至約99%、約55%至約99%、約60%至約99%、約65%至約99%、約70%至約99%、約75%至約99%、約80%至約99%、約85%至約99%、約90%至約99%、約95%至約99%、約0.1%至約90%、約1%至約90%、約5%至約90%、約10%至約90%、約15%至約90%、約20%至約90%、約25%至約90%、約30%至約90%、約35%至約90%、約40%至約90%、約45%至約90%、約50%至約90%、約55%至約90%、約60%至約90%、約65%至約90%、約70%至約90%、約75%至約90%、約80%至約90%、約85%至約90%、約20%至約80%、約25%至約80%、約30%至約80%、約35%至約80%、約40%至約80%、約45%至約80%、約50%至約80%、約55%至約80%、約60%至約80%、約65%至約80%、約70%至約80%、約75%至約80%、約70%至約99%、約75%至約99%、約80%至約99%等(w/w或w/v)。替代地及/或另外，非天然存在之多肽(例如重組多肽)在組合物、調配物及/或個人護理產品中之例示性濃度可小於約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%等(w/w或w/v)。
在一些實施例中，施加之時程視個體之目的、性別、年齡或健康狀況而變化。舉例而言，在一些實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品(例如局部)一天一次、一天兩次、一天三次、一天至多6次、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天等施加。替代地及/或另外，在一些實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品以不規律間隔，或增加的間隔，或減少的間隔施加(例如局部)多次。在某些實施例中，組合物、調配物及/或個人護理產品以足以或可有效獲得如本文提供之結果的劑量及/或時程局部施加。
局部施加可用於化妝目的。局部調配物可為任何類型之局部調配物，包括但不限於粉末、乳膏、凝膠、凝膠乳膏、液體、洗劑、油及其類似物。在此類實施例中，組合物可進一步包括載劑分子(例如媒劑)、防腐劑及/或額外成分中之至少一者。涵蓋任何適合的載劑分子，且例示性載劑分子可包括水、油、醇、丙二醇或乳化劑、脂質體、可生物降解微囊、洗劑、噴霧、氣溶膠、粉劑、可生物降解聚合物、礦物油、三酸甘油酯油、聚矽氧油、甘油、單硬脂酸甘油酯、乙醇、乳化劑、液體石油、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蠟、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯、十六酯蠟、十六醇十八醇、2-辛基十二醇、苄醇、環甲聚矽氧烷及環戊矽氧烷。
另外，涵蓋任何適合的防腐劑，且例示性防腐劑包括氧化鋅、對羥基苯甲酸酯、甲醛釋放劑、異噻唑啉酮、苯氧基乙醇或有機酸，諸如苯甲酸、苯甲酸鈉或丁二醇、己二醇、山梨酸鉀、生育酚、二碘甲基對甲苯碸、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、順式異構體1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮雜-1-氮鎓金剛烷(azoniaadamantane)氯化物、戊二醛、4,4-二甲基㗁唑啶、7-乙基雙環㗁唑啶、苯氧基乙醇、丁二醇、1,2己二醇、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸、Germaben ®II、迷迭香萃取物及EDTA。
此類組合物通常為皮膚上可接受的，因為其在施加至皮膚及/或角蛋白組織時並不具有異常毒性、不相容性、不穩定性、過敏反應及其類似者。本發明之局部皮膚護理組合物可具有所選擇之黏度以避免在施加至皮膚及/或角蛋白組織之後大量滴落或集中。
個人護理產品可適用於增加皮膚之緊緻度、彈性、亮度、水合作用、觸感紋理或視覺紋理及/或刺激膠原蛋白產生。個人護理產品可適用於減少深紋及皺紋、減少細紋及皺紋、均勻不均勻膚色、增加皮膚光澤、減少光損傷、減少皮膚下垂、減少面部體積損失、增加皮膚屏障功能、減少皮膚發紅、減少皮膚乾燥、減少脫皮或掉皮或增加膠原蛋白、彈性蛋白、纖維結合蛋白或層黏連蛋白之表現及/或產生。
頭髮護理產品及使用方法 .在一些實施例中，重組多肽適用作頭髮護理產品中之成分，例如用於洗髮及護髮組合物中。重組多肽可適用於治療受損頭髮或頭皮。重組多肽亦可適用於保護頭髮免受未來的傷害。隨時間推移可能導致頭髮受損之因素之實例包括環境影響、營養、熱處理及化學處理。受損頭髮會變脆弱，造成髮束斷裂(「分叉末梢」)。受損頭髮亦可具有暗淡外觀。重組多肽可適用於添加至頭髮或頭皮護髮素。
重組多肽可併入或包括於沖洗型或可沖洗出型皮膚或頭髮組合物中。此係指組合物施加至皮膚、頭髮及/或頭皮且隨後視情況在一段時間之後沖洗掉，諸如在約10秒之後、在約20秒之後、在約30秒之後、在約1分鐘之後、在約5分鐘之後、在約10分鐘之後、在約20分鐘之後、在約30分鐘之後或在約一小時之後。舉例而言，沖洗型組合物可為皮膚清潔組合物或洗髮組合物，諸如護髮洗髮組合物。重組多肽組合物可施加至皮膚、頭髮及/或頭皮且隨後沖洗掉。舉例而言，可按以下步驟洗滌或清潔皮膚、頭髮及/或頭皮：第一步，將本發明之組合物施加至皮膚、頭髮及/或頭皮上，並視情況留存一段時間，接著，第二步，例如在視情況留存一段時間之後，諸如1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘或約20分鐘或更久之後，用水沖洗頭髮。
在各種實施例中，根據本發明之處理及/或護理皮膚、頭髮及/或頭皮之方法可賦予皮膚或頭皮水分益處，或賦予頭髮護理及可管理性益處，甚至是在組合物沖洗掉之後。另外，相對於尚未用本發明之含溶解度增進胺基酸序列-角蛋白融合蛋白之組合物處理之頭髮，用根據本發明之重組多肽護理系統及/或沖洗型頭髮組合物處理過的頭髮可產生的結果為更容易理順、更順滑、更有光澤、管理感(discipline)更好而不泛油或有重壓感、有潤澤感、分叉末梢修復及/或靜電減少，可能更加光亮及/或可能對捲髮具有更大程度的控制。
在一些實施例中，重組多肽適用作頭髮護理產品中之成分，該頭髮護理產品為「存留型(leave-in)」產品。此類產品可在用洗髮之後或在頭髮定型過程期間施加至頭髮上。此外，重組多肽組合物可適用於撫平捲曲或毛躁頭髮。捲髮往往會在體積上顯著擴展且在暴露於高濕度條件下或濕度環境變化時失去其捲曲定義。
額外成分 .組合物可含有其他適合於人類使用之化妝品成分。在一些態樣中，本發明之組合物及調配物可進一步包括界面活性劑、含聚矽氧化合物、UV劑、油及/或其他本說明書中鑑別之成分或此項技術中已知之成分。該組合物可為乳液、乳膏、身體黃油、敷膜、磨砂膏、洗滌劑、凝膠、血清、乳液(例如水包油、油包水、水包聚矽氧、聚矽氧包水、含油包水之水、含水包油之油、含水包油之聚矽氧等)、溶液(例如水溶液或水醇溶液)、無水基質(例如口紅或粉末)、軟膏、乳劑、膏劑、氣溶膠、固體形式、眼膠、凝膠精華液、凝膠乳液等。組合物可經調配用於在使用期間一天施加至局部皮膚、頭皮或頭髮至少1次、至少2次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次或更多次。
本發明之組合物及調配物可包括三酸甘油酯。非限制性實例包括短鏈、中鏈及長鏈三酸甘油酯。本發明之組合物及調配物亦可包括防腐劑。防腐劑之非限制性實例包括苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、丁基胺基甲酸碘代丙炔酯、山梨醇鉀、苯甲酸鈉或其任何混合物。在一些實施例中，本發明之組合物及調配物無對羥基苯甲酸酯。
本發明之組合物及調配物可具有UVA及UVB吸收特性。本發明之組合物及調配物可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更大值或其中任何整數或衍生物之防曬係數(SPF)。本發明之組合物及調配物可為防曬乳、防曬噴霧或防曬霜。
本發明之組合物及調配物亦可包括以下額外成分中之任一者、其任何組合或全部：護髮劑、保濕劑、著色劑、pH調節劑、規整劑、無機鹽、防腐劑、增稠劑、含聚矽氧之化合物、精油、芳香劑、維生素、醫藥成分或抗氧化劑，或該等成分之任何組合或該等成分之混合物。該等成分之量的範圍以組合物之重量或體積計可為0.0001%至99.9%，或其間之任何整數或範圍。
CTFA國際化妝品成分詞典及手冊(CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook) (2004及2008)描述可用於本發明之上下文中的廣泛多種非限制性化妝品成分。此等成分類別的實例包括：芳香劑(人工及天然的；例如葡萄糖酸、苯氧基乙醇及三乙醇胺)、染料及顏色成分(例如藍1、湖藍1、紅40、二氧化鈦、D&C藍4號、D&C綠5號、D&C橙4號、D&C紅17號、D&C紅33號、D&C紫2號、D&C黃10號及D&C黃11號)、調味劑/香味劑(例如甜菊( Stevia rebaudiana) (甜葉菊)萃取物及薄荷醇)、吸附劑、潤滑劑、溶劑、保濕劑(包括例如潤膚劑、潤濕劑、成膜劑、閉塞劑及影響皮膚之天然保濕機制的藥劑)、疏水劑、UV吸收劑(物理及化學吸收劑，諸如對胺基苯甲酸(「PABA」)及對應PABA衍生物、二氧化鈦、氧化鋅等)、精油維生素(例如A、B、C、D、E及K)、痕量金屬(例如鋅、鈣離子及硒)、抗刺激物(例如類固醇及非類固醇抗炎劑)、植物萃取物(例如真蘆薈( Aloe vera)、甘菊、胡瓜萃取物、銀杏( Ginkgo biloba)、人參及迷迭香)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如BHT及生育酚)、螯合劑(例如二鈉及四鈉EDTA)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯)、pH調節劑(例如氫氧化鈉及檸檬酸)、吸附劑(例如辛烯基丁二酸鋁澱粉、高嶺土、玉米澱粉、燕麥澱粉、環糊精、滑石及沸石)、皮膚漂白劑及美白劑(例如氫醌及乳酸菸鹼醯胺)、保濕劑(例如山梨糖醇、尿素、甲基葡糖醇聚醚(methyl gluceth)-20、醣同分異構體及甘露糖醇)、去角質劑、防水劑(例如氫氧化鎂/鋁硬脂酸鹽)、皮膚調理劑(例如蘆薈萃取物、尿囊素、沒藥醇、神經醯胺、二甲聚矽氧烷、玻尿酸、生物糖膠(biosaccharide gum)-1、乙基己基甘油、戊二醇、氫化聚癸烯、油酸辛基十二烷酯、葡萄糖酸內酯、葡糖酸鈣、環己矽氧烷及甘草酸二鉀)。
在一些實施例中，本發明之組合物、調配物及/或個人護理產品包括一或多種選自由以下組成之群的額外成分：乙醯丙酸、聚甘油-3甲基葡萄糖二硬脂酸酯、甘油十一碳烯酸酯、中國希蒙得木( Simmondsia chinensis) (荷荷芭(Jojoba))籽油、聚丙烯酸酯交聯聚合物、角鯊烷、玻尿酸鈉、丙烯酸聚合物(卡波姆(carbomer))、戊二醇、月桂基磺基乙酸鈉、油醯基肌胺酸鈉、油酸鈉、蓖麻( Ricinus communis/castor)籽油、巴西棕櫚( Copernicia cerifera/棕櫚蠟)蠟、小燭樹蠟、可可樹( Theobroma cacao) (可可)籽油、異壬酸異壬酯、地蠟、三異硬脂酸異丙氧鈦鹽(isopropyl titanium triisostearate)、聚羥基硬脂酸、氧化鐵、二氧化鈦、乙醯丙酸鈉及羥丙基瓜兒膠。
特性 .在各個態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含動物成分。舉例而言，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不包括任何自動物獲得之成分。在一些情況下，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品包含由植物獲得的材料或具有植物來源之材料及/或由該等材料製成。在一些情況下，本文提供之組合物、調配物及個人護理產品包含以合成方式獲得之材料或具有合成來源之材料(例如在微生物細胞，例如細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞中產生)。在一些情況下，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含動物來源成分(MDI)。因此，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含牛海綿狀腦病(BSE)及/或傳染性海綿狀腦病(TSE)。在一些實施例中，未對動物測試本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不包含任何可偵測之經遺傳修飾之生物體或任何可偵測之經遺傳修飾之生物體遺傳物質。在一些情況下，藉由菌落形成單位(CFU)分析測定，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品之特徵在於不存在活微生物群。在一些情況下，藉由聚合酶鏈反應(PCR)測定，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品之特徵在於不存在活微生物群DNA。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含已知會引起癌症或出生缺陷或其他生殖損傷之任何天然存在及/或合成化學物質。此類成分之非限制性清單可見於oehha.ca.gov/proposition-65/proposition-65-list。在各個態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何致癌、誘變或生殖毒性(CMR)物質。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品不含高度關注物質(SVHC)。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何瀕危野生動植物種國際貿易公約(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora，CITES)成分(例如來源於由CITES保護之任何物種、獲自或源自由CITES保護之任何物種的任何成分)。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何衝突礦石或衝突資源。
在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品無芳香劑。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品與國際香料協會(International Fragrance Association，IFRA)相符。
在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理不含任何已知過敏原。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何基於樹堅果或花生之材料來源。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不使用已與基於樹堅果或花生之材料接觸過的設備處理。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何基於椰子之材料來源。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不使用已與基於椰子之材料接觸過的設備處理。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何基於小麥之材料來源。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不使用已與基於小麥之材料接觸過的設備處理。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何麩質來源(例如無麩質成分)。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何乳糖或乳糖衍生物來源(例如無乳糖成分)。在一些情況下，組合物、調配物及/或個人護理產品不含任何乳膠或乳膠衍生物來源(例如無乳膠成分)。
在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含一或多種選自由以下組成之群的成分：鄰苯二甲酸酯、對羥基苯甲酸酯、三氯沙(triclosan)、尿素、丁基化羥基甲苯(BHT)、丁基化羥基大茴香醚(BHA)、甲醛、甲基氯異噻唑啉酮及甲基異噻唑啉酮(例如Kathon®)之混合物、礦物油、苯氧基乙醇、石蠟脂、單乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇、硫酸鹽(例如月桂基硫酸鈉(SLS)、月桂基醚硫酸鈉(SLES))、軟脂酸視黃酯、環氧乙烷、1,4-二㗁烷及其任何組合。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含殺蟲劑。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含奈米粒子(「無奈米粒子成分」)。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含黃麴毒素。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含黴菌毒素。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含聚芳族烴(PAH)。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含聚矽氧(例如環矽氧烷)。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品並非使用USP ＜467＞或ICH Q3C (R6)中所列之任何溶劑製造。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品不含有由Swiss Ordinance 814.O18所定義之任何揮發性有機化合物。
在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品含有少於0.5 ppm砷。在各個態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品含有少於0.1 ppm汞。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品含有少於0.1 ppm鎘。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品含有少於2 ppm鉛。
在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品經認證為純素。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品經認證為無殘酷性。在各種態樣中，組合物、調配物及/或個人護理產品經認證為清真產品(Halal)。 重組多肽作為皮膚組合物及調配物之用途
在某些實施例中，本文提供促進、維持及/或改善個體之年輕皮膚(例如皮膚外觀、皮膚紋理等)的方法，其包含向個體皮膚施加組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)。促進及/或維持年輕皮膚可包含促進、維持及/或改善個體皮膚之外觀。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚外觀較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚外觀。促進及/或維持年輕皮膚可包含促進、維持及/或改善個體皮膚之紋理。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚紋理較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚紋理。
在各種態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體皮膚以促進、維持及/或改善皮膚之緊緻度。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚緊緻度較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚緊緻度。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚之緊緻度涉及增加皮膚之緊緻度(例如相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由量測皮膚對負壓之抵抗力測定，皮膚之緊緻度增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。在一些情況下，藉由使用Cutometer®量測皮膚對負壓之抵抗力。
在各個態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體皮膚以促進、維持及/或改善皮膚彈性。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚彈性較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚彈性。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚彈性涉及增加皮膚彈性(例如，相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由量測皮膚變形後恢復至其原始位置之能力測定，皮膚之彈性增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。在一些情況下，皮膚在變形之後恢復至其原始位置之能力藉由使用Cutometer®量測。
在各種態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體皮膚以促進、維持及/或改善皮膚亮度。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚亮度較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚亮度。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚亮度涉及增加皮膚亮度(例如，相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由專家臨床評分員測定，皮膚之亮度增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。
在各個態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚或頭髮以促進、維持及/或改善皮膚或頭髮之水合作用。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體皮膚或頭髮之水合作用較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚或頭髮之水合作用。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚之水合作用涉及增加皮膚之水合作用(例如，相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由量測皮膚或頭髮之電容測定，皮膚或頭髮之水合作用增加(例如相對於施加之前的皮膚或頭髮)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。在一些情況下，藉由Corneometer®量測皮膚或頭髮之電容。
在各種態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚或頭髮以促進、維持及/或改善皮膚或頭髮之觸感紋理。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體皮膚或頭髮之觸感紋理較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚或頭髮之觸感紋理。
在各個態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚或頭髮以促進、維持及/或改善皮膚或頭髮之視覺紋理。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體皮膚或頭髮之視覺紋理較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚或頭髮之視覺紋理。
在各種態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)施加至個體皮膚以促進、維持及/或改善皮膚之膠原蛋白含量。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之後，個體之皮膚膠原蛋白含量較接近於年輕個體(例如小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚膠原蛋白含量。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚之膠原蛋白含量涉及增加皮膚之膠原蛋白含量(例如相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之後，皮膚之膠原蛋白含量增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%，或至少約75%。
在各種態樣中，本文提供之方法包含向個體皮膚施加組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)以促進、維持及/或改善皮膚彈性蛋白含量。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之後，個體之皮膚彈性蛋白含量較接近於年輕個體(例如小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚彈性蛋白含量。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚彈性蛋白含量涉及增加皮膚彈性蛋白含量(例如，相對於在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之非天然存在之多肽)之後，皮膚之彈性蛋白含量增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%，或至少約75%。
在各種態樣中，本文提供之方法包含向個體皮膚施加組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)以改善皮膚發紅。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚發紅較接近於年輕個體(例如小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚發紅。在一些情況下，改善皮膚發紅涉及減少皮膚發紅(例如相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由專家臨床評分員測定，皮膚發紅減少(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。
在各個態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體皮膚以改善皮膚之細紋及/或皺紋。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之細紋及/或皺紋較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚細紋及/或皺紋。在一些情況下，改善皮膚之細紋及/或皺紋涉及減少皮膚之細紋及/或皺紋(例如減少量、減小尺寸等) (例如相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由專家臨床評分員測定，皮膚之及/或皺紋減少(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。
在各個態樣中，本文提供之方法包含將組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體皮膚以促進、維持及/或改善皮膚之表皮厚度。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之後，個體之皮膚表皮厚度較接近於年輕個體(例如，小於30歲、小於25歲、小於20歲、小於15歲等)之皮膚表皮厚度。在一些情況下，促進、維持及/或改善皮膚之表皮厚度涉及增加皮膚之表皮厚度(例如，相對於施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)之前的皮膚)。在一些情況下，在施加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)之後，藉由反射式共聚焦顯微法測定，皮膚之表皮厚度增加(例如相對於施加之前的皮膚)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75%。在一些情況下，反射式共聚焦顯微法由Vivascope®執行。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加角質細胞生長(例如增殖)。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示；例如，含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，角質細胞生長(例如，增殖)增加至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%或更多(例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加角質細胞再生。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，角質細胞再生增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加角質細胞再生。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，角質細胞再生增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加由纖維母細胞產生的膠原蛋白產量。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，由纖維母細胞產生的膠原蛋白產量增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體之皮膚之後增加纖維母細胞遷移。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，纖維母細胞遷移增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加纖維母細胞增殖。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，纖維母細胞增殖增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加纖維母細胞黏附。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，纖維母細胞黏附增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)在暴露於城市粉塵之後(例如在城市粉塵暴露之前將組合物、調配物及/或個人護理產品施加至皮膚的情況下)增加角質細胞存活率。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，角質細胞在暴露於城市粉塵之後的存活率增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)具有抗氧化能力。在一些實施例中，抗氧化能力可使用氧自由基吸收能力(oxygen radical absorbance capacity；ORAC)分析來量測。在一些實施例中，抗氧化能力可以Trolox當量單位量測。在一些實施例中，組合物之抗氧化能力可為至少約50 µM、100 µM、150 µM、200 µM、250 µM或超過250 µM Trolox當量單位。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)在施加至個體皮膚之後增加一或多個基因(例如參與細胞增殖、細胞遷移、細胞黏附等之一或多個基因)之表現(藉由存在於皮膚中之細胞，例如角質細胞、纖維母細胞)。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品(例如，如本文所揭示，例如含有非天然存在之本發明多肽)施加至個體之皮膚之後，一或多個基因之表現(例如藉由存在於皮膚中之細胞，例如纖維母細胞、角質細胞)增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前的皮膚)。
在一些實施例中，一或多個基因涉及信號傳導路徑(例如涉及細胞增殖、細胞遷移、細胞黏附)。在一些情況下，一或多個基因涉及VEGFA/VEGFR2信號傳導路徑。在一些情況下，涉及VEGFA/VEGFR2信號傳導路徑之一或多個基因係選自由以下組成之群：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK 1、EGR1及其任何組合。
在一些情況下，一或多個基因涉及焦點黏附信號傳導路徑。在一些情況下，涉及焦點黏附信號傳導路徑之一或多個基因係選自由以下組成之群：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何組合。
在一些情況下，一或多個基因涉及內皮素信號傳導路徑。在一些情況下，涉及內皮素信號傳導路徑之一或多個基因係選自由以下組成之群：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何組合。
在一些情況下，一或多個基因涉及EGF/EGFR信號傳導路徑。在一些情況下，涉及EGF/EGFR信號傳導路徑之一或多個基因係選自由以下組成之群：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何組合。
在一些情況下，一或多個基因涉及轉型生長因子-β (TGF-β)信號傳導路徑。在一些情況下，涉及TGF-β信號傳導路徑的一或多個基因係選自由以下組成之群：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何組合。 重組多肽作為頭髮及頭皮組合物及調配物之用途
在各種態樣中，本文提供之方法包含向個體之頭皮或頭髮施加組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有非天然存在之本發明多肽)。施加可使得頭髮光澤增加、頭髮強度增加、可梳理性增加、熱處理(諸如捲髮器或直髮器、吹風機等)後的水合作用增加、頭髮強度增加及頭髮直徑增加。
頭髮纖維由三個主要結構構成：表皮、皮質及髓質。可量測之頭髮之物理特性包括彈性、順滑度、體積、光澤度及柔軟度，此歸因於表皮鱗片之顯著黏著性及移動控制(韌性)；以及梳理容易度(「可梳理性」)，此係因為其減少纖維靜電。
在一些實施例中，含有非天然存在之本發明多肽的組合物適用作作為頭髮護理產品之個人護理產品。可使用若干分析來判定此類組合物是否對頭髮有益。在用此類組合物處理之後可量測的例示性頭髮特徵包括例如個體頭髮之健康狀況、光澤度、可梳理性、理順性、拉直能力及直徑。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可增加頭髮之可梳理性。在一些情況下，在組合物、調配物及/或個人護理產品施加至個體之頭髮之後，頭髮之可梳理性增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可增加頭髮之光澤度。在一些實施例中，在組合物、調配物及/或個人護理產品施加至個體之頭髮之後，經光澤計量測的頭髮之光澤度增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可增加頭髮之彈性。在一些實施例中，在組合物、調配物及/或個人護理產品施加至個體之頭髮之後，頭髮之彈性增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可增加頭髮之強度。在一些實施例中，在組合物、調配物及/或個人護理產品施加至個體之頭髮之後，頭髮之強度增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%或至少約75% (例如相比於施加組合物、調配物及/或個人護理產品之前)。
在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可藉由首次施加來滲透毛皮質。在一些實施例中，增加施加頻率或持續時間可進一步增加本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)的滲透。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後抵抗多次洗髮循環。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可賦予頭髮熱保護(例如回應於熱損傷增進頭髮熱保護)。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後調節頭髮柔韌度。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後改善髮型保持度。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後改善捲髮控制。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後調整頭髮梳理性(亦即梳頭所需力)。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可提供抗氧化益處。在一些情況下，抗氧化劑益處可藉由保護頭髮之結構蛋白免受氧化壓力來減少角蛋白變性。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可改善促進頭髮及頭皮健康之細胞群(例如纖維母細胞及/或角質細胞)的存活率。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可在施加至頭髮之後調節頭髮柔韌度。在各種態樣中，本文提供之組合物、調配物及/或個人護理產品(例如含有本發明之重組多肽)可提供傷口癒合益處，其可在美容、個人護理及生物醫學之應用方面有益。
可藉由若干方法進行對頭髮施加之影響的評估。其中有光學及電子顯微法、共聚焦顯微法、機械阻力量測、光澤度評估及光學相干斷層掃描(OCT)。用於量測經處理頭髮之特徵的其他顯微方法包括SEM顯微攝影術，其適用於評估頭髮表面形態；及原子力顯微法(AFM)，其使用探針以產生可定量之影像。光學相干斷層掃描亦可用於檢查頭髮。可用以量測處理對頭髮強度之影響的機械分析包括例如用測力計量測髮絲之斷裂負荷。此系統亦用於評估彈性、可梳理性及理順性。亦可執行主觀測試。此等測試可由經訓練之志願者(模擬終端使用者)或由專用技術員執行。 自宿主細胞純化重組多肽的方法
本文描述一種自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法。自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法包含(a)提供或獲得包含該重組多肽及宿主細胞或宿主細胞溶解物之混合物；(b)將該混合物分離成包含該重組多肽之第一可溶部分及第一不可溶部分；(c)將該第一可溶部分之pH調節至5或更小之pH，以產生pH經調節之混合物；及(d)將該pH經調節之混合物分離成包含該重組多肽之第二可溶部分及第二不可溶部分，其中該重組多肽佔該第二可溶部分中之蛋白質的至少50%。
在一些態樣中，宿主細胞可為微生物細胞。在一些態樣中，微生物細胞可為細菌細胞。在一些態樣中，細菌細胞可為革蘭氏陰性細菌。在一些態樣中，革蘭氏陰性細菌可為大腸桿菌。在一些態樣中，步驟(c)中之分離混合物可包含離心、超速離心、過濾、超過濾或其組合。亦可以採用可將混合物分離成可溶及不可溶部分之替代方法。
在一些態樣中，重組多肽可包含溶解度增進胺基酸序列。在一些態樣中，重組多肽不包含溶解度增進胺基酸序列。在一些態樣中，重組多肽可為pH穩定蛋白質。在一些態樣中，重組多肽可以胞內表現。在一些態樣中，重組多肽可經表現且導引至周質。在一些態樣中，重組多肽可細胞外表現。
在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將酸添加至第一可溶部分。在一些態樣中，酸可為弱酸或強酸。在一些態樣中，酸可為H 2SO 4。在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將第一可溶部分之pH調節至4或更小之pH。在一些態樣中，步驟(c)中之調節pH可包含將第一可溶部分之pH調節至3或更小之pH。
在一些態樣中，自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法可進一步包含步驟(e)將第二可溶部分之pH調節至比(c)之該pH低的pH以產生第二pH經調節之混合物；及(f)將第二pH經調節之混合物分離成包含重組多肽之第三可溶部分及第三不可溶部分。在一些態樣中，該方法可進一步包含步驟(g)將第三可溶部分之pH調節至比(e)之該pH低的pH以產生第三pH經調節之混合物；及(h)將第三pH經調節之混合物分離成包含重組多肽之第四可溶部分及第四不可溶部分。
在一些態樣中，重組多肽之純度在第三可溶部分中比在第二可溶部分中高；且其中重組多肽之純度在第四可溶部分中比在第三可溶部分中高。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少55%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少60%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少65%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少70%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少75%%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少80%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少85%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少90%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少94%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少95%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少96%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少97%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少98%。在一些態樣中，重組多肽或其部分為存在於第二可溶部分中之蛋白質的至少99%。  在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物不含宿主細胞碎片。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多50%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多45%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多40%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多35%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多30%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多25%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多20%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多15%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多10%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多6%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多5%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多4%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多3%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多2%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物包含相對於總蛋白至多1%內源性宿主細胞蛋白。在一些態樣中，包含重組多肽之最終產物不含內源性宿主細胞蛋白。 實例 實例 1 . 多種非天然存在之角蛋白多肽之生產
此實例展示各種重組角蛋白多肽之重組表現及純化。人類膠原蛋白I型、α1、角蛋白12、角蛋白31及角蛋白33A的所需聚核苷酸序列藉由IDT合成。pET載體與編碼重組角蛋白多肽之插入聚核苷酸序列之間的交疊經設計為在20與30 bp長之間且使用PCR添加以酶PrimeStar® GXL聚合酶(可在takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase上獲得)。打開之pETno載體及插入DNA根據製造商說明書使用無縫選殖(In-Fusion Cloning) (可在takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning上獲得)在一起組裝成最終質體。在所有情況下，編碼序列之前為分泌信號序列，該核苷酸序列編碼來自以下花蜜腸桿菌( Rosenbergiella nectarea)之DegP分泌序列： 。
質體序列經由桑格定序(Sanger sequencing)檢驗。大腸桿菌宿主細胞用最終質體轉型且隨後在純素Luria Bertani (LB)培養液中培養且在1.5毫升等分試樣中用以50:50液體培養物與甘油溶液之比率稀釋於水中之50%植物甘油溶液冷凍。在37℃，200 rpm下，將一小瓶此冷凍培養物在50 ml之基本培養基中復活隔夜。將細胞轉移至300 ml之基本培養基中且生長6-9小時以達至3-10之OD600。  基本培養基調配物：
基本培養基調配物： 1)高壓滅菌5 L之550 g/kg葡萄糖糖漿於去離子水中之濃度(VWR，產品號97061-170)。 2)在3946 mL之去離子水中高壓滅菌： 20 g (NH 4) 2HPO 4(VWR，產品號97061-932)。 66.5 g KH 2PO 4(VWR，產品號97062-348)。 22.5 g H 3C 6H 5O 7(VWR，產品號BDH9228-2.5KG)。 8.85 g MgSO 4.7H2O (VWR，產品號97062-134。 10 mL 1000×痕量金屬調配物(藉由Geltor調配)。 在高壓滅菌之後，添加 118g (1)至(2) 5 mL 25 mg/mL硫酸康黴素(Kanamycin Sulfate) (VWR-V0408) 使用28% NH 4OH (VWR，產品號BDH3022)以將pH調節至6.1。 痕量金屬調配物： 七水合硫酸亞鐵，27.8 g/L (光譜，7782-63-0) 七水合硫酸鋅，2.88 g/L (光譜，7446-20-0) 氯化鈣二水合物，2.94 g/L (光譜，2971347) 鉬酸鈉二水合物，0.48 g/L (光譜，10102-40-6) 氯化錳四水合物，1.26 g/L (光譜，13446-34-9) 亞硒酸鈉，0.35 g/L (光譜，10102-18-8) 硼酸，0.12 g/L (光譜，10043-35-3)
根據以下方法製備用於培養經轉型宿主細胞的基本培養基。高壓處理5 L 550 g/kg葡萄糖漿。分別混合及高壓處理以下成分：3946 mL去離子水；20 g (NH 4) 2HPO 4；66.5 g KH 2PO 4；22.5 g H 3C 6H 5O 7；及8.85 g MgSO4.7H2O。在高壓滅菌之後，將118 g葡萄糖漿添加至經高壓滅菌之營養混合物中。添加10 ml 1000×痕量金屬調配物。隨後，添加5 mL 25 mg/mL硫酸康黴素。隨後使用28% NH 4OH將培養基調節至pH 6.1。
在28℃之溫度下進行醱酵。藉由添加IPTG至濃度在0.1-0.5 mM範圍內之培養基進行誘導。持續醱酵24-60小時。重組多肽如下純化；使用5-50%硫酸使醱酵液之pH降低至3-3.5之間。接著使用離心分離細胞。酸化培養液之上清液在SDS-PAGE凝膠上運作且發現與起始集結粒相比含有相對較高豐度的重組蛋白。
設計含有溶解度增進胺基酸序列以及目標角蛋白多肽序列之若干種重組多肽以及單獨角蛋白多肽(作為對照)，將其轉型至細菌菌株，進行生產且純化。
編碼衍生自與截短人類角蛋白12型序列(菌株8737)融合之截短人類膠原蛋白I型α1序列的溶解度增進胺基酸序列之核苷酸序列展示如下： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼衍生自與截短人類角蛋白33A型序列(菌株8739)融合之截短人類膠原蛋白I型α序列的溶解度增進胺基酸序列之核苷酸序列展示如下： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼衍生自與截短人類角蛋白31型序列(菌株8738)融合之截短人類膠原蛋白1型α序列的溶解度增進胺基酸序列之核苷酸序列展示如下： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
其他溶解度增進胺基酸序列-角蛋白多肽序列在以下實例中指明。
使用SDS-PAGE，接著用庫馬斯藍染色蛋白質來確認培養基中多肽中之各者的存在，展示所表現構築體中之各者的預測尺寸範圍下的條帶。在pH處理之後，將樣品離心。將可溶部分裝載至SDS-PAGE凝膠上。在醱酵結束時(「EFT 36」)或在pH調節至pH 3之後(「EFT 36 - pH 3」)獲取樣品。對於各別多肽中之各者，觀測到預期尺寸下的較厚且清晰條帶(如 圖 2中所示)。左側凝膠展示在醱酵結束時存在之蛋白質，而右側凝膠展示在pH 3.0下存在於上清液中之蛋白質。如 圖 2中所見，相較於單獨的人類角蛋白多肽(7639)；人類角蛋白12型多肽(8737)、人類角蛋白31型多肽(8738)及人類角蛋白33a型多肽(8739)之表現及純化，向各種人類角蛋白多肽添加溶解度增進胺基酸序列可改善在pH 3下之溶解度及純化。
另外，在各種人類角蛋白多肽之兩側上添加兩種溶解度增進胺基酸序列(例如以「夾心」構築體；或「C-K-C」形式)亦改善在pH 3下之溶解度及純化；人類角蛋白12型多肽夾心(8733)及人類角蛋白33a型多肽夾心(8734)。
C-K-C夾心之胺基酸序列(菌株8733) (人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白12型截短(179 aa)-人類膠原蛋白I型α1截短(219 aa))展示如下： 。
使用不同角蛋白截短的C-K-C夾心之胺基酸序列(菌株8734) (人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白33a型截短(147 aa)-人類膠原蛋白I型α1截短(219 aa))展示如下： 。 表 6 . 與各種角蛋白融合之溶解度增進胺基酸序列之產生 .
菌株 描述 蛋白質 SEQ ID NO:
8733 溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白12型截短-(179 aa)-人類膠原蛋白I型α1截短(219 aa) 81
8734 溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白33a型截短-(147 aa)-人類膠原蛋白I型α1截短(219 aa) 82
8737 溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白12型截短-(179 aa) 76
8738 溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白31型截短-(147 aa) 80
8739 溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1截短(262 aa)-人類角蛋白33a型截短-(147 aa) 78
7639 人類角蛋白33a型截短(147 aa)對照 12
實例 2 . 角蛋白多肽之溶解度經由使用本發明之溶解度增進胺基酸序列增進
為證實使用本發明之溶解度增進胺基酸序列可增加角蛋白多肽之溶解度，用單獨角蛋白多肽，或以融合蛋白形式與膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列組合進行實驗。先前研究展示，多種重組膠原蛋白多肽在低pH下可溶，且可藉由降低培養基pH至約3.0，隨後將培養基離心而與培養基中之其他多肽及污染物分離。非重組多肽及其他污染物沈澱且變成集結粒部分之一部分，而重組膠原蛋白保持在上清液部分中可溶。此特性隨後用於賦予多種角蛋白多肽溶解度特性，否則該等角蛋白多肽不容易以重組方式表現或純化。
為判定組合溶解度增進多肽與角蛋白多肽是否將允許其在低pH下保持更可溶(以允許快速純化程序)，人類角蛋白31型多肽(「K31」) (SEQ ID NO: 7)由自身表現( 圖 3之左圖)或以重組方式融合至262個胺基酸之I型α1人類膠原蛋白片段(「HsCol1a1-27」；SEQ ID NO: 26)以產生具有SEQ ID NO: 80之序列的融合蛋白( 圖 3之右圖)。
遵循實例1之方法在大腸桿菌中產生147個胺基酸之截短人類角蛋白多肽序列(人類角蛋白31型；SEQ ID NO: 7)。遵循 圖 1A及 圖 1B中圖解之方法，培養萃取物藉由添加H 2SO 4而經歷pH 5、pH 4或pH 3。接著以20,000×g離心萃取物10分鐘。藉由SDS-PAGE檢查集結粒(「Pel」不可溶)及上清液(「Sol」可溶)兩者( 圖 3)。
當角蛋白多肽由自身表現時( 圖 3之左圖)，在醱酵結束時大部分目標角蛋白多肽存在於上清液部分中(表示為Sol)，但隨後在酸化之後在集結粒部分中發現(表示為Pel)。相比之下，當角蛋白片段融合至溶解度增進胺基酸序列時( 圖 3之右圖)，融合蛋白大部分保留於上清液部分中，而大部分污染蛋白質位於集結粒部分中。方框中之條帶展示pH 3樣品之兩種條件之比較。在低pH下之溶解度增加允許角蛋白多肽容易地自污染多肽分離。此亦在膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列與人類角蛋白12型及人類角蛋白33A型之組合的情況下可見，如以上實例1中所示。
此指示本發明之溶解度增進胺基酸序列能夠賦予多種重組角蛋白多肽溶解度，從而實現所需角蛋白多肽之簡單且低成本的純化。 實例 3 . 各種類型的溶解度增進胺基酸序列增進角蛋白多肽之溶解度
除以上實例中所示之多肽以外，亦發現衍生自其他膠原蛋白多肽之其他類型的溶解度增進胺基酸賦予角蛋白多肽改善的溶解度。
188個胺基酸之原雞屬(雞)膠原蛋白21型片段(GL21) (SEQ ID NO: 19)融合至如本文所描述之147個胺基酸之人類角蛋白31型多肽(SEQ ID NO: 7)。
編碼融合至截短人類角蛋白31型序列的截短雞膠原蛋白21型序列的核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
如在先前評估之人類I型α1膠原蛋白片段中所見，當衍生自雞21型膠原蛋白片段之溶解度增進胺基酸序列( 圖 4)與角蛋白多肽一起表現(「GL21_K31」)時，相較於自溶液沈澱出且見於集結粒部分中的單獨的角蛋白多肽( 圖 3之左圖)，所得角蛋白多肽在酸化後大部分保留於上清液部分中。
作為另一實例，147 aa人類角蛋白31型多肽截短(SEQ ID NO: 7)亦與如本文所述之200個胺基酸之人類膠原蛋白III型α1片段(SEQ ID NO: 25)融合。
編碼融合至截短人類角蛋白31型序列的人類膠原蛋白III型α1片段之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
如在先前評估之膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列中所見，當衍生自人類III型α1膠原蛋白片段之溶解度增進胺基酸序列與角蛋白多肽(「HsCol13a1-4_K31」)一起表現時，所得角蛋白多肽在酸化後大部分保持在上清液部分(「Supe」)中( 圖 5)。
此指示衍生自多種膠原蛋白片段之多種類型的溶解度增進胺基酸序列能夠賦予本發明之重組角蛋白多肽溶解度，從而實現對所需角蛋白多肽之簡單且低成本的純化。 實例 4 . 各種長度的溶解度增進胺基酸序列增進角蛋白多肽之溶解度
為判定溶解度增進胺基酸序列之長度在賦予角蛋白多肽溶解度方面是否重要，使各種類型及長度之溶解度增進胺基酸序列的片段與人類角蛋白31型多肽片段(SEQ ID NO: 7) (本文中標記為「K147」)融合。除使用以上實例中所示之各種溶解度增進胺基酸序列之各種角蛋白多肽以外，一些膠原蛋白衍生之溶解度增進標籤亦能夠增加角蛋白多肽之溶解度。
所有均衍生自人類膠原蛋白I型α1多肽的225個胺基酸(C225) (SEQ ID NO: 27)、196個胺基酸(C196) (SEQ ID NO: 28)、130個胺基酸(C130) (SEQ ID NO: 29)、64個胺基酸(C64) (SEQ ID NO: 30)或25個胺基酸(C25) (SEQ ID NO: 31)之溶解度增進胺基酸序列全部融合至147個胺基酸長的人類角蛋白31型片段(K147)；(SEQ ID NO: 7)，且蛋白質表現及分泌於如本文所描述之醱酵培養液中( 圖 6)。下表列出用於測試角蛋白多肽之溶解度的若干截短長度變化。 表 7 . 角蛋白融合物中所用之溶解度增進胺基酸序列之各種長度 .
多肽名稱 膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白31 型片段 大致尺寸 C:K 比率 在低pH 下改善角蛋白之溶解度 ？ DNA SEQ ID NO: 蛋白質SEQ ID NO:
C225-K147 225 aa 147 aa 41 kDa 1.53 是 87 88
C196-K147 196 aa 147 aa 38 kDa 1.33 是 89 90
C130-K147 130 aa 147 aa 30 kDa 0.88 是 91 92
C64-K147 64 aa 147 aa 23 kDa 0.44 一些是 93 94
C25-K147 25 aa 147 aa 19 kDa 0.17 不可偵測 95 96
C0-K147 無 147 aa ** (對照) (對照) -- 7
上述融合蛋白之核酸序列及對應胺基酸序列展示如下。
編碼C225-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C196-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C130-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C64-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C25-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
隨著連接至角蛋白多肽之溶解度增進胺基酸序列片段的尺寸減小，在酸化後保留於上清液部分(「Supe」)中之角蛋白多肽的比例亦減小( 圖 6)。
為判定是否在來自不同來源之膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列中可見長度之影響，使用所有均衍生自雞膠原蛋白21型多肽且全部融合至147個胺基酸長之人類角蛋白31型片段(K147)；(SEQ ID NO: 7)的188個胺基酸(SEQ ID NO: 19)、141個胺基酸(SEQ ID NO: 20)、93個胺基酸(SEQ ID NO: 21)或47個胺基酸(SEQ ID NO: 22)之溶解度增進胺基酸序列嘗試進行實驗，且蛋白質表現且分泌於如本文所述之醱酵液中( 圖 7A及 圖 7B)。下表列出用於測試角蛋白多肽之溶解度的若干截短長度變化。 表 8 . 角蛋白融合物中所用之溶解度增進胺基酸序列之各種長度 .
多肽名稱 膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白31 型片段 大致尺寸 C:K 比率 在低pH 下改善角蛋白之溶解度 ？ DNA SEQ ID NO: 蛋白質SEQ ID NO:
GL21_K31 188 aa 147 aa 35 kDa 1.28 是 97 63
GL21Cdel25_K31 141 aa 147 aa 30 kDa 0.96 是 98 64
GL21Cdel50_K31 93 aa 147 aa 26 kDa 0.63 一些是 99 65
GL21Cdel75_K31 48 aa 147 aa 22 kDa 0.32 一些是 100 66
上述融合蛋白之核酸序列及對應胺基酸序列展示如下。
編碼GL21_K31之核酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼GL21del25_K31之核酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼GL21del50_K31之核酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼GL21del75_K31之核酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
如在人類膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列構築體中所見，隨著連接至角蛋白多肽之雞衍生之溶解度增進胺基酸序列片段之尺寸減小，在酸化後保留在上清液部分(「Supe」)中之角蛋白多肽之比例亦減小( 圖 7A及 圖 7B)。
此指示衍生自多種膠原蛋白片段之多個長度的溶解度增進胺基酸序列能夠賦予本發明之重組角蛋白多肽溶解度，從而實現對所需角蛋白多肽之簡單且低成本的純化。 實例 5 . 使用溶解度增進胺基酸序列表現且純化各種長度之角蛋白多肽
為判定各種長度之角蛋白多肽是否可使用本發明之溶解度增進胺基酸序列表現及純化，進行以下實驗。在衍生自人類膠原蛋白I型α1多肽片段(C262) (SEQ ID NO: 26)之溶解度增進胺基酸序列不存在( 圖 8A及 圖 8B)及存在( 圖 9)的情況下測試各種長度之人類角蛋白31型多肽片段。所測試之人類角蛋白31型多肽長度為147個胺基酸(K147) (SEQ ID NO: 7)、100個胺基酸(K100) (SEQ ID NO: 9)、75個胺基酸(K75) (SEQ ID NO: 10)及50個胺基酸(K50) (SEQ ID NO: 11)，且蛋白質表現且分泌於如本文所述之醱酵液中。 表 9 . 溶解度增進胺基酸序列對各種長度角蛋白多肽之影響 .
多肽名稱 膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白31 型片段 大致尺寸 C:K 比率 在低pH 下改善角蛋白之溶解度 ？ 蛋白質SEQ ID NO:
C262-K147 262 aa 147 aa 45 kDa 1.78 是 102
C262-K100 262 aa 100 aa 40 kDa 2.62 是 104
C262-K75 262 aa 75 aa 37 kDa 3.49 是 106
C262-K50 262 aa 50 aa 34 kDa 5.24 是 108
僅 角蛋白：
C0-K147 - 147 aa 16 kDa - - 7
C0-K125 - 125 aa 13 kDa - - 8
C0-K100 - 100 aa 11 kDa - - 9
C0-K75 - 75 aa 8 kDa - - 10
C0-K50 - 50 aa 6 kDa - - 11
上述融合蛋白之核酸序列及對應胺基酸序列展示如下。
編碼C262-K147之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C262-K100之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C262-K75之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
編碼C262-K50之核苷酸序列為： 。
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
如 圖 8A及 圖 8B中所示，單獨角蛋白多肽在整個酸化過程中保持不可溶。溶解度增進胺基酸序列在產生可溶角蛋白多肽，尤其較短角蛋白多肽方面顯著有效( 圖 9)。隨著融合蛋白之角蛋白部分之尺寸減小，在酸化後保留於上清液部分中之融合蛋白的比例增加。 圖 9展示此差異，特別是藉由比較pH 3集結粒色帶中存在之蛋白質之量與pH 3上清液色帶中存在之蛋白質之量展示。另外，隨著角蛋白片段的尺寸減小，膠原蛋白與角蛋白的比率(「C:K」)增加。在酸化pH下上清液部分相對於集結粒部分中剩餘之融合蛋白之比例亦增加。
圖 8A及 圖 8B中展示在酸化培養基中未能純化缺乏溶解度增進胺基酸序列之角蛋白多肽，例如未融合之147個胺基酸、125個胺基酸及100個胺基酸之角蛋白31構築體。當單獨表現時，所檢查之缺乏溶解度增進區段之角蛋白片段中無一者可溶於酸化培養基中。
此指示本發明之溶解度增進胺基酸序列能夠賦予各種長度之重組角蛋白多肽溶解度，從而實現所需角蛋白多肽之簡單且低成本的純化。 實例 6 . 溶解度增進胺基酸序列與角蛋白多肽片段之長度比之變化
為檢驗溶解度增進胺基酸序列與角蛋白多肽之比率(藉由胺基酸長度測定)的影響，進行以下實驗。將各種長度之膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列與各種長度之人類角蛋白31型多肽組合。 表 10 ：膠原蛋白及角蛋白胺基酸長度比率 .
膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白31 型片段 總殘基 大致尺寸(kDa) C:K 比率 註釋
262 aa 147 aa 409 aa 44.99 1.78 原始HsCol1a1-27_K31構築體
262 aa 100 aa 362 aa 39.82 2.62   
262 aa 75 aa 337 aa 37.07 3.49   
262 aa 50 aa 312 aa 34.32 5.24 最長膠原蛋白，最短角蛋白
                 
225 aa 147 aa 372 aa 40.92 1.53   
196 aa 147 aa 343 aa 37.73 1.33 「_Cdel25」
130 aa 147 aa 277 aa 30.47 0.88 「_Cdel50」
64 aa 147 aa 211aa 23.21 0.44 「_Cdel75」
25 aa 147 aa 172 aa 18.92 0.17 最短膠原蛋白，最長角蛋白
                 
196 aa 100 aa 296 aa 32.56 1.96 C:K比率擴展；不同總尺寸
196 aa 50 aa 246 aa 27.06 3.92 C:K比率擴展；不同總尺寸
64 aa 100 aa 164 aa 18.04 0.64 C:K比率擴展；不同總尺寸
64 aa 50 aa 114 aa 12.54 1.28 C:K比率擴展；不同總尺寸
                 
0 147aa 147 aa 16.17 0 僅角蛋白對照
0 125 aa 125 aa 13.75 0 僅角蛋白對照
0 100 aa 100 aa 11.0 0 僅角蛋白對照
0 75 aa 75 aa 8.25 0 僅角蛋白對照
0 50 aa 50 aa 5.5 0 僅角蛋白對照
196 aa之人類膠原蛋白I型α1多肽片段(SEQ ID NO: 28)與100 aa之人類角蛋白31型多肽(SEQ ID NO: 9)產生「C196-K100」(SEQ ID NO: 70)；196 aa之人類膠原蛋白I型α1多肽片段(SEQ ID NO: 28)與50 aa之人類角蛋白31型多肽(SEQ ID NO: 11)產生「C196-K50」(SEQ ID NO: 71)；64 aa之人類膠原蛋白I型α1多肽片段(SEQ ID NO 30)與100 aa之人類角蛋白31型多肽( SEQ ID NO: 9)產生「C64-K100」(SEQ ID NO: 72)；及64 aa之人類膠原蛋白I型α1多肽片段(SEQ ID NO: 30)與50 aa之人類角蛋白31型多肽(SEQ ID NO: 11)產生「C64-K50」(SEQ ID NO: 73) ( 圖 10)。 表 11 . 溶解度增進胺基酸序列與角蛋白多肽序列之比率的影響 .
多肽名稱 膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白31 型片段 大致尺寸 C:K 比率 在低pH 下改善角蛋白之溶解度 ？ 蛋白質SEQ ID NO:
C196-K100 196 aa 100 aa 33 kDa 1.96 是 70
C196-K50 196 aa 50 aa 27 kDa 3.92 是 71
C64-K100 64 aa 100 aa 18 kDa 0.64 一些是 72
C64-K50 64 aa 50 aa 12 kDa 1.28 是 73
如在先前實例中所見，在酸化後連接至各種長度角蛋白多肽之各種長度的溶解度增進胺基酸序列增加保留於上清液部分(「Supe」)中的角蛋白多肽之比例( 圖 10)。C:K之比率在各凝膠切片下指示。具有高C:K比率之角蛋白多肽具有較大量的多肽存在於可溶部分中，尤其是在pH 3下。具有低C:K比率(0.64)之C64:K100蛋白質具有極少蛋白質存在於上清液中。此證實，隨著溶解度增進胺基酸序列與角蛋白序列之長度比增加，溶解度增加。 實例 7 . 溶解度增進胺基酸序列之位置及數目相對於角蛋白多肽之變化
進行此實例以判定是否向角蛋白多肽之N端及C端區域添加溶解度增進胺基酸序列之側接區會改善其溶解度，由此促進後續處理。
構築體係根據下表製備。在確認編碼融合蛋白之核酸序列之準確性及融合蛋白在微生物細胞中之表現後，藉由SDS-PAGE分析蛋白質以確認所得蛋白質之正確尺寸。溶解度增進胺基酸序列衍生自人類膠原蛋白I型α1多肽片段且與各種類型角蛋白多肽組合。 表 12 . 基於膠原蛋白之穩定性夾心 .
融合物類型 ( C = 膠原蛋白； K = 角蛋白 ) 多肽名稱 膠原蛋白衍生之溶解度增進序列 角蛋白片段 額外膠原蛋白截短 ( 名稱及尺寸 ) SEQ ID NO: 在低pH 下改善角蛋白之溶解度 ？
C-K-C HsCol1A-027_K12_HsCol1A-028 人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白12 (179 aa) 人類膠原蛋白27α1 (219 aa) 81 是
C-K HsCol1A-027_K31 人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白31 (147 aa) NA 109 是
C-K-C HsCol1A-027_角蛋白-33A-lowC_HsCol1A-028 人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白33A (147 aa) 人類膠原蛋白27α1 (219 aa) 82 是
C-K-C 「K82-2」(HsCol1A-027_K82-2_HsCol1A-028) 人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白「K82-2」 人類膠原蛋白27α1 (219 aa) 110 是
CC-K   人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白31 (147 aa)    人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 111 未測試
C-K-CC   人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白31 (147 aa)    人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 112 未測試
K-C   人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 人類角蛋白31 (147 aa)    人類膠原蛋白I型α1 (262 aa) 113 未測試
對應於表12中之「C-K」序列的胺基酸序列展示如下： 。
對應於表12中之「C-K-C」序列的胺基酸序列展示如下： 。
對應於表12中之「C-C-K」序列的胺基酸序列展示如下： 。
對應於表12中之「C-K-C-C」序列的胺基酸序列展示如下： 。
對應於表12中之「K-C」序列的胺基酸序列展示如下： 。
與無膠原蛋白衍生之溶解度增進序列之角蛋白多肽(資料未示出)相比，具有融合至N端及C端位置之膠原蛋白衍生之溶解度增進序列的角蛋白多肽(「穩定夾心」)被發現在低pH下具有增加之溶解度。另外，視需要，多肽序列亦可經設計以在角蛋白序列之一端或兩端具有重複的膠原蛋白序列。藉由使用此方法，角蛋白多肽與膠原蛋白衍生之溶解度增進序列之組合在低pH下比單獨角蛋白多肽更可溶。 實例 8 . 在溶解度增進胺基酸序列與角蛋白多肽片段之間使用可裂解連接子
在一些情況下，當角蛋白多肽根據本發明方法產生時，其產生具有溶解度增進胺基酸序列之融合蛋白。視需要，在初始設計中融合蛋白可藉由使用酶可裂解連接區容易地分離成其分開的多肽。用對應蛋白酶裂解連接子後，可進行一種或兩種多肽之進一步純化。
以下實例證實角蛋白多肽成功裂解。將編碼蛋白酶裂解位「ENLYFQG」(SEQ ID NO: 34)或替代地「ENLYFQ」(SEQ ID NO: 114)之核酸序列插入衍生自人類膠原蛋白I型α1多肽(HSCol1a-27)編碼核酸序列之溶解度增進胺基酸序列之C端及人類角蛋白31型多肽片段(K31)編碼核酸序列之N端之間。TEV蛋白酶在典型TEV蛋白酶裂解位ENLYFQG (「tev」) (SEQ ID NO: 34)之Q與G殘基之間裂解。TEV裂解系統因此通常在裂解角蛋白多肽上產生甘胺酸胺基酸「疤痕」。為了產生無「疤痕」之角蛋白多肽，對融合核酸序列進行修飾使得角蛋白序列在其N端截短3個胺基酸；使用序列(tev)-DRL…，而非(tev)-QLGDRL…(SEQ ID NO: 115)。因為裂解後甘胺酸「疤痕」為天然角蛋白序列的一部分，所以所得片段(GDRL…) (SEQ ID NO: 116)可視為無疤痕。
編碼上述融合蛋白之核苷酸序列為：
對應於以上核酸序列之胺基酸序列為： 。
如本文所描述製備融合蛋白，且如本文所描述進行融合蛋白之酸富集純化。在離心後，將來自酸化(pH 3.0)上清液之280 µl樣品經緩衝液交換成50 mM Tris-HCl pH 8.0 + 0.5 mM ETDA。向經緩衝液交換之融合蛋白中添加70 µl AcTEV蛋白酶，總體積為2100 µl。將混合物在30℃下培育1小時，隨後離心。在SDS-PAGE凝膠上分離10 µl裂解融合蛋白之集結粒或上清液部分且用庫馬斯藍染色以確認裂解成功( 圖 1 1)。此外，如所預期，所得裂解角蛋白多肽位於集結粒部分中，而裂解的膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列位於上清液部分中。此證實該方法可用於經由使用併有可裂解連接子之融合構築體分離難以純化的蛋白質，諸如角蛋白多肽，且隨後分離組分以單獨產生所需角蛋白多肽。 實例 9 . 角蛋白多肽之按比例調整之醱酵及純化
在醱酵達成適合細胞密度及蛋白質表現量之後，將醱酵培養液冷卻直至達到≤15℃。此時，將濃硫酸溶液(98.5 wt%)滴定至醱酵器中，以將培養液pH降低至3.0-3.2。離心用作移除細胞生物質及較大細胞碎片之主要培養液澄清步驟。隨後使用微過濾以由離心移除含產物之物料流中之任何殘餘細胞及細胞碎片。超過濾用於自微過濾滲透流移除殘留鹽、糖、可溶醱酵副產物及水。其他步驟可包括用活性碳處理以對蛋白質濃縮物脫色及去味、添加防腐劑、pH調節(至4-5)及無菌過濾。所調配之蛋白質濃縮物接著經噴霧乾燥以移除大部分水且產生最終多肽粉末。替代地，多肽可調配成溶液形式。多肽可隨後用於製造如本文提供之組合物及調配物。
亦可能需要產生重組多肽之水解產物。重組多肽可溶解於適合的溶劑(諸如緩衝水溶液)中且在混合時用熱或酸處理以產生具有類似胺基酸組成但片段比重組蛋白小之水解產物。水解產物接著經噴霧乾燥或凍乾。水解產物適用於個人護理產品、食品工業、化妝品工業或毛髮護理工業。此外，水解產物肽可尤其適用於例如強化正常或受損毛髮，此係由於較小肽能夠進入個別毛髮束內部，從而強化內部之毛髮。重組多肽可溶解於水溶液中，且加熱、用酸性溶液處理，或用酶處理以便使一部分肽鍵斷裂且產生較小肽。水解產物材料可隨後經噴霧乾燥或凍乾。 實例 1 0. 由角蛋白多肽之粉末製備各種個人護理產品
包含本發明角蛋白多肽之粉末可用於製備如本文所述之用於美容及個人護理的多種產品。此實例證實使用藉由本文所描述之方法產生之角蛋白多肽的通常適用調配物。
組合粉末：各調配物藉由在添加粉末之前混合成分開始。隨著混合進行，隨後逐漸添加粉末。使用分散器圓盤或高剪切混合器達成粉末之較快水合。替代地，在濃縮預混物中使粉末水合，隨後將其併入調配物中。為了促進水合及防止團塊形成，粉末可在水合之前與液體成分(例如甘油、丙二醇)預混合成漿液。在酸性或鹼性組分之任何中和步驟之後併入粉末。粉末亦可使用高剪切混合器分散於無水系統中。在添加粉末之前混合調配物。隨著混合進行，逐漸添加粉末直至均勻分散為止。若需要更細粒子，則可能需要施加研磨步驟。
水溶液：粉末狀多肽可容易轉化成液體溶液供進一步用作成分。將粉末緩慢溶解於相容溶液中，通常濃度為1-2%。
組合乳膏或凝膠調配物：粉末狀多肽之1-2%溶液亦容易用標準處理工具併入調配物之水相中。當將溶液併入低於40℃之調配物中時且在酸性或鹼性組分之任何中和步驟之後，獲得最佳結果。 表 13. 例示性凝膠乳膏調配物 0 . 1 % ( w / w ) 角蛋白多肽 .
相 成分 量(% w/w)
水相      
水 77.65
乙醯丙酸、水、甘油、乙醯丙酸鈉摻合物 4.00   
聚甘油-3甲基葡萄糖二硬脂酸酯 2.00
甘油十一碳烯酸酯 2.00
油相      
中國希蒙得木(荷荷芭)籽油 2.00
聚丙烯酸酯交聯聚合物 1.25
角鯊烷 1.00
活性成分相      
水 10.00
角蛋白多肽 0.10
表 14. 含有 0 . 1 % ( w / w ) 角蛋白多肽的例示性水凝膠調配物 .
成分 重量 % 階段
水 45.0 A
玻尿酸鈉 0.1
卡波姆(Carbopol® Ultrez 30聚合物) 0.4 B
甘油 1.0 C
苯氧基乙醇 1.0
戊二醇(Hydrolite® 5染色) 0.5
水 45.0 D
角蛋白多肽 0.1
水(及)月桂基磺基乙酸鈉(及)戊二醇(及)油醯基肌胺酸鈉(及)氯化鈉(及)油酸鈉(SymSol® PF-3) 0.5 E
水(及)氫氧化鈉(10N) PH F
水 QS G
100  
頭髮護理調配物：製備以下調配物A及調配物B且充分混合。調配物按沖洗處理或留存處理，在剛洗過之頭髮及乾燥頭髮上進行測試。在施加之後30分鐘至2小時量測光澤度、可梳理性及頭髮強度。 表 15. 含有角蛋白多肽之例示性頭髮護理調配物 .
組分 頭髮護理凝膠調配物A (大致%) 頭髮護理凝膠調配物B (大致%)
角蛋白多肽 2% 0.5%
乙二醇二硬脂酸酯 5% 8%
聚四級銨-10 0.1% 0.2%
聚四級銨-67 0.2% 0.1%
氯化鈉 0.5% 0.8%
椰油基葡糖苷 10% 8%
椰子油酸羥乙基磺酸鈉 2% 4%
椰油醯胺基丙基甜菜鹼 5% 3%
椰油基甜菜鹼 0.1% 0.5%
PEG-55丙二醇油酸酯 0.7% 0.5%
PEG-150二硬脂酸酯 0.4% 0.8%
椰油醇-辛酸酯 0.5% 0.8%
甘油 6.5% 0.75%
二甲聚矽氧烷 1% 0.2%
水 QS QS
實例 1 1. 對包含角蛋白多肽之調配物的毒理學分析
在活體外進行多種毒理學分析以篩選含有角蛋白多肽之調配物的任何潛在負面影響。
細菌反向突變分析：評估多肽誘導鼠傷寒沙門桿菌之四種不同菌株及大腸桿菌菌株之誘變反應的能力。藉由用測試菌株在Arocolor TM1254誘導之大鼠肝微粒體(S9)存在及不存在下塗鋪樣品，篩選不同劑量下的樣品。若樣品引起逆轉菌落(revertant colony)增加至高於自發背景含量，則樣品視為經誘變。該分析為此項技術中已知且根據測試化學物質之OECD 4714準則進行：細菌逆相突變分析。
EpiDerm TM皮膚模型活體外毒性測試：如此項技術中已知，利用MatTek Corporation EpiDerm TM活體外毒性測試系統評估多肽之刺激潛力。簡言之，測試已經培養形成人類表皮之多層高度分化模型之正常人類衍生之表皮角質細胞(NHEK)的物質且評估藉由顏色反應監測的對粒線體酶丁二酸脫氫酶之破壞。酶將水溶性黃色MTT轉化為紫色不可溶產物，且經轉化之MTT之量與活細胞數目成比例。Triton X-100 (1%)用作陽性對照。 表 16 . EpiDerm TM 皮膚模型活體外毒性測試系統之標準範圍 .
ET-50 ( 小時 ) 預期活體內刺激 實例
＜0.5 重度，可能腐蝕 濃硝酸
0.5-4 中度 1%十二烷基硫酸鈉
4-12 中度至輕度 1% Triton X-100
12-24 極輕度 嬰兒洗髮精
24 無刺激 10% Tween 20
EpiOcular TM組織模型活體外毒性測試系統：如此項技術中已知，利用MatTek Corporation EpiOcular TM活體外毒性測試系統評估多肽之刺激潛力。簡言之，測試已經培養形成分級鱗狀上皮細胞(類似於角膜中發現之嗜人類化表皮角質細胞之物質)的正常人類衍生之表皮角質細胞的物質且評估藉由顏色反應監測的對粒線體酶丁二酸脫氫酶之破壞。酶將水溶性黃色MTT轉化為紫色不可溶產物，且經轉化之MTT之量與活細胞數目成比例。Triton X-100 (0.3%)用作陽性對照。 表 17 . EpiOcular TM 組織模型之活體外毒性測試系統的標準範圍 .
德萊茲分數 ( Draize Score ) 刺激分類 實例 EpiOcular ET-50 (min)
0-15 無刺激性，最小 PEG-75羊毛脂，Tween 20 ＞256-26.5
15.1-25 輕度 3%十二烷基硫酸鈉 ＜26.5-11.7
25.1-50 中度 5% Triton X-100 ＜11.7-3.45
50.1-110 重度，極重 5%氯化苯甲烴銨 ＜3.45
實例 12 . 皮膚細胞上之本發明角蛋白多肽之活體外研究
健康皮膚主要由I型及III型膠原蛋白、玻尿酸、纖維結合蛋白及彈性蛋白及包括其他蛋白質(諸如層黏連蛋白及膠原蛋白IV)之基底層構成。纖維母細胞為產生此等結構蛋白(包括膠原蛋白)之主要細胞類型。蛋白質統稱為細胞外基質(ECM)，且其支撐皮膚之結構。纖維母細胞之膠原蛋白輸出量隨著年齡增長而減少，因此纖維母細胞為化妝品試圖挽救皮膚衰老之活性的主要目標。
角質細胞為形成表皮或皮膚外層之主要細胞類型。HaCaT細胞為來源於成人皮膚之永生性角質細胞細胞株。兩種細胞類型均用於證實調配物對皮膚之益處。此等細胞具有較高周轉率(turn-over)且接受日常污染及輻射之衝擊。其受吾人所處環境之負面影響，使得發炎增加且破壞吾人天然皮膚屏障。用於評定角質細胞健康之標誌包括發炎性標記、細胞周轉率及DNA完整性。
毒性。用角蛋白多肽處理人類初代纖維母細胞、HaCaT細胞及人類初代角質細胞且使用標準MTT分析測定存活率。  方案： 1.      將細胞匯合時接種於96孔培養盤中。 2.      24小時後，將培養基更換為低血清培養基(以避免任何因血清所致的影響)。 3.      用多肽在相同的低血清培養基中處理細胞24小時。 4.      在用多肽處理後，保存上清液，且將細胞與MTT染料一起在37℃下培育60 min。 5.      MTT由活細胞代謝成甲䐶鹽。 6.      使用異丙醇溶解此等鹽且所產生之顏色使用細胞培養盤讀取器定量。
對角質細胞生長及再生之影響。角質細胞或HaCaT細胞用角蛋白多肽處理且量測生長及再生。
對I型膠原蛋白纖維母細胞產生之影響。纖維母細胞與角蛋白多肽一起培養，且藉由酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)分析培養物上清液之原膠原I型C肽，其為總分泌膠原蛋白I型蛋白之讀數。  ELISA方案： 1.    在標準培養基DMEM/F12+10% FBS中培養初代人類纖維母細胞。 2.    使用上清液測定所存在的I型膠原蛋白之含量。 3.    本文所用之套組為Takara原膠原I型C肽偵測ELISA套組。 4.    遵循製造商方案量測上清液中之膠原蛋白I型的數量。
細胞外基質蛋白之基因對纖維母細胞產生之影響。纖維母細胞與角蛋白多肽一起培育大致48小時，且隨後進行RNA定序以分析細胞中之總體基因表現，包括若干細胞外基質基因，諸如膠原蛋白I型基因(COL1A)、彈性蛋白基因(ELN)及纖維結合蛋白基因(FN1)，以及負責細胞增殖、遷移、黏附之若干路徑中的基因。  微陣列RNA分析方案： 1.    將細胞匯合時接種於6孔培養盤中。 2.    24小時後，將培養基更換為低血清培養基。 3.    細胞用0.05%多肽及對照物處理。 4.    使用QIAGEN RNeasy套組提取RNA且經提取之RNA用於分析。
對傷口癒合之作用。傷口癒合為動態過程，包括一系列事件，包括細胞增殖及遷移。纖維母細胞遷移及增殖藉由分泌各種化學物質，包括膠原蛋白及其他基質蛋白而在傷口閉合方面起關鍵作用。藉由抓撓纖維母細胞之匯合層誘導缺口，且藉由缺口之細胞增殖及閉合來監測角蛋白多肽之處理。  方案： 1.    將細胞匯合時接種於24孔培養盤中。 2.    24小時後，將培養基更換成低血清培養基且使細胞饑餓6-8小時。 3.    在饑餓後，抓撓及處理含有細胞之孔。此時(亦即時間0 h)及24小時後獲取影像。 4.    使用Image J軟體分析影像。
對暴露於城市粉塵污染之角質細胞的細胞存活率的影響。用角蛋白多肽預處理HaCaT細胞且接著將其暴露於2 mg/ml政府認證之城市粉塵樣品。  方案： 1.    將細胞匯合時接種於96孔培養盤中。 2.    細胞用多肽處理24小時(亦即在細胞暴露於城市粉塵之前預處理細胞)。 3.    製備所需城市粉塵濃度，且將細胞暴露於其中24 h。 4.    在城市粉塵暴露後，儲存上清液以運作不同發炎性細胞介素且將細胞與MTT染料一起在37℃下培育60分鐘。 5.    MTT由活細胞代謝成甲䐶鹽。 6.    使用異丙醇溶解此等鹽且所產生之顏色使用細胞培養盤讀取器定量。
抗氧化能力。氧自由基吸收能力(ORAC)分析(使用螢光讀數之無細胞分析)用於展示角蛋白多肽之抗氧化能力。資料以Trolox (維生素E)當量報導。
對受UVB光照射之角質細胞之發炎的影響。用40 mJ/cm 2UVB光照射人類初代角質細胞，且隨後用0.15%膠原蛋白-角蛋白融合多肽處理24小時。接著藉由ELISA測定促發炎細胞介素(諸如IL-1a)之含量。 實例 13 . 對含有角蛋白多肽之局部皮膚護理產品之人類臨床研究
評定角蛋白多肽調配物相較於安慰劑產品之抗皺功效的抗老化研究。入選面部具有健康皮膚而在眶周區域中具有可見皺紋之女性個體。皮膚水合作用藉由Corneometer量測，皮膚彈性及緊緻度藉由Cutometer量測，且表皮厚度藉由Vivascope量測。另外，進行細紋及皺紋、亮度及發紅之客觀評估，且獲取影像(Colorface)以用於影像分析。在第一次產品施加之前、施加之後即刻以及在產品施加之4及12週之後進行評定。此外，個體將填寫關於產品性狀之調查表。
參數-P1：目測評定：細紋及皺紋、亮度、發紅之外觀[經訓練評分員]；P2：皮膚水合作用[Corneometer]；P3：皮膚彈性及緊緻度[Cutometer]；P4：皮膚厚度[Vivascope]；P5：攝影成像，全臉及概況(左及右)，CP，Std60 [ColorFace]；P6：影像分析(例如細紋及皺紋，暗斑) [Newtone]；P7：調查表(至多10個問題) [個體]。
測試區域-抗皺特性(皮膚粗糙度)之量測在眶內，亦即在表面凹陷(crowfeet)區中進行。評估化妝品對面頰骨之皮膚保濕及緊緻作用。以面部分區(split-face)設計進行研究。測試程序第1天：在適應P1-P5之後進行基線量測；向個體施配測試產品；在監督下由個體施加測試產品，P1-P5、P7；第2-85天：由個體在家施加測試產品，每天兩次；第29天：適應之後進行量測：P1-P5；第57天：經由電話進行符合性檢查；第86天：適應之後進行量測：P1-P5、P7，返還產品。
在第86天之後：P6。
小組100名女性個體(大約每產品33名)年齡在35歲與70歲之間，根據proDERM分數3至6，有可見眼紋，無其他具體納入。每產品有28名個體完成。對個體進行探索性、隨機化盲法；個體內比較；面部分區；安慰劑對照；每個子組進行測試產品與安慰劑之間的比較；進行評定時間(在產品施加之前的基線第1天、在產品施加之後的第一天、在產品施加之4及12週之後)之間的比較。
分別進行每個測試產品之時間分析比較P1-P4；P6、P7之描述性統計資料；各測試產品相對於參考產品之比較。
氣候條件：所有研究均在空調完全覆蓋之房間中進行，特別是在限定的小組成員環境適應時段之後針對上述測試配備。最後一次施加通常在量測之前的晚間進行。
Cutometer-藉由量測總彈性及彈性恢復得到皮膚緊緻度。用Cutometer量測皮膚彈性。量測原理係基於吸入法。在量測頭中，誘導設定為300 mbar之真空。所量測區域上之皮膚吸入至量測頭之開口中5秒，在釋放之後進行另一5秒之後續量測時段。使用光學量測系統，無接觸地偵測皮膚吸入至量測頭中的距離；此值給出皮膚彈性的量測。根據所得量測曲線，計算2個參數：總彈性Uf及彈性鬆弛與總彈性之商Ur/Uf。
Corneometer-皮膚水合作用。角質層水合作用之量測係藉由電容法用CorneometerCM 825 (Courage & Khazaka, Cologne, Germany)進行。量測原理係基於充當冷凝器之量測頭之電容的變化。在由金組成之導體之間，建構電場。藉由此等方式，量測上部皮膚層之介電性。因為介電性隨皮膚含水量而變化，所以可量測角質層水合作用。Corneometer值之增加展示皮膚保濕作用。
調查表-自我評定。個體將在研究結束時在具有至多10個問題的調查表中判斷測試產品。調查表由封閉式問題組成，其中預限定一致選項打勾。若調查表嚴重偏離給定結構，則會消費額外成本。
藉由經訓練評分員，對細紋及皺紋、亮度及發紅之外觀進行客觀評估。
VivaScope-表皮厚度。VivaScope®1500係用於活體內共聚焦掃描雷射顯微法之裝置。共聚焦顯微法為允許對不透明物體(例如皮膚)進行光學切面的技術。使用此技術，皮膚可在其天然狀態下活體內成像而無需進一步準備。此方法能夠活體內定位皮膚至多350 μm深度，其視皮膚類型而定，因為皮膚內之不同微結構自然引起折射率之變化，且因此該方法提供具有對比度之影像。舉例而言，具有接近於水之折射率(反射率1.33)的折射率的細胞質被描繪為具有極低對比度。然而，黑色素及角蛋白(折射率1.7)具有相對較高的折射率且因此充當天然對比劑。VivaScope® 1500可活體內產生具有小於5微米之光學切面厚度的皮膚切面，且因此與組織學皮膚切面相當。VivaCam®宏觀攝影機允許捕獲測試區域之宏觀影像且將共聚焦影像與宏觀影像關聯。
藉由Newtone進行影像分析：
色斑。參數：比色可視性；斑點中及斑點外部之顏色參數(基於基線斑點偵測)；對比形態可視性之計算-與皮膚形成對比：顯著區域(與膚色形成對比之表觀表面偵測，基於各時間點之斑點偵測)，模式：CP，觀察：概況。
多色斑。參數：色斑中及外部，面積，L*，a*，b*，dE76對比度，模式：CP，觀察：概況。
魚尾紋。參數：明顯長度、明顯表面、明顯深度以及明顯體積，模式：標準60，觀察：概況。
鼻唇溝。參數：明顯長度、明顯表面、明顯深度以及明顯體積，模式：標準60，觀察：前表面。
可能與輻射率相關的指數。參數：飽和度、發光度、與輻射相關之參數，模式：CP及Std60，觀察：概況。
眼下皺紋。參數：明顯長度、明顯表面、明顯深度以及明顯體積，模式：標準60，觀察：前表面。
前額皺紋。參數：明顯長度、明顯表面、明顯深度以及明顯體積，模式：標準60，觀察：前表面。
藉由Colorface進行皺紋分析(魚尾紋、鼻唇溝、眼下皺紋及前額皺紋；藉由Colorface進行顏色/色調分析(色斑、多色斑，與輻射相關的指數、孔)。 實例 14 . 對含有角蛋白多肽之頭髮護理調配物的人類臨床研究
頭髮拉直。測試調配物拉直頭髮之能力。選擇部分卷的頭髮量用於測試程序。各處理樣品包括12根頭髮，各約50 mm長。為模擬受損頭髮，將一些樣品用10%漂白劑處理10分鐘，隨後用水沖洗。將膠原蛋白-角蛋白融合蛋白的水溶液施加至天然頭髮及經漂白處理的頭髮。
頭髮光澤度。測試調配物增加頭髮光澤之能力。製備大致各100根頭髮(8吋長)的剛洗過且剪下的頭髮測試髮束樣品。將膠原蛋白-角蛋白融合蛋白之水溶液施加至頭髮。在一些情況下，使髮束在室溫下乾燥，且重複施加2次或3次。一個髮束樣品未經處理，作為陰性對照。將可商購的光澤劑施加至髮束樣品作為陽性對照。在室溫下乾燥1小時之後，使用光澤計量測髮束光澤度。光澤計為一件設計成量測頭髮光澤度的設備。頭髮表面的規則性有助於判定光反射。當光沿著均勻表面時，如在鏡面中，入射角正好等於反射角。然而，頭髮並非完全均勻，且在一些點處，光束經反射形成不同角度。光澤計可容易地定量頭髮處理增加髮束光澤的能力。
頭髮光澤/光彩度。針對各處理，製備4公克及20公分長之三種經漂白II型髮綹。在洗髮精處理之後，將呈護髮洗淨產品形式之調配物施加至濕髮。使產品在頭髮中停留10分鐘。接著自頭髮沖洗過量產品。將頭髮風乾1小時。隨後使用閃爍室(shine chamber)拍攝髮綹。拍攝各髮綹之兩個影像以便獲得漫反射(正交極化)及鏡面反射(平行極化)。反射係藉由內部開發之軟體計算且經儲存用於光澤度計算。相較於對照，統計分析結果。
對頭髮之保護作用。在藉由施加燙髮器進行熱處理之前及之後，藉由熱解重量分析(TGA)使用aa 4000 TGA系統(Perkin Elmer, Waltham, MA, US)檢查經處理及未處理之髮束的含水量損失。以15℃/分鐘自30℃至250℃進行量測。為了評估熱保護，製備1公克及15公分長之一根經漂白II型頭髮纖維用於各處理。在洗髮精處理之後，將呈護髮洗淨產品形式之調配物施加至濕髮。使產品在頭髮中停留10分鐘。接著自頭髮沖洗過量產品。頭髮經風乾1小時，接著在450℉下平燙1分鐘。接著藉由差示掃描熱量測定分析經熱處理之髮綹。分析含有10 mg頭髮之五個坩堝，計算且統計分析角蛋白變性之焓。焓愈高，熱保護愈高。
頭髮順滑度。使用標準SEM顯微攝法測試調配物使單根頭髮之表面順滑的能力。製備大致各100根頭髮(8吋長)的剛洗過且剪下的頭髮測試髮束之若干髮簇。將多肽水溶液施加至頭髮。已施加上述基礎調配物但不用多肽之對照髮簇亦包括於測試中。使髮簇在室溫下乾燥兩小時。選擇且使用此項技術中可用之標準方法製備各處理髮簇之個別頭髮以用於SEM顯微攝影術。針對對照與經膠原蛋白-角蛋白處理之頭髮之間的差異，檢查顯微攝影影像。以目視檢查頭髮之光亮度，且用顯微鏡檢查可見裂縫、缺口及/或裂紋。
經漂白頭髮之頭髮順滑度。針對各處理，製備5公克及20公分長之六綹經漂白II型頭髮。在洗髮精處理之後，將呈護髮洗淨產品形式之調配物施加至濕髮。使產品在頭髮中停留10分鐘。接著自頭髮沖洗過量產品。將頭髮風乾1小時。接著使用連接至Instron模型5565之輔助系統分析頭髮。使髮綹穿過直徑為12 mm且寬度為20 mm之Teflon環，且阻力以及位移藉由Instron記錄。對平均能量(力相對於位移之曲線下面積)進行統計比較，其中能量愈低，頭髮順滑度愈高。
頭髮厚度。大致50根頭髮之髪簇各自未處理或用8%漂白劑進行化學處理1小時，隨後沖洗且乾燥，以便模擬在某些美髮處理期間發生的頭髮受損類型。將多肽於基礎調配物中之溶液或單獨的基礎調配物施加至各種髮簇。隨後頭髮用水沖洗三次且風乾兩小時。在用膠原蛋白-角蛋白融合蛋白處理之前及之後使用倒置顯微鏡量測頭髮直徑。
使用水解多肽調配物之頭髮厚度及健康狀況。如本文所述產生1公克量之角蛋白多肽。此藉由在10%鹽酸中沸騰4小時而水解成較短多肽。冷卻混合物且用NaOH中和至pH 6.0。過濾混合物，且將其噴霧乾燥成粉末。自若干志願者(具有不同頭髮類型)獲取髪簇(每髪簇約70根頭髮，長度約15 cm)。製備水解產物粉末於水中之1%溶液。將溶液施加至正常頭髮或經漂白之受損頭髮上。為接近個體之護髮素之典型使用情況，該等髮簇用洗髮精洗滌，沖洗，且接著在皮氏培養皿(petri dish)中在膠原蛋白-角蛋白水解產物溶液中培育10分鐘。該等髮簇用水沖洗1分鐘，使其乾燥，且該過程重複2次，相隔24小時(再次接近個體之使用情況)。接著使用共聚焦顯微法檢查頭髮以判定直徑變化、髮束健康狀況以及頭髮表面的裂縫及裂隙(亦即髮束的順滑度)。拍攝頭髮截面之數位影像，且定量未處理與經處理之頭髮之間的頭髮直徑差異。
延長之治療、評估及自我報導。選擇標準護髮配方。向此調節劑中添加角蛋白多肽(粉末形式)或角蛋白多肽之水解產物(粉末形式)且充分混合直至溶解。在雙盲研究中，給與志願者單獨的護髮素，或護髮素加多肽，以便添加至其每日常規頭髮護理。在3週之後，對志願者頭髮取樣，且針對以下測試：可梳理性、光澤度、強度、水合作用及熱損傷(諸如燙髮)保護。志願者報告頭髮特徵，例如強度、水合作用、光澤度、觸感、可梳理性及保護免受熱損傷。
頭髮斷裂。選擇四綹經漂白II型頭髮(大致3公克及20公分長)用於各處理。將含有1%角蛋白多肽之頭髮處理產品施加至頭髮樣品且使其在室溫下乾燥1小時。接著將髮綹插入自動刷洗機器(BLPA 101)中，其中該等髮綹以1000次為週期刷洗8000次。在各週期之後，對斷裂纖維之數目進行計數，且進行平均斷裂纖維值之統計比較。
頭髮強度/拉伸強度。製造50根60 mm長之經漂白頭髮纖維用於各處理。將含有1%角蛋白多肽之頭髮處理產品施加至頭髮纖維且使其在室溫下乾燥1小時。隨後使用Instron模型5565拉伸測試系統分析髮束，其中記錄各纖維的機械特性。針對以下三個因素評估平均拉伸曲線的三個主要參數：最大壓力(斷裂時的壓力，其為纖維強度的指標)、楊氏模數(Young modulus) (虎克區域(Hookean region)的彈性模數，其為纖維剛性的指標)以及最大應變(斷裂時的應變)。統計分析結果。
分叉末梢之修復。製備六綹經漂白II型頭髮(但在其他方面不處理)用於各處理。接著將髮綹插入於自動刷洗機器(BLPA 101)中，其中該等髮綹經刷洗2000次。接著對分叉末梢進行計數。將調配物施加至頭髮上，且使其在室溫下乾燥3小時。再計數分叉末梢，且統計分析結果。
頭髮捲曲度及體積。製備六綹經漂白III型頭髮用於各處理。將呈留存型洗髮產品形式之調配物施加至髮綹，且將髮綹置放於濕度及溫度控制室中，該等髮綹將保持在該腔室中24小時(55±5%相對濕度(RH)；22±2℃)。隨後拍攝髮綹，且使用數位成像軟體分析影像以測定捲曲度及體積的水平(T0)。隨後將髮綹重新插入濕度及溫度控制室中，該等髮綹將保持在該腔室中24小時(85±5% RH；22±2℃)。拍攝髮綹且再次分析(T24)，且在兩個時間點之處理之間統計比較捲曲度及體積之值。
頭髮捲曲保持度。製備六綹原生VI型頭髮(捲曲)用於各處理。在洗髮精處理之後，將呈護髮洗淨產品形式之調配物施加至濕髮。使產品在頭髮中停留10分鐘。接著自頭髮沖洗過量產物，且將頭髮風乾1小時。拍攝頭髮且使用數位成像軟體分析以量測捲曲度及體積、捲髮數目及長度(T0)。隨後，將髮綹插入濕度及溫度控制室中，該等髮綹將保持在該腔室中24小時(85±5% RH；22±2℃)。拍攝且再次分析髮綹(T24)，且在兩個時間點之處理之間統計比較捲曲度及體積、捲髮數目及長度之值。
對頭髮纖維之顯微鏡分析。製備1公克及15公分長之經漂白II型頭髮纖維樣品用於各處理。在洗髮精處理之後，將呈護髮洗淨產品形式之調配物施加至濕髮。使產品在頭髮中停留10分鐘。接著自頭髮沖洗過量產品。將頭髮風乾1小時。隨後在以下處理步驟中之各者中藉由SEM顯微法檢查頭髮：在剛施加之後、在熱損傷及機械斷裂之後及在平燙損傷之後。使用數位成像軟體統計分析影像。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 15. 藉由 pH 調節純化重組蛋白
蛋白質純化為重組蛋白生產中的關鍵步驟，蛋白質純化可能耗時且耗資源。此實例中描述一種自微生物宿主細胞純化重組蛋白以獲得高純度重組蛋白產物之方法。此純化方法可用於純化細胞內保留的或分泌的重組蛋白。此純化方法亦可用於自細胞溶解物或上清液純化重組蛋白。純化方法之示意性工作流程繪示於 圖 1B中。
表現所關注重組蛋白之微生物宿主細胞之細胞溶解物可用作此純化過程之輸入材料。細胞溶解物可分離成可溶部分及不可溶部分(例如使用離心)。來自包含微生物宿主細胞之細胞培養基的上清液亦可用作此純化方法之輸入材料，該等宿主細胞表現所關注重組蛋白。上清液可類似地分離成可溶部分及不可溶部分(例如使用離心)。
首先，分離出的可溶部分可用酸(例如H 2SO 4)處理至約5之pH以產生經酸化處理之混合物，隨後將經酸化處理之混合物分離成可溶及不可溶部分。可重複酸處理及分離步驟以將可溶部分調節至約4之pH，隨後調節至約3之pH。此方法極大地減少污染蛋白質，諸如內源性宿主細胞蛋白，從而產生高純重組蛋白產物( 圖 2 ， 實例 1 ； 圖 6 - 實例 4)。在藉由質譜分析進行分析時，此純化方法可產生高純度純化重組蛋白產物，其中純度定義為相對於所存在之所有蛋白質，含有與目標蛋白匹配之序列的蛋白質之百分比。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
實例 16 . 本發明之重組角蛋白融合多肽沈積於頭髮表面上 .
進行此實例以測定本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)之頭髮表面沈積水平，一種可影響藉由施加融合多肽而加強之益處的持久性之特性。使用在pH 4下調配的包含1%重組角蛋白融合多肽的溶液評估在各種施加方案的情況下漂白過三次之I型頭髮(經3次漂白之I型頭髮)之表面上之頭髮表面沈積。用於此實驗之具有SEQ ID NO: 71之胺基酸序列的重組多肽用Cy5共軛NHS酯標記，使得能夠使用螢光顯微法(EVOS M5000, ThermoFisher Scientific)觀測髮束上之重組角蛋白融合多肽。
將髮束浸沒於1%包含重組角蛋白融合多肽之溶液中，且將兩端保持在溶液外部，進行1、3或5次施加(每次施加5分鐘)，或持續1小時。髮束在各次施加之後用去離子水洗滌30秒且在兩層實驗室擦拭紙片之間輕輕按壓來乾燥。
使用螢光顯微法評估重組角蛋白融合多肽頭髮表面沈積，其中使用ImageJ定量頭髮表面沈積( 圖 12)。此處所描述之螢光強度定義為頭髮之平均灰度值(8位元)減去背景之平均灰度值。資料展示重組角蛋白融合多肽在施加1次及洗滌循環之後即於頭髮表面上可見( 圖 12)。此外，資料證實，藉由螢光強度之增加表明，重組角蛋白融合多肽在頭髮表面上之沈積隨著重複施加而增加( 圖 12)。此外，可以看到，經由5次短暫施加達成的重組角蛋白融合多肽頭髮表面沈積的程度可以用單次1小時培育期再現( 圖 12)。總體而言，資料展示重組角蛋白融合多肽在一次短暫施加之後沈積於頭髮表面上，且更多重組角蛋白融合多肽可藉由增加施加頻率或持續時間而沈積於頭髮表面上。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
實例 17 . 本發明之重組角蛋白融合多肽滲透髮束 .
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)滲透髮束的能力，一種可影響重組角蛋白融合多肽之有益作用的效能及持久性的特性。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽的溶液評估用各種施加方案漂白三次的I型頭髮(3×漂白I型頭髮)之滲透。此實驗中所用之重組角蛋白融合多肽用Cy5共軛NHS酯標記，使得能夠使用螢光顯微法觀測髮束上之重組角蛋白融合多肽。
將髮束浸沒於包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液中，且將兩端保持在溶液外部，進行1、3或5次施加(每次施加5分鐘)，或持續1小時。髮束在各次施加之後用去離子水洗滌30秒且在兩層實驗室擦拭紙片之間輕輕按壓來乾燥。製備經處理頭髮之截面以用於後續藉由螢光顯微法(EVOS M5000, ThermoFisher Scientific)成像。
使用螢光顯微法評估重組角蛋白融合多肽頭髮滲透，其中使用ImageJ定量滲透( 圖 13)。此處所描述之螢光強度定義為頭髮之平均灰度值(8位元)減去背景之平均灰度值。資料展示重組角蛋白融合多肽在施加1次及洗滌循環之後即於頭髮之皮質中可見( 圖 13)。與頭髮表面沈積研究結果類似，重組角蛋白融合多肽頭髮滲透隨著重複施加而增加，且5次短暫重複施加之作用可用單次1小時培育再現( 圖 13)。綜合而言，資料展示重組角蛋白融合多肽在短暫施加1次之後即可有效地滲透頭髮皮質，且增加重組角蛋白融合多肽施加之頻率或持續時間可實質上增進重組角蛋白融合多肽滲透。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 18 . 本發明之重組角蛋白融合多肽抵抗多 次洗髮循環 .
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)抵抗多次洗髮循環的能力，一種可影響藉由重組角蛋白融合多肽施加而加強之益處的持久性之特性。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型頭髮(經3次漂白之I型頭髮)。此實驗中所用之重組角蛋白融合多肽用Cy5共軛NHS酯標記，使得能夠使用螢光顯微法(EVOS M5000, ThermoFisher Scientific)觀測髮束上之重組角蛋白融合多肽。
藉由將髮束浸沒於1%包含重組角蛋白融合多肽之溶液中1小時，接著用去離子水洗滌30秒來將重組角蛋白融合多肽施加至髮束。藉由在兩層實驗室擦拭紙片之間輕輕按壓髮束來乾燥髮束。接著，髮束經歷由以下組成的洗髮循環：1)浸泡於2%月桂基硫酸鈉(SLS)溶液中1分鐘，2)用去離子水沖洗30秒，及3)藉由在兩層實驗室擦拭紙片之間輕輕按壓髮束來乾燥。經處理的髮束經歷0、1、3或5次連續洗髮循環。製備髮束及頭髮截面以用於後續藉由螢光顯微法成像。
經表面上及皮質內之剩餘重組角蛋白融合多肽的存在證明，重組角蛋白融合多肽抵抗多次洗髮循環( 圖 14)。值得注意地，當與經重組角蛋白融合多肽處理的未經洗髮精洗髮的髮束相比時，經歷5次連續洗髮循環之髮束在皮質中仍然保持約50%的重組角蛋白融合多肽( 圖 14)。此資料強調重組角蛋白融合多肽之穩定性及對於頭髮護理之長久效能潛力。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 19 . 本發明之重組角蛋白融合多肽促進頭髮熱保護 .
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)賦予頭髮熱保護之能力。使用在pH 4下使用氫氧化鈉調配之包含1%重組角蛋白融合多肽的溶液施加至歐洲中棕色髮綹。
首先用15%月桂基硫酸鈉(SLES)溶液(0.1 mL/g 乾髮)清洗髮綹且隨後在毛巾上乾燥，重複3次清洗循環。除用1 mL去離子水處理之對照髮綹以外，將1%重組角蛋白融合多肽溶液作為留存型處理劑施加至清洗過的髮綹(0.2 mL/g 乾髮)。接著，除一縷未進行熱處理之對照髮綹以外，使髮綹經歷由熨斗450℉ (232℃)之10次衝程組成之熱損傷方案。在熱處理之後，髮綹用15% SLES溶液清洗，在去離子水中培育隔夜，且隨後乾燥隔夜。收集來自頭髮中間部分之纖維片段以用於使用差示掃描熱量測定分析。
用1%重組角蛋白融合多肽溶液處理之頭髮在熱損傷之後具有比未處理之頭髮(對照)高的變性溫度，表明當與未處理之頭髮(對照)相比時，重組角蛋白融合多肽改進基質交聯密度( 圖 15)。資料清楚表明用1%重組角蛋白融合多肽溶液預處理之頭髮可促進顯著熱保護。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 20 . 本發明之重組角蛋白融合多肽改善頭髮柔韌度 .
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對頭髮柔韌度之影響。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)。
首先用20% SLS溶液(0.4 g/g 乾髮)清洗髮綹，且隨後在85% RH下乾燥24小時。將1%重組角蛋白融合多肽溶液施加至乾髮綹(0.2 g/g 乾髮)，靜置5分鐘，且隨後在流水下沖洗15秒。使一些髮綹經歷多次重組角蛋白融合多肽施加及乾燥循環。在第1次及第5次施加之後在85% HR下乾燥髮綹24小時，但在其他情況下在施加之間使用冷風設置吹乾。對於留存型施加條件，不對測試條件進行靜置或沖洗。
在基線之後及在1及5次處理施加之後，使用目標距離為10 mm之TA XT (Stable Microsystems)對髮綹進行3點彎曲測試。低彎力指示頭髮更加柔軟，且可解釋成柔韌的頭髮，具有較自然頭髮移動。資料展示重組角蛋白融合多肽作為沖洗型處理劑施加減小彎曲髮綹所需力，表明重組角蛋白融合多肽作為沖洗型處理劑施加使頭髮更柔韌( 圖 16)。增加沖洗型處理劑施加之次數進一步減小彎曲髮綹所需力，指示頭髮柔韌度隨著增加沖洗型處理劑施加頻率而增加( 圖 16)。相比之下，用重組角蛋白融合多肽作為留存型處理劑護理之髮綹增加彎曲髮綹所需力( 圖 16)。
總體而言，可以看到，重組角蛋白融合多肽在賦予柔韌度或硬度方面可為通用的，視施加方案而定。可將重組角蛋白融合多肽施加至頭髮且在需要柔韌的頭髮時將其沖洗掉，且替代地，可將重組角蛋白融合多肽施加至頭髮且出於定型及頭髮可管理性目的而將其留在上面。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 21 . 本發明之重組角蛋白融合多肽改善式樣保持 度 .
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對頭髮式樣保持度的影響。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)或原生I型髮綹。
首先用20% SLS溶液(0.4 g/g 乾髮)清洗髮綹。將1%重組角蛋白融合多肽溶液施加至濕髮綹(0.2 g/g 乾髮)；對照髮綹不施加重組角蛋白融合多肽。隨後將濕髮綹在0.2吋塑膠捲髮器中卷壓且在85% RH下乾燥隔夜。在乾燥隔夜之後，自髮綹移除塑膠捲髮器且將髮綹置放於設定在85% RH下之頭髮影像獲取系統(Shuffle, Bossa Nova Vision)中，其中在初始設置時間及24小時後獲取影像( 圖 17)。在此實例中使用兩個度量值定量髮型保持度。首先，長度保持度定義為初始頭髮長度與最終頭髮長度之間的比率。第二，相對於對照之最終長度差異定義為對照髮綹與經處理之髮綹樣品之間的最終長度差異，相對於對照髮綹之最終長度正規化。資料展示經3次漂白之I型髮綹保持其初始長度之57%，而原生型髮綹保持其初始長度之62% ( 圖 17)。重要地，發現用重組角蛋白融合多肽處理之兩種頭髮類型之髮綹比對照對應髮綹短( 圖 17)，指示重組角蛋白融合多肽處理可改善式樣保持度。亦可注意到，重組角蛋白融合多肽處理可在施加至受損頭髮，諸如經3次漂白之I型髮綹時加強較強式樣保持度益處。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 22 . 當作為留存型處理劑施加時，本發明之重組角蛋白融合多肽改善捲髮控制
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對捲髮控制之影響。使用在pH 4下調配之包含0.1%或1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)、原生I型髮綹或原生IV型髮綹。
首先用20% SLS溶液(0.4 g/g 乾髮)清洗髮綹。將重組角蛋白融合多肽溶液施加至濕髮綹(0.2 g/g 乾髮)；對照髮綹不施加重組角蛋白融合多肽。接著將髮綹置放於設定在85% RH下之頭髮獲取系統(Shuffle, Bossa Nova Vision)中，其中在初始設置時間及24小時之後獲取影像( 圖 18)。對各樣品之捲曲表面之變化進行定量且計算捲曲表面相對於對照髮綹之平均變化，使得負值指示當與未處理之對照髮綹相比時捲曲度減小。
資料展示用0.1%重組角蛋白融合多肽溶液作為留存型處理劑施加處理之經3次漂白之I型髮綹及原生I型髮綹之表面捲曲度減小( 圖 18)。相對於未處理之原生IV型頭髮，在原生IV型髮綹上施加以較高劑量之包含重組角蛋白融合多肽(1%)之溶液亦展現了捲髮控制之改善( 圖 18)。資料展示，重組角蛋白融合多肽在作為留存型處理劑施加時可改善各種頭髮類型之捲髮控制。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 23 . 當作為 沖洗型處理劑施加時 ， 本發明之重組角蛋白融合多肽改善捲髮控制
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對捲髮控制之影響。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)、原生I型髮綹或原生IV型髮綹。
首先用20% SLS溶液(0.4 g/g 乾髮)清洗髮綹。將1%重組角蛋白融合多肽溶液施加至濕髮綹(0.2 g/g 乾髮) 5分鐘且隨後用水沖洗15秒；對照髮綹不施加重組角蛋白融合多肽。接著將髮綹置放於設定在85% RH下之頭髮獲取系統(Shuffle, Bossa Nova Vision)中，其中在初始設置時間及24小時之後獲取影像( 圖 19)。對各樣品之捲曲表面之變化進行定量且計算捲曲表面相對於對照髮綹之平均變化，使得負值指示當與未處理之對照髮綹相比時捲曲度減小。
資料展示用1%重組角蛋白融合多肽溶液作為留存型處理劑施加處理之經3次漂白之I型髮綹及原生I型髮綹之表面捲曲度實質性減小( 圖 19)。資料展示重組角蛋白融合多肽當作為沖洗型處理劑施加時亦可改善各種頭髮類型之捲髮控制。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 24 . 本發明之重組角蛋白融合多肽影響梳理性
進行此實例以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對頭髮梳理性的影響。使用在pH 4下調配之包含0.1%或1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)。首先用20% SLS溶液(0.4 g/g 乾髮)清洗髮綹。將重組角蛋白融合多肽溶液作為留存型或沖洗型處理劑施加至濕髮綹(0.2 g/g 乾髮)。在可沖洗掉條件下使重組角蛋白融合多肽溶液在髮綹上靜置5分鐘且隨後用水沖洗15秒，而在留存型條件下使重組角蛋白融合多肽溶液保留在髮綹上。使用配備有測力計之質構分析儀(TA.XT Plus Connect, Stable Micro Systems)進行梳理測試以量測梳力，該力為將梳子梳過髮綹所必需的。髮綹由連接至測力計之夾具緊固，藉由連接至儀器之基座的平台固持在適當位置。自動臂移動髮綹穿過梳子，同時量測作為梳力達到程式化移位所需之力。可在頭髮乾燥時進行測試。測試亦可在頭髮潮濕時進行用於濕髮梳理測試；潮濕的頭髮亦可隨後經乾燥以用於乾髮梳理測試。梳力解釋為可使頭髮梳順及解開髮結的容易度，且較低梳力可指示頭髮較易於梳理及解開髮結。在重組角蛋白融合多肽施加之前對髮綹進行基線梳力量測。相對於基線梳力計算重組角蛋白融合多肽處理之後的梳力之變化，使得梳力之正增加指示重組角蛋白融合多肽處理之後的梳力增加。
資料展示，向頭髮施加重組角蛋白融合多肽增加濕髮梳力，而較低劑量之重組角蛋白融合多肽可減小乾髮梳力( 圖 20)。相比之下，增加重組角蛋白融合多肽在頭髮表面上之沈積，例如經由使用具有較高濃度之組合物或增加施加頻率，可增加乾髮梳力( 圖 20)。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 25 . 本發明之重組角蛋白融合多肽呈現抗氧化特性
進行ORAC分析(OxiSelect™ Oxygen Antioxidant Capacity (ORAC) Activity Assay, Cell Biolabs, Inc.)以評估在各種濃度下之本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)之抗氧化能力。將重組角蛋白融合多肽樣品以1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL及10 mg/mL稀釋於套組中提供之分析稀釋劑(1×)中；遵循製造商說明書進行分析且資料以Trolox (維生素E)當量報導。資料展示，當與陽性對照(200微莫耳Trolox； 圖 21)相比時，重組角蛋白融合多肽在大於2.5 mg/mL之濃度下具有顯著較高的ORAC指數，表明重組角蛋白融合多肽呈現實質性抗氧化特性。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 26 . 本發明之重組角蛋白融合多肽改善細胞群存活率，促進頭髮及頭皮健康
進行MTT分析以評估本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對纖維母細胞及角質細胞之細胞存活率的影響。在培育箱(維持在37℃及5% CO 2下)中每孔接種5,000個纖維母細胞及10,000個角質細胞。在24小時之後，移出廢細胞培養基且用含有0.125-10 mg/mL重組角蛋白融合多肽之新鮮培養基補充且在培育箱中再培養24小時。移出含有重組角蛋白融合多肽之廢細胞培養基，且隨後在培育箱中在MTT溶液中培育細胞4小時。在MTT培育期結束時添加二甲亞碸(DMSO)以溶解細胞且使用分光光度計在550 nm處進行吸光度讀取。
與未處理之對照相比，將纖維母細胞培養物與0.5 mg/mL、1 mg/mL及5 mg/mL重組角蛋白融合多肽一起培育引起細胞存活率之顯著增加( 圖 22A)。與未處理之對照相比，將角質細胞培養物與0.5 mg/mL重組角蛋白融合多肽一起培育亦引起細胞存活率之顯著增加( 圖 22B)。重要地，在所有測試條件下重組角蛋白融合多肽不會對纖維母細胞及角質細胞存活率帶來任何損害( 圖 22)。資料表明重組角蛋白融合多肽活體外無毒且可改善纖維母細胞及角質細胞存活率。綜合而言，可以看到，重組角蛋白融合多肽可顯著改善細胞群存活率，促進頭髮及頭皮健康，由此增進期望的頭髮及頭皮特性。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 27 . 本發明之重組角蛋白融合多肽賦予顯著的傷口癒合益處
進行如實例12中所述之活體外傷口癒合分析以評估由本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)提供之傷口癒合益處。傷口癒合為與生物醫學(例如傷口修復)及美容及個人護理(例如皮膚護理、頭皮護理)極其相關的重要生物過程。
本文所描述之傷口癒合分析亦可用於說明重組角蛋白融合多肽對纖維母細胞之傷口癒合益處。總體而言，資料展示，重組角蛋白融合多肽展現顯著的傷口癒合益處，在此分析中量測為細胞遷移，勝過HAK對應物( 圖 23)。此類活體外傷口癒合益處可解釋為例如藉由增進皮膚及頭皮護理之表皮完整性而在美容及個人護理應用中之益處。此外，此類傷口癒合益處亦可提高生物醫學應用中的傷口修復成效。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 28 . 評估本發明之重組角蛋白融合多肽 對頭髮持久性之影響
本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對頭髮耐久性的影響將藉由疲乏試驗來評估。使用在pH 4下調配之包含1%重組角蛋白融合多肽之溶液施加至將會漂白過三次之I型髮綹(經3次漂白之I型髮綹)。
髮束將浸泡在1%重組角蛋白融合多肽溶液中5分鐘，且兩端在溶液外部，持續施加5或10次。髮束將在每次施加之後用去離子水洗滌30秒，且在兩層實驗室擦拭紙片之間輕輕按壓以在各次施加循環之間乾燥。藉由疲乏試驗，使用CYC801環狀測試儀(Diastron)來評估髮束的持久性。在此測試中，頭髮經歷較小變形(低應變)且對各頭髮纖維量測失效(斷裂)前應變/鬆弛循環之次數；在此設置中亦可計算存活時間。相較於未處理之頭髮，預期重組角蛋白融合多肽施加可改善頭髮持久性。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 29 . 本發明之重組角蛋白融合多肽與用於頭髮護理之代表性膠原蛋白之間的比較
此實例比較本發明之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)及代表性膠原蛋白(纖維狀水螅蟲(hydrozoan/ Podocoryna carnea)膠原蛋白之截短)對頭髮特性的影響。將重組角蛋白融合多肽及代表性膠原蛋白兩者施加至髮綹且隨後評估其對頭髮之影響。選擇梳力及捲髮控制為代表性測試，分別如實例24及實例22中所概述，以評估多肽對頭髮之影響。結果說明，用重組角蛋白融合多肽處理之頭髮之梳力的增加(△梳力)低於用代表性膠原蛋白處理之頭髮之梳力的增加( 圖 24A)。此表明，當與用代表性膠原蛋白處理頭髮相比時，用重組角蛋白融合多肽處理頭髮可引起頭髮與梳子間摩擦力之較大減小。結果進一步說明，當與經代表性膠原蛋白處理之髮綹相比時，經重組角蛋白融合多肽處理之髮綹呈現優異的捲髮控制( 圖 24B)。綜合而言，此實驗中收集之資料表明重組角蛋白融合多肽組合物當與代表性膠原蛋白組合物相比時賦予優異的頭髮益處。亦預期，當與代表性膠原蛋白組合物相比時，重組角蛋白融合多肽可賦予優異的頭髮拉伸強度及熱損傷抗性。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。 實例 30 . 溶解度增進肽融合物在原核及真核宿主細胞中之表現
此實例證實本發明之代表性多肽在原核及真核宿主細胞兩者中之重組表現。使用「C196-K50」(SEQ ID NO: 71)多肽驗證 大腸桿菌及人類胚胎腎 ( HEK293 ) 細胞中之重組表現，該多肽為196 aa之人類膠原蛋白I型α1多肽片段(SEQ ID NO: 28)與50 aa之人類角蛋白31型多肽(SEQ ID NO: 11)的融合物。遵循實例1之方法， 使「 C196 - K50 」多肽表現於大腸桿菌中。HEK293細胞經短暫轉染以表現重組「C196-K50」多肽。
使用SDS-PAGE，接著用庫馬斯藍染色蛋白質確認大腸桿菌及HEK293細胞中之「C196-K50」表現( 圖 18A，左側)展示預測尺寸下之蛋白質條帶。藉由西方墨點分析，使用角蛋白特異性抗體進一步驗證「C196-K50」表現( 圖 18A，右側)。使用H 2SO 4使HEK293細胞培養提取物經歷pH 5、pH 4或pH 3之pH處理( 圖 1B)。藉由SDS-PAGE檢查不可溶及可溶部分，接著用庫馬斯藍染色蛋白質( 圖 18B)。觀測到可溶部分中之「C196-K50」在所有pH範圍內的預期尺寸下之較厚且清晰條帶( 圖 18B)，指示「C196-K50」蛋白質在低pH條件下穩定。
綜合而言，資料指示本文所描述之溶解度增進肽融合物，諸如代表性融合多肽「C196-K50」，可由原核宿主細胞及真核宿主細胞成功地表現。資料進一步例示在本文中描述為平台賦能技術的溶解度增進融合肽之效用，該技術可用於原核及真核宿主細胞兩者中。
綜合而言，資料指示本文所描述之溶解度增進肽融合物，諸如代表性融合多肽「C196-K50」，可由原核宿主細胞及真核宿主細胞成功地表現。資料進一步例示在本文中描述為平台賦能技術的溶解度增進融合肽之效用，該技術可用於原核及真核宿主細胞兩者中。
雖然已在本文中展示並描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者應顯而易見，此等實施例僅以舉例方式提供。熟習此項技術者現將在不背離本揭示之情況下想到許多變化、改變及取代。應理解，本文中所描述之本發明實施例的各種替代方案可用於實踐本發明之實施例。意欲以下申請專利範圍界定本發明之範疇，且藉此涵蓋此等申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
本文所揭示之主題的新穎特徵在隨附申請專利範圍中細緻闡述。參考以下闡述利用本文所揭示之主題之原理的說明性實施例之實施方式及隨附圖式將獲得對本文所揭示之主題的特徵及優點的較佳理解，其中：
圖 1A及 圖 1B為展示用於產生本發明多肽及用於測試其在各種pH值下之溶解度的方法的示意圖。 圖 1A為展示含有編碼所關注蛋白質之基因的細菌細胞如何在搖瓶中生長及所關注多肽如何經誘導且分泌於培養基中的圖式。 圖 1B為展示在細胞培養步驟( 圖 1A)之後，將來自離心細胞培養基之培養液用酸處理以達到若干pH級，接著再次離心的示意圖。移出各pH級下的等分試樣以用於分析。藉由SDS-PAGE檢查集結粒部分(不可溶)及上清液部分(可溶)中之蛋白質，接著用庫馬斯藍(Coomassie blue)染色蛋白質，以便測定在各種pH值下之表現及溶解度。
圖 2為SDS-PAGE凝膠之照片，展示各種人類角蛋白多肽在以與本發明之溶解度增進胺基酸序列之融合蛋白形式產生時(左側凝膠EFT 36)；及在培養基之pH調節至pH 3.0且分離成不可溶(集結粒)及可溶(上清液)部分之後(上清液展示於右側凝膠EFT 36-pH 3中)的表現及在培養基中之分泌。角蛋白多肽在pH處理之後保持可溶。最右側色帶展示在無溶解度增進胺基酸序列的情況下表現之角蛋白多肽，展示其在pH 3下不可溶。
圖 3為展示人類角蛋白31型多肽之產生的SDS-PAGE凝膠之照片。左側凝膠展示由自身表現之角蛋白31型多肽序列(「K31」)，且右側凝膠展示與衍生自人類I型α1膠原蛋白之溶解度增進胺基酸序列一起表現的相同序列(「HsCol1a1-27_K31」)。在醱酵結束(「EOF」)時，不處理含有分泌蛋白質之培養基或將其調節至pH 5、4或3。將培養基離心以分離呈集結粒(「Pel」)形式之不可溶部分及呈上清液(「Sol」)部分形式之可溶部分，且分析兩種部分中之蛋白質。最左側色帶：蛋白質尺寸標記。在各pH測試下進行酸處理之後，K31在酸處理之後存在於不可溶集結粒部分中，而HsCol1a1-27_K31存在於可溶上清液部分中。因此，溶解度增進胺基酸序列用於成功地產生及純化原本不可溶角蛋白31型多肽序列。
圖 4為SDS-PAGE凝膠之照片，展示用衍生自原雞屬(Gallus) 21型膠原蛋白之替代溶解度增進胺基酸序列(「GL21」)產生人類角蛋白31型多肽。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白質尺寸標記。因此，此溶解度增進序列亦用於成功地產生及純化目標角蛋白多肽(「*」)。
圖 5為SDS-PAGE凝膠之照片，展示用衍生自人類III型α1之另一替代溶解度增進胺基酸序列(「HsCol3a1-4」)產生人類角蛋白31型多肽。如上製備且分析樣品。因此，此溶解度增進序列亦用於成功地產生及純化目標角蛋白多肽(「*」)。
圖 6為SDS-PAGE凝膠之照片，展示使用衍生自人類I型α1膠原蛋白之各種長度的溶解度增進胺基酸序列(225個胺基酸(C225)、196個胺基酸(C196)、147個胺基酸(C130)、64個胺基酸(C64)及25個胺基酸(C25))產生人類角蛋白31型多肽。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白尺寸標記。在圖下指示各角蛋白多肽之膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列與角蛋白胺基酸序列的分子量及比率(藉由胺基酸長度量測) (「C:K比率」)。較長溶解度增進胺基酸在產生可溶角蛋白多肽方面更有效。
圖 7A及 圖 7B為SDS-PAGE凝膠之照片，展示使用衍生自原雞21型膠原蛋白之各種長度的替代溶解度增進胺基酸序列(188個胺基酸(GL21； 圖 7A)、141個胺基酸(GL21Cdel25； 圖 7A)、93個胺基酸(GL21Cdel50； 圖 7B)及47個胺基酸(GL21Cdel75； 圖 7B))產生人類角蛋白31型多肽。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白尺寸標記。此類型之較長溶解度增進胺基酸在產生可溶角蛋白多肽方面亦更有效。
圖 8A及 圖 8B為各種凝膠之照片，展示在不使用溶解度增進胺基酸序列的情況下產生各種長度之人類角蛋白31型多肽(147個胺基酸(K147； 圖 8A)、125個胺基酸(K125； 圖 8A)、100個胺基酸(K100； 圖 8A)、75個胺基酸(K75； 圖 8B)及50個胺基酸(K50； 圖 8B))。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白尺寸標記。在所有pH水平下進行pH處理之後，此等角蛋白多肽為不可溶的(集結粒部分)。
圖 9為各種凝膠之照片，展示如 圖 8A及 圖 8B中一般，但在使用衍生自人類I型α1膠原蛋白(C262)之溶解度增進胺基酸序列的情況下產生各種長度的相同人類角蛋白31型多肽。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白質尺寸標記。因此，溶解度增進胺基酸序列用於以目標角蛋白多肽序列之各長度成功地產生及純化原本不可溶角蛋白31型多肽序列。
圖 10為展示各種人類角蛋白31型多肽之產生的各種凝膠之照片。衍生自人類I型α1膠原蛋白之兩個不同長度的溶解度增進胺基酸序列(196個胺基酸(C196)或64個胺基酸(C64))隨兩個不同長度的人類角蛋白31型多肽序列(100個胺基酸(K100)或50個胺基酸(K50))而變化。如上製備且分析樣品。在圖下指示各角蛋白多肽之膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列與角蛋白胺基酸序列的分子量及比率(藉由胺基酸長度量測) (「C:K比率」)。最左側色帶：蛋白尺寸標記。溶解度增進胺基酸序列與目標角蛋白胺基酸序列之較高比率在產生可溶角蛋白多肽方面更有效。
圖 11為凝膠之照片，展示在膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列(HsCoa1-27)與目標角蛋白胺基酸序列之間使用酶可裂解連接子(quasiTEV)產生人類角蛋白31型多肽(K31)。如上製備且分析樣品。最左側色帶：蛋白質尺寸標記。在酸富集之後，用AcTEV蛋白酶處理所表現角蛋白多肽之樣品，使得膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列及連接子(24 kDa下之HsCoIa1-27quasiTEV)與目標角蛋白胺基酸序列(17 kDa下之K31)分離。在裂解所有表現角蛋白多肽之後，再次使用pH分離含多肽之混合物，膠原蛋白衍生之溶解度增進胺基酸序列及連接子膠原蛋白片段保持可溶，且現目標角蛋白胺基酸序列部分分離出集結粒。因此，溶解度增進胺基酸序列用於成功地產生及純化呈融合多肽形式的原本不可溶角蛋白31型多肽序列，隨後成功地單獨分離及純化目標角蛋白31型多肽。
圖 12繪示經Cy5標記的例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)沈積於已漂白過三次之I型頭髮上之螢光顯微影像(底部圖)。使用ImageJ定量各髮束之螢光強度。資料標繪於顯微影像上方。
圖 13繪示經Cy5標記的例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)滲透至已漂白過三次的I型頭髮之皮質中之截面螢光顯微影像(底部圖)。用重組角蛋白融合多肽經1、3或5次短暫施加或單次1小時培育護理髮束。使用ImageJ定量各髮束的截面內之螢光強度。資料標繪於顯微影像上方。
圖 14繪示經Cy5標記之例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)沈積於已漂白過三次之I型頭髮上及該頭髮內的表面與截面螢光顯微影像(底部圖)。髮束與重組角蛋白融合多肽一起培育1小時且隨後經歷0、1、3或5次洗髮循環。使用ImageJ定量各髮束的截面內及表面上的螢光強度。資料標繪於顯微影像上方。
圖 15繪示歐洲中棕色髮束在經歷熱損傷方案之後的藉由差示掃描熱量測定的頭髮變性溫度。在熱損傷之前，將例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)作為留存型(leave-on)處理劑施加至髮綹；未處理之對照亦經歷熱損傷。對照髮綹不用重組角蛋白融合多肽護理。
圖 16繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對頭髮柔韌度之影響，其藉由彎力定量，該力為產生髮綹變形所必需的。漂白過三次之I型髮綹在用TA XT (Stable Microsystems)進行3點彎曲測試之前，接受施加0、1或5次重組角蛋白融合多肽。圖表展示彎力之平均差異，其中負值指示彎力相對於未處理頭髮的減小。
圖 17繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)對式樣保持度之影響。已漂白過三次之I型頭髮(I型，經3次漂白之頭髮)或未經漂白的I型頭髮(I型，原生) (底部圖)用重組角蛋白融合多肽處理且在塑膠捲髮器中卷壓隔夜。自移除捲髮器起開始式樣保持度測試，且在測試開始時及在24小時之後對髮綹進行成像(底部圖)。長度保持度定義為髮綹的初始長度與最終長度之間的比率(頂部圖)。對照髮綹與經處理髮綹之間的最終長度差異相對於對照髮綹之最終長度正規化(頂部圖)。
圖 18繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)在作為留存型處理劑施加至髮綹時對捲髮控制之影響。用不同濃度之重組角蛋白融合多肽護理漂白過三次之I型頭髮(I型，經3次漂白之頭髮)、未經漂白之I型頭髮(I型，原生)或未經漂白之IV型頭髮(IV型，原生)。接著將髮綹置放於設定在85%相對濕度下之影像獲取系統(Shuffle, Bossa Nova Vision)中，並獲取初始影像集且在24小時之後獲取最終影像集。資料說明捲曲表面相對於對照(未處理)髮綹之平均變化，其中負結果指示捲曲度相比於對照(未處理)髮綹的減小。
圖 19繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)在作為沖洗型處理劑施加至髮綹時對捲髮控制之影響。用重組角蛋白融合多肽護理漂白過三次之I型頭髮(I型，經3次漂白之頭髮)、未經漂白之I型頭髮(I型，原生)或未經漂白之IV型頭髮(IV型，原生)。接著將髮綹置放於設定在85%相對濕度下之影像獲取系統(Shuffle, Bossa Nova Vision)中，並獲取初始影像集且在24小時之後獲取最終影像集。資料說明捲曲表面相對於對照(未處理)髮綹之平均變化，其中負值指示捲曲度相比於對照(未處理)髮綹的減小。
圖 20繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)在作為留存型處理劑或沖洗型處理劑施加至髮綹時對梳理性之影響。用重組角蛋白融合多肽護理已漂白過三次之I型頭髮(I型，經3次漂白之頭髮)。在重組角蛋白融合多肽施加之前及之後使用質構分析儀進行濕髮及乾髮梳理測試。資料說明在重組角蛋白融合多肽施加之後在各種條件下的梳力的變化(相對於基線量測值)，其中負值指示重組角蛋白融合多肽施加之後的梳力的減小。
圖 21繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)之抗氧化特性。商業抗氧化能力(ORAC)套組(OxiSelect TMORAC Activity Assay, Cell Biolabs, Inc.)用於評估重組角蛋白融合多肽在各種濃度下之抗氧化特性。資料表示為Trolox當量(TE)。
圖 22A及 圖 22B繪示例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71；本文中之「KFC」)對促進頭髮及頭皮護理之細胞群之細胞存活率的影響。在MTT存活率分析中將人類纖維母細胞及角質細胞與不同濃度的重組角蛋白融合多肽共培育。 圖 22A繪示活體外人類纖維母細胞存活率，且結果相對於未處理對照正規化。 圖 22B繪示活體外人類角質細胞存活率，且結果相對於未處理之對照正規化。
圖 23繪示在活體外傷口癒合分析中例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)之傷口癒合特性。在不存在重組多肽之情況下、在存在重組角蛋白融合多肽之情況下或在存在水解動物角蛋白(HAK)之情況下藉由抓撓細胞培養物來模擬傷口。歷經48小時定量即時細胞遷移。 圖 23(右圖)繪示用重組角蛋白融合多肽處理之細胞的代表性影像。定量細胞遷移資料展示於 圖 23(左圖)中。
圖 24A及 圖 24B繪示在頭髮護理之情形下例示性重組角蛋白融合多肽(SEQ ID NO: 71)與代表性膠原蛋白之間的比較。 圖 24A繪示例示性重組角蛋白融合多肽及代表性膠原蛋白對乾髮梳力之影響。 圖 24B繪示例示性重組角蛋白融合多肽及代表性膠原蛋白在作為留存型處理劑施加時對未經漂白的IV頭髮(頭髮IV型，原生)之捲髮控制的影響。
圖 25A及 圖 25B描繪代表性融合多肽(C196-K50)在哺乳動物細胞株(HEK293)中之表現及低pH穩定性。 圖 25A展示使用對融合多肽之角蛋白區具有特異性之抗體的SDS-PAGE凝膠(左)及西方墨點(右)且比較來自大腸桿菌及HEK293宿主細胞之表現。 圖 25B為SDS-PAGE凝膠之照片，展現融合多肽(箭頭)及其在低pH條件下保持可溶之能力；在pH處理之後分析不可溶集結粒部分(「P」)及可溶上清液部分(「S」)。

Claims (100)

  1. 一種非天然存在之多肽，其包含(a)溶解度增加胺基酸序列；及(b)至少50個胺基酸長的與角蛋白多肽之對應區具有至少80%序列一致性的目標胺基酸序列，其中該溶解度增加胺基酸序列由(Gly-X-Y) n之三聯體胺基酸模式組成，其中n=8-300，且X及Y為任何胺基酸殘基。
  2. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為相同胺基酸殘基。
  3. 如請求項1或2之非天然存在之多肽，其中至少一個(Gly-X-Y)三聯體，X及Y為不同胺基酸殘基。
  4. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體不同。
  5. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中至少一個(Gly-X-Y)三聯體與另一個(Gly-X-Y)三聯體相同。
  6. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該非天然存在之多肽為融合蛋白。
  7. 如請求項6之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列與該目標胺基酸序列之N端融合。
  8. 如請求項6之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列與該目標胺基酸序列之C端融合。
  9. 如請求項6之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列包含與該目標胺基酸序列之N端融合的第一溶解度增加胺基酸序列及與該目標胺基酸序列之C端融合的第二溶解度增加胺基酸序列。
  10. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列中存在之胺基酸殘基之數目與該目標胺基酸序列中存在之胺基酸殘基之數目的比率為至少0.5:1。
  11. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該角蛋白多肽為I型角蛋白或II型角蛋白。
  12. 如請求項11之非天然存在之多肽，其中該I型角蛋白係選自由以下組成之群：上皮角蛋白、毛囊特異性上皮角蛋白及毛髮角蛋白。
  13. 如請求項12之非天然存在之多肽，其中該角蛋白多肽為選自由K31、K32、K33a、K33b、K34、K35、K36、K37、K38、K39及K40組成之群的毛髮角蛋白。
  14. 如請求項12之非天然存在之多肽，其中該角蛋白多肽為選自由K9、K10、K12、K13、K14、K15、K16、K17、K18、K19、K20、K23及K24組成之群的上皮角蛋白。
  15. 如請求項17之非天然存在之多肽，其中該II型角蛋白係選自由以下組成之群：上皮角蛋白、毛囊特異性上皮角蛋白及毛髮角蛋白。
  16. 如請求項15之非天然存在之多肽，其中該角蛋白多肽為選自由K81、K82、K83、K84、K85及K86組成之群的毛髮角蛋白。
  17. 如請求項15之非天然存在之多肽，其中該角蛋白多肽為選自由K1、K2、K3、K4、K5、K6a、K6b、K6c、K7、K8、K76、K77、K78、K79及K80組成之群的上皮角蛋白。
  18. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列及該目標胺基酸序列直接藉由肽鍵連接。
  19. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加胺基酸序列及該目標胺基酸序列經由連接序列連接。
  20. 如請求項19之非天然存在之多肽，其中該連接序列係選自由以下組成之群：可撓性連接子、剛性連接子及可裂解連接子。
  21. 如請求項20之非天然存在之多肽，其中該可裂解連接子包含蛋白酶裂解位。
  22. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該溶解度增加序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 18-31或119中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 18-31或119中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性之胺基酸序列。
  23. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該目標胺基酸序列包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 2-12中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 2-12中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性的胺基酸序列。
  24. 如請求項1之非天然存在之多肽，其中該非天然存在之多肽包含以下或由以下組成：SEQ ID NO: 56-74、76、78、80-82、84、86、88、90、92、94、96、102、104、106、108-113或118中之任一者之胺基酸序列，或包含以下或由以下組成：與該SEQ ID NO: 56-74、76、78、80-82、84、86、88、90、92、94、96、102、104、106、108-113或118中之任一者之胺基酸序列具有至少約80%序列一致性的胺基酸序列。
  25. 一種產生非天然存在之多肽的方法，該方法包含：(a)培養包含編碼如請求項1之非天然存在之多肽的聚核苷酸的宿主細胞；及(b)回收該非天然存在之多肽，由此產生該非天然存在之多肽。
  26. 一種產生目標多肽之方法，該方法包含：(a)培養包含編碼如請求項1之非天然存在之多肽的聚核苷酸的宿主細胞，(b)回收該非天然存在之多肽，及(c)將該溶解度增加胺基酸序列與該目標胺基酸序列分離，由此產生該目標多肽。
  27. 如請求項25或26中任一項之方法，其中該宿主細胞為微生物細胞或真核細胞。
  28. 如請求項27之方法，其中該微生物宿主細胞為細菌細胞。
  29. 如請求項28之方法，其中該細菌細胞為大腸桿菌( E. coli)。
  30. 如請求項27之方法，其中該真核細胞為哺乳動物細胞。
  31. 一種重組多肽，其包含具有50個胺基酸至400個胺基酸之總截短的全長人類角蛋白31 (K31)之胺基酸序列。
  32. 如請求項31之重組多肽，其中該總截短係50個胺基酸至350個胺基酸、50個胺基酸至300個胺基酸、50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸，或50個胺基酸至100個胺基酸。
  33. 如請求項31或32之重組多肽，其中該總截短包含N端截短、C端截短、內部截短，或其任何組合。
  34. 如請求項33之重組多肽，其中該總截短為N端截短。
  35. 如請求項34之重組多肽，其中該N端截短係50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸，或50個胺基酸至100個胺基酸。
  36. 如請求項33之重組多肽，其中該總截短為C端截短。
  37. 如請求項36之重組多肽，其中該C端截短係50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸，或50個胺基酸至100個胺基酸。
  38. 如請求項33之重組多肽，其中該總截短為N端截短及C端截短兩者。
  39. 如請求項38之重組多肽，其中該N端截短係50個胺基酸至250個胺基酸、50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸，或50個胺基酸至100個胺基酸，且該C端截短係50個胺基酸至200個胺基酸、50個胺基酸至150個胺基酸，或50個胺基酸至100個胺基酸。
  40. 如請求項31之重組多肽，其中該重組多肽具有小於75%的該全長K31之胺基酸序列。
  41. 如請求項31之重組多肽，其中該重組多肽具有小於70%、小於65%、小於60%、小於55%、小於50%、小於45%、小於40%、小於35%、小於30%、小於25%、小於20%或小於15%之該全長K31之胺基酸序列。
  42. 如請求項31之重組多肽，其中該重組多肽包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 11具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
  43. 如請求項31之重組多肽，其中該重組多肽包含SEQ ID NO: 7、9或10中之任一者之胺基酸序列；或與SEQ ID NO: 7、9或10中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列。
  44. 如請求項31之重組多肽，其中該重組多肽由SEQ ID NO: 7或9-11中之任一者之胺基酸序列組成；或由與SEQ ID NO: 7或9-11中之任一者具有至少80%序列一致性之胺基酸序列組成。
  45. 一種非天然存在之多肽，其包含膠原蛋白多肽之至少9個連續胺基酸殘基及角蛋白多肽之至少25個連續胺基酸殘基，其中該膠原蛋白多肽之至少9個連續胺基酸殘基包含至少三個(Gly-X-Y)三聯體重複序列。
  46. 一種組合物，其包含0.005%至30% w/w之如請求項1或45中任一項之非天然存在之多肽、如請求項26之目標多肽或如請求項31之重組多肽。
  47. 一種包含重組多肽之組合物，其中該重組多肽包含與具有至少50個胺基酸之截短之全長角蛋白多肽之對應區具有至少80%序列一致性的胺基酸序列，其中如高效液相層析或質譜分析量測，該重組多肽具有至少80%之純度。
  48. 如請求項46之組合物，其中該組合物經調配用於局部施加。
  49. 如請求項46之組合物，其中該組合物為用於施加至皮膚、頭髮、頭皮或指甲之個人護理產品。
  50. 一種用於治療或提供美容益處於個體之皮膚或指甲之方法，該方法包含向個體之皮膚或指甲投與或施加如請求項46之組合物，由此治療或提供美容益處於該個體之皮膚或指甲。
  51. 如請求項50之方法，其中該投與或施加造成減少皮膚損傷、促進受損皮膚修復、保護皮膚免受UV傷害、保護皮膚細胞免受暴露於城市粉塵之影響、增加皮膚細胞存活率、增加纖維母細胞存活率、增加角質細胞存活率、增加原膠原合成、減少發炎性細胞介素之產生、修復或強化甲板、修復乾燥或受損指甲、防止指甲受傷、改善指甲強度或生長，或其任何組合。
  52. 一種用於治療或提供美容益處於個體之頭髮之方法，該方法包含向個體之頭髮投與或施加如請求項46之組合物，由此治療或提供美容益處於該個體之頭髮。
  53. 如請求項52之方法，其中該投與或施加造成改善頭髮強度；改善頭髮光澤度、順滑度、柔韌度(suppleness)、梳理性、捲髮控制、光彩(sheen)或感覺；改善頭髮可梳理性或可管理性；改善頭髮柔順性；增加髮束直徑；改善細胞群存活率，促進頭髮及頭皮健康；就頭髮護理提供傷口癒合益處；就皮膚護理提供傷口癒合益處；就生物醫學提供傷口癒合益處；強化頭髮；修復分叉末梢；修復因大氣因素而受損之頭髮；修復因機械或化學處理而受損或變脆弱之頭髮；保護頭髮結構蛋白免受氧化壓力；減少角蛋白變性；保護頭髮免受熱傷害；保護頭髮免受大氣因素、機械或化學處理傷害；或其任何組合。
  54. 一種自複數個宿主細胞純化重組多肽之方法，該方法包含： (a)提供或獲得包含該重組多肽及該等宿主細胞或宿主細胞溶解物之混合物； (b)將該混合物分離成包含該重組多肽之第一可溶部分及第一不可溶部分； (c)將該第一可溶部分之pH調節至5或更小之pH，以產生pH經調節之混合物；及 (d)將該pH經調節之混合物分離成包含該重組多肽之第二可溶部分及第二不可溶部分，其中該重組多肽包含該第二可溶部分中之蛋白質的至少50%。
  55. 如請求項54之方法，其中該宿主細胞為微生物細胞。
  56. 如請求項55之方法，其中該微生物細胞為細菌細胞。
  57. 如請求項56之方法，其中該細菌細胞為革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacterium)。
  58. 如請求項57之方法，其中該革蘭氏陰性細菌為大腸桿菌。
  59. 如請求項54之方法，其中分離該混合物包含離心、超速離心、過濾、超過濾或其組合。
  60. 如請求項54之方法，其中(c)之調節pH包含將酸添加至該第一可溶部分。
  61. 如請求項60之方法，其中該酸為弱酸或強酸。
  62. 如請求項60之方法，其中該酸為H 2SO 4。
  63. 如請求項54之方法，其中(c)之調節pH包含將該第一可溶部分之pH調節至4或更低之pH。
  64. 如請求項54之方法，其中(c)之調節pH包含將該第一可溶部分之pH調節至3或更低之pH。
  65. 如請求項54之方法，其進一步包含(e)將該第二可溶部分之pH調節至比(c)之pH低的pH以產生第二pH經調節之混合物；及(f)將該第二pH經調節之混合物分離成包含該重組多肽之第三可溶部分及第三不可溶部分。
  66. 如請求項65之方法，其進一步包含(g)將該第三可溶部分之pH調節至比(e)之pH低的pH以產生第三pH經調節之混合物；及(h)將該第三pH經調節之混合物分離成包含該重組多肽之第四可溶部分及第四不可溶部分。
  67. 如請求項66之方法，其中該重組多肽之純度在該第三可溶部分中比在該第二可溶部分中高；且其中該重組多肽之純度在該第四可溶部分中比在該第三可溶部分中高。
  68. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少55%。
  69. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少60%。
  70. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少65%。
  71. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少70%。
  72. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少75%。
  73. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少80%。
  74. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少85%。
  75. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少90%。
  76. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少94%。
  77. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少95%。
  78. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少96%。
  79. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少97%。
  80. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少98%。
  81. 如請求項54之方法，其中該重組多肽或其部分為該第二可溶部分中存在之蛋白質的至少99%。
  82. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之最終產物不含宿主細胞碎片。
  83. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多50%內源性宿主細胞蛋白。
  84. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多45%內源性宿主細胞蛋白。
  85. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多40%內源性宿主細胞蛋白。
  86. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多35%內源性宿主細胞蛋白。
  87. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多30%內源性宿主細胞蛋白。
  88. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多25%內源性宿主細胞蛋白。
  89. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多20%內源性宿主細胞蛋白。
  90. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多15%內源性宿主細胞蛋白。
  91. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多10%內源性宿主細胞蛋白。
  92. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多6%內源性宿主細胞蛋白。
  93. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多5%內源性宿主細胞蛋白。
  94. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多4%內源性宿主細胞蛋白。
  95. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多3%內源性宿主細胞蛋白。
  96. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多2%內源性宿主細胞蛋白。
  97. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物包含相對於總蛋白至多1%內源性宿主細胞蛋白。
  98. 如請求項54之方法，其中包含該重組多肽之該最終產物不含內源性宿主細胞蛋白。
  99. 如請求項54之方法，其中該重組多肽包含溶解度增加胺基酸序列。
  100. 如請求項54之方法，其中該重組多肽不包含溶解度增加胺基酸序列。
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