JP2012149062A - ヒトコラーゲン含有化粧料 - Google Patents
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Abstract
【課題】 ヒトの皮膚等との親和性に優れ、保湿性、粘弾性に優れ、また、ヒト繊維芽細胞の増殖効果にも優れた化粧料を提供する。
【解決手段】
ヒトコラーゲン、ヒトコラーゲンペプチド分画または該ヒトコラーゲンの分解生成物ゼラチンおよびこれらの混合物を化粧料材料に配合してなることを特徴とするとする化粧料。
【選択図】 図5
Description
かかる観点から、水溶性のヒト型コラーゲンの提供が切望されてきた。
ヒトコラーゲンまたは該ヒトコラーゲンの低分子化生成物ゼラチンおよびこれらの混合物を化粧料材料に配合してなる化粧料
が提供される。
2)前記ヒトコラーゲンが、ヒトコラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸全長配列のうち681番Fから828番Eまでの198個のアミノ酸を含有するヒトコラーゲンヘプチドBである前記化粧料。
3)前記ヒトコラーゲンが、ヒトコラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸全長配列のうち264番Kから400番Nまでの136個のアミノ酸を含有するヒトコラーゲンヘプチドCである前記化粧料。
4)前記ヒトコラーゲンが、カイコを利用した組換え遺伝子技法による産生物質に特定されたものである前記化粧料。
5)前記化粧料が、皮膚および頭髪に用いられる化粧品である前記化粧料。
6)前記皮膚および頭髪に用いられる化粧品が化粧用クリーム、化粧水、乳液を含むものである前記化粧料。
7)前記ヒトコラーゲンとヒアルロン酸その他の保湿成分とを含有してなる前記化粧料。
8)前記ヒトコラーゲンと抗酸化物質を含有してなる前記化粧料。
9)前記ヒトコラーゲンとカプサイシン、ミントその他の抗肥満物質を含有してなる前記化粧料。
10)前記ヒトコラーゲンとオレンジ、レモングラス、クラリセージ、ネロリその他の精油を含有してなる前記化粧料。
1.ヒトコラーゲン
構造および構造上の特異点
本発明に係る化粧料の必須配合成分であるヒトコラーゲンの構造は、下記記載の通りである。
前記ヒトコラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸配列全長およびDNA配列全長を下記の通りに示す。
A.ヒト型コラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸配列全長
MFSFVDLRLLLLLAATALLTHGQEEGQVEGQDEDIPPITCVQNGLRYHDRDVWKPEPCRICVCDNGKVLCDDVICDETKNCPGAEVPEGECCPVCPDGSESPTDQETTGVEGPKGDTGPRGPRGPAGPPGRDGIPGQPGLPGPPGPPGPPGPPGLGGNFAPQLSYGYDEKSTGGISVPGPMGPSGPRGLPGPPGAPGPQGFQGPPGEPGEPGASGPMGPRGPPGPPGKNGDDGEAGKPGRPGERGPPGPQGARGLPGTAGLPGMKGHRGFSGLDGAKGDAGPAGPKGEPGSPGENGAPGQMGPRGLPGERGRPGAPGPAGARGNDGATGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGAKGEAGPQGPRGSEGPQGVRGEPGPPGPAGAAGPAGNPGADGQPGAKGANGAPGIAGAPGFPGARGPSGPQGPGGPPGPKGNSGEPGAPGSKGDTGAKGEPGPVGVQGPPGPAGEEGKRGARGEPGPTGLPGPPGERGGPGSRGFPGADGVAGPKGPAGERGSPGPAGPKGSPGEAGRPGEAGLPGAKGLTGSPGSPGPDGKTGPPGPAGQDGRPGPPGPPGARGQAGVMGFPGPKGAAGEPGKAGERGVPGPPGAVGPAGKDGEAGAQGPPGPAGPAGERGEQGPAGSPGFQGLPGPAGPPGEAGKPGEQGVPGDLGAPGPSGARGERGFPGERGVQGPPGPAGPRGANGAPGNDGAKGDAGAPGAPGSQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGDRGDAGPKGADGSPGKDGVRGLTGPIGPPGPAGAPGDKGESGPSGPAGPTGARGAPGDRGEPGPPGPAGFAGPPGADGQPGAKGEPGDAGAKGDAGPPGPAGPAGPPGPIGNVGAPGAKGARGSAGPPGATGFPGAAGRVGPPGPSGNAGPPGPPGPAGKEGGKGPRGETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEKGSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQRGVVGLPGQRGERGFPGLPGPSGEPGKQGPSGASGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAEGSPGRDGSPGAKGDRGETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAGKSGDRGETGPAGPAGPVGPVGARGPAGPQGPRGDKGETGEQGDRGIKGHRGFSGLQGPPGPPGSPGEQGPSGASGPAGPRGPPGSAGAPGKDGLNGLPGPIGPPGPRGRTGDAGPVGPPGPPGPPGPPGPPSAGFDFSFLPQPPQEKAHDGGRYYRADDANVVRDRDLEVDTTLKSLSQQIENIRSPEGSRKNPARTCRDLKMCHSDWKSGEYWIDPNQGCNLDAIKVFCNMETGETCVYPTQPSVAQKNWYISKNPKDKRHVWFGESMTDGFQFEYGGQGSDPADVAIQLTFLRLMSTEASQNITYHCKNSVAYMDQQTGNLKKALLLQGSNEIEIRAEGNSRFTYSVTVDGCTSHTGAWGKTVIEYKTTKTSRLRIIDVAPLDVGAPDQEFGFDVGHVCFL*
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GGTCCTGCTGGTGCTCCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTG
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A.ヒトコラーゲンペプチドBおよびヒトコラーゲンペプチドCのアミノ酸配列
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[配列の説明]
ペプチドC(136アミノ酸)の配列:配列上部の下線部文字
ペプチドB(198アミノ酸)の配列:配列下部の下線部文字
ATGTTCAGCTTTGTGGACCTCCGGCTCCTGCTCCTCTTAGCGGCCACCGCCCTCCTGACG
CACGGCCAAGAGGAAGGCCAAGTCGAGGGCCAAGACGAAGACATCCCACCAATCACCTGC
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GGCCGAGTCGGTCCTCCTGGCCCCTCTGGAAATGCTGGACCCCCTGGCCCTCCTGGTCCT
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GGTCCTGCTGGTGCTCCTGGTACTCCCGGGCCTCAAGGTATTGCTGGACAGCGTGGTGTG
GTCGGCCTGCCTGGTCAGAGAGGAGAGAGAGGCTTCCCTGGTCTTCCTGGCCCCTCTGGT
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GTCTGCTTCCTGTAA
[配列の説明]
ペプチドCのDNA配列(408bp):配列上部の下線部文字
ペプチドBのDNA配列(594bp):配列下部の下線部文字
前記の如き構造の本発明に係るヒトコラーゲンは、下記記載の方法により製造することができる。
該ヒトコラーゲン遺伝子のcDNAの5‘末端にフィブロイン鎖との融合したベクターを構築し、これにTTAA特異性トランスポゾンpiggyBac法を用いて、前胚盤葉期の蚕Pnd-w1種(生物資源研究所)の卵に注入した。のち孵化した幼虫を成虫に飼育して、交配し次世代蚕の卵を収穫した。緑色蛍光たんぱく質のマーカーを利用して、該コラーゲン遺伝子を持つトランスジェニック蚕を選別した。
T.Tamura et al,.Nature Biotechnology 18 (2000)81-84
産生されたたんぱく質ないしペプチドは、キモトリプシン酵素処理されたのち、DEAEカラムによる液体クロマトグラフィーを用いてコラーゲンを精製した。精製されたたんぱく質ないしペプチドは、硫安塩析により沈澱させ濃縮した。処理後、水溶性ペプチドを集め、凍結乾燥すればよい。
ヒトコラーゲンの純度は、基準品ヒトコラーゲンとの電気泳動のパターンにより測定することができる。
当該2種のヒトコラーゲンペプチドは、本発明に係るヒトコラーゲン全体(139kDa)よりも4分の1から5分の1の大きさであるが、コラーゲン分子の製造方法と同様に蚕(カイコ)による当該製造方法を用いることが可能である。この場合、ぺプチドB遺伝子およびペプチドC遺伝子は次のような挿入方法によってプラスミドに導入される。
目的遺伝子を市販の発現用プラスミドpPIC9K(インヴィトロゲン社、米 加州)のプロモター遺伝子3‘AOX1(TT)に隣接する制限酵素部位EcoRIおよびNotIを両端として、挿入する。目的遺伝子の挿入の確認は、カナマイシンの存在下の培地中でスクリーニングし、挿入後のプラスミドの大きさをSDS-PAGEの電気泳動によって確認することができる。このペプチドBないしCの遺伝子から構成されるプラスミドの発現は、緑色蛍光たんぱく質遺伝子の導入により、蚕の卵中で確認することができる。繭のたんぱく質として生産されたペプチド分画は、該コラーゲンの抽出方法により分離する。また、DEAEセルロースを担体とする液体クロマトグラフィーによる0.01M-0.85M Naリン酸緩衝液の濃度勾配法により、粗の2つのペプチドの分画を分離し、それぞれの分画を再度DEAEセルロースの液体クロマトグラフィーによるNaリン酸緩衝液により精製される。
本発明に係るヒトコラーゲン含有化粧料は、必須成分のヒトコラーゲンを化粧料材料に配合してなるものであり、配合成分としての化粧料材料について説明する。
化粧料材料は、具体的には下記の通り、通常の化粧料に使用される各種成分および添加剤の群から用途に適したものをヒトコラーゲンの作用を阻害しない範囲または相乗効果が得られる範囲で、任意に選択することができる。
なお、本発明に係るヒトコラーゲン含有化粧料に用いるヒトコラーゲンペプチドおよび対照ヒトコラーゲンの測定に用いるSDS−PAGE電気泳動法、実施例および比較例において得られた化粧料の品質性能の評価方法は下記の通りである。
また、本発明に係るヒトコラーゲン含有化粧料の品質性能を評価するための比較対象材料として用いた他社製品は下記の通りである。
電気泳動装置として、Bio−Rad社Mini−PROTEAN3CELLを使用し、コラーゲン試料を10μg、それぞれ、25mMTris−Hcl(pH6.8)に溶解し、250V/30mAの電気泳動条件で60分間泳動した。
次の1〜5の試験法により評価した。
1.皮膚の保湿性効果の試験法
クリーム試料0.5グラムを、腕の皮膚に1日4回10時、12時、14時、16時、女性30歳代1名、40歳代2名、50歳代1名の計4名に塗布し、モリテックス社E−0016型アイセンサー水分計を用いて、皮膚の保湿性の増減を計測した。(n=16)
2.皮膚への粘弾性効果の試験法
クリーム試料0.5グラムを、腕の皮膚に1日4回10時、12時、14時、16時、女性30歳代1名、40歳代2名、50歳代1名の計4名に塗布し、キュートメータ(CK社製)を使用して、皮膚の弾性を増加させる効果を測定した。(n=16)
3.皮膚への形状変化の影響試験法
クリーム試料0.5グラムを、腕の皮膚に1日4回10時、12時、14時、16時、女性30歳代1名、40歳代2名、50歳代1名の計4名に塗布し、CCDカメラ(マイクロスクエア社、MS-40型)を使用して、皮膚表面の弾性を皮丘と皮溝の規則性を解析し、皮膚表面への調整機能を測定した。
4.ヒト繊維芽細胞増殖効果
サンヨー製MCO−17AIC型細胞培養器を用い、96ウエルのプラスチック容器に0.8mlMSDS(FX)培地4×103個の繊維芽細胞を播種し、72時間5%CO2のインキュベータ中、37℃で培養し、それぞれのクリーム試料0.5%(w/v)を添加して培養後細胞数をカウントした。
5.アンチエージング試験
クリーム試料を対象者女性4名の手の甲に塗布し60分後の皮膚の皮丘と皮溝の規則性をCCDカメラにより測定した。
1)シグマ社製コラーゲン
カタログ番号C5488Type1ヒトコラーゲンHuman Skin,Acid Solube Powder(純度95%以上)、CAS番号2007−34−5
前記SDS−PAGE電気泳動法による分子量; 111kDa
2)ネオシルク社製コラーゲン製品
ネオシルク社「ヒト組換ゼラチン」ロット番号09−RI
前記SDS−PAGE電気泳動法による分子量; 96kDa
ヒトコラーゲンの製造方法
ヒトコラーゲン遺伝子(ヒトコラーゲンI型の鎖の594個のDNA鎖を有する。)のcDNAの5‘末端にフィブロイン鎖との融合したベクターを構築し、これにTTAA特異性トランスポゾンpiggyBac法を用いて、前胚盤葉期の蚕Pnd-w1種(生物資源研究所)の卵に注入した。のち孵化した幼虫を成虫に飼育して、交配し次世代蚕の卵を収穫した。緑色蛍光たんぱく質のマーカーを利用して、該コラーゲン遺伝子を持つトランスジェニック蚕を選別した。
産生されたたんぱく質ないしペプチドは、キモトリプシン酵素処理されたのち、DEAEカラムによる液体クロマトグラフィーを用いてコラーゲンを精製した。精製されたたんぱく質ないしペプチドは、硫安塩析により沈澱させ濃縮した。処理後、水溶性ペプチドを集め、凍結乾燥すればよい。
得られたヒトコラーゲンは、配列表に示すDNA配列およびアミノ酸配列を有するものであり、SDS−PAGE電気泳動法による分子量は図5に示すように139kDaであった。
ヒトコラーゲンペプチドのBおよびヒトコラーゲンペプチドCの製造方法
当該2種のコラーゲンペプチドは、コラーゲン全体(139kD)よりも4分の1から5分の1の大きさであるが、コラーゲン分子の製造方法と同様に蚕による当該製造方法を用いることが可能である。この場合、〔B〕 ぺプチド遺伝子および〔C〕ペプチド遺伝子は次のような挿入方法によってプラスミドに導入された。
照。
ペプチドB
DNA配列;594塩基(1891番Aから2484番Aまで)
アミノ酸配列;198個アミノ酸(681番Fから828番Eまで)
SDS−PAGE電気泳動法による分子量;28kDa
ペプチドC
DNA配列;408塩基(798番Aから1200番Tまで)
アミノ酸配列;136個アミノ酸(264番Kから400番Nまで)
SDS−PAGE電気泳動法による分子量;21kDa
バイオスヒトコラーゲン 139
ペプチドB 28
ペプチドC 21
シグマ社ヒトコラーゲン 111
ネオシルク社ヒトコラーゲン 96
下記の(A)の各成分を混合した後、加熱し70℃とする。
下記の(B)の各成分を混合し、70℃に加熱、混合し、(A)成分に(B)成分を加えて乳化し、35℃まで冷却、下記の(C)成分を加えた。
質量%
(A)ワセリン 5.0
スクワラン 10.0
セタノール 8.0
ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル 1.4
モノステアリン酸ソルビタン 0.3
(B)エチルパラペン
プロピレングリコール
製造例2により調製したヒトコラーゲンペプチドB 0.5
精製水 75.4
(C)香料 0.2
(A)の各成分を混合し、80℃に加熱する。
(B)の各成分を混合し、80℃に加熱する。
(A)の成分に(B)の成分を加えて撹拌乳化し、その後35℃まで冷却した。
(A)ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル 2.0
グリセリンモノステアレート 10.0
流動パラフィン 10.0
ワセリン 4.0
セタノール 5.0
BHT 0.01
ユーヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン 0.5
プチルパラベン 0.2
(B)製造例2により得られたヒトコラーゲンペプチドB 0.5
グリセリン 5.0
精製水 62.79
化粧用クリームの品質性能については、前記の方法により評価し、評価結果を下記に示す。
ヒトコラーゲンペプチドBを用いたこと以外、すべて実施例2と同一の成分・組織および同一の条件・操作により化粧クリームを調製した。化粧クリームの品質性能は、前記1〜5の方法に従い評価した。評価結果は下記に示す通りであった。
ヒトコラーゲンペプチドCを用いたこと以外、すべて実施例2と同一の成分・組織および同一の条件・操作により化粧クリームを調製した。品質性能の評価結果は下記に示す通りであった。
実施例3で調製したヒトコラーゲンペプチドB含有化粧クリーム(以下、「HUMANY(登録商標)と称することがある。」)にカプサイシン*を4質量%添加して化粧クリームを調製し、前記アンチエージング試験に供したところ、下表に示す結果を得た。
*和光純薬社製 品番084−11351
実施例3で調製した化粧クリーム「HUMANY」にペパーミント**を0.5質量%添加した化粧用クリームを調製し、前記アンチエージング試験に供したところ、下表に示す結果を得た。
**コネクト社製 製品番号 003−03
実施例3で調製した化粧クリーム「HUMANY」にカプサイシンを4質量%と、ペパーミント0.5質量%を添加した化粧用クリームを調製し、前記アンチエージング試験に供したところ、下表に示す結果を得た。
組 成 アンチエージング効果
HUMANY(実施例3) 20.0%(SD6.0)
HUMANYにカプサイシンを添加(実施例3) 28.3%(SD9.0)
HUMANYにペパーミントを添加(実施例6) 24.7%(SD8.8)
HUMANYにカプサイシンおよび
ペパーミントを添加(実施例7) 30.5%(SD9.4)
実施例2に示す組成のクリームからヒトコラーゲン
ペプチドBを除いたベースクリームにカプサイシン
およびペパーミントを添加(比較例6) 14.1%−15.9%
(SD5.2)
製造例1により得られたヒトコラーゲンの代わりに市販(株式会社ニッピ社製 PS-1 NP20749)のブタコラーゲンを用いたこと以外、すべて実施例1と同一の方法で化粧用クリームを調製し、前記保湿性、粘弾性等の評価に供した。評価結果を図1〜4に示す。
製造例1により得られたヒトコラーゲンの代わりに市販(株式会社ニッピ社製)のウシコラーゲンを用いたこと以外、すべて実施例2と同一の方法により化粧用クリームを調製し、前記保湿性、粘弾性等の評価に供した。評価結果を図1〜4に示す。
製造例1により得られるヒトコラーゲンの代わりに(株式会社ニッピ社製)サケコラーゲンを用いたこと以外すべて実施例1と同一の方法により化粧用クリームを調製し、前記アンチエージング試験に供した。評価結果を図4に示す。
製造例2で得られたヒトコラーゲンペプチドBの代わりに、シグマ社製コラーゲン製品(カタログ番号C5488 Human Skin,AcidSolible Powder(純度95%以上))を10mMK・リン酸緩衝液(pH7.4)に0.5質量%溶解したものを用いたこと以外、すべて実施例2と同一の組成による化粧用クリームを調製し、前記の品質性能の評価に供した。評価結果を下記に示す。
製造例2で得られたヒトコラーゲンペプチドBの代わりに、ネオシルク社製コラーゲン製品(「ヒト組換えゼラチン」ロット番号09−RI)10mMK・リン酸緩衝液(pH7.4)に0.5質量%溶解したものを用いたこと以外、すべて実施例2と同一の組成による化粧用クリームを調製し、前記の品質性能の評価に供した。評価結果を品質性能評価の欄[0089]に示す。
実施例2に記載のクリーム組成からヒトコラーゲンペプチドBを除いたベースクリームにカプサイシンを4質量%およびペパーミント0.5質量%添加し化粧用クリームを調製し、前記アンチエージング試験に供したところ、下表に示す結果を得た。
保湿性 粘弾性 ヒト繊維芽細胞増殖 アンチエーシ゛ンク゛
実施例1 160 155 135 195
比較例1 100 100 100 120
比較例2 105 85 90 105
比較例3 ― ― ― 110
1)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドB含有クリーム 36.0%(SD5.0)
2)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドC含有クリーム 34.6%(SD5.3)
3)シグマ社製ヒトコラーゲン含有クリーム 32.0%(SD5.2)
4)ネオシルク社製ヒトコラーゲン含有クリーム 28.6%(SD4.2)
1)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドB含有クリーム 1.292%(SD0.6)
2)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドC含有クリーム 1.112%(SD0.06)
3)シグマ社製ヒトコラーゲン含有クリーム 0.832%(SD0.04)
4)ネオシルク社製ヒトコラーゲン含有クリーム 0.790%(SD0.08)
1)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドB含有クリーム 3.68×104個
2)シグマ社製ヒトコラーゲン含有クリーム 2.20×104個
3)ネオシルク社製ヒトコラーゲン含有クリーム 2.20×104個
1)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドB含有クリーム 19.5%(SD6.0)
2)本発明に係るヒトコラーゲンペプチドC含有クリーム 15.3%(SD8.1)
3)シグマ社製ヒトコラーゲン含有クリーム 12.0%(SD8.0)
4)ネオシルク社製ヒトコラーゲン含有クリーム 16.7%(SD6.5)
1)分子量が制御された範囲にある点
バイオスヒトコラーゲンのペプチドBおよびCは、それぞれ前記の通りのアミノ酸配列およびDNA配列を有するもので、前者は28kDa、後者は21kDaであるのに対し、他社コラーゲンに比較して特定されたものである。これにより、下記の化粧料の品質性能に顕著な効果を与えている。
2)水溶性である点
化粧料の皮膚への浸透性、親和性には、水溶性であることが要求されるが、バイオスコラーゲンは、139kDaの大きさであるにも拘らず、配列の特異性から水溶性であるのに対し、他社製品においては油溶性であるか、または、水溶性については開示されていない。
本発明に係るバイオスコラーゲンのペプチドB、ペプチドCを成分とするクリームは、前記の通り、1)皮膚の保湿性効果、2)皮膚の粘弾性効果、3)繊維芽細胞の増殖効果、4)皮膚の形状効果、5)アンチエージング効果のすべてにおいて、前記の比較対象製品に対して優れており、著しく顕著な効果を奏するものであることが示されている。
Claims (11)
- ヒトコラーゲンまたは該ヒトコラーゲンの低分子化生成物ゼラチンおよびこれらの混合物を化粧料材料に配合してなることを特徴とするとするヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記ヒトコラーゲンのアミノ酸全長配列が、配列表1に記載のヒトコラーゲンI型の配列である請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記ヒトコラーゲンが、ヒトコラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸全長配列のうち681番Fから828番Eまでの198個のアミノ酸を含有するヒトコラーゲンヘプチドBである請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記ヒトコラーゲンが、ヒトコラーゲンI型(α鎖)のアミノ酸全長配列のうち264番Kから400番Nまでの136個のアミノ酸を含有するヒトコラーゲンヘプチドCである請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記ヒトコラーゲンが、カイコを利用した組換え遺伝子技法による産生物質である請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記化粧料が皮膚および頭髪に用いられる化粧品である請求項1に項に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- 前記皮膚および頭髪に用いる化粧品が、化粧用クリーム、化粧水、乳液、ファンデーション、ヘアクリーム、ヘアフォームを含む皮膚用および頭髪用化粧品である請求項3に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- さらに、ヒアルロン酸その他の保湿成分を含有してなる請求項1ないし3のいずれかの1項に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- さらに、抗酸化物質を配合してなる請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- さらに、カプサイシン、ミントその他の抗肥満物質を配合してなる請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
- さらに、オレンジ、レモングラス、クラリセージ、ネロリその他の精油からなる抗ストレス物質を配合してなる請求項1に記載のヒトコラーゲン含有化粧料。
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