KR20240039023A

KR20240039023A - 동물 유래 물질이 없는 화장용 콜라겐

Info

Publication number: KR20240039023A
Application number: KR1020247006717A
Authority: KR
Inventors: 니콜라이 오조노프; 제프리 알 멜린; 줄리아 코; 바르셀로스 호세 엠 멜로
Original assignee: 젤터, 인코포레이티드
Priority date: 2021-07-28
Filing date: 2022-07-27
Publication date: 2024-03-26
Also published as: CN118103024A; EP4376951A1; WO2023009673A1

Abstract

전장 콜라겐에 비해 하나 이상의 단축을 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드와 같은 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 화장용(예컨대, 국소) 제형이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 화장용(예컨대, 국소) 제형은 퍼스널 케어 제품(예컨대, 화장품)에 사용될 수 있다.

Description

동물 유래 물질이 없는 화장용 콜라겐

상호 참조

본 출원은 2021년 7월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 63/226,425의 이익을 주장하며, 이 출원은 전체가 참조로 본원에 포함된다.

배경

콜라겐은 힘줄, 인대, 피부 및 모발을 포함한 신체의 다양한 결합 조직에서 발견되는 가장 풍부한 단백질 중 하나이다. 콜라겐 또는 콜라겐 보충제는 의료, 화장 및/또는 건강 목적(예컨대, 피부 성장 자극, 상처 치유 촉진, 손톱 또는 관절 강화 등)으로 인기가 있다. 대부분의 콜라겐 보충제를 위한 콜라겐은 동물 가공 산업의 부산물로 동물로부터 유래된다. 그러나, 이러한 동물 유래된 콜라겐은 알레르기 뿐만 아니라 질병 전염의 위험을 증가시킬 수 있다. 또한, 특정 소비자들은 일반적으로 다양한 다른 이유로 동물 유래 물질이 없는(animal-free) 제품에 관심을 갖고 있다. 따라서, 비-동물 공급원으로부터 유래된 콜라겐의 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 남아 있다.

본 개시내용의 한 측면에서, 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 서열번호 32의 단축물(truncate)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함하고, 크림, 젤, 젤 크림, 오일, 연고, 세럼, 폼, 로션, 페이스트, 밤, 용액, 현탁액, 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화장용 제형이 제공된다. 일부 경우에서, 화장용 제형은 크림, 젤 크림, 또는 분말이다.

또 다른 측면에서, (i) 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드; 및 (ii) 레불린산, 폴리글리세릴-3 메틸글루코스 디스테아레이트, 글리세릴 운데실레네이트, 심몬드시아 시넨시스(Simmondsia chinensis)(호호바) 종자유, 폴리아크릴레이트 교차 중합체, 스쿠알란, 나트륨 히알루로네이트, 아크릴산 중합체(카르보머), 펜틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술포아세테이트, 나트륨 올레오일 사르코시네이트, 나트륨 올레에이트, 리시누스 콤무니스(Ricinus communis)(피마자) 종자유, 코페르니시아 세리페라(Copernicia cerifera)(카나우바) 왁스, 칸델릴라 왁스, 테오브로마 카카오(Theobroma cacao)(코코아) 종자 버터, 이소노닐 이소노나노에이트, 오조케라이트, 이소프로필 티타늄 트리이소스테아레이트, 폴리히드록시스테아르산, 산화철, 이산화티타늄, 나트륨 레불리네이트, 및 히드록시프로필 구아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 화장용 제형이 제공된다.

이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 32에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 폴리펩티드는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 32에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 폴리펩티드는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 32에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 폴리펩티드는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 32에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 폴리펩티드는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 32에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 폴리펩티드는 서열번호 32의 단축물에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 서열번호 32의 단축물은 서열번호 32에 비해 N-말단 단축, C-말단 단축, 또는 둘 다를 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, N-말단 단축은 서열번호 32에 비해 50개 아미노산 내지 750개 아미노산의 N-말단 단축이다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, C-말단 단축은 서열번호 32에 비해 50개 아미노산 내지 600개 아미노산의 C-말단 단축이다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 8에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 8에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 서열번호 8에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 50개 아미노산 내지 1250개 아미노산의 총 단축을 갖는다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드의 길이는 적어도 50개 아미노산이다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드의 길이는 50개 아미노산 내지 250개 아미노산이다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 라미닌 G 도메인, 폰 빌레브란트 인자 유형 A(vWA) 도메인, 및 원섬유성 콜라겐 C-말단 도메인 중 하나 이상을 포함하지 않는다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 하나 이상의 콜라겐 삼중 나선 반복부를 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 단량체이다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐의 안정한 삼중 나선 구조를 형성하지 않는다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드에는 다른 콜라겐 쇄가 실질적으로 없다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐에 비해 비-자연 발생 수준의 히드록실화를 갖는다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드에 존재하는 프롤린의 10% 미만이 히드록실화된다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 비-히드록실화된다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐에 비해 비-자연 발생 수준의 글리코실화를 갖는다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 5 wt% 미만의 글리코실화를 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 폴리펩티드는 화장용 제형에 0.001% 내지 30% w/w의 양으로 존재한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 화장용 제형은 국소 적용을 위해 제형화된다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 화장용 제형은 개체의 피부 또는 모발에 적용하기 위해 제형화된다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 화장용 제형은 국소 담체를 추가로 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 국소 담체는 리포솜, 생분해성 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 분말, 생분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 석유, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산, 및 물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 화장용 제형은 보존제를 추가로 포함한다. 이전 실시양태 중 어느 하나에서, 보존제는 토코페롤, 디요오도메틸-p-톨릴술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 페녹시에탄올, 부틸렌 글리콜, 1,2 헥산디올, 메틸 파라벤, 소르브산, Germaben^® II, 로즈마리 추출물, 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 임의의 이전 실시양태의 화장용 제형을 포함하는 퍼스널 케어 제품이 제공된다. 일부 실시양태에서, 퍼스널 케어 제품은 마스크, 피부 세정제, 세정 크림, 세정 로션, 페이셜 로션, 바디 로션, 샤워 젤, 발한억제제, 탈취제, 면도 크림, 제모제, 페이셜 오일, 립 오일, 바디 오일, 페이셜 세정제, 세정 밀크, 세정 패드, 페이셜 워시, 페이셜 크림, 바디 크림, 페이셜 모이스처라이저, 바디 모이스처라이저, 페이셜 세럼, 페이셜 마스크, 바디 마스크, 페이셜 토너, 페이셜 미스트, 아이 크림, 아이 세럼, 각질제거제, 립 밤, 립스틱, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너, 바디 샴푸, 헤어 세럼, 두피 세럼, 헤어 미스트, 헤어 스프레이, 파운데이션, 틴티드 다기능 크림, 아이 섀도우, 컨실러, 마스카라, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 임의의 이전 실시양태의 화장용 제형 또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 단계를 포함하는, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 탱탱함(firmness)을 개선하는 것을 포함한다. 개체의 피부의 탱탱함을 개선하는 것은 (예컨대, Cutometer®을 사용하여) 음압에 대한 피부의 저항을 측정하는 것을 기준으로 하여 피부 탱탱함을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 탄력성을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 탄력성을 개선하는 것은 (예컨대, Cutometer®를 사용하여) 변형 후 원래 위치로 되돌아가는 피부의 능력을 측정하는 것을 기준으로 하여 피부 탄력성을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 밝기를 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 밝기를 개선하는 것은 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 피부의 밝기를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 수화를 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 수화를 개선하는 것은 (예컨대, Corneometer®을 사용한) 피부의 커패시턴스 측정을 기준으로 하여 피부 수화를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 촉각 질감을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 콜라겐 함량을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 엘라스틴 함량을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 발적을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 발적을 개선하는 것이 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 피부의 발적을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 시각적 질감을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 것은 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 가는 선 및/또는 주름을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 표피 두께를 개선하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 개체의 피부의 표피 두께를 개선하는 것은 (예컨대, Vivascope®를 사용하여) 반사 공초점 현미경으로 측정 시 표피 두께를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적용 후, 피부의 각질세포 성장 및/또는 재생은 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 실시양태에서, 적용 후, 피부의 콜라겐 생성은 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 실시양태에서, 적용 후, 피부의 섬유모세포 이동, 증식, 및/또는 부착은 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 실시양태에서, 적용 후, 도시 먼지에 노출된 후 각질세포 생존율은 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 실시양태에서, 적용 후, VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로, 초점 부착 신호전달 경로, 엔도텔린 신호전달 경로, EGF/EGFR 신호전달 경로, TGF-베타 신호전달 경로, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된다. 일부 실시양태에서, VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 MYOC1, FLII, ROCK1, ROCK2, CLTC, LIMK 1, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 초점 부착 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 ITGA3, TNC, LAMC1, FLNA, TLN1, ZYX, DIAPH1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 엔도텔린 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 TRIOBP, WNK1, MMP2, VCAN, ACTA2, GNA12, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, EGF/EGFR 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 ATXN2, JAK1, RPS6KA2, ROCK1, SHC1, IQGAP1, PLCG1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, TGF-베타 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 SMURF1, SPTBN1, PAK2, ROCK1, SHC1, TGFBR3, TGFBR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시내용의 추가의 측면 및 이점은 본 개시내용의 예시적인 실시양태만이 도시되고 설명되는 하기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다. 실현될 바와 같이, 본 개시내용은 다른 실시양태 및 상이한 실시양태가 가능하며, 이의 여러 세부 사항은 모두 본 개시내용에서 벗어나지 않고 다양하고 명백한 측면에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.

본원에 개시된 주제의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 설명된다. 본원에 개시된 주제의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본원에 개시된 주제의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1은 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드와 상응하는 자연 발생 콜라겐의 정렬을 도시한다. 도 1은 서열번호 33(서열번호 31의 서브섹션)을 개시한다.
도 2는 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드와 상응하는 자연 발생 콜라겐의 정렬을 도시한다. 도 2는 서열번호 34(서열번호 32의 서브섹션)를 개시한다.
도 3은 미생물 세포 배양물로부터의 상청액 샘플에서 콜라겐 단백질의 밴드를 나타내는 2개의 SDS-PAGE 겔의 이미지를 도시한다. 각각의 단백질의 정체성은 각각의 밴드 위에 표시된다.
도 4a-4c는 pH 3.0 처리 전 및 후에 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드의 밴드를 나타내는 SDS-PAGE 겔의 이미지를 도시한다.
도 5는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드의 용해 시간에 대한 pH, 폴리펩티드 농도 및 온도의 영향을 도시한다.
도 6은 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 용액의 탁도에 대한 pH, 폴리펩티드 농도 및 온도의 영향을 도시한다.
도 7a 및 도 7b는 폴리펩티드의 총량에 의해 측정된 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 분말의 안정성에 대한 pH 및 온도의 영향을 도시한다.
도 8a 및 도 8b는 전장 폴리펩티드%/분해로 측정된, 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 분말의 안정성에 대한 pH 및 온도의 영향을 도시한다.
도 9a-9c는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 용액의 점도에 대한 pH 및 온도의 영향을 도시한다.
도 10a-10c는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 용액의 점도에 대한 pH 및 온도의 영향을 도시한다.
도 11은 벤치마크 대비 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드로 처리된 피부 모델 기재의 증가된 탱탱함을 도시한다.
도 12a-12c는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드에 노출된 후 불멸화된 인간 각질세포 세포주, 인간 1차 섬유모세포, 및 인간 1차 각질세포의 생존율을 도시한다.
도 13은 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드에 노출된 후 인간 1차 각질세포의 증식에 있어서 용량 의존적 증가를 도시한다.
도 14는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드에 노출된 후 1차 인간 섬유모세포에 의한 콜라겐 I 생성의 용량 의존적 증가를 도시한다.
도 15는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드에 노출된 후 인간 진피 섬유모세포의 상처 치유 활성을 도시한다.
도 16은 도시 먼지에 노출된 후 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드로 전처리된 불멸화된 인간 각질세포 세포주의 생존율을 도시한다.
도 17은 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드의 항산화 능력을 도시한다.

정의

본원에 사용된 용어는 단지 특정한 경우를 설명하기 위해 사용된 것이며 제한하려는 의도는 아니다. 본원에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 형태도 포함하도록 의도된다. 또한, 용어 "포함하는(including")", "포함하다(include)", "갖는", "갖다", "함께" 또는 이들의 변형은 상세한 설명 및/또는 청구범위에 사용되는 한, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법, 예컨대 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예컨대, "약"은 주어진 값의 실시에 따라 1 또는 1 초과 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에 특정 값이 기재되는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위를 의미하는 것으로 가정되어야 한다.

용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 어떤 용어도 의료인(예컨대, 의사, 공인 간호사, 간호사, 의사 보조원, 간호조무사, 또는 호스피스 종사자)의 감독(예컨대, 지속적 또는 간헐적)에 의해 특징지어지는 상황을 요구하거나 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 이의 변형은 임의의 언급된 특징을 포함하지만 임의의 다른 특징을 배제하지 않음을 나타내는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "포함하는"은 포괄적이며, 추가의 언급되지 않은 특징을 배제하지 않는다. 본원에 제공된 임의의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, "포함하는"은 "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"으로 대체될 수 있다. 문구 "본질적으로 이루어지는"은 지정된 특징(들) 뿐만 아니라 청구된 개시내용의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 특징을 요구하기 위해 본원에 사용된다. 본원에 사용된 용어 "이루어지는"은 지정된 특징만의 존재를 나타내는 데 사용된다.

본 개시내용 전반에 걸쳐, 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 임의의 실시양태의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 점을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 가능한 모든 하위범위 뿐만 아니라 하한 단위의 10분의 1까지 해당 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예컨대, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등 뿐만 아니라 해당 범위 내의 임의의 개별 값, 예컨대 1.1, 2, 2.3, 5, 및 5.9를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 이러한 개재하는 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 구체적으로 배제된 임의의 한계에 따라 본 개시내용 내에 포괄된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위도 본 개시내용에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "단축된 콜라겐"은 일반적으로 전장(예컨대, 천연) 콜라겐의 하나 이상의 부분이 존재하지 않는 전장(예컨대, 천연) 콜라겐보다 더 작은 폴리펩티드를 지칭한다. 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 C-말단 끝, N-말단 끝에서 단축될 수 있거나, 전장 콜라겐 서열의 내부 부분(들)의 제거(예컨대, 내부 단축)에 의해 단축될 수 있거나, C-말단 끝 및 N-말단 끝 둘 다가 단축될 수 있거나, C-말단 단축 및 N-말단 단축 중 하나 또는 둘 다 뿐만 아니라 내부 단축도 가질 수 있다. 비제한적인 실시양태에서, 단축된 콜라겐은 서열번호 2에 따른 아미노산 서열 또는 이의 상동체를 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적인 실시양태에서, 단축된 콜라겐은 서열번호 8에 따른 아미노산 서열 또는 이의 상동체를 포함할 수 있다.

아미노산 위치와 관련하여 사용될 때, "단축"은 상기 아미노산 위치를 포함한다. 예컨대, 전장 폴리펩티드에 비해 아미노산 위치 100에서의 N-말단 단축은 전장 폴리펩티드의 N-말단으로부터 100개 아미노산의 단축을 의미한다(즉, 단축된 폴리펩티드에는 전장 폴리펩티드의 아미노산 위치 1 내지 100이 결손됨). 유사하게, 전장 폴리펩티드(1000개 아미노산 전장 폴리펩티드로 가정)의 아미노산 위치 901에서의 C-말단 단축은 C-말단으로부터 100개 아미노산의 단축을 의미한다(즉, 단축된 폴리펩티드에는 전장 폴리펩티드의 아미노산 위치 901 내지 1000이 결손됨). 유사하게, 아미노산 위치 101 및 200에서의 내부 단축은 전장 폴리펩티드의 100개 아미노산의 내부 단축을 의미한다(즉, 단축된 폴리펩티드에는 전장 폴리펩티드의 아미노산 위치 101 내지 200이 결손됨).

본원에 사용된 섹션 제목은 단지 조직화의 목적을 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

비제한적인 예로서, 비-자연 발생 폴리펩티드, 예컨대 동물 유래 물질이 없는 콜라겐 폴리펩티드 또는 콜라겐 유사 폴리펩티드 뿐만 아니라 콜라겐 단편 및/또는 단축된 콜라겐, 예컨대 유전자 조작 미생물에서 및/또는 이에 의해 발현되는 것을 제조하기 위한 조성물, 방법 및 시스템이 본원의 특정 실시양태에서 제공된다. 따라서, 본 개시내용의 다양한 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 콜라겐 또는 콜라겐 유사 폴리펩티드, 재조합 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 단축된 콜라겐을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 단축된 콜라겐)는 포유동물 또는 비-포유동물 공급원과 같은 임의의 적합한 공급원으로부터 유래된다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 단축된 콜라겐) 또는 이의 적어도 일부는 새 또는 조류(예컨대, 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 콜라겐), 민물고기 또는 바닷물고기(예컨대, 아시펜서 슈렌키이(Acipenser schrenckii) 콜라겐), 또는 이들의 임의의 조합의 콜라겐(예컨대, 변형, 단축, 단편 등)으로부터 유래될 수 있다.

본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연에서는 정상적으로 발견되지 않는다. 일반적으로, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐과 하나 이상의 차이를 나타낸다. 특정 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)와 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐과 상이한 구조를 가질 수 있다. 천연 콜라겐의 4차 구조는 전형적으로 3개의 폴리펩티드로 구성된 삼중 나선 구조이다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 천연 콜라겐의 4차 구조를 갖지 않거나 형성하지 않을 수 있다. 예컨대, 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐의 안정한 삼중 나선 구조를 형성하지 않을 수 있다. 특정 경우에서, 천연 콜라겐을 형성하는 3개의 폴리펩티드 중 2개가 일반적으로 동일하며 알파 쇄로 지정된다. 제3 폴리펩티드는 베타 쇄로 지정된다. 특정 경우에서, 전형적 천연 콜라겐은 AAB로 지정될 수 있으며, 콜라겐은 2개의 알파("A") 가닥 및 1개의 베타("B") 가닥으로 구성된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 천연 콜라겐의 AAB 구조를 갖지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 상이한 콜라겐 쇄가 없거나 실질적으로 없다(예컨대, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 알파 쇄 콜라겐을 포함할 수 있고 베타 쇄 콜라겐이 없거나 실질적으로 없을 수 있다). 일부 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 단량체이며/이거나 다량체 구조를 형성하지 않는다. 다른 측면에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드는 일부 경우에서 동일한 단량체로 다량체 구조(예컨대, 동종이량체, 동종삼량체 등)를 형성할 수 있다.

일부 측면에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 (예컨대, 숙주 세포에서 재조합적으로 제조되는) 재조합 폴리펩티드이다. 비-자연 발생 폴리펩티드는 한 실시양태에서 단축된 콜라겐이다. 다른 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드는 키메라 콜라겐을 포함한다. 키메라 콜라겐은 콜라겐 폴리펩티드의 한 부분이 제2 콜라겐 폴리펩티드의 부분과 인접한 폴리펩티드이다. 예컨대, 또 다른 종으로부터의 콜라겐 부분과 인접한 한 종으로부터의 콜라겐 부분을 포함하는 콜라겐 분자는 키메라 콜라겐이다. 또 다른 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 분비 태그, 히스티딘 태그, 녹색 형광 단백질, 프로테아제 절단 부위, GEK 반복부, GDK 반복부 및/또는 베타-락타마제와 같은 추가 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는, 예컨대 상응하는 천연 콜라겐 또는 자연적으로 존재하는 콜라겐에 비해 비-자연 발생 수준의 글리코실화를 갖는다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는 약 10 wt% 미만, 약 9 wt% 미만, 약 8 wt% 미만, 약 7 wt% 미만, 약 6 wt% 미만, 약 5 wt% 미만, 약 4 wt% 미만, 약 3 wt% 미만, 약 2 wt% 미만, 약 1 wt% 미만, 약 0.9 wt% 미만, 약 0.8 wt% 미만, 약 0.7 wt% 미만, 약 0.6 wt% 미만, 약 0.5 wt% 미만, 약 0.4 wt% 미만, 약 0.3 wt% 미만, 약 0.2 wt% 미만, 또는 약 0.1 wt% 미만의 글리코실화를 포함한다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는 상응하는 천연 콜라겐 또는 자연적으로 존재하는 콜라겐의 총 글리코실화의 약 95% 미만, 약 90% 미만, 약 85% 미만, 약 80% 미만, 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10%, 또는 약 5% 미만을 포함한다. 예컨대, 종 XYZ로부터의 자연적으로 존재하는 콜라겐 ABC가 (콜라겐 ABC의 전장 또는 이의 일부의 전체에 걸쳐) 20개의 글리코실화를 갖는 경우, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는 19개 미만, 18개 미만, 17개 미만, 16개 미만, 15개 미만, 14개 미만, 13개 미만, 12개 미만, 11개 미만, 10개 미만, 9개 미만, 8개 미만, 7개 미만, 6개 미만, 5개 미만, 4개 미만, 3개 미만, 2개 미만, 또는 1개 미만의 글리코실화를 포함하는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 이러한 낮은 수준의 글리코실화는 하나 이상의 유형의 글리코실화(예컨대, O-글리코실화 또는 N-글리코실화 등) 및/또는 글리코실화 잔기(예컨대, 갈락토실히드록시리신(Gal-Hyl), 글루코실 갈락토실히드록시리신(GlcGal-Hyl) 등)에 특이적일 수 있다. (예컨대, 재조합 숙주 세포에서) 재조합적으로 생성된 비-자연 발생 폴리펩티드는 일부 경우에서 자연 발생 콜라겐과 상이한 글리코실화 수준 및/또는 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.

일부 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 비-자연 발생량의 히드록시프롤린을 갖는다. 일부 경우에는, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드에는 히드록시프롤린이 결여된다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐보다 더 적은 수의 히드록시프롤린을 포함한다. 히드록시프롤린은 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린 및 5-히드록시프롤린을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열에 존재하는 프롤린의 약 50% 미만(예컨대, 예컨대, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 그 미만)은 히드록시프롤린이다. 일부 측면에서, (예컨대, 재조합 숙주 세포에서) 재조합적으로 생성된 비-자연 발생 폴리펩티드는 자연 발생 콜라겐보다 더 적은 수의 히드록시프롤린을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 재조합 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드의 하나 이상의 아미노산(예컨대, 프롤린)을 히드록실화하는 효소가 결여된 재조합 숙주 세포(예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포)에서 재조합적으로 발현된다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 재조합 폴리펩티드는 프롤릴 4-히드록실라제 및/또는 프롤릴 3-히드록실라제가 결여된 숙주 세포(예컨대, 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포)에서 재조합적으로 발현된다.

일부 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 리신 산화가 결여되거나 실질적으로 결여된다. 리신 산화는 리신 잔기의 다른 단백질과 가교결합을 형성할 수 있는 높은 반응성의 알데히드로의 전환을 수반한다. 자연 발생 콜라겐은 어느 정도의 리신 산화를 가질 수 있다. 따라서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 리신 산화가 결여되거나 실질적으로 결여된다는 점에서 천연 콜라겐과 상이할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드의 아미노산 서열에 존재하는 리신의 약 50% 미만(예컨대, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 그 미만)이 산화된다.

일반적으로, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 천연 또는 전장 콜라겐과 유사하거나 실질적으로 유사한 기능을 갖고/갖거나 이점(예컨대, 본원에 제공된 바와 같음)을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 천연 또는 전장 콜라겐과 비교하여 개선되거나 증가된 기능 및/또는 이점(예컨대, 본원에 제공된 바와 같음)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 천연 또는 전장 콜라겐과 비교하여 하나 이상의 상이한 기능을 가질 수 있다.

본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드는 종종 이의 단량체 구조 및/또는 다른 콜라겐 가닥과 가교결합할 수 있는 아미노산의 결여, 예컨대 히드록시프롤린 잔기의 결여와 관련된 유리한 특성을 갖는다. 또한, 본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드의 콜라겐 가수분해물은 또한 전장 또는 천연 콜라겐과 비교하여 증가된 용해도로 생성된다. 또한, 천연 삼중 나선 콜라겐과 달리 단량체 구조는 더 쉽게 분해되고 생체 이용이 가능하거나 분해 프로테아제에 의해 분해된다. 다른 유리한 특성은 액체 조성물 및 정제 공정에서 개선된 물리적 특성을 포함하며, 이는 전장 또는 천연 콜라겐 또는 콜라겐 가닥이 상호작용하여 히드록시프롤린 잔기의 존재에 기인하여 침전할 수 있는 더 강한 구조를 형성하기 때문이다.

특정한 바람직한 실시양태에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 이들이 유래되는 자연적으로 존재하는 포유동물 또는 비-포유동물 콜라겐의 적어도 일부분에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 경우에서, 천연 아미노산 서열의 일부분 또는 일부분들이 결실되지만, 서열의 나머지 부분은 천연 아미노산 서열과 실질적으로 유사하거나 동일하다. 특정한 예시적인 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 갈루스 갈루스 유형 21 알파 1 콜라겐 또는 이의 단축물 또는 단편에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 예에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 아시펜서 슈렌키이 유형 2 알파 1 콜라겐 또는 이의 단축물 또는 단편에 대해 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.

일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 단축된 콜라겐이다. 특정 경우에서, 단축된 콜라겐은 전장(예컨대, 천연) 콜라겐보다 작은 폴리펩티드이며, 전장(예컨대, 천연) 콜라겐의 하나 이상의 부분(예컨대, 내부 및/또는 말단 부분(들))이 존재하지 않는다. 다양한 경우에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 C-말단 끝, N-말단 끝이 단축되거나, 전장 콜라겐 폴리펩티드의 내부 부분(들)이 제거되어 단축되거나(예컨대, 내부 단축), C-말단 끝 및 N-말단 끝 둘 다에서 단축되거나, C-말단 단축 및 N-말단 단축 중 하나 또는 둘 다 뿐만 아니라 내부 단축을 포함한다. 일부 경우에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 천연 또는 자연적으로 존재하는 상응하는 콜라겐의 (예컨대, 관심) 기능의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%를 유지하는 자연 발생 콜라겐의 단편이다. 일부 경우에서, 용어 단축된 콜라겐은 용어 콜라겐 단편과 상호교환적으로 사용된다. 일부 경우에서, 단축된 콜라겐은 전장의 천연 또는 자연적으로 존재하는 상응하는 콜라겐의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%인 임의의 인접한 콜라겐 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단축은 내부 단축, 콜라겐의 N-말단 부분에서의 단축, 콜라겐의 C-말단 부분에서의 단축, 내부 부분의 단축, 또는 C-말단 끝 및 N-말단 끝 둘 다에서의 단축이다. 본원에 제공된 단축된 콜라겐은 (예컨대, 전장 콜라겐에 비해) 50개 아미노산 내지 1250개 아미노산, 50개 아미노산 내지 1200개 아미노산, 50개 아미노산 내지 1150개 아미노산, 50개 아미노산 내지 1100개 아미노산, 50개 아미노산 내지 1050개 아미노산, 50개 아미노산 내지 1000개 아미노산, 50개 아미노산 내지 950개 아미노산, 50개 아미노산 내지 900개 아미노산, 50개 아미노산 내지 850개 아미노산, 50개 아미노산 내지 800개 아미노산, 50개 아미노산 내지 750개 아미노산, 50개 아미노산 내지 700개 아미노산, 50개 아미노산 내지 650개 아미노산, 50개 아미노산 내지 600개 아미노산, 50개 아미노산 내지 550개 아미노산, 50개 아미노산 내지 500개 아미노산, 50개 아미노산 내지 450개 아미노산, 50개 아미노산 내지 400개 아미노산, 50개 아미노산 내지 350개 아미노산, 50개 아미노산 내지 300개 아미노산, 50개 아미노산 내지 250개 아미노산, 50개 아미노산 내지 200개 아미노산, 50개 아미노산 내지 150개 아미노산, 또는 50개 아미노산 내지 100개 아미노산이 단축될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단축된 콜라겐은 (예컨대, 전장의 콜라겐에 비해) 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 또는 1250개 아미노산이 단축된다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드(예컨대, 이의 아미노산 서열)는 (전장 콜라겐에 비해) C-말단 끝에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 50 내지 800, 50 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 100개 등의 아미노산 잔기가 단축될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드(예컨대, 이의 아미노산 서열)는 (전장 콜라겐에 비해)에서 C-말단 끝에서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800개 또는 그 초과의 아미노산이 단축될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드(예컨대, 이의 아미노산 서열)는 (전장 콜라겐에 비해) N-말단 끝에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 50 내지 800, 50 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 100개 등의 아미노산 잔기가 단축될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 (전장 콜라겐에 비해) N 말단 끝에서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800개 또는 그 초과의 아미노산이 단축될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드(예컨대, 이의 아미노산 서열)는 전장 콜라겐에 비해 N-말단 끝 및 C-말단 끝 둘 다에서 단축될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 (전장 콜라겐에 비해) N-말단 끝에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 50 내지 800, 50 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 100개 등의 아미노산 잔기가 단축될 수 있고; (전장 콜라겐에 비해) C-말단 끝에서 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 50 내지 800, 50 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 100개 등의 아미노산 잔기가 단축될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 (전장 콜라겐에 비해) N-말단 끝에서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800개 또는 그 초과의 아미노산이 단축될 수 있고; (전장 콜라겐에 비해) C-말단 끝에서 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800개 또는 그 초과의 아미노산이 단축될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리펩티드(예컨대, 이의 아미노산 서열)는 (전장 콜라겐에 비해) 임의의 적합한 수의 아미노산 잔기, 예컨대 최대 10, 10 내지 800, 10 내지 700, 10 내지 600, 10 내지 500, 10 내지 400, 10 내지 300, 10 내지 200, 10 내지 100, 50 내지 800, 50 내지 700, 50 내지 600, 50 내지 500, 50 내지 400, 50 내지 300, 50 내지 200, 50 내지 100개 등의 아미노산 잔기가 내부적으로 단축될 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드는 (전장 콜라겐에 비해) 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800개 또는 그 초과의 아미노산이 내부적으로 단축될 수 있다.

본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 전장(예컨대, 천연) 콜라겐에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단축된 콜라겐은 전장(예컨대, 천연) 닭(갈루스 갈루스) 유형 21 알파 1 콜라겐(예컨대, 서열번호 31)에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단축된 콜라겐은 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 N-말단 단축, C-말단 단축, 내부 단축, 또는 이들의 조합을 갖는 서열번호 31의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 서열 동일성(예컨대, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 초과)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단축된 콜라겐은 전장(예컨대, 천연) 일본 철갑상어(아시펜서 슈렌키이) 유형 2 알파 1 콜라겐(예컨대, 서열번호 32)에 비해 단축을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단축된 콜라겐은 서열번호 32의 아미노산 서열, 또는 N-말단 단축, C-말단 단축, 내부 단축, 또는 이들의 조합을 갖는 서열번호 32의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 서열 동일성(예컨대, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 초과)을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전장(예컨대, 천연) 콜라겐의 비제한적 예는 하기 표 1에 제공된다.

일부 경우에서, 본원에 제공된 폴리펩티드의 길이는 적어도 50개 아미노산, 적어도 75개 아미노산, 적어도 100개 아미노산, 적어도 125개 아미노산, 적어도 150개 아미노산, 적어도 175개 아미노산, 적어도 200개 아미노산, 적어도 225개 아미노산, 적어도 250개 아미노산, 적어도 275개 아미노산, 적어도 300개 아미노산, 적어도 350개 아미노산, 적어도 400개 아미노산, 적어도 450개 아미노산, 또는 적어도 500개 아미노산이다.

다른 실시양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 다른 종의 철갑상어, 또는 연어, 스틸헤드, 송어, 럼피시, 화이트피시, 또는 잉어 뿐만 아니라 틸라피아 및 상어와 같은 다른 어류를 포함한 캐비어에 적합한 어란을 생성하는 다른 종으로부터의 어류 콜라겐에 비교할 만한 단축된 콜라겐 폴리펩티드일 수 있다. 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 적합한 비교할 만한 서열은 NCBI 등록 번호 BAO58965.1, BAO58966.1, BAO58967.1, BAT51012.1, BAR72360.1, BAR72359.1, BAR72358.1, BAR72357.1 및 BAR72356.1을 포함한다. 아시펜서 루테누스(Acipenser ruthenus)(스털렛 철갑상어)로부터의 적합한 서열은 NCBI 등록 번호 A0A444UGW0, A0A444TZM6, A0A444UC45, A0A444UC53, A0A662YTX1, A0A662Z270, A0A662YZ39, A0A444U1F5, A0A444UJK3, A0A444UNU0, X5HZZ7, X5IHC1, A0A444UPK8, A0A444UBS1, A0A444UYQ7, A0A444TWQ3, A0A444ULY4, A0A444TZ23, A0A662YS48, A0A444U4C8, A0A444UD64, A0A662YX10, A0A662YXI2, A0A444TXQ4, A0A444TZ42, A0A444U8N8, A0A444UJU3, A0A444UQ51, A0A444U2T2, A0A662YJ50, A0A444V1V9, A0A444V113, A0A662YWR6, A0A662YW91, A0A444U5J5, A0A662YR93, A0A444UJB0, A0A444UFS4, A0A444UVK2, A0A444UJU1, A0A444ULY9, A0A444UKA7, A0A444U5L7, A0A444V6M4, A0A444V788, A0A444UFS9, A0A444UVP7, A0A444U4D9, A0A444UHN6, A0A662YJC1, A0A444V1E8, A0A444UPM0, A0A662YU87, A0A444TZS8, A0A444U200, A0A444V2E3, A0A662YXD3, A0A662YQA4, A0A444U1H9, A0A444V7I5, A0A444UFX8, A0A444V7B8, A0A444U2K4, A0A444V762, A0A444UQ49, A0A662YMD3, A0A662YWF2, A0A444UE44, A0A444UAR6, A0A444UX46, A0A444U5P4, A0A662YRG8, A0A444USC3, A0A444UK09, A0A444UNQ7, A0A444UN69, A0A444V5D9, E6Y298, A0A444TZY1, A0A444TYS0, 및 E6Y299를 포함한다.

다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 닭 콜라겐, 또는 닭, 칠면조, 거위 및 오리를 포함한 가금으로부터의 것과 같은 다른 가금류 콜라겐에 비교할 만한 단축된 콜라겐 폴리펩티드일 수 있다. 갈루스 갈루스(닭)로부터 적합한 비교할 만한 서열은 NCBI 등록 번호 V9GZR2, Q9PSS5, A0A3Q2UDI3, Q90802, A0A1D5PNH7, Q4TZW6, Q90803, Q91014, A0A1D5PPI0, A0A1D5P1A5, A0A3Q2U6K2, A0A3Q2U8F9, Q90689, A0A3Q2U3U6, P13731, A0A1D5PFE0, A0A3Q2TXZ7, Q5FY72, A0A1D5PR16, A0A1D5PKR6, F1NDF5, Q90589, P08125, F1NRH2, P32017, A0A1D5PW49, Q90800, P12108, E1C353, Q7LZR2, P02460, A0A1L1RNI7, Q90796, P12106, F1NQ20, Q9I9K3, P20785, A0A1D5PWN6, P15988, P12105, F1NIL4, O93419, P02467, A0A5H1ZRJ7, A0A1D5PKQ4, A0A5H1ZRK9, Q90W37, A0A1D5NY11, A0A1D5P959, P02457, A0A1D5PYU1, A0A1D5PE57, Q90ZA0, Q90584, A0A1L1RZW7, A0A1D5NVM0, A0A1D5P8P3, F1NIP0, F1P2Q3, A0A1D5PE74, Q9IAU4, A0A3Q2TTC1, F1NHH4, P32018, A0A1D5P0F4, R4GHP9, A0A3Q2UD12, A0A3Q2UMJ2, A0A3Q2U4U7, F1NX22, A0A1D5P8I8, A0A1L1RPW4, P13944, P15989, F1P2F0, A0A1D5PGD5, 및 A0A3Q3AR07을 포함한다.

일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 (예컨대, 서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 1 내지 537; 아미노산 위치 1 내지 542; 아미노산 위치 1 내지 547; 아미노산 위치 1 내지 552; 아미노산 위치 1 내지 557; 아미노산 위치 1 내지 562; 아미노산 위치 1 내지 567; 아미노산 위치 1 내지 572; 또는 아미노산 위치 1 내지 577의 임의의 아미노산 위치에서 N-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 726 내지 957; 아미노산 위치 731 내지 957; 아미노산 위치 736 내지 957; 아미노산 위치 741 내지 957; 아미노산 위치 746 내지 957; 아미노산 위치 751 내지 957; 아미노산 위치 756 내지 957; 아미노산 위치 761 내지 957; 아미노산 위치 766 내지 957; 아미노산 위치 769 내지 957; 아미노산 위치 774 내지 957; 아미노산 위치 779 내지 957; 또는 아미노산 위치 784 내지 957의 임의의 아미노산 위치에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 N-말단 단축 및 C-말단 단축을 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 1 내지 537; 아미노산 위치 1 내지 542; 아미노산 위치 1 내지 547; 아미노산 위치 1 내지 552; 아미노산 위치 1 내지 557; 아미노산 위치 1 내지 562; 아미노산 위치 1 내지 567; 아미노산 위치 1 내지 572; 또는 아미노산 위치 1 내지 577의 임의의 아미노산 위치에서 N-말단 단축; 및 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 726 내지 957; 아미노산 위치 731 내지 957; 아미노산 위치 736 내지 957; 아미노산 위치 741 내지 957; 아미노산 위치 746 내지 957; 아미노산 위치 751 내지 957; 아미노산 위치 756 내지 957; 아미노산 위치 761 내지 957; 아미노산 위치 766 내지 957; 아미노산 위치 769 내지 957; 아미노산 위치 774 내지 957; 아미노산 위치 779 내지 957; 또는 아미노산 위치 784 내지 957의 임의의 아미노산 위치에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 557에서 N-말단 단축; 및 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 746에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 31의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 557에서 N-말단 단축; 및 (서열번호 31에 비해) 아미노산 위치 769에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 32의 아미노산 서열, 또는 (예컨대, 서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 1 내지 660; 아미노산 위치 1 내지 665; 아미노산 위치 1 내지 670; 아미노산 위치 1 내지 675; 아미노산 위치 1 내지 680; 아미노산 위치 1 내지 685; 아미노산 위치 1 내지 690; 아미노산 위치 1 내지 695; 또는 아미노산 위치 1 내지 700의 임의의 아미노산 위치에서 N-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 32의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 855 내지 1420; 아미노산 위치 860 내지 1420; 아미노산 위치 865 내지 1420; 아미노산 위치 870 내지 1420; 아미노산 위치 875 내지 1420; 아미노산 위치 880 내지 1420; 아미노산 위치 885 내지 1420; 아미노산 위치 890 내지 1420; 아미노산 위치 895 내지 1420; 또는 아미노산 위치 900 내지 1420의 임의의 아미노산 위치에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 N-말단 단축 및 C-말단 단축을 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 32의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 1 내지 660; 아미노산 위치 1 내지 665; 아미노산 위치 1 내지 670; 아미노산 위치 1 내지 675; 아미노산 위치 1 내지 680; 아미노산 위치 1 내지 685; 아미노산 위치 1 내지 690; 아미노산 위치 1 내지 695; 또는 아미노산 위치 1 내지 700의 임의의 아미노산 위치에서 N-말단 단축; 및 (서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 855 내지 1420; 아미노산 위치 860 내지 1420; 아미노산 위치 865 내지 1420; 아미노산 위치 870 내지 1420; 아미노산 위치 875 내지 1420; 아미노산 위치 880 내지 1420; 아미노산 위치 885 내지 1420; 아미노산 위치 890 내지 1420; 아미노산 위치 895 내지 1420; 또는 아미노산 위치 900 내지 1420의 임의의 아미노산 위치에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 32의 아미노산 서열, 또는 (서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 680에서 N-말단 단축; 및 (서열번호 32에 비해) 아미노산 위치 880에서 C-말단 단축을 갖는 이에 대해 적어도 약 80%(예컨대, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 그 초과) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일부 경우에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 일부 경우에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 본질적으로 본원에 제공된 임의의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖거나 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 본질적으로 이로 이루어진다.

일부 측면에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 적어도 하나의 비-연속 콜라겐 단편을 포함하는 임의의 키메라 콜라겐을 포함할 수 있다. 예컨대, 비-자연 발생 폴리펩티드는 N-말단 콜라겐의 일부가 C-말단 콜라겐의 일부에 인접한 키메라 콜라겐일 수 있으며, N-말단 콜라겐의 일부 및 C-말단 콜라겐의 일부는 천연 또는 자연적으로 존재하는 상응하는 콜라겐에 인접하지 않는다. 또 다른 예에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 C-말단 콜라겐의 일부가 N-말단 콜라겐의 일부에 인접한 키메라 콜라겐일 수 있고(예컨대, 뒤집힌 순서 또는 역순으로 - C 말단 콜라겐은 N-말단 콜라겐 부분의 N-말단에 위치됨), C-말단 콜라겐 부분 및 N-말단 콜라겐 부분은 천연 또는 자연적으로 존재하는 상응하는 콜라겐에서 인접하거나 비-인접한다. 또 다른 예에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 콜라겐 폴리펩티드의 한 부분이 제2 콜라겐 폴리펩티드의 일부에 인접한 키메라 콜라겐일 수 있다(예컨대, 제2 종으로부터의 콜라겐의 일부에 인접한 제1 종으로부터의 콜라겐의 일부를 포함하는 콜라겐 분자는 키메라 콜라겐임).

재조합 폴리펩티드의 예시적인 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열은 하기에 제공된다:

서열번호 1 - 갈루스 갈루스(닭)로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 2 - 갈루스 갈루스(닭)의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열

서열번호 3 - 갈루스 갈루스(닭)로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 4 - 갈루스 갈루스(닭)로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열

서열번호 5 - 갈루스 갈루스(닭)로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 6 - 갈루스 갈루스(닭)로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열

서열번호 7 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 8 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드의 아미노산 서열

서열번호 9 - 분비 신호 서열 1로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 10 - 분비 신호 서열 1의 아미노산 서열

서열번호 11 - 분비 신호 서열 2로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 12 - 분비 신호 서열 2의 아미노산 서열

서열번호 13 - 분비 신호 서열 3으로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 14 - 분비 신호 서열 3의 아미노산 서열

서열번호 15 - 분비 신호 서열 4로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 16 - 분비 신호 서열 4의 아미노산 서열

서열번호 17 - 분비 신호 서열 5로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 18 - 분비 신호 서열 5의 아미노산 서열

서열번호 19 - 분비 신호 서열 6으로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 20 - 분비 신호 서열 6의 아미노산 서열

서열번호 21 - 분비 신호 서열 7로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 22 - 분비 신호 서열 7의 아미노산 서열

서열번호 23 - 분비 신호 서열 8로 명명된 분비 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열

서열번호 24 - 분비 신호 서열 8의 아미노산 서열

서열번호 25 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

서열번호 26 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

서열번호 27 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

서열번호 28 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

서열번호 29 - 아시펜서 슈렌키이(일본 철갑상어)로부터의 단축된 콜라겐 유형 2 알파 1 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

서열번호 30 - 갈루스 갈루스로부터의 단축된 콜라겐 유형 21 폴리펩티드를 코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6 및 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 2, 4, 6, 및 8 중 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 등의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 및 25-30 중 어느 하나의 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드는 서열번호 1, 3, 5, 7, 및 25-30 중 어느 하나의 핵산 서열에 대해 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 등의 서열 동일성을 갖는 핵산에 의해 코딩된다.

일부 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 천연 콜라겐으로부터의 하나 이상의 도메인을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 도 1 및 도 2는 본 개시내용의 예시적인 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐)와 상응하는 자연 발생 콜라겐의 정렬을 도시한다. 도 1은 서열번호 2 및 서열번호 6의 비-자연 발생 폴리펩티드와 갈루스 갈루스 유형 21 알파 1 콜라겐(예컨대, 서열번호 31)의 정렬을 도시한다. 도 2는 서열번호 8의 비-자연 발생 폴리펩티드와 아시펜서 슈렌키이 유형 2 알파 1 콜라겐의 정렬을 도시한다. 도 1 및 도 2는 비-자연 발생 폴리펩티드가 천연 콜라겐에서 발견되는 하나 이상의 도메인(예컨대, 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인)을 가질 수 있음을 입증한다. 도 1 및 도 2는 비-자연 발생 폴리펩티드에 천연 콜라겐에서 발견되는 하나 이상의 도메인(예컨대, 폰 빌레브란트 인자 유형 A(vWA) 도메인, 라미닌 G 도메인, 원섬유성 콜라겐 C-말단 도메인)이 결여될 수 있음을 추가로 입증한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드는 하나 이상의 콜라겐 삼중 나선 반복 도메인을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드에 폰 빌레브란트 인자 유형 A(vWA) 도메인, 라미닌 G 도메인, 및 원섬유성 콜라겐 C-말단 도메인 중 하나 이상이 결여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는 분비 신호 서열을 포함한다. 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)가 (예컨대, 재조합 숙주 세포에서 생성될 때) 주변세포질 및/또는 세포외 공간으로 분비되도록 유도할 수 있는 임의의 적합한 분비 신호 서열(예컨대, 소수성 신호전달 펩티드, Sec 신호 펩티드, Tat 신호 펩티드 등). 예시적인 분비 신호 서열은 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함한다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 분비 신호 서열은 서열번호 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23 중 어느 하나의 핵산 서열에 의해 코딩되는 펩티드를 포함한다. 분비 신호 서열은 바람직하게는 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)의 N-말단에 위치된다. 그러나, 분비 신호 서열은 분비 신호 서열이 기능을 유지하는 N-말단 이외의 위치에 위치될 수 있는 것으로 고려된다.

본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)는 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 서열을 통해 발현되거나 생성될 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 또 다른 측면은 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 박테리아 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 곤충 발현 벡터이다. 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 삽입된 핵산으로부터 단백질 발현을 유도할 수 있는 임의의 적합한 발현 벡터. 예시적인 박테리아 발현 벡터는 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 융합 파트너로 사용되고 유전자 발현이 tac 프로모터의 제어 하에 있는 pGEX 벡터, 또는 T7 프로모터를 사용하는 pET 벡터(예컨대, pET28 벡터 등)를 포함할 수 있다. 예시적인 효모 발현 벡터는 메탄올로 유도 가능한 AOX1 프로모터를 사용하는 pPIC 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 숙주 세포(예컨대, 재조합 폴리펩티드를 발현하는 세포)에 독립적으로 존재하는 플라스미드 형태(예컨대, 박테리아 인공 염색체 형태 등 포함)이다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 무작위 또는 표적화된 통합을 통해 숙주 세포의 염색체로 안정적으로 통합된다.

일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 서열은 비-동물 세포, 바람직하게는 박테리아 세포에서 발현되도록 코돈 최적화된다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된"은 코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 않고 이종 세포(예컨대, 미생물 세포, 박테리아 세포 등)에서의 발현을 위해 코돈 조성이 개선되는 것을 의미한다. (예컨대, 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드를 코딩하는) 코돈 최적화된 핵산 서열의 비제한적인 예는 서열번호 25-30을 포함한다.

일부 실시양태에서, 발현 벡터는 하나 이상의 선별제를 포함할 수 있다. 선별제는 갈락토스 함유 슈가를 포함한 특정 슈가 또는 암피실린, 히그로마이신, G418 등을 포함한 항생제를 포함한다. 선별제에 대한 내성을 부여하는 데 사용되는 효소는 β-갈락토시다제 또는 β-락타마제를 포함한다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 발현 벡터는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산이 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터에 작동적으로 연결되도록 유도성 프로모터 또는 구성적 프로모터(예컨대, CMV 프로모터 등)를 포함한다. 예컨대, 발현 벡터는 테트라사이클린 유도성 프로모터 pTET, araC-ParaBAD 유도성 프로모터, IPTG 유도성 lac 프로모터를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "작동적으로 연결된" 프로모터 및 핵산은 핵산의 발현(예컨대, 전사, 번역 등)이 적어도 프로모터의 부분적 제어 하에 있음을 의미한다.

일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산(예컨대, 서열번호 1, 3, 5, 7 및 25-30 중 어느 하나의 핵산) 및 발현 벡터는 20 내지 50 bp 길이, 20 내지 40 bp 길이, 20 내지 30 bp 길이, 또는 30 내지 40 bp 길이의 중첩을 가질 수 있다. 이러한 중첩은 DNA 폴리머라제(예컨대, PRIMESTAR^® GXL 폴리머라제(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase))와 함께 PCR을 이용하여 추가될 수 있다. 개방형 발현 벡터 및 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드)를 코딩하는 삽입 핵산은 임의의 적합한 클로닝 시스템(예컨대, IN-FUSION^® Cloning (takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning) 또는 SGI 깁슨(Gibson) 어셈블리(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc))을 사용하여 최종 플라스미드로 함께 조립될 수 있다.

이러한 제조된 발현 벡터 (또는 플라스미드)는 본원에 기재된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 콜라겐, 단축된 콜라겐 또는 콜라겐 단편)를 생성하는 유전적으로 조작되거나 변형된 유기체, 또는 재조합 세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 재조합 세포는 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 콜라겐, 단축된 콜라겐 또는 콜라겐 단편, 바람직하게는 갈루스 갈루스 콜라겐 및/또는 아시펜서 슈렌키이 콜라겐의 또는 이로부터 유래된 콜라겐, 단축된 콜라겐, 또는 콜라겐 단편)를 코딩하는 플라스미드 또는 안정적으로 통합된 이종 핵산 서열의 적어도 하나의 카피를 함유한다. 일부 실시양태에서, 재조합 세포는 미생물 세포이다. 예컨대, 발현 벡터가 박테리아 발현 벡터인 경우, 발현 벡터는 (예컨대, 임의의 적합한 형질전환 방법을 통해) 단백질 발현을 위한 박테리아 세포(예컨대, BL-21 세포를 포함하는 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli) 등)에 삽입되어 박테리아의 세포질에 독립적으로 존재하거나(예컨대, 플라스미드 형태로) 또는 박테리아 염색체에 적어도 일시적으로 및/또는 안정적으로 통합될 수 있다.

결과적으로, 형질전환된 세포는 적합한 배지에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 적합한 배지는 최소 배지를 포함하고, 세포는 50:50의 세포 대 글리세린의 비율로 식물성 글리세린과 함께 1.5 분취량으로 동결된다. 단백질 발현을 위해, 동결 배양된 세포 중 1개 바이알을 적합한 양의 박테리아 배양 배지(예컨대, 최소 배지, 50 mL, 100 mL 등)에서 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간 동안, 적어도 밤새 적어도 36℃, 바람직하게는 약 37℃에서 배양물을 연속적으로 진탕(예컨대, 적어도 100 rpm, 적어도 200 rpm, 적어도 250 rpm 등)함으로써 배양할 수 있다. 표 2 및 표 3은 세포 컬티베이션 및 배양에 사용될 수 있는 최소 배지의 예시적인 제형을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 형질전환된 세포는 이어서 더 큰 부피의 성장 배지(예컨대, 최소 배지)로 전달되고, 적어도 4시간, 적어도 5시간, 적어도 6시간, 적어도 7시간, 적어도 8시간, 5 내지 10시간, 5 내지 9시간, 6 내지 9시간, 및/또는 대안적으로 배지의 세포 밀도가 광학 밀도(OD) 600에 도달할 때까지 성장될 수 있다.

또한, 발효 공정은 22℃ 내지 33℃, 29℃ 내지 33℃, 30℃ 내지 32℃, 23℃ 내지 29℃, 또는 25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발효 온도는 일정한 온도로 유지될 수 있으며, 발효 완료 즉시 비-자연 발생 폴리펩티드는 정제될 수 있다. 대안적으로, 발효 온도를 원하는 기간 동안 유지될 수 있고, OD600의 세포 밀도가 10-20에 도달하면 온도를 낮추어 단백질 생성을 유도할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 전형적으로 온도는 28℃에서 25℃로 낮아진다. 발효 동안, 유도 시약을 첨가함으로써 박테리아에서의 단백질 발현이 유도될 수 있다. 예컨대, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하고 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 콜라겐)를 코딩하는 핵산이 lac 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 핵산의 발현은 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 0.1 - 1.5 mM, 0.1 - 1.0 mM 또는 0.1 - 0.5 mM 범위의 농도로 첨가하여 유도될 수 있다. 발효는 20-24시간 동안, 또는 일부 실시양태에서는 40-60시간 동안 계속될 수 있다.

이렇게 생성된 재조합 세포(예컨대, 발현 벡터로 형질전환된 재조합 박테리아)는 발현 벡터에서 핵산에 의해 코딩된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 콜라겐)를 세포내에서 발현하는 것으로 고려된다. 이러한 세포내 발현된 폴리펩티드(예컨대, 단축된 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 콜라겐)는 이후 (분비 신호 서열을 통해) 세포외 공간(예컨대, 배양 배지)으로 분비될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 배양 배지는 핵산에 의해 코딩된 분비된 재조합 단백질(예컨대, 단축된 콜라겐, 콜라겐 단편, 또는 콜라겐)을 함유할 수 있다.

따라서, 본 개시내용의 또 다른 측면은 핵산에 의해 코딩된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 콜라겐, 단축된 콜라겐, 콜라겐 단편 또는 콜라겐)를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 콜라겐, 단축된 콜라겐 또는 이의 단편)를 코딩하는 통합된 이종 핵산 서열을 포함하는 재조합 세포 및/또는 재조합 세포를 위한 배양 배지(예컨대, 성장 배지, 컬티베이션 배지 등)를 포함할 수 있다.

대안적으로 및/또는 추가적으로, 조성물은 재조합 세포 및/또는 배양 배지로부터 정제된 재조합 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 재조합 세포가 성장하고 이로 재조합 폴리펩티드를 분비하는 배양 배지로부터 정제된다. 일부 실시양태에서, 재조합 폴리펩티드는 태그(예컨대, 히스티딘 태그 등)와 커플링되어 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 공지된 친화성 정제를 이용하여 정제될 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드는 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있다. 예컨대, 재조합 폴리펩티드는 균질화된 성장 배지의 산 처리에 의해 정제될 수 있다. 이러한 예에서, 성장 배지(예컨대, 발효 브로쓰)의 pH는 5-50% 황산을 사용하여 3 내지 3.5로 감소될 수 있다. 이어서, 재조합 세포는 원심분리를 이용하여 분리된다. 산성화된 브로쓰의 상층액을 폴리아크릴아미드 겔에서 시험하고 출발 펠렛에 비해 상대적으로 높은 풍부도로 재조합 폴리펩티드를 포함하는지의 여부를 결정할 수 있다. 수득된 재조합 폴리펩티드 슬러리는 일반적으로 염 함량이 높다. 부피 및 염 감소를 위해 여과 단계를 이용하여 농축 및 정용여과 단계를 수행할 수 있다. 예컨대, 여과 단계는 각각 0.1 m²의 한외여과 카세트를 갖춘 EMD 밀리포어(Millipore) 접선 유동 여과 시스템을 이용하여 수행될 수 있다. 이 예에서 총 여과 면적은 2개의 카세트를 병렬로 사용하여 0.2 m²가 될 수 있다. TFF 단계에서는 부피를 5x 감소시키고 염을 19x 감소시킬 수 있다. 최종 슬러리를 SDS-PAGE 겔에서 실행하여 재조합 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있다. 이어서, 정제된 재조합 폴리펩티드를 SDS-PAGE 겔에서 분석하여 각각의 폴리펩티드에 대해 예상되는 크기에서 관찰되는 상응하는 두껍고 선명한 밴드를 확인할 수 있다. 역가 및 순도의 정량화는 역상 및 크기 배제 HPLC 크로마토그래피를 이용하여 추가로 수행될 수 있다. 정제된 재조합 폴리펩티드의 순도는 적어도 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%인 것이 바람직하다.

다양한 측면에서, 본 개시내용의 폴리펩티드 및 하나 이상의 추가 성분을 포함하는 조성물 및 제형이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 조성물 및 제형은 모든 유형의 비히클 및 담체를 포함하거나 이에 혼입될 수 있다. 비히클 또는 담체는 미용적으로 또는 피부과적으로 허용되는 비히클 또는 담체일 수 있다. 비히클 또는 담체의 비제한적인 예는 물, 글리세린, 알콜, 오일, 실리콘 함유 화합물, 실리콘 화합물 및 왁스를 포함한다. 변형 및 다른 적절한 비히클은 당업자에게 명백할 것이며, 본 개시내용의 조성물 및 제형에 사용하기에 적합하다. 특정 측면에서, 화합물, 성분 및 작용제의 농도 및 조합은 조합이 화학적으로 적합하고 최종 제품에서 침전되는 복합체를 형성하지 않는 방식으로 선택될 수 있다.

일부 측면에서, 본 개시내용의 조성물 및 제형은 계면활성제, 실리콘 함유 화합물, UV 작용제, 오일, 및/또는 본 명세서에서 확인된 다른 성분 또는 당업계에 공지된 성분을 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 로션, 크림, 바디 버터, 마스크, 스크럽, 워시, 젤, 세럼, 에멀젼(예컨대, 수중유, 유중수, 수중실리콘, 실리콘중수, 수중유중수, 유중수중유, 실리콘중수중유 등), 용액(예컨대, 수성 또는 히드로 알콜 용액), 무수 염기(예컨대, 립스틱 또는 분말), 연고, 우유, 페이스트, 에어로졸, 고체 형태, 아이 젤리, 젤 세럼, 젤 에멀젼 등일 수 있다. 조성물은 사용 동안 하루에 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 또는 그 초과로 국소 피부 적용을 위해 제형화될 수 있다.

본 개시내용의 조성물 및 제형은 트리글리세리드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 소형, 중형 및 대형 쇄 트리글리세리드를 포함한다. 본 개시내용의 조성물 및 제형은 또한 보존제를 포함할 수 있다. 보존제의 비제한적인 예는 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 요오도프로피닐 부틸카르바메이트, 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 또는 이들의 임의의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물 및 제형은 파라벤이 없다.

본 개시내용의 조성물 및 제형은 UVA 및 UVB 흡수 특성을 가질 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 제형은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 또는 그 초과, 또는 이 내의 정수 또는 파생물의 자외선 차단 지수(SPF)를 가질 수 있다. 본 개시내용의 조성물 및 제형은 선스크린 로션, 스프레이 또는 크림일 수 있다.

본 개시내용의 조성물 및 제형은 또한 하기 추가 성분 중 임의의 하나, 임의의 조합 또는 모두를 포함할 수 있다: 컨디셔닝제, 보습제, pH 조절제, 구조화제, 무기 염, 보존제, 증점제, 실리콘 함유 화합물, 에센셜 오일, 향료, 비타민, 약학적 성분 또는 항산화제, 또는 이러한 성분들의 임의의 조합 또는 이러한 성분들의 혼합물. 이러한 성분의 양은 조성물의 중량 또는 부피를 기준으로 0.0001% 내지 99.9% 범위, 또는 이 사이의 임의의 정수 또는 범위일 수 있다.

CTFA 국제 화장 성분 사전 및 핸드북(2004 및 2008)은 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 매우 다양한 비제한적인 화장 성분을 기재한다. 이러한 성분 분류의 예는 하기를 포함한다: 향료(인공 및 천연, 예컨대 글루콘산, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민), 염료 및 색소 성분(예컨대, 블루 1, 블루 1 레이크, 레드 40, 이산화티타늄, D&C 블루 4호, D&C 그린 5호, D&C 오렌지 4호, D&C 레드 17호, D&C 레드 33호, D&C 바이올렛 2호, D&C 옐로우 10호, D&C 옐로우 11호), 향미제/향신제(예컨대, 스테비아 레바우디아나(노린재나무) 추출물 및 멘톨), 흡착제, 윤활제, 용제, 보습제(예컨대, 연화제, 습윤제, 필름 형성제, 폐쇄제 및 피부의 천연 보습 메커니즘에 영향을 미치는 작용제 포함), 발수제, UV 흡수제(파라-아미노벤조산("PABA") 및 상응하는 PABA 유도체, 이산화티타늄, 산화아연 등과 같은 물리적 및 화학적 흡수제), 에센셜 오일, 비타민(예컨대, A, B, C, D, E, 및 K), 미량 금속(예컨대, 아연, 칼슘 및 셀레늄), 항자극제(예컨대, 스테로이드 및 비-스테로이드성 항염증제), 식물 추출물(예컨대, 알로에 베라, 카모마일, 오이 추출물, 은행나무, 인삼, 로즈마리), 항미생물제, 항산화제(예컨대, BHT 및 토코페롤), 킬레이트제(예컨대, 이나트륨 EDTA 및 사나트륨 EDTA), 보존제(예컨대, 메틸파라벤 및 프로필파라벤), pH 조절제(예컨대, 수산화나트륨 및 시트르산), 흡수제(예컨대, 알루미늄 전분 옥테닐숙시네이트, 카올린, 옥수수 전분, 귀리 전분, 사이클로덱스트린, 활석 및 제올라이트), 피부 표백제 및 미백제(예컨대, 히드로퀴논 및 니아신아미드 락테이트), 습윤제(예컨대, 소르비톨, 우레아, 메틸 글루세스-20, 당류 이소머레이트 및 만니톨), 박리제, 방수제(예컨대, 수산화마그네슘/알루미늄 스테아레이트), 피부 컨디셔닝제(예컨대, 알로에 추출물, 알란토인, 비사볼롤, 세라미드, 디메티콘, 히알루론산, 바이오사카라이드 검-1, 에틸헥실글리세린, 펜틸렌 글리콜, 수소화 폴리데센, 옥틸도데실 올리에이트, 글루코놀락톤, 칼슘 글루코네이트, 사이클로헥사실록산, 디칼륨 글리시리제이트).

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 레불린산, 폴리글리세릴-3 메틸글루코스 디스테아레이트, 글리세릴 운데실레네이트, 심몬드시아 시넨시스(호호바) 종자유, 폴리아크릴레이트 교차 중합체, 스쿠알란, 나트륨 히알루로네이트, 아크릴산 중합체(카르보머), 펜틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술포아세테이트, 나트륨 올레오일 사르코시네이트, 나트륨 올레에이트, 리시누스 콤무니스(피마자) 종자유, 코페르니시아 세리페라(카나우바) 왁스, 칸델릴라 왁스, 테오브로마 카카오(코코아) 종자 버터, 이소노닐 이소노나노에이트, 오조케라이트, 이소프로필 티타늄 트리이소스테아레이트, 폴리히드록시스테아르산, 산화철, 이산화티타늄, 나트륨 레불리네이트, 및 히드록시프로필 구아로 이루어진 구느로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분을 포함한다.

일부 실시양태에서, 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 폴리펩티드 및/또는 정제된 재조합 폴리펩티드)를 포함하는 조성물은 국소 적용을 위해 제형화될 수 있다. 국소 적용은 피부 및/또는 각질 조직에 대한 적용을 포함한다. 각질 조직은 포유동물의 가장 바깥쪽 보호 덮개로 배치된 케라틴 함유 층을 포함하고, 입술, 피부, 헤어 및 손톱을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 국소 적용은 화장 목적일 수 있다. 국소 제형은 분말, 크림, 젤, 젤 크림, 액체, 로션, 오일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의 유형의 국소 제형일 수 있다. 이러한 실시양태에서, 조성물은 담체 분자(예컨대, 비히클), 보존제 및/또는 추가 성분 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 담체 분자가 고려되며, 예시적인 담체 분자는 물, 오일, 알콜, 프로필렌 글리콜 또는 유화제를 포함할 수 있다. 또한, 임의의 적합한 보존제가 고려되며, 예시적인 보존제는 산화아연, 파라벤, 포름알데히드 방출제, 이소티아졸리논, 페녹시에탄올, 또는 벤조산, 나트륨 벤조에이트, 또는 부틸렌 글리콜, 헥산디올 또는 칼륨 소르베이트와 같은 유기산을 포함한다. 이러한 조성물은 피부 및/또는 각질 조직에 적용될 때 과도한 독성, 부적합성, 불안정성, 알레르기 반응 등을 나타내지 않는다는 점에서 전형적으로 피부학적으로 허용 가능하다. 본 개시내용의 국소 스킨 케어 조성물은 피부 및/또는 각질 조직에 적용한 후 상당한 드리핑 또는 풀링을 방지하기 위해 선택되는 점도를 가질 수 있다.

한 측면에서, 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 퍼스널 케어 제품(예컨대, 화장품)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국소 투여를 위해 제형화된다. 조성물은 인간 사용에 적합한 다른 화장용 성분을 함유할 수 있다. 퍼스널 케어 제품은 인간 피부 또는 모발에 대한 자외선 방사선 손상을 예방하거나 치료하는 데 유용할 수 있다. 퍼스널 케어 제품은 피부의 탱탱함, 탄력성, 밝기, 수화, 촉각 질감 또는 시각적 질감을 증가시키고/시키거나 콜라겐 생성을 자극하는 데 유용할 수 있다. 퍼스널 케어 제품은 깊은 선 및 주름 감소, 가는 선 및 주름 감소, 고르지 못한 피부 톤 균등화, 피부 광휘 증가, 광손상 감소, 피부 처짐 감소, 페이셜 부피 손실 감소, 피부 장벽 기능 증가, 피부 발적 감소, 피부 건조 감소, 벗겨짐 또는 박리 감소, 콜라겐, 엘라스틴, 피브로넥틴 또는 라미닌의 발현 및/또는 생성 증가에 유용할 수 있다. 퍼스널 케어 제품은 피부 또는 모발에 적용될 수 있다. 조성물은, 예컨대 마스크, 피부 세정제, 예컨대 비누, 세정 크림, 세정 로션, 페이셜 로션, 바디 로션, 샤워 젤, 발한억제제, 탈취제, 면도 크림, 제모제, 페이셜 오일, 립 오일, 바디 오일, 페이셜 세정제, 세정 밀크, 세정 패드, 페이셜 워시, 페이셜 및 바디 크림 및 모이스처라이저, 페이셜 세럼, 페이셜 및 바디 마스크, 페이셜 토너 및 미스트, 아이 크림 및 아이 트리트먼트, 아이 세럼, 각질제거제, 립 밤 및 립스틱, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너 및 바디 샴푸, 헤어 및 두피 세럼, 헤어 미스트 및 스프레이, 파운데이션, 틴티드 다기능 크림, 아이 섀도우, 컨실러, 마스카라 및 다른 색조 화장품을 포함한다.

비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 국소 담체 또는 보존제를 포함하는 적어도 하나의 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 국소 담체는 리포솜, 생분해성 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 분말, 생분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 석유, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산, 물, 디글리세롤(INCI: 디글리세린), 및 지방산(예컨대, 카프릴산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 국소 담체를 포함할 수 있다. 보존제는 토코페롤, 디요오도메틸-p-톨릴술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 페녹시에탄올, 부틸렌 글리콜, 1,2 헥산디올, 메틸 파라벤, 소르브산, Germaben^® II, 로즈마리 추출물, EDTA, 벤조산 및 이의 염, 및 클로르헥시딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제를 포함할 수 있다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 동물 유래 물질이 없다. 예컨대, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 동물로부터 수득된 어떠한 성분도 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 식물로부터 수득된 물질 또는 식물 유래 물질을 포함하고/하거나 이로부터 제조된다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및 퍼스널 케어 제품은 합성적으로 수득된 물질 또는 합성 유래 물질(예컨대, 미생물 세포, 예컨대 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포에서 생성됨)을 포함한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 동물 유래 성분(ADI)을 함유하지 않는다. 따라서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 소 해면상 뇌병증(BSE) 및/또는 전염성 해면상 뇌병증(TSE)이 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 동물에서 시험되지 않는다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 임의의 검출 가능한 유전적으로 변형된 유기체 또는 임의의 검출 가능한 유전적으로 변형된 유기체 유전 물질을 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 콜로니 형성 단위(CFU) 검정으로 결정 시 살아있는 미생물총이 없음을 특징으로 한다. 일부 경우에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 결정 시 살아있는 미생물총 DNA가 없음을 특징으로 한다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 암, 출생 결함 또는 다른 생식 손상을 유발하는 것으로 공지된 임의의 자연 발생 및/또는 합성 화학물질을 함유하지 않는다. 이러한 성분의 비제한적 목록은 oehha.ca.gov/proposition-65/proposition-65-list에서 찾을 수 있다. 다양한 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 임의의 발암성, 돌연변이 유발성 또는 생식독성(CMR) 물질을 함유하지 않는다. 다양한 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 매우 높은 우려 물질(SVHC)을 함유하지 않는다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 멸종 위기에 처한 야생 동식물 종의 국제 거래에 관한 협약(CITES) 성분(예컨대, CITES에 의해 보호되는 임의의 종으로부터 유도된, 이로부터 수득된 또는 이로부터 유래된 임의의 성분)을 함유하지 않는다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 임의의 분쟁 미네랄 또는 분쟁 자원을 함유하지 않는다.

다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 향료가 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 국제 향료 협회(IFRA)를 준수한다.

다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 임의의 공지된 알레르기 항원을 함유하지 않는다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 견과류 또는 땅콩 기반 물질의 어떠한 공급원도 없다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 견과류 또는 땅콩 기반 물질과 접촉한 장비를 사용하여 가공되지 않는다. 일부 경우에서 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 코코넛 기반 물질의 어떠한 공급원도 없다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 코코넛 기반 물질과 접촉한 장비를 사용하여 가공되지 않는다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 밀 기반 물질의 어떠한 공급원도 없다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 밀 기반 물질과 접촉한 장비를 사용하여 가공되지 않는다. 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어생 제품에는 글루텐의 어떠한 공급원도 없다(예컨대, 글루텐이 없음). 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 락토스 또는 락토스 유도체의 어떠한 공급원도 없다(예컨대, 락토스가 없음). 일부 경우에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 라텍스 또는 라텍스 유도체의 어떠한 공급원도 없다(예컨대, 라텍스가 없음).

다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 프탈레이트, 파라벤, 트리클로산, 우레아, 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT), 부틸화된 히드록시아니솔(BHA), 포름알데히드, 메틸클로로이소티아졸리논과 메틸이소티아졸리논의 혼합물(예컨대, Kathon®), 미네랄 오일, 페녹시에탄올, 바셀린, 모노에탄올아민(MEA), 디에탄올아민(DEA), 트리에탄올아민(TEA), 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에틸렌 글리콜, 술페이트(예컨대, 나트륨 라우릴 술페이트(SLS), 나트륨 라우릴 에테르 술페이트(SLES)), 레티닐 팔미테이트, 에틸렌 옥사이드, 1,4-디옥산, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분이 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 살충제가 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 나노입자가 없다("나노-프리"). 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 아플라톡신이 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 마이코톡신이 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 폴리 방향족 탄화수소(PAH)가 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에는 실리콘(예컨대, 사이클로실록산)이 없다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 USP <467> 또는 ICH Q3C (R6)에 나열된 임의의 용매를 사용하여 제조되지 않는다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 스위스 법령 814.O18에 의해 정의된 임의의 휘발성 유기 화합물을 함유하지 않는다.

다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 0.5 ppm 미만의 비소를 함유한다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 0.1 ppm 미만의 수은을 함유한다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 0.1 ppm 미만의 카드뮴을 함유한다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 2 ppm 미만의 납을 함유한다.

다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 비건으로 인증되었다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 크루얼티-프리(Cruelty-Free)로 인증되었다. 다양한 측면에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 할랄로 인증되었다.

특정 실시양태에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하는 단계를 포함하는, 개체의 젊은 피부(예컨대, 피부 외관, 피부 질감 등)를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 젊은 피부를 촉진 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부 외관을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후 개체의 피부의 외관은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 외관과 더 밀접하게 유사하다. 젊은 피부를 촉진 및/또는 유지하는 것은 개체의 피부의 질감을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후 개체의 피부의 질감은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 질감과 더 밀접하게 유사하다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 탱탱함을 촉진, 유지 및 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 탱탱함은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 탱탱함과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 탱탱함을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 탱탱함을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 탱탱함은 음압에 대한 피부의 저항을 측정하여 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 경우에서, 음압에 대한 피부의 저항은 Cutometer®를 사용하여 측정된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 탄력성을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 탄력성은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 탄력성과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 탄력성을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 탄력성을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 탄력성은 변형 후 원래 위치로 되돌아가는 피부의 능력을 측정하여 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 경우에서, 변형 후 원래 위치로 되돌아가는 피부의 능력은 Cutometer®를 사용하여 측정된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 밝기를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 밝기는 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 밝기와 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 밝기를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 밝기를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 밝기는 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 수화를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 수화는 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 수화와 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 수화를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 수화를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 수화는 피부의 커패시턴스를 측정하여 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 경우에서, 피부의 커패시턴스는 Corneometer®를 사용하여 측정된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 촉각 질감을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 촉각 질감은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 촉각 질감과 더 밀접하게 유사하다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 시각적 질감을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 시각적 질감은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 촉각 질감과 더 밀접하게 유사하다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 콜라겐 함량을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 콜라겐 함량은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 콜라겐 함량과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 콜라겐 함량을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 콜라겐 함량을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 콜라겐 함량은 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 엘라스틴 함량을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 엘라스틴 함량은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 엘라스틴 함량과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 엘라스틴 함량을 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 엘라스틴 함량을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 엘라스틴 함량은 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 발적을 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 발적은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 발적과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 발적을 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 발적을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 발적은 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 가는 선 및/또는 주름은 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 가는 선 및/또는 주름과 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 가는 선 및/또는 주름을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 가는 선 및/또는 주름은 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소된다.

다양한 측면에서, 본원에 제공된 방법은 (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 피부의 표피 두께를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 단계를 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 개체의 피부의 표피 두께는 젊은 개체(예컨대, 30세 미만, 25세 미만, 20세 미만, 15세 미만 등)의 피부의 표피 두께와 더 밀접하게 유사하다. 일부 경우에서, 피부의 표피 두께를 촉진, 유지 및/또는 개선하는 것은 (예컨대, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 피부의 표피 두께를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 경우에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용한 후, 피부의 표피 두께는 반사 공초점 현미경으로 결정 시 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다. 일부 경우에서, 반사 공초점 현미경은 Vivascope®로 측정된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 각질세포 성장(예컨대, 증식)을 증가시킨다. 일부 경우에서, 각질세포 성장(예컨대, 증식)은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 또는 그 초과로 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 각질세포 재생을 증가시킨다. 일부 경우에서, 각질세포 재생은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 섬유모세포에 의한 콜라겐 생성을 증가시킨다. 일부 경우에서, 섬유모세포에 의한 콜라겐 생성은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 섬유모세포 이동을 증가시킨다. 일부 경우에서, 섬유모세포 이동은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 섬유모세포 증식을 증가시킨다. 일부 경우에서, 섬유모세포 증식은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 섬유모세포 부착을 증가시킨다. 일부 경우에서, 섬유모세포 부착은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 도시 먼지에 노출되기 전 피부에 적용 시) 도시 먼지에 노출된 후 각질세포 생존율을 증가시킨다. 일부 경우에서, 도시 먼지에 노출된 후 각질세포 생존율은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

일부 실시양태에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 개시된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 항산화 능력을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항산화 능력은 산소 라디칼 흡수 능력(ORAC) 검정을 이용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항산화 능력은 트롤록스(Trolox) 등가 단위로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물의 항산화 능력은 적어도 약 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM, 또는 250 μM 초과의 트롤록스 등가 단위일 수 있다.

다양한 측면에서, (예컨대, 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 적용한 후 (피부에 존재하는 세포, 예컨대 각질세포, 섬유모세포에 의한) 하나 이상의 유전자(예컨대, 세포 증식, 세포 이동, 세포 부착 등에 관여하는 하나 이상의 유전자)의 발현을 증가시킨다. 일부 경우에서, (피부에 존재하는 세포, 예컨대 섬유모세포, 각질세포에 의한) 하나 이상의 유전자의 발현은 (예컨대, 본원에 개시된; 예컨대 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용한 후 (예컨대, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품을 적용하기 전의 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가된다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 유전자는 (예컨대, 세포 증식, 세포 이동, 세포 부착에 관여하는) 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, 하나 이상의 유전자는 VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 MYOC1, FLII, ROCK1, ROCK2, CLTC, LIMK 1, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 경우에서, 하나 이상의 유전자는 초점 부착 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, 초점 부착 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 ITGA3, TNC, LAMC1, FLNA, TLN1, ZYX, DIAPH1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 경우에서, 하나 이상의 유전자는 엔도텔린 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, 엔도텔린 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 TRIOBP, WNK1, MMP2, VCAN, ACTA2, GNA12, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 경우에서, 하나 이상의 유전자는 EGF/EGFR 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, EGF/EGFR 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 ATXN2, JAK1, RPS6KA2, ROCK1, SHC1, IQGAP1, PLCG1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 경우에서, 하나 이상의 유전자는 전환 성장 인자-베타(TGF-베타) 신호전달 경로에 관여한다. 일부 경우에서, TGF-베타 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자는 SMURF1, SPTBN1, PAK2, ROCK1, SHC1, TGFBR3, TGFBR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서 (예컨대, 화장 용도를 위한) 본원에 제공된 하나 이상의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 (예컨대, 국소) 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 임의의 적합한 양(예컨대, 개체 또는 세포에 제공되거나 적용될 때 이점을 제공하기에 적합한 양)의 본원에 제공된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 특정 실시양태에서, 조성물, 제형, 및/또는 퍼스널 케어 제품은 개체의 피부에 (예컨대, 국소적으로) 적용될 때 개체의 피부에 유익한 효과를 제공하기에 적합한 양을 포함한다. 특정 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 약 0.001% 내지 약 30% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드)를 포함한다. 더욱 구체적인 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 약 0.001% 내지 약 20% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 10% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 5% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 4% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 3% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 2% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 1% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 약 0.001% 내지 약 0.5% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드), 및 약 0.001% 내지 약 0.2% w/w의 본원에 제공된 것과 같은 폴리펩티드 (또는 비-자연 발생 콜라겐 폴리펩티드)를 포함한다.

다양한 실시양태에서, 본원에 제공된 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 단백질)의 농도 또는 양은 본원에 제공된 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품에 임의의 적합한 양으로 존재하며, 예컨대 용도 또는 제형(예컨대, 젤, 캡슐, 액체, 분말 등)에 따라 상이할 수 있다. 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품 중 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 단백질)의 예시적인 농도는 적어도 약 0.01%, 적어도 약 0.05%, 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2 %, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% (w/v 또는 w/w)일 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품 중 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 단백질)의 예시적인 농도는 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.2 %, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 98% (w/v 또는 w/w)일 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품 중 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 단백질)의 예시적인 농도는 약 0.01% 내지 약 99%, 약 0.05% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 99%, 약 0.5% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 99%, 약 5% 내지 약 99%, 약 10% 내지 약 99%, 약 15% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99%, 약 25% 내지 약 99%, 약 30% 내지 약 99%, 약 35% 내지 약 99%, 약 40% 내지 약 99%, 약 45% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 99%, 약 55% 내지 약 99%, 약 60% 내지 약 99%, 약 65% 내지 약 99%, 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99%, 약 85% 내지 약 99%, 약 90% 내지 약 99%, 약 95% 내지 약 99%, 약 0.1% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 15% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 35% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 45% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 55% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 65% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 35% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 45% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 55% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 65% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 99%, 약 75% 내지 약 99%, 약 80% 내지 약 99% 등 (w/w 또는 w/v)의 범위일 수 있다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품 중 비-자연 발생 폴리펩티드(예컨대, 재조합 단백질)의 예시적인 농도는 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40% 등 (w/w 또는 w/v) 미만일 수 있다.

일부 실시양태에서, 적용 일정은 대상체의 목적, 성별, 연령 또는 건강 상태에 따라 다양하다. 예컨대, 일부 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 (예컨대, 국소적으로) 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 최대 6회, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다 등으로 적용된다. 대안적으로 및/또는 추가적으로, 일부 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 (예컨대, 국소적으로) 불규칙한 간격, 증가된 간격, 감소된 간격으로 다수회 적용된다. 특정 실시양태에서, 조성물, 제형 및/또는 퍼스널 케어 제품은 본원에 제공된 바와 같이 젊은 피부(예컨대, 외관, 질감 등)를 촉진, 유지 및/또는 개선하기에 충분하거나 효과적인 용량 및/또는 일정으로 국소적으로 적용된다.

실시예

실시예 1. 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드의 생성

이 실시예는 유전적으로 조작된 미생물에 의한 본 개시내용의 재조합 폴리펩티드의 생성 및 이러한 생성된 폴리펩티드의 정제 과정을 나타낸다.

서열번호 1, 3, 5 및 7의 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나를 pET 벡터에 삽입하였다. pET 벡터와 서열번호 1, 3, 5, 및 7 사이의 중첩은 20 내지 30 bp 길이가 되도록 설계하고, 효소 PRIMESTAR^® GXL 폴리머라제(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)와 함께 PCR을 이용하여 추가하였다. IN-FUSION^® 클로닝(takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)을 이용하여 개방된 pET 벡터 및 삽입 DNA(예컨대, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드)를 최종 플라스미드로 함께 조립하였다. 모든 경우에서, 핵산 서열 앞에는 서열번호 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 또는 23으로 개시된 분비 신호 서열이 있었다. 플라스미드 서열은 생어(Sanger) 시퀀싱을 통해 확인되었다.

세포를 최종 플라스미드로 형질전환시킨 후, 최소 배지에서 배양하고, 50:50의 세포 대 글리세린 비율로 식물성 글리세린과 함께 1.5 분취량으로 동결시켰다. 이 동결 배양물 중 하나의 바이알을 50 ml의 최소 배지에서 밤새 37℃, 200 rpm에서 부활시켰다. 이 실시예에서 최소 배지의 제형은 표 2 및 표 3에 나타나 있다. 이어서, 세포를 300 ml의 최소 배지로 전달하고, 광학 밀도(OD) 600이 5-10에 도달하도록 6-9시간 동안 성장시켰다.

발효는 25℃ 내지 28℃ 범위의 다양한 온도에서 수행되었다. 일부 발효의 경우, 발효 온도를 일정한 온도로 유지하고, 발효 완료 즉시 폴리펩티드를 정제하였다. 다른 발효의 경우, 원하는 기간 동안 발효 온도를 유지하고, OD600의 세포 밀도가 10-20에 도달하면 온도를 낮추어 단백질 생성을 유도하였다. 전형적으로, 온도를 28℃에서 25℃로 낮췄다. IPTG를 0.1 - 0.5 mM 범위의 농도로 배지에 첨가하여 유도를 수행하였다. 40-60시간 동안 발효를 계속하였다.

재조합 폴리펩티드는 하기와 같이 정제되었다: 발효 브로쓰의 pH는 5-50% 황산을 사용하여 3-3.5로 감소되었다. 이어서, 원심분리 또는 원심분리 후 미세여과를 이용하여 세포를 분리하였다. 산성화된 브로쓰의 상청액을 폴리아크릴아미드 겔에서 시험한 결과, 출발 펠릿에 비해 상대적으로 높은 풍부도로 재조합 폴리펩티드를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 부피 및 염 감소를 위해 농축 및 정용여과 단계를 한외여과로 수행하였다. 최종 폴리펩티드 슬러리를 SDS-PAGE 겔 상에서 실행하여 재조합 폴리펩티드의 존재를 확인하였다.

원하는 단백질이 생성되었는지를 확인하기 위해, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7을 보유하는 미생물의 배양물로부터의 상청액을 수집하고, 상기 기재된 바와 같이 pH를 감소시켜 정제하였다. 산성화된 브로쓰를 SDS-PAGE로 분석하고, 예상된 크기의 단백질에 상응하는 밴드를 상대적인 순도로 검출하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 각각의 단백질에 대해 예상되는 크기에서 두껍고 선명한 밴드가 관찰되었다. 이후 샘플을 재조합 폴리펩티드 역가 및 순도를 정량화하기 위해 역상 및 크기 배제 HPLC 크로마토그래피 및 질량 분광측정으로 분석하여 각각의 관심 단백질의 정확한 정체성을 확인하였다.

도 4a-4c는 pH 3.0에서 처리 전 및 후의 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 도 4a는 pH 3.0에서 처리 전(레인 1) 및 후(레인 2)에 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 발효 상층액의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 이러한 폴리펩티드의 예상 분자량은 약 17.9 kDa였다. 폴리펩티드의 정체성은 질량 분광측정으로 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). 도 4b는 pH 3.0에서 처리 전(레인 3) 및 후(레인 4)에 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 발효 상층액의 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 이러한 폴리펩티드의 예상 분자량은 약 17.6 kDa였다. 폴리펩티드의 정체성은 질량 분광측정으로 확인되었다(데이터는 표시되지 않음). 도 4c는 pH 3.0에서 처리 전(레인 3-5) 및 처리 후(레인 6-8)에 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 다양한 박테리아 숙주 균주에서 생성된 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 발효 상청액의 SDS-PAGE 겔을 도시한다.

실시예 2. 생성물의 폴리펩티드 서열 확인 및 히드록시프롤린 잔기의 결여

본 개시내용에 따른 방법에 의해 생성된 서열번호 2의 폴리펩티드의 서열을 확인하기 위해 질량 분광측정을 이용하였다. 표 4 및 표 5는 이 폴리펩티드의 펩티드 매핑 결과를 제공한다.

또한, 서열번호 2의 생성된 폴리펩티드에 존재하는 임의의 아미노산 또는 펩티드 변형을 평가하기 위해 분석을 수행하였다(표 6). 몇몇 경우에서, 메티오닌 산화와 히드록시프롤린 잔기의 존재를 구별하기 위해 추가적인 확증 분석을 수행하였다. 예컨대, MS/MS 스캔의 단편화 결과에 기초하여, 트립신분해 펩티드 T1(서열 DTGFPGMPGR)은 프롤린 히드록실화보다는 메티오닌 산화를 함유하는 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, 트립신분해 펩티드 1(T1)은 메티오닌 위치 7에서 산화를 갖고 위치 5 또는 8에서 히드록시프롤린의 증거가 없다는 결론이 내려졌다. 유사하게, 트립신분해 펩티드 9(T9)의 위치 83에 또 다른 메티오닌이 있는 경우, 메티오닌 산화, 폴리펩티드의 위치 77, 85, 92, 95, 및 97에 히드록시프롤린, 또는 위치 98에 히드록시리신의 검출 가능한 수준이 없었다. 따라서, 본 개시내용의 단축된 콜라겐 폴리펩티드는 또한 히드록시프롤린 잔기가 결여된다는 점에서 자연 발생 콜라겐 폴리펩티드와 상이하다.

실시예 3. 미용 및 퍼스널 케어 제품에 사용하기 위한 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 분말의 제조

이 실시예는 서열번호 8에 따른 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 분말의 제조를 입증한다. 적합한 세포 밀도 및 단백질 발현 수준을 달성하는 발효 후(예컨대, 실시예 1 참조) ), 발효 브로쓰를 ≤15℃에 도달할 때까지 냉각시켰다. 이 시점에서, 진한 황산 용액(98.5 wt%)을 발효기로 적정하여 브로쓰 pH를 3.0-3.2로 낮추었다. 원심분리는 세포 바이오매쓰 및 더 큰 세포 잔해물을 제거하기 위한 1차 브로쓰 정화 단계로 이용되었다. 이어서, 미세여과를 이용하여 원심분리로부터의 생성물 함유 스트림 내의 임의의 잔류 세포 및 세포 잔해물을 제거하였다. 한외여과를 이용하여 미세여과 투과 스트림으로부터의 잔류 염, 슈가, 가용성 발효 부산물 및 물을 제거하였다. 추가 단계는 단백질 농축물을 탈색 및 탈취하기 위한 활성탄 처리, 보존제 첨가, (pH 4-5로) pH 조정 및 멸균 여과를 포함하였다. 이어서, 제형화된 단백질 농축물을 분무 건조하여 대부분의 물을 제거하고 최종 콜라겐 분말을 생성하였다. 생성된 콜라겐 분말은 표 7의 사양에 따라 검증되었다.

실시예 4. 미용 및 퍼스널 케어 제품에 사용하기 위한 콜라겐 용액의 제조

이어서, 실시예 3으로부터의 콜라겐 분말을 사용하여 미용 및 퍼스널 케어 제품에 혼입하기에 적합한 다양한 제형을 제조하였다. 표준 용액은 2% 콜라겐 용액이었다. 예시적인 제형은 하기와 같이 부틸렌 글리콜 제형(표 8) 및 글리세롤 제형(표 9)으로 만들어졌다. 이러한 2% 용액은 쉽게 분석되었으며 미용 및 퍼스널 케어 제품의 추가 제형에 적합하였다.

생성된 2% 콜라겐 용액은 표 10에 기재된 사양에 따라 검증되었다.

실시예 5. 철갑상어 콜라겐 분말로부터 다양한 화장용 제품의 제조

본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 분말은 본원에 기재된 바와 같은 미용 및 퍼스널 케어를 위한 다양한 화장용 제품을 제조하는 데 사용될 수 있다. 이 실시예는 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 사용하여 일반적으로 적용 가능한 제형을 입증한다.

본 개시내용의 비-자연 발생 발생 폴리펩티드를 포함하는 분말을 갖는 제형의 제조

혼합 및 수화

각각의 제형은 분말을 첨가하기 전에 성분을 혼합하여 시작되었다. 혼합을 진행하면서, 분말을 점차적으로 첨가하였다. 분산 디스크 또는 고전단 혼합기를 사용하여 분말의 더 빠른 수화를 달성하였다. 대안적으로, 분말을 제형에 혼입하기 전에 농축된 프리믹스에서 수화시켰다. 수화를 촉진하고 덩어리 형성을 방지하기 위해, 분말을 수화 전에 액체 성분(예컨대, 글리세린, 프로판디올)과 함께 슬러리에 미리 혼합할 수 있다.

온도 및 pH

분말을 산성 또는 알칼리성 성분의 임의의 중화 단계 후에 혼입하였다. 제형 공정 동안 폴리펩티드를 더 높은 온도(최대 80℃)에 노출시키면, 제형의 pH가 최적의 결과를 위한 5.0 이상인 것으로 확인되었다.

분말은 또한 고전단 혼합기를 사용하여 무수 시스템에 분산될 수 있다. 제형을 분말을 첨가하기 전에 혼합한다. 혼합을 진행하면서 균일하게 분산될 때까지 분말을 점차적으로 첨가한다. 더 미세한 입자가 필요한 경우, 밀링 단계를 적용해야 할 수 있다.

본 개시내용의 비-자연 발생 발생 폴리펩티드의 2% 용액을 갖는 제형의 제조

혼합 및 수화

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드의 2% 용액은 또한 표준 처리 도구를 사용하여 제형의 수상에 쉽게 혼입되었다.

온도 및 pH

최상의 결과는 용액이 40℃ 미만에서 산성 또는 알칼리성 성분의 임의의 중화 단계 후에 제형에 혼입되었을 때 달성되었다.

실시예 6. 다양한 화장용 제품에서 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드 분말의 사용을 위한 가공 파라미터 및 적합성의 결정

용해도

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 분말의 상이한 용매에서의 용해도를 0.1% (w/w)의 농도에서 시험하였다.

하기 표 14는 용해도 결과를 요약한 것이다.

용해도 수준은 하기와 같이 정의되었다:

가용성: 폴리펩티드를 혼입하고 균질화한 후에 투명한 혼합물이 수득되었다.

제한된 용해도: 폴리펩티드를 혼입하고 균질화한 후에 상당한 양의 현탁된 입자 또는 높은 수준의 헤이즈가 관찰되었다.

용해 시간 연구; 분말의 용해도, 혼합 및 수화에서 가공 파라미터의 영향

탈이온수는 시트르산 또는 수산화나트륨을 사용하여 상이한 pH 수준으로 조정되었다. 상이한 pH 수준의 물을 상이한 온도로 가열하였다. 단백질을 특정 pH 및 온도에서 물에 혼입하고, 오버헤드 혼합기(RW20, IKA)로 미리 정의된 속도(207 ± 3 rpm)로 혼합하고, 용해 시간을 눈에 보이는 고체 물질이 관찰되지 않는 시점에서 타이머로 기록하였다. 색상은 분광광도계(CM-5, Konica Minolta)를 사용하여 측정하고, 가드너(Gardner) 척도로 보고하였다. 탁도는 탁도계(2100Q, Hach)로 측정하고, NTU로 보고하였다. 점도는 레오미터(Discovery HR-2, TA 기기)를 사용하여 25℃에서 평행 플레이트로 10s^-1의 전단 속도에서 피크 유지 모드(60s)로 측정하였다.

시험된 변수:

폴리펩티드 농도: 0.1% 내지 1% (w/w)

초기 pH: 3 내지 10

혼입 온도: 25℃ 내지 80℃

207 +/- 3 rpm의 혼합 속도

아웃풋:

용해 시간, 최종 pH, 탁도, 색상. 이러한 연구는 화장용 제품의 제형에 대한 최적 파라미터를 결정하는 데 사용될 수 있다. 온도를 올리면 용해 시간이 줄어들지만 더 낮은 pH에서 탁도가 증가할 수 있다는 것이 전반적으로 확인되었다. 폴리펩티드 함량이 증가하면 용해 시간, 탁도 및 색상 영향이 증가하는 것으로 나타났다. 초기 pH가 높아지면 탁도가 감소하는 것으로 나타났다.

용해 시간: 도 5에 나타난 바와 같이, 폴리펩티드 농도가 증가하면 용해 시간이 증가하는 것으로 나타났고, 온도를 높이면 용해 시간이 줄어드는 것으로 나타났다.

최종 pH: 폴리펩티드는 최종 pH에 영향을 미치는 완충 효과를 갖는 것으로 나타났다.

탁도: 온도를 올리고 pH를 낮추면 침전이 초래되고 탁도가 증가할 수 있는 것으로 확인되었다. 폴리펩티드 농도는 또한 도 6에 나타난 바와 같이 탁도에 긍정적인 영향을 미친다.

색상: 색상 변화의 주요 동인은 폴리펩티드 농도인 것으로 나타났다.

분말 제형화/스트레스 시험에서 pH 및 온도의 영향

10 mg/ml 농축 폴리펩티드 용액(서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 함유)을 다양한 pH 수준 및 온도에서 4시간 동안 처리하여 해당 조건 하에서 분해에 대한 척도로서 전장 폴리펩티드 양(mg/ml) 및 %에 대한 영향을 결정하였다. 일반적으로 색상의 차이는 관찰되지 않았다. 80℃ 및 pH 4.0 미만으로 처리된 샘플에 대해 불용성 입자가 관찰되었다.

도 7a 및 도 7b는 다양한 pH 수준에서 온도 증가에 따른 안정성을 나타낸다.

도 8a 및 도 8b는 다양한 pH 수준에서 온도 증가에 따른 전장 폴리펩티드의 안정성을 나타낸다.

종합 연구에 따르면, 폴리펩티드는 바람직하게는 제형 공정의 마지막, 유화 전, 또는 pH가 5.0 이상인 경우 80℃까지 가열되는 단계에 첨가되는 것으로 나타났다. pH가 4.0 미만인 경우 폴리펩티드는 바람직하게는 제형 공정의 마지막에 혼입되고; pH가 4.0-5.0인 경우 폴리펩티드는 바람직하게는 50℃ 미만에서 첨가되고, pH가 5.0 이상인 경우 폴리펩티드는 공정 동안 최대 80℃까지 가열될 수 있다.

점도에 대한 pH 또는 pH 유발된 단백질 분해의 영향은 1% (w/w)의 폴리펩티드를 함유하는 용액을 사용하여 평가되었다.

제품의 점도 프로파일은 1 mm 간격을 갖는 평행 플레이트를 사용하여 레오미터(Discovery HR-2, TA Instruments)를 사용하여 측정되었다. 유동 스윕 모드에서 전단 속도는 0.1 s^-1내지 1000 s^-1로 다양하였으며, 점도는 전단 속도의 함수로 표현되었다. 모든 샘플은 25℃에서 시험되었다.

점도에 대한 pH의 영향은 도 9a-9c에 5℃, 50℃ 및 80℃에서 나타나 있다. 점도에 대한 pH 또는 pH 유발된 폴리펩티드 분해의 명확한 영향이 이 폴리펩티드 농도에서 관찰되지 않았다.

점도에 대한 온도의 영향은 도 10a-10c에 pH 3.99, 4.95 및 6.15에서 나타나 있다. 점도에 대한 온도 또는 온도 유발된 폴리펩티드 분해의 명확한 영향이 이 폴리펩티드 농도에서 관찰되지 않았다.

실시예 7. 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 제형의 독성학 분석

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드를 함유하는 제형의 임의의 잠재적인 부정적인 영향을 스크리닝하기 위해 다양한 독성학 검정을 시험관내에서 수행하였다.

1) 박테리아 역돌연변이 검정

폴리펩티드를 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 4가지 상이한 균주 및 이. 콜리(E. coli) 균주에서 돌연변이유발 반응을 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 샘플을 Arocolor^TM 1254 유도된 래트 간 마이크로솜(S9)과 함께 또는 없이 시험 균주와 함께 플레이팅하여 다양한 용량 수준에서 샘플을 스크리닝하였다. 자발적인 배경 수준 이상으로 복귀 콜로니의 증가를 유발하는 경우 샘플은 돌연변이 유발성으로 간주된다. 검정은 당업계에 공지되어 있으며, 화학물질 시험을 위한 OECD 4714 지침: 박테리아 역돌연변이 검정에 따라 수행된다.

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분말을 멸균 탈이온수에서 5가지 농도로 제조하였다: 5 mg/플레이트, 1 mg/플레이트, 0.5 mg/플레이트, 0.1 mg/플레이트, 및 0.05 mg/플레이트. 시험은 적절한 용매 대조군과 함께 수행되었고, 양성 대조군은 아로클로르(Aroclor) 유발된 래트 간 S9의 존재 및 부재 하에 선별적 최소 한천에서 밤샌 배양물과 함께 플레이팅되었다. 모두 3중으로 플레이팅되었다.

결과는 시험 균주가 양성 대조군 돌연변이유발원에 민감하고 적절한 돌연변이유발 반응을 나타낸다는 것을 보여주었다. 자발적 복귀율은 균주가 잠재적으로 유전독성제의 검출에 민감하다는 것을 나타내었다. 제형은 시험 시스템에 세포독성이 있는 것으로 밝혀지지 않았다. S9 활성화 혼합물을 사용한 대사 활성화는 활성 마이크로솜 제제를 나타내었다. 제형은 S9 효소 활성화의 존재 또는 부재 하에 어떠한 농도에서도 검출 가능한 유전독성 활성을 나타내지 않았다.

2) EpiDerm™ 피부 모델 시험관내 독성 시험 시스템

철갑상어 콜라겐을 당업계에 공지된 마르텍 코포레이션(MatTek Corporation) EpiDerm™ 시험관내 독성 시험 시스템을 활용하여 자극 가능성에 대해 평가하였다. 간략하게, 인간 표피의 다층의 고도로 분화된 모델을 형성하기 위해 배양된 정상적인 인간 유래된 표피 각질세포(NHEK)를 물질로 시험하고, 색상 반응으로 모니터링하면서 미토콘드리아 효소 숙시네이트 디히드로게나제에 대한 손상을 평가하였다. 효소는 수용성의 황색 MTT를 자주색의 불용성 생성물로 전환시키며, 전환된 MTT의 양은 생존 가능한 세포의 수에 비례한다. 트리톤 X-100(1%)을 양성 대조군으로 사용하였다. 결과는 표 15에 나타나 있다(GEL-CAV-A는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로의 처리를 나타냄).

폴리펩티드에 대해 생존율이 50%인 시간 ET-50이 24시간 초과인 것으로 결정되었고, 양성 대조군은 9.4시간이었다. 제조사에 따른 표준 범위가 표 16에 나타나 있다.

따라서, 폴리펩티드는 비-자극 범위에서 예상되는 생체내 진피 자극 가능성을 갖는다.

3) EpiOcular™ 조직 모델 시험관내 독성 시험 시스템

폴리펩티드를 당업계에 공지된 마르텍 코포레이션 EpiOcular^TM 시험관내 독성 시험 시스템을 활용하여 자극 가능성에 대해 평가하였다. 간략하게, 각막에서 발견되는 것과 유사한 층상 편평 상피를 형성하기 위해 배양된 정상적인 인간 유래된 표피 각질세포를 물질로 시험하고, 색상 반응으로 모니터링하면서 미토콘드리아 효소 숙시네이트 디히드로게나제에 대한 손상을 평가하였다. 효소는 수용성의 황색 MTT를 자주색의 불용성 생성물로 전환시키며, 전환된 MTT의 양은 생존 가능한 세포의 수에 비례한다. 트리톤 X-100(0.3%)을 양성 대조군으로 사용하였다. 결과는 표 17에 나타나 있다(GEL-CAV-A는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로의 처리를 나타냄).

생존율이 50%인 시간 ET-50을 결정한 후, 토끼 드레이즈(Draize) 아이 점수를 추정하는 데 사용하였다: 당업계에 공지된 바와 같이 드레이즈=-4.74 + 101.7/(ET-50)^0.5. 폴리펩티드는 256분 초과의 ET-50을 갖고, 추정된 드레이즈 아이 자극 점수는 0인 것으로 밝혀졌다(양성 대조군은 19.6분/드레이즈 18.2). 제조사에 따른 표준 범위는 표 18에 나타나 있다.

따라서, 폴리펩티드는 비-자극성 자극 분류를 갖는다.

4) 반복 상해 패치 연구

당업계에 공지된 폐쇄성 반복 상해 패치 연구를 이용하여 정상적인 피부를 갖는 지원자 대상체의 피부를 민감하게 하는 능력을 결정하기 위해 폴리펩티드를 평가하였다. 간략하게, 반복 상해 패치 평가는 알레르기 반응을 일으키기에 충분한 세포 매개된(유형 IV) 면역 반응을 유도하기 위해 다수의 적용이 필요한 약한 민감제를 검출할 수 있는 변형된 예측 패치 연구이다. 이 평가 방법을 이용하여 자극성 반응을 검출할 수도 있지만 이것이 이 절차의 주요 목적은 아니다. 나트륨 라우릴술페이트, 0.2% 수용액이 양성 대조군으로 사용되었다.

95명의 대상체가 연구를 완료하였다. 이 연구에 사용된 조건 하에서 폴리펩티드 제형에 대한 민감성의 증거가 없었다.

실시예 8. 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 제형의 인간 임상 연구

이 실시예는 위약 제품과 비교하여 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 제형의 주름 방지 효능을 평가하기 위한 노화 방지 연구를 입증한다. 얼굴에 건강한 피부 및 아이 주위 부위에 눈에 띄는 주름을 갖는 여성 대상체가 등록된다. 피부 수화 효과는 코르네오미터(Corneometer)로 측정되고, 피부 탄력성 및 탱탱함의 효과는 쿠토미터(Cutometer)로 측정되고, 표피 두께는 비바스코프(Vivascope)로 측정된다. 추가적으로, 가는 선 및 주름, 밝기, 발적의 객관적 평가를 수행하고, 이미지 분석을 위해 이미지를 촬영한다(Colorface). 평가는 제품 적용 전, 첫 번째 제품 적용 직후, 제품 적용 4주 및 12주 후에 수행된다. 대상체는 제품 특성에 관한 설문지를 작성한다.

시험 제형: 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 0.1% (w/w) 폴리펩티드

파라미터:

P1: 시각적 평가: 가는 선 및 주름의 외관, 밝기, 발적[훈련된 평가자]

P2: 피부 수화[Corneometer®]

P3: 피부 탄력성 및 탱탱함[Cutometer®]

P4: 진피 두께[Vivascope®]

P5: 사진 이미징, 전체 페이셜 및 옆얼굴(왼쪽 및 오른쪽), CP, Std60[Colorface®]

P6: 이미지 분석(예컨대, 가는 선 및 주름, 어두운 점)[뉴톤(Newtone)]

P7: 설문지(최대 10개 질문)[대상체]

시험 영역

주름 방지 특성(피부 거칠기)의 측정은 눈주위, 즉 눈가의 부위에서 수행된다. 화장용 제품의 피부 보습 및 퍼밍 효과는 볼뼈에 대해 평가된다. 연구는 분할면 설계로 수행된다.

시험 절차

제1일: 적응 후 기준선 측정: P1-P5

대상체에게 시험 제품 분배

감독 하에 있는 대상체에 의한 시험 제품의 적용: P1-P5, P7

제2-85일: 집에서 대상체에 의한 1일 2회 시험 제품 적용

제29일: 적응 후 측정: P1-P5

제57일: 전화를 통한 규정 준수 확인

제86일: 적응 후 측정: P1-P5, P7, 제품 반품

제86일 후: P6

패널

추가의 특정 포함 기준 없이 proDERM 점수 3 내지 6에 따라 눈에 띄는 아이 주름을 갖는 35세 내지 70세의 100명의 여성 대상체(제품당 대략 33명)가 포함되었다. 제품당 28명의 대상체가 완료할 것으로 예상된다. 탐색적, 무작위화, 대상체에 대한 맹검, 개체내 비교, 페이셜 분할, 위약 대조; 하위그룹당 시험 제품과 위약 간의 비교, 평가 시간 간의 비교(기준선 제품 적용 전 제1일, 제품 적용 후 제1일, 제품 적용 4주 및 12주 후).

분석

시험 제품 P1-P4당 시간 비교

P6, P7에 대한 기술 통계

각각의 시험 제품 대 참조 제품의 비교는 별도로 수행된다.

기후 조건

모든 조사는 에어컨이 완벽하게 갖춰진, 특히 패널리스트의 정의된 적응 기간 후에 상기에 기재된 시험을 위한 장비가 갖춰진 방에서 수행된다. 마지막 적용은 일반적으로 측정 전날 저녁에 이루어진다.

Cutometer® - 총 탄력성 및 탄력 회복 측정에 의한 피부 탱탱함

피부 탄력성은 Cutometer®로 측정된다. 측정 원리는 흡입 방법에 기초한다. 측정 헤드에서 300 mbar로 설정된 진공이 유도된다. 측정 영역의 피부를 5초 동안 측정 헤드의 개구로 흡입하고 떼어낸 후 또 다른 5초의 후속 측정 기간을 갖는다. 광학 측정 시스템을 사용하여 측정 헤드에 피부가 얼마나 빨려 들어가는지 비접촉식으로 검출하며; 이 값은 피부 탄력성에 대한 척도를 제공한다. 결과 측정 곡선으로부터 총 탄력성 Uf 및 탄력 이완 대 총 탄력성 Ur/Uf의 몫의 2개의 파라미터가 계산된다.

Corneometer® - 피부 수화

각질층 수화 측정은 Corneometer® CM 825(Courage & Khazaka, Cologne, Germany)를 사용하여 전기 커패시턴스 방법으로 수행된다. 측정 원리는 컨덴세이터(condensator) 역할을 하는 측정 헤드의 커패시턴스 변화에 기초한다. 금으로 이루어진 도체 사이에 전기장이 형성된다. 이를 통해 상부 피부층의 유전율이 측정된다. 유전율은 피부의 물 함량에 따라 달라지므로 각질층 수화가 측정될 수 있다. Corneometer® 값의 증가는 피부 보습 효과를 나타낸다.

설문지 - 자체 평가

대상체는 연구 종료 시 최대 10개의 질문을 갖는 설문지로 시험 제품을 판단한다. 설문지는 미리 정의된 동일한 선택 옵션을 갖는 폐쇄형 질문으로 이루어진다. 설문지가 주어진 구조로부터 크게 벗어나면 추가 비용이 청구된다.

훈련받은 평가자에 의한 객관적인 평가

가는 선 및 주름의 외관, 밝기, 발적.

VivaScope® - 표피 두께

VivaScope®1500은 생체내 공초점 주사 레이저 현미경 검사를 위한 장치이다. 공초점 현미경 검사는 탁한 물체(예컨대, 피부)의 광학적 분할을 허용하는 기술이다. 이 기술을 이용하면 추가 준비 없이 피부를 원래 상태로 생체내에서 이미지화할 수 있다. 이 방법은 피부 내의 상이한 미세구조가 굴절률의 자연적인 변화를 유발하여 대비가 있는 이미지를 제공하기 때문에 피부 유형에 따라 최대 350 μm 깊이까지 피부의 생체내 매핑이 가능하다. 예컨대, 굴절률이 물에 가까운 세포질(반사율 1.33)은 매우 낮은 대비로 표시된다. 그러나, 멜라닌 및 케라틴(반사율 1.7)은 상대적으로 굴절률이 높아 천연 조영제 역할을 한다. VivaScope® 1500은 광학 절편 두께가 5 마이크로미터 미만인 생체내 피부 절편을 생성할 수 있으므로 조직학적 피부 절편과 비교할 만하다. VivaCam® 매크로카메라를 사용하면 시험 영역의 매크로이미지를 캡처하고 공초점 이미지를 매크로이미지와 연관시킬 수 있다.

뉴톤에 의한 이미지 분석

색소 반점

파라미터: 비색 가시성; 반점 내부 및 외부의 색상 파라미터(기준선 반점 검출 기준); 대비 계산 형태학적 가시성 - 피부 대비: 눈에 띄는 영역(각각의 시점에서의 반점 검출을 기반으로 안색과 대비되는 겉보기 표면 검출)

양식: CP

보기: 옆얼굴

다중 색소 반점

파라미터: 면적, L*, a*, b*, 색소 반점 및 외부, dE76 대비

양식: CP

보기: 옆얼굴

눈가 주름

파라미터: 눈에 띄는 길이, 눈에 띄는 표면, 눈에 띄는 깊이 및 눈에 띄는 부피

양식: Standard60

보기: 옆얼굴

비구순구

양식: Standard60

보기: 정면

광휘와 상관될 수 있는 지수

파라미터: 채도, 광도, 광휘와 상관된 파라미터

양식: CP 및 Std60

보기: 옆얼굴

아이 밑 주름

양식: Standard60

보기: 정면

이마 주름

양식: Standard60

보기: 정면

Colorface®에 의한 주름 분석

눈가 주름, 비구순구, 아이 밑주름, 이마 주름

Colorface®에 의한 색상/톤 분석

색소 반점, 다중 색소 반점, 광휘와 상관된 지수, 모공

실시예 9. 본 개시내용의 비-자연 발생 폴리펩티드를 포함하는 제형은 피부 탱탱함을 증가시켰다

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드의 1% (w/w) 제형을 시험관내에서 시험하고, 피부 탱탱함 이점을 보고하는 시판되는 필름 형성제와 비교하였다. 1% (w/w) 폴리펩티드 제형은 위약과 비교하여 피부 탱탱함을 대략 6.5% 증가시키는 것으로 나타났으며, 도 11에 나타난 바와 같이 비교할 만한 시판되는 필름 형성제를 초과하였다.

위약: 98.5% (w/w) 물, 0.5% (w/w) 히드록시프로필 구아, 1% (w/w) 페녹시에탄올, pH 7(2% NaOH 용액 사용)

1% (w/w) 폴리펩티드 제형: 97.5% (w/w) 물, 1% (w/w) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 0.5% (w/w) 히드록시프로필 구아, 1% (w/w) 페녹시에탄올, pH 7(2% NaOH 용액 사용)

1% (w/w) 시판되는 필름 형성제: 97.5% (w/w) 물, 1% (w/w) 아쿠아플렉스(Aquaflex) XL-30(Ashland), 0.5% (w/w) 히드록시프로필 구아, 1% (w/w) 페녹시에탄올, pH 7(2% 시트르산 용액 사용)

시험 기재: 바이오스킨 탄성 모델(경도 0.18S) - 보루락스(Beaulax), 일본

제품 적용: 2 mg/cm; 건조 시간: 10분

구형 프로브(d: 1/2")를 사용하는 질감 분석기(TA XT Plus Connect, Stable Micro Systems)를 사용하여 기재를 20%의 압박 값으로 압축하였다. 목표 압박을 적용하는 데 필요한 최대 힘을 측정하였다. 이어서, 제품을 기재에 적용하고(2 mg/cm²), 10분 동안 건조되도록 두었다. 측정을 반복하고 새로운 힘 값을 기록하였다. 초기 힘에 대비한 힘 변화는 하기 수학식을 사용하여 보고되었다:

실시예 10. 피부 세포에 대한 시험관내 연구

건강한 피부는 주로 콜라겐 유형 I 및 III, 히알루로난, 피브로넥틴 및 엘라스틴, 및 라미닌 및 콜라겐 IV와 같은 다른 단백질을 포함하는 기저층으로 구성된다. 섬유모세포는 콜라겐을 포함한 이러한 구조 단백질을 생성하는 주요 세포 유형이다. 종합적으로, 단백질은 세포외 기질(ECM)로 공지되어 있으며 피부 구조를 지탱한다. 콜라겐의 섬유모세포 아웃풋은 나이가 들수록 감소하므로, 섬유모세포는 피부 노화를 구제하려는 화장품의 활성의 주요 표적이다.

각질세포는 표피, 또는 피부의 바깥층을 형성하는 주요 세포 유형이다. HaCaT 세포는 성인 피부로부터 유래된 불멸의 각질세포 세포주이다. 두 세포 유형 모두 피부에 대한 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드의 이점을 입증하기 위해 사용되었다(도면에서 "Cav"로 표시됨). 이러한 세포는 회전율이 높으며, 일상적인 오염 및 방사선의 공격을 받는다. 이들은 노출된 환경에 의해 부정적인 영향을 받아 염증이 증가하고 자연적인 피부 장벽이 손상된다. 각질세포 건강을 평가하는 데 사용되는 특징은 염증 마커, 세포 회전율 및 DNA 무결성을 포함한다.

1) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 인간 섬유모세포 및 각질세포에 무독성이다

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드로 처리된 인간 1차 섬유모세포, HaCaT 세포 및 인간 1차 각질세포는 시험관내에서 도 12a-12c에 나타난 바와 같이 독성 징후를 나타내지 않았으며, 이는 제품이 시험된 용량에서 국소 성분으로 안전하다는 것을 나타낸다.

프로토콜:

세포를 96웰 플레이트에 컨플루언시 상태로 시딩하였다. 24시간 후, (혈청으로 인한 임의의 영향을 피하기 위해) 배지를 저혈청 배지로 교체하였다. 세포를 동일한 저혈청 배지에서 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드로 24시간 동안 처리하였다. 폴리펩티드로 처리한 후, 상층액을 보관하고, 세포를 MTT 염료와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. MTT는 생존 가능한 세포에 의해 포르마잔 염으로 대사된다. 이러한 염을 이소프로판올을 사용하여 용해시키고, 생성된 색상을 세포 플레이트 판독기를 사용하여 정량화하였다.

2) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 각질세포의 성장 및 재생을 촉진한다

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드로 처리된 각질세포는 각질세포 성장 및 재생에서 용량 의존적 증가를 나타내었다. 불멸의 HaCaT 각질세포에서 유사한 결과가 나타났다. 도 13에 나타난 바와 같이(인간 1차 각질세포), 폴리펩티드는 각질세포의 세포 성장 및 재생을 용량 의존적으로 자극하는 것으로 나타났으며, 대조군 세포와 비교하여 0.2% (w/w) 및 0.1% (w/w) 처리에서 세포 수가 40% 증가하였다.

3) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 콜라겐 생성을 자극한다

서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 도 14에 나타난 바와 같이 시험관내 섬유모세포에 의한 콜라겐 I 생성을 자극하였다.

ELISA 프로토콜: 1차 인간 섬유모세포를 표준 배지 DMEM/F12+10% FBS에서 배양하였다. 상청액을 사용하여 존재하는 콜라겐 유형 I의 수준을 결정하였다. 사용된 키트는 타카라(Takara) 프로콜라겐 유형 I C-펩티드 검출 ELISA 키트였다. 상청액에서 콜라겐 유형 I의 양을 측정하기 위해 제조사의 프로토콜을 따랐다.

제2 분석 방법에서, 다양한 인간 콜라겐에 대한 RNA 수준을 보고하는 마이크로어레이 데이터는 폴리펩티드로 처리된 섬유모세포에서 이러한 콜라겐의 발현이 2.5-3배 증가함을 나타내었다. 표 20은 마이크로어레이 데이터를 나타낸다.

마이크로어레이 RNA 분석 프로토콜: 세포를 6웰 플레이트에 컨플루언시 상태로 시딩하였다. 24시간 후 배지를 저혈청 배지로 교체하였다. 세포를 0.05% (w/w)의 폴리펩티드 및 대조군으로 처리하였다. QIAGEN RNeasy 키트를 사용하여 RNA를 추출하고 추출된 RNA를 분석하였다.

폴리펩티드는 콜라겐의 상향조절 외에 증식, 이동 및 부착을 담당하는 여러 경로에 관여하는 다양한 유전자에 대한 RNA 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다.

상향조절된 경로:

VEGFA - VEGFR2 신호전달 경로

상향조절된 유전자의 수: 74

하향조절된 유전자의 수: 12

유의도: 7.74

초점 부착 경로

상향조절된 유전자의 수: 53

하향조절된 유전자의 수: 0

유의도: 9.93

엔도텔린 경로

상향조절된 유전자의 수: 48

하향조절된 유전자의 수: 4

유의도: 3.57

EGF/EGFR 신호전달 경로

상향조절된 유전자의 수: 32

하향조절된 유전자의 수: 4

유의도: 4.83

TGF-베타 신호전달 경로

상향조절된 유전자의 수: 33

하향조절된 유전자의 수: 3

유의도: 6.92

4) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 상처 치유 활성을 촉진한다

상처 치유는 세포 증식 및 이동을 포함한 일련의 사건을 포함하는 역동적인 과정이다. 섬유모세포 이동 및 증식은 콜라겐 및 다른 기질 단백질을 포함한 다양한 화학물질을 분비하여 상처 봉합에 중요한 역할을 한다. 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드로 시험관내 인간 진피 섬유모세포를 처리한 결과, 세포가 증식하고 섬유모세포의 합류층을 긁음으로써 유도된 간격을 폐쇄함에 따라 도 15에 나타난 바와 같이 시험관내 상처 치유 모델에서 상처 치유 활성을 나타내었다. 또한, 마이크로어레이 데이터는 상처 치유 이점을 갖는 폴리펩티드와 일치하였다. 데이터는 또한 세포 증식, 이동 및 부착을 담당하는 여러 경로에 관여하는 유전자의 상향조절을 나타내었다.

프로토콜: 세포를 24웰 플레이트에 컨플루언시 상태로 시딩하였다. 24시간 후, 배지를 저혈청 배지로 교체하고, 세포를 6-8시간 동안 기아 상태로 두었다. 기아 상태 후, 세포를 함유하는 웰을 긁고 처리하였다. 이때(시간 0시간) 및 24시간 후에 이미지를 촬영하였다. 이미지는 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.

5) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 도시 먼지 오염에 노출된 각질세포의 세포 생존율을 증가시킨다

정부 인증 도시 먼지 샘플에 노출되기 전에 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드로 HaCaT 세포를 전처리하면 세포가 보호되었다. 도 16에 나타난 바와 같이, 세포 생존율은 폴리펩티드 전처리가 없는 경우에 비해(대조군은 전처리가 없고 도시 먼지 노출이 없음) 폴리펩티드로 전처리한 경우 대략 20% 더 높았다.

사용된 도시 먼지 농도: 2 mg/ml.

프로토콜: 세포를 96웰 플레이트에 컨플루언시 상태로 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 폴리펩티드로 처리하였다(세포를 도시 먼지에 노출하기 전에 전처리함). 원하는 도시 먼지 농도를 준비하고, 세포를 24시간 동안 이에 노출시켰다. 도시 먼지에 노출된 후, 상청액을 보관하여 상이한 염증성 시토카인을 실행하고, 세포를 MTT 염료와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. MTT는 생존 가능한 세포에 의해 포르마잔 염으로 대사된다. 이러한 염을 이소프로판올을 사용하여 용해시키고, 생성된 색상을 세포 플레이트 판독기를 사용하여 정량화하였다.

6) 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 항산화 능력을 갖는다

산소 라디칼 흡광 능력(ORAC) 검정(형광 판독을 사용하는 무세포 검정)을 이용하여 철갑상어 콜라겐의 항산화 능력을 나타내었다. 데이터는 트롤록스(비타민 E) 등가물로 보고되었다. 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드는 0.2% (w/w) 용액 형태로 도 17에 나타난 바와 같이 130 μM 트롤록스와 동등한 항산화 특성을 나타내었다.

본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자라면 다양한 변형, 변경 및 대체를 할 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용의 실시양태를 실시하는 데 채용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 하기의 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 및 이의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포괄되도록 의도된다.

Claims

화장용 제형으로서,
서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 서열번호 32의 단축물(truncate)에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 포함하고,
크림, 젤, 젤 크림, 오일, 연고, 세럼, 폼, 로션, 페이스트, 밤, 용액, 현탁액, 및 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 화장용 제형.
제1항에 있어서, 화장용 제형이 크림, 젤 크림, 또는 분말인 화장용 제형.
(i) 서열번호 32에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드, 또는 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드; 및
(ii) 레불린산, 폴리글리세릴-3 메틸글루코스 디스테아레이트, 글리세릴 운데실레네이트, 심몬드시아 시넨시스(Simmondsia chinensis)(호호바) 종자유, 폴리아크릴레이트 교차 중합체, 스쿠알란, 나트륨 히알루로네이트, 아크릴산 중합체(카르보머), 펜틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술포아세테이트, 나트륨 올레오일 사르코시네이트, 나트륨 올레에이트, 리시누스 콤무니스(Ricinus communis)(피마자) 종자유, 코페르니시아 세리페라(Copernicia cerifera)(카나우바) 왁스, 칸델릴라 왁스, 테오브로마 카카오(Theobroma cacao)(코코아) 종자 버터, 이소노닐 이소노나노에이트, 오조케라이트, 이소프로필 티타늄 트리이소스테아레이트, 폴리히드록시스테아르산, 산화철, 이산화티타늄, 나트륨 레불리네이트, 및 히드록시프로필 구아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가 성분
을 포함하는 화장용 제형.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 32에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드가 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 32에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드가 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 32에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드가 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 32에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드가 서열번호 32의 단축물에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 32에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드가 서열번호 32의 단축물에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 32의 단축물이 서열번호 32에 비해 N-말단 단축, C-말단 단축, 또는 둘 다를 포함하는 것인 화장용 제형.
제9항에 있어서, N-말단 단축이 서열번호 32에 비해 50개 아미노산 내지 750개 아미노산의 N-말단 단축인 화장용 제형.
제9항 또는 제10항에 있어서, C-말단 단축이 서열번호 32에 비해 50개 아미노산 내지 600개 아미노산의 C-말단 단축인 화장용 제형.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 8에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 8에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 8에 대해 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 서열번호 8에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 50개 아미노산 내지 1250개 아미노산의 총 단축을 갖는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 적어도 50개 아미노산인 화장용 제형.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드의 길이가 50개 아미노산 내지 250개 아미노산인 화장용 제형.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 라미닌 G 도메인, 폰 빌레브란트 인자 유형 A(vWA) 도메인, 및 원섬유성 콜라겐 C-말단 도메인 중 하나 이상을 포함하지 않는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 콜라겐 삼중 나선 반복부를 포함하는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 단량체인 화장용 제형.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 자연 발생 콜라겐의 안정한 삼중 나선 구조를 형성하지 않는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드에 다른 콜라겐 쇄가 실질적으로 없는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 자연 발생 콜라겐에 비해 비-자연 발생 수준의 히드록실화를 갖는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드에 존재하는 프롤린의 10% 미만이 히드록실화되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 비-히드록실화되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 자연 발생 콜라겐에 비해 비-자연 발생 수준의 글리코실화를 갖는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 5 wt% 미만의 글리코실화를 포함하는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 화장용 제형에 0.001% 내지 30% w/w의 양으로 존재하는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 화장용 제형이 국소 적용을 위해 제형화되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 화장용 제형이 개체의 피부 또는 모발에 적용하기 위해 제형화되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 화장용 제형이 국소 담체를 추가로 포함하는 것인 화장용 제형.
제33항에 있어서, 국소 담체가 리포솜, 생분해성 마이크로캡슐, 로션, 스프레이, 에어로졸, 더스팅 분말, 생분해성 중합체, 미네랄 오일, 트리글리세리드 오일, 실리콘 오일, 글리세린, 글리세린 모노스테아레이트, 알콜, 유화제, 액체 석유, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌, 왁스, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데칸올, 벤질 알콜, 사이클로메티콘, 사이클로펜타실록산, 물, 디글리세롤(INCI: 디글리세린), 및 지방산(예컨대, 카프릴산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제를 추가로 포함하는 화장용 제형.
제35항에 있어서, 보존제가 토코페롤, 디요오도메틸-p-톨릴술폰, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-디올, 시스 이성질체 1-(3-클로로알릴)-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄 클로라이드, 글루타르알데히드, 4,4-디메틸 옥사졸리딘, 7-에틸비사이클로옥사졸리딘, 페녹시에탄올, 부틸렌 글리콜, 1,2 헥산디올, 메틸 파라벤, 소르브산, Germaben^® II, 로즈마리 추출물, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 벤조산 또는 이의 염, 및 클로르헥시딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화장용 제형.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 화장용 제형을 포함하는 퍼스널 케어 제품.
제37항에 있어서, 퍼스널 케어 제품이 마스크, 피부 세정제, 세정 크림, 세정 로션, 페이셜 로션, 바디 로션, 샤워 젤, 발한억제제, 탈취제, 면도 크림, 제모제, 페이셜 오일, 립 오일, 바디 오일, 페이셜 세정제, 세정 밀크, 세정 패드, 페이셜 워시, 페이셜 크림, 바디 크림, 페이셜 모이스처라이저, 바디 모이스처라이저, 페이셜 세럼, 페이셜 마스크, 바디 마스크, 페이셜 토너, 페이셜 미스트, 아이 크림, 아이 세럼, 각질제거제, 립 밤, 립스틱, 헤어 샴푸, 헤어 컨디셔너, 바디 샴푸, 헤어 세럼, 두피 세럼, 헤어 미스트, 헤어 스프레이, 파운데이션, 틴티드 다기능 크림, 아이 섀도우, 컨실러, 마스카라, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 퍼스널 케어 제품.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항의 화장용 제형 또는 퍼스널 케어 제품을 개체의 피부에 적용하여 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 단계를 포함하는, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 탱탱함을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제40항에 있어서, 개체의 피부의 탱탱함을 개선하는 것이 (예컨대, Cutometer®을 사용하여) 음압에 대한 피부의 저항을 측정하는 것을 기준으로 하여 피부 탱탱함을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 탄력성을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 개체의 피부의 탄력성을 개선하는 것이 (예컨대, Cutometer®를 사용하여) 변형 후 원래 위치로 되돌아가는 피부의 능력을 측정하는 것을 기준으로 하여 피부 탄력성을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 밝기를 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제44항에 있어서, 개체의 피부의 밝기를 개선하는 것이 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 피부의 밝기를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 수화를 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 개체의 피부의 수화를 개선하는 것이 (예컨대, Corneometer®을 사용한) 피부의 커패시턴스 측정을 기준으로 하여 피부 수화를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 촉각 질감을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 콜라겐 함량을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 엘라스틴 함량을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 발적을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제51항에 있어서, 개체의 피부의 발적을 개선하는 것이 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 피부의 발적을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 시각적 질감을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제54항에 있어서, 개체의 피부의 가는 선 및/또는 주름을 개선하는 것이 전문 임상 평가자에 의해 결정 시 가는 선 및/또는 주름을 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 감소시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항에 있어서, 개체의 젊은 피부를 촉진, 개선 및/또는 유지하는 것이 개체의 피부의 표피 두께를 개선하는 것을 포함하는 것인 방법.
제56항에 있어서, 개체의 피부의 표피 두께를 개선하는 것이 (예컨대, Vivascope®를 사용하여) 반사 공초점 현미경으로 측정 시 표피 두께를 (예컨대, 적용 전 피부에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제39항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 적용 후, 피부의 각질세포 성장 및/또는 재생이 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가되는 것인 방법.
제39항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 적용 후, 피부의 콜라겐 생성이 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가되는 것인 방법.
제39항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 적용 후, 피부의 섬유모세포 이동, 증식, 및/또는 부착이 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가되는 것인 방법.
제39항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 적용 후, 도시 먼지에 노출된 후 각질세포 생존율이 (예컨대, 적용 전에 비해) 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가되는 것인 방법.
제39항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 적용 후, VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로, 초점 부착 신호전달 경로, 엔도텔린 신호전달 경로, EGF/EGFR 신호전달 경로, TGF-베타 신호전달 경로, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현이 증가되는 것인 방법.
제62항에 있어서, VEGFA/VEGFR2 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 MYOC1, FLII, ROCK1, ROCK2, CLTC, LIMK 1, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제62항 또는 제63항에 있어서, 초점 부착 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 ITGA3, TNC, LAMC1, FLNA, TLN1, ZYX, DIAPH1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도텔린 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 TRIOBP, WNK1, MMP2, VCAN, ACTA2, GNA12, EGR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제62항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, EGF/EGFR 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 ATXN2, JAK1, RPS6KA2, ROCK1, SHC1, IQGAP1, PLCG1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-베타 신호전달 경로에 관여하는 하나 이상의 유전자가 SMURF1, SPTBN1, PAK2, ROCK1, SHC1, TGFBR3, TGFBR1, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.