KR20230042091A - 재조합 실크 조성물 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

다른 용도 중에서도, 피부에 수분을 공급하고/하거나, 피부를 세정하고/하거나, 피부를 방어하고/하거나, 피부를 해독하고/하거나, 피부를 매트하게 하고/하거나 피부의 각질을 제거하기 때문에 안정한 분말로 형성된 재조합 거미 실크 조성물이 본원에 개시된다.

Description

재조합 실크 조성물 및 이를 제조하는 방법

관련 출원의 교차 참조

본 출원은 2020년 7월 23일자 출원된 미국 임시 출원 제63/055,894호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

기술분야

본 개시내용은 다른 용도 중에서도, 피부에 수분을 공급하고/하거나, 피부를 세정하고/하거나, 피부를 방어하고/하거나, 피부를 해독하고/하거나, 피부를 매트하게 하고/하거나 피부의 각질을 제거하기 때문에 안정한 분말로 형성된 재조합 거미 실크(silk) 조성물에 관한 것이다.

실크는 스킨케어와 화장품과 같은 적용에 사용하기에 바람직한 다수의 특징을 갖는 구조 단백질이다. 최근의 기술은 다양한 숙주 유기체를 사용하여 다양한 재조합 거미 실크 폴리펩타이드와, 재조합 거미 실크 폴리펩타이드에서 유도된 폴리펩타이드의 확장 가능한 생산을 가져왔다. 하지만, 전장 실크 기반 고체 또는 반고체 조성물과 같은 바람직한 제형을 수득하기 위해 대규모로 용액에 회수된 재조합 실크 분말을 수화시키는 데 있어 어려움이 있다는 점은 중요한 문제였다.

실크를 포함하는 대부분의 화장품 및 스킨케어 제품은 작은 아미노산 사슬로 가수분해된 실크를 사용한다. 하지만, 분해된 실크 단백질의 단편을 포함하는 이러한 조성물은 실크의 바람직한 특성을 상실한다. 나아가, 유해한 용매의 사용은 피부와의 접촉하게 되는 실크 제형에 사용하기에 바람직하지 않다.

세리신 고갈된 누에 실크(본원에서 "실크 피브로인(fibroin)"으로 지칭됨)를 생산하는 새로운 방법으로 전장(즉, 가수분해되지 않은) 실크 단백질을 포함할 수 있는 다양한 스킨케어 제품이 생산되었지만, 실크의 자가 응집 특성은 이러한 제품의 저장 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 전장 실크 피브로인 분자는 응집되어 용액에서 침전되는 경향이 있다. 나아가, 이러한 공정은 확장 가능하지 않기 때문에, 상업적으로 이용 가능하지 않다. 재조합 거미 실크 폴리펩타이드는 실크 피브로인과 유사한 2차 및 3차 구조를 형성하기 때문에, 화장품 및 스킨케어 제형에 사용하기에 동등하게 바람직하지만, 자가 응집으로 인해 유사한 안정성 문제를 나타낼 수도 있다.

따라서, 유해한 용매를 사용하지 않고, 미적 가치를 개선시키며, 전장 실크 단백질의 바람직한 특성을 유지하는 다양한 재료 형태의 실크 제형(예를 들어, 화장품 및 스킨케어 제형)에서 저장 수명(예를 들어, 원재료 보관)과 안정성을 위해 재조합 거미 실크 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키는 확장 가능한 방법이 필요하다.

일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법으로서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 재조합 실크 입자를 실크 기반 조성물로 변형시키는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 입자가 용매용 담체로 기능하는 방법이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 상기 외부 쉘에 개구부를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 거미 입자는 건조 분말 형태이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하는 단계는 중공 코어를 팽창시킨다.

일부 구현예에서, 용매는 수성 용매, 알코올, 유성 용매 또는 실리콘을 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 물, 글리세린, 탈이온수, 올리브유, 펜틸렌 글리콜 또는 실리콘이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 용매용 담체이다.

일부 구현예에서, 재조합 거미 실크 입자는 용매와 혼합 시 팽윤된다. 일부 구현예에서, 외부 쉘의 직경은 재조합 실크 입자가 건조한 경우 5 μm 내지 25 μm이다. 일부 구현예에서, 외부 쉘의 직경은 용매와 혼합되는 경우 최대 120 μm까지 팽윤된다. 일부 구현예에서, 외부 쉘 두께는 재조합 실크 입자 직경의 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만이다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 복수의 재조합 실크 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 상기 용매에서 1% wt/wt 내지 10% wt/wt의 농도로 상기 조성물에 존재한다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 재조합 거미 실크를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 폴리펩타이드를 적어도 1 중량%의 농도로 포함한다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 수불용성이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 비드이다. 일부 구현예에서, 분말은 분무 건조된 것이다.

일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법은 재조합 실크 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 분무 건조시켜 상기 재조합 실크 입자를 포함하는 건조 분말을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법은 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 염료를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법은 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 계면활성제 또는 습윤제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 화장품 또는 스킨케어 제형이다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 피부의 탱탱함(firming), 탄력, 전반적인 피부 건강, 상처 치유 및/또는 외관을 개선시킨다.

일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 피부에 도포하면 산화 스트레스가 감소한다. 일부 구현예에서, 산화 스트레스는 기저 수준의 산화 스트레스, 청색광 조사에 의해 야기되는 산화 스트레스, 오염 유도 산화 스트레스, UVA 유도 산화 스트레스 및 UVB 산화 스트레스로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 피부에 도포하면 피부의 표면이 매트해진다.

또한, 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법으로서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 실크 기반 조성물을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 입자가 용매용 담체이고, 재조합 실크 입자가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.

또한, 일부 구현예에서, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법으로서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 실크 기반 조성물을 형성하는 단계(여기서 재조합 실크 입자는 용매용 담체로 기능함); 실크 기반 조성물을 표면에 도포하는 단계; 및 실크 기반 조성물을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 표면은 피부, 모발 또는 손발톱을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 건조된 실크 기반 조성물은 상기 표면 상에 장벽을 형성한다. 일부 구현예에서, 장벽은 실질적으로 균질하다.

일부 구현예에서, 실크 기반 고체 또는 히드로겔은 비드이다. 일부 구현예에서, 실크 기반 고체 또는 히드로겔은 필름이다. 일부 구현예에서, 실크 기반 고체 또는 히드로겔은 화장품 또는 스킨케어 제형이다.

또한, 일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법으로서, 실크 단백질 분말과 용매를 포함하는 실크 기반 제형을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 분말이 중공 코어를 포함하며 용매용 담체인 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 분말은 용매용 담체이다.

일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 염료를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 실크 기반 제형을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 실크 기반 제형을 에멀젼에 혼합하여 실크 기반 에멀젼을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 실크 기반 에멀젼을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 첨가제와 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 혼합하여 강화된 실크 기반 제형을 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 제형을 제조하는 방법은 실크 기반 제형을 응집시켜 실크 기반 제형 중에 응집된 실크를 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 실크 기반 제형은 겔상을 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 단백질 분말은 재조합 거미 실크를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 거미 실크는 전장 실크 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 제형은 스킨케어 또는 화장품 제형이다. 일부 구현예에서, 알코올은 글리세롤이다. 일부 구현예에서, 유성 용매는 유리 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 유리 지방산은 올리브유, 포도씨유 또는 트리글리세리드를 포함한다. 일부 구현예에서, 실크 기반 제형은 피부 또는 물과 접촉하거나 부드럽게 문지르면 분산된다.

또한, 일부 구현예에서, 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 용매용 담체를 형성하도록 적합화된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 분말 형태이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 재조합 거미 실크를 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 피부의 각질을 제거한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 염료를 추가로 포함한다.

또한, 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자와 용매를 포함하는 조성물로서, 여기서 재조합 실크 입자가 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 용매용 담체이다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 계면활성제 또는 습윤제를 포함한다. 일부 구현예에서, 중공 코어는 용매에 의해 팽창된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 화장품 또는 스킨케어 제형이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 피부를 세정한다.

또한, 일부 구현예에서, 실크 단백질 입자와 용매를 포함하는 실크 화장품 또는 스킨케어 제품으로서, 여기서 실크 단백질 입자가 중공 코어를 포함하고 용매를 운반하는 실크 화장품 또는 스킨케어 제품이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 실크 단백질 입자는 수불용성이다. 일부 구현예에서, 실크 화장품 또는 스킨케어 제품은 고체, 히드로겔 또는 필름이다.

또한, 일부 구현예에서, 반고체를 포함하는 재조합 실크 화장품 또는 스킨케어 제품으로서, 여기서 반고체가 분산되어 응집되지 않은 재조합 실크 단백질과 용매를 포함하는 재조합 실크 화장품 또는 스킨케어 제품이 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, 반고체는 피부와 접촉 시 잔류물을 제거한다. 일부 구현예에서, 반고체는 히드로겔이다.

또한, 일부 구현예에서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 각질제거제이다.

또한, 일부 구현예에 따르면, 피부의 외관을 개선시키는 방법으로서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 재조합 실크 단백질을 약 1 wt% 포함한다.

일부 구현예에서, 피부의 개선된 외관은 하기를 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 결과를 제공한다: 피부 탱탱함/팽팽함 증가, 탄력 증가, 전반적인 피부 건강 증가, 수분 공급 증가, 상처 치유 개선, 산화 스트레스 수준 감소, 오염 유도 산화 스트레스 약화, UVA 또는 UVB 유도 산화 스트레스 약화, 및 이들의 임의의 조합.

일부 구현예에서, 표면을 세정하는 방법으로서, 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는 조성물을 표면에 도포하여 필름 또는 비드를 형성하는 단계; 및 표면에서 필름 또는 비드를 제거하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다.

또한, 일부 구현예에 따르면, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법으로서, 재조합 실크를 포함하는 조성물을 건조시켜 재조합 실크 입자를 포함하는 건조된 분말을 형성하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 외부 쉘과 중공 코어를 포함한다.

또한, 일부 구현예에 따르면, 재조합 실크 단백질을 포함하는 건조된 분말을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 건조된 분말은 중공 코어와 외부 쉘을 포함하는 재조합 실크 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 입자는 담체로 작용하도록 적합화된다.

상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 특정 구현예의 하기 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1a는, 건조 상태에서 18B 폴리펩타이드 서열(서열번호 1)을 갖는 온전한 및 깨진(cracked) 재조합 실크 분말 입자("18B 분말" 또는 "18B")의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지를 보여준다. 도 1b는, 광학 및 편광 현미경을 통한 수화된 상태의 중공 쉘 형태를 보여준다.
도 2a는, 다양한 상이한 용매에 재현탁된 18B 분말의 광학 현미경 이미지를 보여준다. 도 2b는, 건조 상태의 18B 분말 1 g과 수용액에 포화 노출된 후의 18B 분말 1 g의 이미지를 보여준다.
도 3a는, 물, 산성 직물 염료, 및 본 발명의 다양한 구현예에 따라 생성된 18B 분말의 혼합물을 보여준다. 도 3b는, 최종 분말 상태 및 피부에 도포된 후의 염색된 18B 분말을 보여준다. 도 3c는, 크림 에멀젼에 첨가된 상이한 농도의 염색된 18B 분말을 보여준다. 도 3d는, 4℃에서 6개월 저장 후 염색된 18B 분말의 색상 견뢰도(color fastness) 안정성을 보여준다.
도 4는, 18B 분말 용액이 피부에 도포되고, 건조되어, 표피층의 피부 표면 상에 얇고 균질한 장벽을 형성하는 개략도를 보여준다.
도 5a는, 본 발명의 다양한 구현예에 따른 기재에 18B 분말 용액을 첨가하는 개략도와, 2 mg/cm²의 표면적당 질량으로 기재에 도포될 때 약 1 μm 두께의 얇은 필름으로 합쳐지는 건조된 1 wt% 18B 분말 용액의 SEM 이미지를 보여준다. 도 5b는, 용액 농도, 부피 및 표면적에 따라 변화하는 필름 두께를 보여준다. 이러한 이미지는 4 cm² 면적 상에 분배된 1 wt% 용액의 다양한 질량 차이를 나타낸다. 도 5c는, 염색된 2 wt% 18B 분말 용액을 2 mg/cm²로 도포하고, 건조시키기(21℃및 40% 습도의 주변 조건에서 5분 건조) 전과 후 피부의 이미지를 보여준다.
도 6a는, 단백질을 형광으로 태깅하는 방식으로 가시화한 18B 분말 단백질 장벽의 이미지를 보여준다. 도 6b는, 18B 분말 단백질 장벽에 대한 반복된 마모의 영향을 조사하기 위한 실험 설계를 보여준다. 도 6c는, 맨 피부("대조군")와 비교하여, 문지름 없음, 100회 문지름 및 600회 문지름의 반복된 마모에 적용된 18B 분말 단백질 장벽의 이미지를 보여준다. 도 6d는, 습식 와이프(wet wipe)를 1회 내지 5회 통과시킨 후 피부 상의 18B 분말 단백질 장벽의 이미지를 보여준다. 도 6e는, 다회 통과 후 습식 와이프의 이미지를 보여준다.
도 7a와 도 7b는, 18B 분말 용액이 탄소 입자에 미치는 영향을 조사하기 위한 오염 등급 연구의 결과를 보여준다. 도 7c는, 대조군과 비교하여, 가수분해된 실크와 18B 분말 용액을 사용하여 폴리우레탄 재료 또는 모조(faux) 피부 상에서 수행된 오염 세척의 이미지를 보여준다. 도 7d는, 미처리 대조군과 비교하여, 1% 및 2% 18B 분말 용액을 사용하여 모발에서 수행된 오염 세척, 및 세척 후 생성된 헹굼수(rinse water)의 이미지를 보여준다.
도 8a는, 18B 분말, 챠콜 블랙 및 쌀겨를 포함하는 다양한 건조 물질을 흑색 아이쉐도우 위의 피부에 문지른 이미지와, 물 헹굼 후 이미지를 보여준다. 도 8b는, 대조군 및 다른 표준 성분과 비교하여, 피부 모방체 상에 각질제거제로 사용된 18B 분말의 현미경 이미지를 보여준다. 도 8c는, 대조군 및 가수분해된 실크 용액과 비교하여, 피부 대용품 상에 클렌저(cleanser)로 사용된 10 wt% 18B 분말 용액을 보여준다. 도 8d는, 18B 분말 미함유 클렌저 제형(성분 목록은 도 8e에 개략되어 있음)과 비교하여, 클렌저 첨가제로 사용된 다양한 농도의 18B 분말 용액을 보여준다. 도 8e는, 본 발명의 하나의 구현예에 따른 18B 분말 클렌저의 성분 목록을 보여준다.
도 9a는, 피부의 탱탱함과 탄력에 대한 2 wt% 18B 분말 용액의 평균 개선%를 보여준다. * = t=0주에서의 기준선 측정과 비교하여 t=12주에서의 기본 피부 크림 중 2 wt% 18B 분말의 p<0.05. 도 9b는, 8주 기간에 걸쳐 중앙 안면부 리프팅, 탄력, 탱탱함 및 전반적인 피부 건강 외관에 대한 2 wt% 18B 분말 용액의 통계적 개선의 그래프를 보여준다. * = 빈 비히클과 비교하여 2 wt% 18B 분말 용액의 p<0.05. 도 9c는, 대상이 2 wt% 18B 분말 용액을 4주 동안 사용한 후 주관적 패널 설문지에 대한 피부 결과의 그래프를 보여준다. * = 빈 비히클과 비교하여 2 wt% 18B 분말 용액의 p<0.05.
도 10은, 스크래치가 만들어진지 48시간 후 각질형성세포 상처 스크래치 모델의 광학 현미경 이미지와, 100 μg/mL의 18B 분말 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 상처 봉합의 컴퓨터 생성 정량화를 보여준다.
도 11a는, 스크래치가 만들어진지 24시간 후 섬유아세포 상처 스크래치 모델의 광학 현미경 이미지와, 양성 대조군과 비교하여 다양한 농도의 18B 분말(25 μg/mL 및 50 μg/mL) 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 상처 봉합의 정량화를 보여준다. 도 11b는, 양성 대조군과 비교하여, 다양한 농도의 18B 분말(25 μg/mL 및 50 μg/mL) 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 섬유아세포 이동에 의한 상처 부위 커버리지(coverage)%의 정량화를 보여준다.
도 12a는, 상이한 용매에 재현탁된 18B 분말의 추가 광학 현미경 이미지를 보여준다. 도 12b는, 이미지 분석에 따라 결정된 다양한 용매에서의 분말 직경의 비교를 보여준다. 도 12c는, 누적 백분율(%)에 대한 다양한 용매에서의 분말 직경의 그래프 비교를 보여준다.
도 13a는, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 결정된 다양한 재조합 18B 단백질 분말 용액의 용해도 정량화를 보여준다. 도 13b는, 용해도 결과의 표를 보여준다.
도 14a는, 4일차 및 8일차 시점에서 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 점선은 본래 상처 부위의 위치(좌측 점선)와 상처 봉합의 정도(우측 점선)를 나타낸다. 도 14b는, 4일차 및 8일차 시점에서 샘플의 평균 표피 혀 길이(μm)의 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(**=p<0.01, *=p<0.05).
도 15a는, 8-OHdG에 대해 염색된 후 청색광 조사 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 2% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 15b는, 청색광 조사 유무에 따른 조직학 결과의 정량화를 보여주며, 평균 8-OHdG 염색된 표면% +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(**=p<0.01).
도 16a는, Nrf2에 대해 염색된 후 오염에의 노출 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 2% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 16b는, 오염에의 노출 유무에 따른 Nrf2 발현의 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(**=p<0.01). 도 16c는, IL-1α에 대해 염색된 후 오염에의 노출 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 2% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 16d는, 오염에의 노출 유무에 따른 IL-1α 발현의 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(**=p<0.01).
도 17a는, 세포 생존능을 가시화하기 위해 Mason's Trichrome으로 염색된 후 UVB에의 노출 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17b는, UVB에 노출되어 일광화상을 입은(sunburned) 세포의 총 수에 대한 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(* = p<0.05). 도 17c는, 티민 이량체에 대해 염색된 후 UVB에의 노출 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17d는, UVB에 노출된 티민 이량체 발현의 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(**=p<0.01). 도 17e는, Nrf2에 대해 염색된 후 UVA에의 노출 유무에 따른 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17f는, UVA에 노출된 Nrf2 발현의 정량화 결과를 보여준다. 데이터는 평균 +/- 표준편차로 플롯팅되어 있다(#=p<0.1).
도 18은, 빈 비히클과 비교 시 피부에 대한 18B 분말의 매트화 효과를 보여준다.

본 발명의 다양한 구현예의 세부사항이 하기 상세한 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이러한 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 나아가, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수 형태를 포함하며, 복수 형태의 용어는 단수 형태를 포함할 것이다. 문맥이 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 복수의 언급대상을 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 기술은, 당업계에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것들이다.

정의

하기 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:

실크 단백질과 관련하여 본원에 사용된 "안정성"이라는 용어는, 실크 단백질의 자가 응집으로 인한 겔화, 변색 또는 혼탁을 형성하지 않는 제품의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 미국 특허 공개공보 제2015/0079012호(Wray et al.)는 전장 실크 피브로인을 포함하는 스킨케어 제품의 자가 안정성을 증가시키기 위해 글리세롤을 포함하는 습윤제의 사용에 관한 것이다. 미국 특허 공개공보 제9,187,538호는 최대 10일 동안 저장 안정성이 있는 전장 실크 피브로인을 포함하는 스킨케어 제형에 관한 것이다. 상기 특허 공개공보는 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 분자"라는 용어는, 적어도 10개 염기 길이의 중합체 형태의 뉴클레오타이드를 나타낸다. 이러한 용어는 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 또는 합성 DNA)와 RNA 분자(예를 들어, mRNA 또는 합성 RNA)뿐 아니라, 비천연 뉴클레오타이드 유사체, 비천연 뉴클레오시드간 결합, 또는 둘 모두를 함유하는 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함한다. 핵산은 임의의 위상적 입체형태일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 가닥, 사중체형, 부분 이중 가닥, 분지형, 헤어핀형, 원형 또는 패드락(padlocked) 입체형태일 수 있다.

달리 지시되지 않는 한, 일반 형식 "서열번호"로 본원에 기재된 모든 서열에 대한 예로서, "서열번호 1을 포함하는 핵산"은 이의 적어도 일부가 (i) 서열번호 1의 서열 또는 (ii) 서열번호 1과 상보적인 서열 중 하나를 갖는 핵산을 나타낸다. 둘 사이의 선택은 문맥에 따라 결정된다. 예를 들어, 핵산이 프로브로 사용되는 경우, 둘 사이의 선택은 프로브가 목적하는 표적에 상보적이어야 한다는 요건에 따라 결정된다.

"단리된" RNA, DNA 또는 혼합 중합체는 천연 숙주세포에서 천연 폴리뉴클레오타이드를 자연적으로 동반하는 다른 세포 구성요소, 예를 들어 자연적으로 연관된 리보솜, 폴리머라아제 및 게놈 서열에서 실질적으로 분리된 것이다.

"단리된" 유기 분자(예를 들어, 실크 단백질)는, 그것이 유래된 숙주세포의 세포 구성요소(막 지질, 염색체, 단백질)에서, 또는 숙주세포가 배양된 배지에서 실질적으로 분리된 것이다. 상기 용어는, 특정 단리된 생체분자가 거의 균질하게 정제될 수 있지만, 생체분자가 모든 다른 화학물질로부터 분리되어야 하는 것은 아니다.

"재조합"이라는 용어는, (1) 자연 발생 환경에서 제거되었거나, (2) 유전자가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 관련이 없거나, (3) 자연적인 것과 관련이 없는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되어 있거나, (4) 자연에서 발생하지 않는 생체분자, 예를 들어 유전자 또는 단백질을 나타낸다. "재조합"이라는 용어는, 클로닝된 DNA 단리물, 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드 유사체, 또는 이종 시스템에 의해 생물학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드 유사체뿐 아니라, 이러한 핵산에 의해 인코딩된 단백질 및/또는 mRNA와 관련하여 사용될 수 있다.

유기체의 게놈 내 내인성 핵산 서열(또는 해당 서열의 인코딩된 단백질 산물)은, 이종 서열이 내인성 핵산 서열에 인접하여 배치되어, 이러한 내인성 핵산 서열의 발현이 변경되는 경우, 본원에서 "재조합"으로 간주된다. 이러한 맥락에서, 이종 서열은, 이종 서열 자체가 내인성(동일한 숙주세포 또는 이의 자손에서 유래됨)인지 외인성(상이한 숙주세포 또는 이의 자손에서 유래됨)인지에 관계없이 내인성 핵산 서열에 자연적으로 인접하지 않은 서열이다. 예로서, 프로모터 서열은 (예를 들어, 상동 재조합에 의해) 숙주세포의 게놈 내 유전자의 천연 프로모터를 대체하여, 이러한 유전자가 변경된 발현 패턴을 갖도록 할 수 있다. 이러한 유전자는, 이를 자연적으로 플랭킹하는 서열 중 적어도 일부에서 분리되기 때문에, 이제 "재조합"이 된다.

핵산은 또한 게놈 내 상응하는 핵산에 대해 자연적으로 발생하지 않는 임의의 변형을 함유하는 경우, "재조합"으로 간주된다. 예를 들어, 내인성 코딩 서열은, 예를 들어 인간 개입에 의해 인공적으로 도입된 삽입, 결실 또는 점 돌연변이를 함유하는 경우, "재조합"으로 간주된다. "재조합 핵산"은 또한 이종 부위에서 숙주세포 염색체에 통합된 핵산과, 에피솜으로 존재하는 핵산 구조체를 포함한다.

본원에 사용된 "펩타이드"라는 용어는, 짧은 폴리펩타이드, 예를 들어 전형적으로 약 50개 미만의 아미노산 길이, 및 보다 전형적으로 약 30개 미만의 아미노산 길이인 펩타이드를 나타낸다. 본원에 사용된 상기 용어는, 구조 및 따라서 생물학적 기능을 모방하는 모방체와 유사체를 포함한다.

"폴리펩타이드"라는 용어는, 자연 발생 및 비자연 발생 단백질, 및 이의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체를 모두 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체이거나 중합체일 수 있다. 나아가, 폴리펩타이드는 각각이 하나 이상의 별개의 활성을 갖는 다수의 상이한 도메인을 포함할 수 있다.

"단리된 단백질" 또는 "단리된 폴리펩타이드"라는 용어는, 이의 기원 또는 파생원으로 인해, (1) 자연 상태에서 이에 동반되는 자연적으로 관련이 있는 구성요소와 관련이 없거나, (2) 자연에서 발견되지 않는 순도로 존재하거나(여기서 순도는 다른 세포 물질의 존재와 관련하여 순도를 판단될 수 있음)(예를 들어, 동일한 종의 다른 단백질이 없음), (3) 상이한 종의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 발생하지 않는(예를 들어, 자연에서 발견되는 폴리펩타이드의 단편이거나, 자연에서 발견되지 않는 아미노산 유사체 또는 유도체, 또는 표준 펩타이드 결합 이외의 연결을 포함함) 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 이것이 자연적으로 발생하는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성된 폴리펩타이드는, 자연적으로 관련이 있는 구성요소에서 "단리"될 것이다. 폴리펩타이드 또는 단백질은 또한 당업계에 널리 공지된 단백질 정제 기술을 사용한 단리에 의해 자연적으로 관련이 있는 구성요소가 실질적으로 없게 만들어질 수 있다. 이렇게 정의된 바와 같이, "단리된"은 반드시 이와 같이 기재된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 올리고펩타이드가 이의 자연 환경에서 물리적으로 제거되어야 하는 것은 아니다.

"폴리펩타이드 단편"이라는 용어는, 전장 폴리펩타이드와 비교하여 결실, 예를 들어 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 폴리펩타이드 단편은 해당 단편의 아미노산 서열이 자연 발생 서열의 상응하는 위치와 동일한 인접 서열이다. 단편은 전형적으로 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 12개, 14개, 16개 또는 18개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 적어도 25개, 30개, 35개, 40개 또는 45개 아미노산 길이, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 50개 또는 60개 아미노산 길이, 및 더 더욱 바람직하게는 적어도 70개 아미노산 길이이다.

단백질은 해당 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 제2 단백질을 인코딩하는 핵산 서열과 유사한 서열을 갖는 경우 제2 단백질과 "상동성"을 갖거나 이와 "상동"이다. 대안적으로, 단백질은 2개의 단백질이 "유사한" 아미노산 서열을 갖는 경우 제2 단백질과 상동성을 갖는다. (따라서, "상동 단백질"이라는 용어는, 2개의 단백질이 유사한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미하는 것으로 정의됨). 본원에 사용된 바와 같이, (특히 예측된 구조적 유사성과 관련하여) 아미노산 서열의 2개의 영역 사이의 상동성은 기능에 있어서 유사성을 암시하는 것으로 해석된다.

단백질 또는 펩타이드와 관련하여 "상동"이 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존적 아미노산 치환에 의해 달라지는 것으로 여겨진다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변경하지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우, 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 서열 동일성% 또는 상동성 정도가 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 위한 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 및 25:365-89](본원에 참조로 인용됨) 참조.

20개의 통상적 아미노산과 이의 약어는 통상적인 사용법을 따른다. 문헌[Immunology-A Synthesis (Golub and Gren eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass., 2^nd ed. 1991)](이는 본원에 참조로 인용됨) 참조. 20개의 통상적 아미노산, 비천연 아미노산, 예컨대 α-,α-이중치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 다른 비통상적 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산) 또한 본 발명의 폴리펩타이드에 적합한 구성요소일 수 있다. 비통상적 아미노산의 예에는, 4-히드록시프롤린, γ카르복시글루타메이트, ε트리메틸리신, ε아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신, N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 본원에 사용된 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 사용법 및 관례에 따라, 좌측 단부는 아미노 말단 단부에 상응하고, 우측 단부는 카르복시 말단 단부에 상응한다.

하기 6개의 기는 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 알라닌(A), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

때때로 서열 동일성%로도 지칭되는 폴리펩타이드에 서열 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 예를 들어, GCG(Genetics Computer Group)의 서열 분석 소프트웨어 패키지(University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705) 참조. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 대해 할당된 상동성의 척도를 사용하여 유사한 서열을 매칭한다. 예를 들어, GCG에는, 상이한 종의 유기체로부터의 상동 폴리펩타이드와 같이 밀접하게 관련된 폴리펩타이드들 사이, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 매개변수와 함께 사용될 수 있는 "Gap" 및 "Bestfit"과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG Version 6.1 참조.

특정 폴리펩타이드 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 유용한 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST(문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]; 문헌[Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993)]; 문헌[Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996)]; 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)]; 문헌[Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)]), 특히 blastp 또는 tblastn(문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)])이다.

BLASTp에 대한 바람직한 매개변수는 다음과 같다: 기대값(Expectation value): 10(디폴트); 필터(Filter): seg(디폴트); 갭 개방 비용(Cost to open a gap): 11(디폴트); 갭 연장 비용(Cost to extend a gap): 1(디폴트); 최대 정렬(Max. alignments): 100(디폴트); 단어 크기(Word size): 11(디폴트); 설명 수(No. of descriptions): 100(디폴트); 패널티 매트릭스(Penalty Matrix): BLOWSUM62.

BLASTp에 대한 바람직한 매개변수는 다음과 같다: 기대값: 10(디폴트); 필터: seg(디폴트); 갭 개방 비용: 11(디폴트); 갭 연장 비용: 1(디폴트); 최대 정렬: 100(디폴트); 단어 크기: 11(디폴트); 설명 수: 100(디폴트); 패널티 매트릭스: BLOWSUM62. 상동성에 대해 비교되는 폴리펩타이드 서열의 길이는 일반적으로 적어도 약 16개 아미노산 잔기, 통상적으로 적어도 약 20개 잔기, 보다 통상적으로 적어도 약 24개 잔기, 전형적으로 적어도 약 28개 잔기, 및 바람직하게는 약 35개 초과의 잔기일 것이다. 다수의 상이한 유기체로부터의 서열을 함유하는 데이터베이스를 검색하는 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 바람직하다. 아미노산 서열을 사용한 데이터베이스 검색은 당업계에 공지된 blastp 이외의 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, GCG Version 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 폴리펩타이드 서열을 비교할 수 있다. FASTA는 쿼리와 검색 서열 사이에서 최상으로 중첩되는 영역의 정렬과 서열 동일성%를 제공한다. 문헌[Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)](본원에 참조로 인용됨). 예를 들어, 아미노산 서열들 사이의 서열 동일성%는 GCG Version 6.1(본원에 참조로 인용됨)에 제공된 바와 같은 디폴트 매개변수(단어 크기 2 및 PAM250 스코어링 매트릭스)와 함께 FASTA를 사용하여 결정될 수 있다.

본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다"라는 단어와 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 이의 변형은, 명시된 정수 또는 정수들의 그룹을 포함한다는 것을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 "유리 전이"라는 용어는, 경질, 강성 또는 "유리질" 상태에서 보다 유연한 "고무질" 또는 "점성" 상태로의 물질 또는 조성물의 전이를 나타낸다.

본원에 사용된 "유리 전이 온도"라는 용어는, 물질 또는 조성물이 유리 전이를 거치는 온도를 나타낸다.

본원에 사용된 "용융 전이"라는 용어는, 고무질 상태에서 덜 정렬된 액상으로의 물질 또는 조성물의 전이를 나타낸다.

본원에 사용된 "용융 온도"라는 용어는, 물질이 용융 전이를 거치는 온도 범위를 나타낸다.

본원에 사용된 "가소제"라는 용어는, 폴리펩타이드 서열이 3차 구조 및 결합을 형성하는 것을 방지하고/하거나 폴리펩타이드 서열의 이동성을 증가시키기 위해 폴리펩타이드 서열과 상호작용하는 임의의 분자를 나타낸다.

본원에 사용된 "분말"이라는 용어는, 물 또는 세럼과 같은 용매와 복합체화 또는 응집될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는, 과립 형태로 존재하는 조성물을 나타낸다. 본원에 사용된 "건조 분말"이라는 용어는 "분말"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있지만, 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "건조 분말"은 단순히 과립화된 물질의 전체적인 외관을 나타내며, 재료에 복합체화 또는 응집된 용매가 전혀 없음을 의미하는 것으로 의도되지 않는다. 건조 분말은 분무 건조, 동결건조에 의해, 및/또는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

"담체"라는 용어는, 표면 수화, 표면 세정, 표면 방어, 표면 해독, 표면 박리, 표면 개선, 착색, 및/또는 비제한적으로, 물, 글리세린, 알코올, 실록산, 오일, 습윤제, 연화제, 폐색제, 활성제 및/또는 화장품 아쥬반트를 포함하는 다양한 첨가제 또는 용매의 피부, 모발 또는 손발톱과 같은 표면에의 전달에 사용되는 재조합 단백질을 나타낸다. 본원에 사용된 담체는 외부 쉘과 중공 코어, 예를 들어 18B 단백질을 포함한다.

본원에 사용된 "화장품"이라는 용어에는, 메이크업, 파운데이션, 스킨케어, 헤어케어 및 네일케어 제품이 포함된다.

본원에 사용된 "메이크업"이라는 용어는, 파운데이션, 흑색 및 갈색을 포함하여 얼굴에 색상을 남기는 제품, 즉, 마스카라, 컨실러, 아이라이너, 브로우 컬러, 아이쉐도우, 블러셔, 립 컬러, 분말, 고체 에멀젼 콤팩트 등을 나타낸다.

본원에 사용된 "파운데이션"이라는 용어는, 피부의 전체적인 착색을 고르게 하기 위해 화장품 회사에 의해 생성되거나 재도입된 액체, 크림, 무스, 팬케이크, 콤팩트, 컨실러 등의 제품을 나타낸다.

본원에 사용된 "스킨케어 제품"이라는 용어는, 피부를 처리(치료)하거나 관리하기 위해, 또는 어떻게든 보습하거나, 개선시키거나 또는 세정하기 위해 사용되는 것들을 나타낸다. "스킨케어 제품"이라는 문구로 고려되는 제품에는, 비제한적으로, 크림, 미스트, 세럼, 클렌징 젤, 앰풀, 접착제, 패치, 붕대, 치약, 무수 폐색성 보습제, 발한방지제, 탈취제, 퍼스널 세정 제품, 분말 세제, 섬유 유연제 타월, 폐색성 약물 전달 패치, 매니큐어, 분말, 조직, 와이프, 무수 헤어 컨디셔너, 면도 크림 등이 포함된다.

본원에 사용된 "처짐"이라는 용어는, 진피 엘라스틴, 근육 및/또는 피하 지방의 손실, 손상, 변경 및/또는 이상으로 인해 발생하는 피부의 이완, 느슨함 등의 상태를 의미한다.

본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는, 상태(예를 들어, 피부 상태)의 치료(예를 들어, 증상의 경감 또는 제거, 및/또는 치유) 및/또는 예방 또는 저해, 또는 증상의 완화를 나타낸다.

예시적인 방법 및 재료가 하기 기재되어 있지만, 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있고, 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 언급된 모든 간행물 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 상충하는 경우, 정의를 포함한 본 발명의 명세서가 우선할 것이다. 재료, 방법 및 예는 예시적인 것으로, 제한하고자 하는 것이 아니다.

재조합 실크 단백질

본 개시내용은 합성 단백질성 공중합체(즉, 재조합 폴리펩타이드)로부터 합성된 섬유를 포함하는 본 발명의 구현예를 설명한다. 적합한 단백질성 공중합체는 2016년 8월 45일자 공개된 미국 특허 공개공보 제2016/0222174호, 2018년 4월 26일자 공개된 미국 특허 공개공보 제2018/0111970호, 및 2018년 3월 1일자 공개된 미국 특허 공개공보 제2018/0057548호에 논의되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.

일부 구현예에서, 합성 단백질성 공중합체는 실크 유사 폴리펩타이드 서열로 제조된다. 일부 구현예에서, 실크 유사 폴리펩타이드 서열은, 1) 실크 폴리펩타이드 서열에서 유도된 반복 도메인을 혼합하고 매칭하는 방식으로 생성된 블록 공중합체 폴리펩타이드 조성물 및/또는 2) 산업적으로 확장 가능한 미생물로부터의 분비에 의해 유용한 성형체 조성물을 형성하기에 충분히 큰 크기(대략 40 kDa)를 갖는 블록 공중합체 폴리펩타이드의 재조합 발현이다. 실크 폴리펩타이드의 거의 모든 공개된 아미노산 서열로부터의 서열을 포함하는 실크 반복 도메인 단편으로부터 조작된 대형(대략 40 kDa 내지 대략 100 kDa) 블록 공중합체 폴리펩타이드는, 본원에 기재된 변형된 미생물에서 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드 서열은 성형체 형성이 가능한 고도로 발현되고 분비된 폴리펩타이드를 생산하도록 매칭되고 설계된다.

일부 구현예에서, 블록 공중합체는 실크 폴리펩타이드 서열 공간을 가로지르는 실크 폴리펩타이드 도메인의 조합 혼합물로부터 조작된다. 일부 구현예에서, 블록 공중합체는 확장 가능한 유기체(예를 들어, 효모, 진균 및 그람 양성 박테리아)에서 발현시키고 분비하는 방식으로 제조된다. 일부 구현예에서, 블록 공중합체 폴리펩타이드는 0개 이상의 N-말단 도메인(NTD), 1개 이상의 반복 도메인(REP) 및 0개 이상의 C-말단 도메인(CTD)을 포함한다. 구현예의 일부 양태에서, 블록 공중합체 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬의 >100개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 블록 공중합체 폴리펩타이드는 "Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers"라는 발명의 명칭의 국제 공개공보 WO/2015/042164(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 개시된 바와 같은 블록 공중합체 폴리펩타이드의 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 도메인을 포함한다.

몇 가지 유형의 천연 거미 실크가 확인되었다. 각각의 천연 방적 실크 유형의 기계적 특성은 해당 실크의 분자 조성과 밀접하게 관련이 있는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌[Garb, J.E., et al., Untangling spider silk evolution with spidroin terminal domains, BMC Evol. Biol., 10:243 (2010)]; 문헌[Bittencourt, D., et al., Protein families, natural history and biotechnological aspects of spider silk, Genet. Mol. Res., 11:3 (2012)]; 문헌[Rising, A., et al., Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure-function relationships and biomedical applications, Cell. Mol. Life Sci., 68:2, pg. 169-184 (2011)]; 및 문헌[Humenik, M., et al., Spider silk: understanding the structure-function relationship of a natural fiber, Prog. Mol. Biol. Transl. Sci., 103, pg. 131-85 (2011)] 참조. 예를 들어:

포도상(aciniform)(AcSp) 실크는 중간 정도로 높은 강도와 중간 정도로 높은 신장성(extensibility)이 결합된 결과로 높은 인성을 갖는 경향이 있다. AcSp 실크는 종종 폴리 세린과 GPX의 모티프를 포함하는 큰 블록("앙상블 반복") 크기를 특징으로 한다. 관상(tubuliform)(TuSp 또는 원통형) 실크는 중간 정도의 강도와 높은 신장성과 함께 큰 직경을 갖는 경향이 있다. TuSp 실크는 폴리 세린 및 폴리 트레오닌 함량과, 폴리 알라닌의 짧은 트랙을 특징으로 한다. 대낭상(major Ampullate)(MaSp) 실크는 높은 강도와 중간 정도의 신장성을 갖는 경향이 있다. MaSp 실크는 MaSp1과 MaSp2의 두 가지 유형 중 하나일 수 있다. MaSp1 실크는 일반적으로 MaSp2 실크보다 신장성이 낮고, 폴리 알라닌, GX 및 GGX 모티프를 특징으로 한다. MaSp2 실크는 폴리 알라닌, GGX 및 GPX 모티프를 특징으로 한다. 소낭상(minor Ampullate)(MiSp) 실크는 중간 정도의 강도와 중간 정도의 신장성을 갖는 경향이 있다. MiSp 실크는 GGX, GA 및 폴리 A 모티프를 특징으로 하며, 종종 대략 100개 아미노산의 스페이서 요소를 함유한다. 편모상(flagelliform)(Flag) 실크는 매우 높은 신장성과 중간 정도의 강도를 갖는 경향이 있다. Flag 실크는 통상적으로 GPG, GGX 및 짧은 스페이서 모티프를 특징으로 한다.

각각의 실크 유형의 특성은 종마다 다를 수 있으며, 특유의 생활 방식(예를 들어, 좌식 웹 스피너(sedentary web spinner) 대 방량자 사냥꾼(vagabond hunter))을 주도하거나 진화적으로 더 오래된 거미는 상기 설명과 특성이 상이한 실크를 생산할 수 있다(거미 다양성과 분류에 대한 설명은, 예를 들어 문헌[Hormiga, G., and Griswold, C.E., Systematics, phylogeny, and evolution of orb-weaving spiders, Annu. Rev. Entomol. 59, pg. 487-512 (2014)]; 및 문헌[Blackedge, T.A. et al., Reconstructing web evolution and spider diversification in the molecular era, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106:13, pg. 5229-5234 (2009)] 참조). 하지만, 천연 실크 단백질의 반복 도메인과 서열 유사성 및/또는 아미노산 조성 유사성을 갖는 합성 블록 공중합체 폴리펩타이드는 천연 실크 폴리펩타이드로 제조된 상응하는 성형체의 특성을 재현하는 특성을 갖는 일관된 성형체를 상업적 규모로 제조하는 데 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 추정 실크 서열의 목록은 GenBank에서 관련 용어, 예를 들어 "스피드로인(spidroin)", "피브로인", "MaSp"을 검색하는 방식으로 작성될 수 있으며, 이들 서열은 독립적인 시퀀싱 노력을 통해 얻은 추가의 서열과 풀링될 수 있다. 이어서, 서열은 아미노산으로 번역되고, 중복 항목에 대해 필터링되고, 수동으로 도메인(NTD, REP, CTD)으로 분할된다. 일부 구현예에서, 후보 아미노산 서열은 피키아(코마가타엘라) 파스토리스(Pichia (Komagataella) pastoris)에서의 발현에 최적화된 DNA 서열로 역번역된다. DNA 서열은 각각 발현 벡터에 클로닝되고, 피키아(코마가타엘라) 파스토리스로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 성공적인 발현과 분비를 나타내는 다양한 실크 도메인은 성형체 형성이 가능한 실크 분자를 구축하기 위해 후속으로 조합 방식으로 조립된다.

실크 폴리펩타이드는 특징적으로 비반복 영역(예를 들어, C-말단 및 N-말단 도메인)이 플랭킹된 반복 도메인(REP)으로 구성된다. 일 구현예에서, C-말단 도메인과 N-말단 도메인은 모두 75개 내지 350개 아미노산 길이이다. 반복 도메인은 도 1에 도시된 바와 같은 계층 구조를 나타낸다. 반복 도메인은 일련의 블록(반복 단위로도 불림)을 포함한다. 블록은 실크 반복 도메인 전체에 걸쳐 때때로 완벽하게 및 때때로 불완전하게(준반복 도메인을 구성함) 반복된다. 블록의 길이와 조성은 상이한 실크 유형과 상이한 종에 따라 달라진다. 표 1A는 선택된 종 및 실크 유형으로부터의 블록 서열의 예를 열거한 것으로, 추가 예는 문헌[Rising, A. et al., Spider silk proteins: recent advances in recombinant production, structure-function relationships and biomedical applications, Cell Mol. Life Sci., 68:2, pg 169-184 (2011)]; 및 문헌[Gatesy, J. et al., Extreme diversity, conservation, and convergence of spider silk fibroin sequences, Science, 291:5513, pg. 2603-2605 (2001)]에 제시되어 있다. 일부 경우에, 블록은 규칙적인 패턴으로 배열되어, 실크 서열의 반복 도메인에서 다회(통상적으로 2회 내지 8회) 나타나는 더 큰 마크로 반복부(macro-repeat)를 형성할 수 있다. 반복 도메인 또는 마크로 반복부 내부의 반복된 블록과, 반복 도메인 내 반복된 마크로 반복부는, 이격 요소(spacing element)에 의해 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 블록 서열은 글리신 풍부 영역에 이어, polyA 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 짧은(약 1개 내지 10개) 아미노산 모티프는 블록 내부에서 수차례 나타난다. 본 발명의 목적을 위해, 상이한 천연 실크 폴리펩타이드의 블록은 원순열(circular permutation)과 관계없이 선택될 수 있다(즉, 실크 폴리펩타이드 사이에서 달리 유사한 식별된 블록은 원순열로 인해 정렬되지 않을 수 있음). 따라서, 예를 들어 SGAGG(서열번호 494)의 "블록"은, 본 발명의 목적을 위해, GSGAG(서열번호 495)와 동일하고, GGSGA(서열번호 496)와 동일하며; 이들은 모두 서로의 원순열일 뿐이다. 주어진 실크 서열에 대해 선택된 특정 순열은 무엇보다 편의에 따라(통상적으로 G로 시작함) 작성될 수 있다. NCBI 데이터베이스에서 얻은 실크 서열은 블록과 비반복 영역으로 분할될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에 따른 블록 및/또는 마크로 반복 도메인으로부터의 섬유 형성 블록 공중합체 폴리펩타이드는, 국제 공개공보 WO/2015/042164(이는 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다. GenBank와 같은 단백질 데이터베이스 또는 신규한 시퀀싱을 통해 얻은 천연 실크 서열은 도메인(N-말단 도메인, 반복 도메인 및 C-말단 도메인)별로 분해된다. 섬유 또는 성형체로의 합성 및 조립을 목적으로 선택된 N-말단 도메인과 C-말단 도메인 서열은 천연 아미노산 서열 정보와 본원에 기재된 다른 변형을 포함한다. 반복 도메인은 아미노산을 인코딩하는 DNA의 크기를 용이하게 합성 가능한 단편으로 줄이면서 중요한 아미노산 정보를 포획하는 대표적인 블록을, 실크의 유형에 따라 통상적으로 1개 내지 8개 함유하는 반복 서열로 분해된다. 일부 구현예에서, 적절하게 형성된 블록 공중합체 폴리펩타이드는 적어도 1개의 반복 서열을 포함하는 적어도 1개의 반복 도메인을 포함하며, 선택적으로 N-말단 도메인 및/또는 C-말단 도메인이 플랭킹된다.

일부 구현예에서, 반복 도메인은 적어도 하나의 반복 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 150개 내지 300개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 복수의 블록을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 복수의 마크로 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, 블록 또는 마크로 반복부는 다수의 반복 서열로 분할된다.

일부 구현예에서, 반복 서열은 DNA 조립체 요건을 충족시키기 위해, 글리신에서 시작하여 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 시스테인(C), 히스티딘(H), 아스파라긴(N), 메티오닌(M) 또는 아스파르트산(D)으로 종결되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 서열 중 일부는 천연 서열과 비교하여 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 (F, Y, W, C, H, N, M 또는 D로 종결되는 것을 회피하기 위해) 폴리펩타이드의 C 말단에 세린을 부가하는 방식으로 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 불완전 블록을 또 다른 블록의 상동 서열로 채우는 방식으로 변경될 수 있다. 일부 구현예에서, 반복 서열은 블록 또는 마크로 반복부의 순서를 재배열하는 방식으로 변경될 수 있다.

일부 구현예에서, 비반복 N- 및 C-말단 도메인이 합성을 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, N-말단 도메인은, 예를 들어 SignalP(문헌[Peterson, T.N., et. Al., SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions, Nat. Methods, 8:10, pg. 785-786 (2011)])에 따라 확인된 바와 같이, 리딩 신호 서열의 제거에 의한 것일 수 있다.

일부 구현예에서, N-말단 도메인, 반복 서열 또는 C-말단 도메인 서열은 하기에서 유래될 수 있다: 아겔레놉시스 아페르타(Agelenopsis aperta), 알리아티푸스 굴로수스, 아포노펠마 시만니(Aphonopelma seemanni), 압토스티쿠스 종(Aptostichus sp.) AS217, 압토스티쿠스 종 AS220, 아라네우스 디아데마투스(Araneus diadematus), 아라네우스 겜모이데스, 아라네우스 벤트리코수스, 아르기오페 아모에나(Argiope amoena), 아르기오페 아르겐타타(Argiope argentata), 아르기오페 브루에니키(Argiope bruennichi), 아르기오페 트리파시아타, 아티포이데스 리베르시(Atypoides riversi), 아비쿨라리아 주루엔시스(Avicularia juruensis), 보트리오시르툼 칼리포르니쿰(Bothriocyrtum californicum), 데이노피스 스피노사, 디구에티아 카니티에스(Diguetia canities), 돌로메데스 테네브로수스, 유아그루스 키소세우스(Euagrus chisoseus), 유프로스테놉스 아우스트랄리스, 가스테라칸타 맘모사(Gasteracantha mammosa), 히포킬루스 토렐리(Hypochilus thorelli), 쿠쿨카니아 히베르날리스(Kukulcania hibernalis), 라트로덱투스 헤스페루스, 메가헥수라 풀바(Megahexura fulva), 메테페이라 그란디오사(Metepeira grandiosa), 네필라 안티포디아나(Nephila antipodiana), 네필라 클라바타, 네필라 클라비페스, 네필라 마다가스카리엔시스(Nephila madagascariensis), 네필라 필리페스(Nephila pilipes), 네필렌기스 크루엔타타, 파라윅시아 비스트리아타(Parawixia bistriata), 페우세티아 비리단스(Peucetia viridans), 플렉트레우리스 트리스티스, 포에실로테리아 레갈리스(Poecilotheria regalis), 테트라그나타 카우아이엔시스 또는 울로보루스 디베르수스.

일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 코딩 서열은 알파 교배 인자 뉴클레오타이드 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 코딩 서열은 또 다른 내인성 또는 이종 분비 신호 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 코딩 서열은 3X FLAG 뉴클레오타이드 코딩 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드 뉴클레오타이드 코딩 서열은 6개 내지 8개 His 잔기와 같은 다른 친화성 태그에 작동적으로 연결된다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 폴리펩타이드는 MaSp2, 예컨대 아르기오페 브루에니키 종에서 유도된 재조합 거미 실크 단백질 단편 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 합성된 섬유는 2개 내지 20개의 반복 단위를 포함하는 단백질 분자를 함유하며, 여기서 각각의 반복 단위의 분자량은 약 20 kDa 초과이다. 공중합체의 각각의 반복 단위 내에는 "준-반복 단위"의 수로 조직화되는, 약 60개 초과의 아미노산 잔기, 종종 60개 내지 100개 아미노산 범위의 잔기가 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 폴리펩타이드의 반복 단위는 MaSp2 드래그라인(dragline) 실크 단백질 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.

양호한 기계적 특성을 갖는 섬유를 형성하는 단백질성 블록 공중합체의 반복 단위는 실크 폴리펩타이드의 일부를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드 반복 단위는 알라닌 풍부 영역과 글리신 풍부 영역을 함유하며, 150개 이상의 아미노산 길이이다. 본 개시내용의 단백질성 블록 공중합체에서 반복부로 사용될 수 있는 일부 예시적인 서열은 공동 소유의 PCT 공개공보 WO 2015/042164(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 제공되어 있으며, 피키아(Pichia) 발현 시스템을 사용하여 발현하는 것으로 입증되었다.

일부 구현예에서, 실크 단백질은 150개 초과의 아미노산 잔기를 포함하고 적어도 10 kDa의 분자량을 갖는 반복 단위의 적어도 2회의 발생; 적어도 80%의 알라닌 함량을 포함하는 6개 이상의 연속 아미노산을 갖는 알라닌 풍부 영역; 적어도 40%의 글리신 함량과 30% 미만의 알라닌 함량을 포함하는 12개 이상의 연속 아미노산을 갖는 글리신 풍부 영역을 포함하며, 여기서 섬유는 550 cN/tex 초과의 탄성 계수, 적어도 10%의 신장성 및 적어도 15 cN/tex의 극한 인장 강도로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 특성을 포함한다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 반복 단위를 포함하고, 여기서 각각의 반복 단위는 2개 내지 20개의 준-반복 단위를 포함하는 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고; 각각의 준-반복 단위는 {GGY-[GPG-X₁]_n1-GPS-(A)_n2}를 포함하며, 여기서 각각의 준-반복 단위에 대해; X₁은 SGGQQ, GAGQQ, GQGOPY, AGQQ 및 SQ로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되고; n1은 4 내지 8이고, n2는 6 내지 10이다. 반복 단위는 다수의 준-반복 단위로 구성된다.

일부 구현예에서, 3개의 "긴" 준-반복부 다음에는 3개의 "짧은" 준-반복 단위가 이어진다. 상기 언급된 바와 같이, 짧은 준-반복 단위는 n1=4 또는 5인 것들이다. 긴 준-반복 단위는 n1=6, 7 또는 8인 것들로 정의된다. 일부 구현예에서, 짧은 준-반복부는 모두 반복 단위의 각각의 준-반복 단위 내 동일한 위치에 동일한 X₁ 모티프를 갖는다. 일부 구현예에서, 6개 중 3개 이하의 준-반복 단위는 동일한 X₁ 모티프를 공유한다.

추가 구현예에서, 반복 단위는 반복 단위 내 하나의 행에서 동일한 X₁을 2회 초과로 사용하지 않는 준-반복 단위로 구성된다. 추가 구현예에서, 반복 단위는 준-반복부 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개가 반복 단위의 단일 준-반복 단위에서 동일한 X₁을 2회 초과로 사용하지 않는 준-반복 단위로 구성된다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 폴리펩타이드는 서열번호 1의 폴리펩타이드 서열(즉, 18B)을 포함한다. 일부 구현예에서, 반복 단위는 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드이다. 이러한 서열은 표 1B에 제시되어 있다:

일부 구현예에서, 상기 기재된 재조합 실크 폴리펩타이드로 형성된 섬유의 구조는 베타-시트 구조, 베타-회전 구조 또는 알파-나선 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 형성된 섬유의 2차, 3차 및 4차 단백질 구조는 나노결정질 베타-시트 영역, 비정질 베타-회전 영역, 비정질 알파-나선 영역, 비결정질 매트릭스에 포매된 무작위로 공간적으로 분포된 나노결정질 영역, 또는 비결정질 매트릭스에 포매된 무작위로 배향된 나노결정질 영역을 갖는 것으로 기재된다. 이론에 제한됨 없이, 거미 실크 내 단백질의 구조 특성은 섬유 기계적 특성과 관련이 있는 것으로 이론화된다. 섬유 내 결정질 영역은 섬유의 인장 강도와 관련이 있지만, 비정질 영역은 섬유의 신장성과 관련이 있다. 대낭상(MA) 실크는 편모상 실크보다 큰 강도와 낮은 신장성을 갖는 경향이 있으며, 마찬가지로 MA 실크는 편모상 실크에 비해 결정질 영역의 부피 분율이 더 높다. 나아가, 거미 실크 단백질의 결정질 및 비정질 영역의 분자 동역학에 기반한 이론적 모델은, 결정질 영역이 섬유의 인장 강도와 관련이 있고, 비정질 영역이 섬유의 신장성과 관련이 있다는 주장을 뒷받침한다. 또한, 이론적 모델링은 RPF의 기계적 특성에 대한 2차, 3차 및 4차 구조의 중요성을 뒷받침한다. 예를 들어, 무작위, 병렬 및 직렬 공간 분포에서의 나노결정 도메인의 조립과, 비정질 영역 내 얽힌 사슬 사이 및 비정질 영역과 나노결정질 영역 사이의 상호작용력의 강도는 모두, 생성된 섬유의 이론적 기계적 특성에 영향을 미쳤다.

일부 구현예에서, 실크 단백질의 분자량은 20 kDa 내지 2000 kDa, 또는 20 kDa 초과, 또는 10 kDa 초과, 또는 5 kDa 초과, 또는 5 kDa 내지 400 kDa, 또는 5 kDa 내지 300 kDa, 또는 5 kDa 내지 200 kDa, 또는 5 kDa 내지 100 kDa, 또는 5 kDa 내지 50 kDa, 또는 5 kDa 내지 500 kDa, 또는 5 kDa 내지 1000 kDa, 또는 5 kDa 내지 2000 kDa, 또는 10 kDa 내지 400 kDa, 또는 10 kDa 내지 300 kDa, 또는 10 kDa 내지 200 kDa, 또는 10 kDa 내지 100 kDa, 또는 10 kDa 내지 50 kDa, 또는 10 kDa 내지 500 kDa, 또는 10 kDa 내지 1000 kDa, 또는 10 kDa 내지 2000 kDa, 또는 20 kDa 내지400 kDa, 또는 20 kDa 내지 300 kDa, 또는 20 kDa 내지 200 kDa, 또는 40 kDa 내지 300 kDa, 또는 40 kDa 내지 500 kDa, 또는 20 kDa 내지 100 kDa, 또는 20 kDa 내지 50 kDa, 또는 20 kDa 내지 500 kDa, 또는 20 kDa 내지 1000 kDa, 또는 20 kDa 내지 2000 kDa 범위일 수 있다.

재조합 거미 실크 폴리펩타이드 분말 불순물 및 분해의 특징분석

상이한 재조합 거미 실크 폴리펩타이드는 단백질에 의해 형성된 2차 및 3차 구조의 강도와 안정성에 기반하여 용융 온도와 유리 전이 온도 같은 상이한 물리화학적 특성을 갖는다. 실크 폴리펩타이드는 단량체 형태의 베타 시트 구조를 형성한다. 다른 단량체 존재 하에서, 실크 폴리펩타이드는 베타 시트 구조의 3차원 결정질 격자를 형성한다. 베타 시트 구조는 폴리펩타이드 서열의 비정질 영역에서 분리되어 이들 사이에 산재되어 있다.

베타 시트 구조는 고온에서 매우 안정하며, 베타 시트의 용융 온도는 고속 주사 열량계로 측정 시 대략 257℃이다. 문헌[Cebe et al., Beating the Heat - Fast Scanning Melts Silk Beta Sheet Crystals, Nature Scientific Reports 3:1130 (2013)] 참조. 베타 시트 구조가 실크 폴리펩타이드의 유리 전이 온도 초과에서 온전한 상태로 유지되는 것으로 여겨지기 때문에, 재조합 실크 폴리펩타이드의 유리 전이 온도에서 관찰되는 구조 전이는 베타 시트 사이 비정질 영역의 증가된 이동성 때문인 것으로 가정되었다.

가소제는 비정질 영역의 이동성을 증가시키고, 잠재적으로 베타 시트 형성을 방해하는 방식으로 실크 단백질의 유리 전이 온도와 용융 온도를 낮춘다. 이러한 목적에 사용되는 적합한 가소제에는, 비제한적으로, 물, 및 글리세롤, 트리글리세롤, 헥사글리세롤 및 데카글리세롤과 같은 폴리알코올(폴리올)이 포함된다. 다른 적합한 가소제에는, 비제한적으로, 디메틸 이소소르바이트; 아디프산; 디메틸아미노프로필 아민과 카프릴산/카프르산의 아미드; 아세트아미드 및 이들의 임의의 조합이 포함된다.

실크 폴리펩타이드의 친수성 부분은 습도로 공기 중에 존재하는 주변 물과 결합할 수 있고, 물은 거의 항상 존재할 것이기 때문에, 결합된 주변 물은 실크 폴리펩타이드를 가소화할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 가소제는 단독으로, 또는 물 또는 다른 가소제와 조합으로 존재하는 글리세롤일 수 있다. 다른 적합한 가소제는 상기 논의되어 있다.

또한, 재조합 실크 폴리펩타이드가 발효에 의해 생산되고 이로부터 재조합 실크 폴리펩타이드 분말로 회수되는 경우, 가소제로 작용하거나 달리 3차 구조의 형성을 저해하는 불순물이 재조합 실크 폴리펩타이드 분말에 존재할 수 있다. 예를 들어, 잔류 지질 및 당류는 가소제로 작용하여, 3차 구조의 형성을 방해하는 방식으로 단백질의 유리 전이 온도에 영향을 미칠 수 있다.

다양한 잘 확립된 방법을 사용하여 재조합 실크 폴리펩타이드 분말 또는 조성물의 순도와 상대적 조성을 평가할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 상대적인 크기에 기반하여 분자를 분리하고, 전장 중합체 및 단량체 형태의 재조합 실크 폴리펩타이드의 상대적인 양뿐 아니라, 재조합 실크 폴리펩타이드 분말 내 고분자량, 저분자량 및 중간 분자량 불순물의 양을 분석하는 데 사용될 수 있다. 유사하게, 고속 고성능 액체 크로마토그래피는 단량체 형태의 재조합 실크 폴리펩타이드와 같은 용액에 존재하는 다양한 화합물을 측정하는 데 사용될 수 있다. 이온 교환 액체 크로마토그래피는 지질 및 당류와 같은 불순물을 포함하여, 용액 중 다양한 미량 분자의 농도를 평가하는 데 사용될 수 있다. 질량분석법과 같은 다양한 분자의 크로마토그래피 및 정량화의 다른 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다.

구현예에 따라, 재조합 실크 폴리펩타이드는 재조합 실크 폴리펩타이드 분말의 다른 구성요소 대비(중량 기준) 단량체 형태의 재조합 실크 폴리펩타이드의 양에 기반하여 계산된 순도를 가질 수 있다. 다양한 예에서, 순도는 재조합 실크 폴리펩타이드의 유형, 및 재조합 실크 폴리펩타이드 분말을 회수하고, 분리하고 후처리하는 데 사용되는 기술에 따라 50 중량% 내지 90 중량% 범위일 수 있다.

크기 배제 크로마토그래피와 역상 고성능 액체 크로마토그래피는 모두 전장 재조합 실크 폴리펩타이드를 측정하는 데 유용하며, 이는 가공 전후 조성물 내 전장 실크 폴리펩타이드 양을 비교하는 방식으로 가공 과정이 재조합 실크 폴리펩타이드를 분해하는지 여부를 결정하는 유용한 기술이다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 가공 전후 조성물에 존재하는 전장 재조합 실크 폴리펩타이드의 양은 최소로 분해될 수 있다. 분해량은 0.001 중량% 내지 10 중량% 또는 0.01 중량% 내지 6 중량% 범위, 예를 들어 10 중량% 또는 8 중량% 또는 6 중량% 미만, 또는 5 중량% 미만, 3 중량% 미만 또는 1 중량% 미만일 수 있다.

재조합 실크 조성물

구현예에 따라, 재조합 실크 조성물에서 중량 기준 재조합 실크 폴리펩타이드 분말의 적합한 농도는, 1 중량% 내지 25 중량%, 1 중량% 내지 30 중량%, 내지 70 중량%, 10 중량% 내지 60 중량%, 15 중량% 내지 50 중량%, 18 중량% 내지 45 중량% 또는 20 중량% 내지 41 중량% 범위이다.

이론에 제한됨 없이, 본 발명의 다양한 구현예에서, 재조합 실크 조성물을 유도하는 것은, 단량체성 재조합 실크 폴리펩타이드가 이의 결정질 중합체 형태로 응집하는 것을 방지하거나, 이후 가공 단계에서 재조합 실크 폴리펩타이드가 이의 결정질 중합체 형태로 전이되는 것을 제어하는 것이 바람직한 적용에 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 유도는 필요하지 않다.

하나의 특정 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 재조합 실크 폴리펩타이드와 제2 중합체의 블렌딩 전 재조합 실크 폴리펩타이드의 응집을 방지하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 재조합 실크 폴리펩타이드가 단량체 형태로 베이스에 존재하는 화장품 또는 스킨케어 제품의 베이스를 형성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 베이스에 단량체 형태의 재조합 실크 폴리펩타이드를 갖는 것은, 피부와의 접촉 시 또는 다양한 다른 화학 반응을 통해 단량체의 결정질 중합체 형태로의 제어된 응집을 가능하게 한다.

다양한 구현예에서, 재조합 실크 조성물이 가열되는 온도는 재조합 실크 폴리펩타이드의 분해를 최소화하거나 완전히 방지하도록 최소화될 것이다. 특정 구현예에서, 재조합 실크 용융물은 120℃미만, 100℃미만, 80℃미만, 60℃미만, 40℃미만, 또는 20℃미만의 온도로 가열될 것이다. 종종, 용융물은 가공 동안 10℃ 내지 120℃, 10℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 80℃, 15℃ 내지 60℃, 18℃ 내지 40℃ 또는 18℃ 내지 22℃ 범위의 온도에 있을 것이다. 다른 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 가열되지 않는다. 이러한 구현예에서, 재조합 실크 조성물을 형성하는 데 열의 존재가 필요하지 않다.

재조합 실크 폴리펩타이드의 분해량은 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 재조합 실크 폴리펩타이드의 분해량은 존재하는 전장 재조합 실크 폴리펩타이드의 양을 측정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 측정될 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 조성물은 성형체로 형성된 후, 6.0 중량% 미만의 양으로 분해된다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 성형 후 4.0 중량% 미만, 3.0 중량% 미만, 2.0 중량% 미만 또는 1.0 중량% 미만의 양으로 분해되어, 분해량은 0.001 중량% 내지 10 중량%, 8 중량%, 6 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량% 또는 1 중량%, 또는 0.01 중량% 내지 6 중량%, 4 중량%, 3 중량%, 2 중량% 또는 1 중량% 범위일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 조성물 내 재조합 실크 단백질은 실질적으로 분해되지 않는다. 유사한 구현예에서, 상기 조성물 내 재조합 실크 단백질은 실질적으로 적어도 1일, 1개월, 1년 또는 5년의 기간에 걸쳐 분해되지 않는다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 물리적으로 안정하다. 다양한 구현예에서, 상기 조성물은 연장된 기간 동안, 연장된 저장 수명을 갖는 재료 형태, 예를 들어 분말로 유지된다. 장기간 사용 시, 재조합 실크 조성물은 실질적으로 안정하게 유지된다.

본 발명의 대부분의 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 분말이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 분무 건조된다. 다른 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 동결 건조되거나 진공 건조된다. "분무 건조" 및 "분무 건조된"은 본원에서 간단성을 위해 사용되며, 당업자는 적절한 경우 동결 건조 또는 동결건조 및 진공 건조가 분무 건조를 대체할 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 조성물은 건조된 형태로 저장될 수 있다.

18B 단백질은 수성 슬러리보다 건조된 형태에서 더 안정하다. 일부 구현예에서, 분무 건조된 재조합 실크는 하기와 같이 수득된다: 추출된 재조합 실크를 포함하는 슬러리 조성물을 건조 단계 동안 냉각된 상태로 유지시킨다. 이를 생성된 분말의 수분 함량이 엄격하게 제어되는 장형(tall form) 분무 건조기에 펌핑한다. 단백질 분말이 흡습성이기 때문에, 수분의 재도입을 최소화하기 위해 최종 분말 수집 및 팩아웃을 수행한다. 포장재 디자인은 수분 및 광 노출을 최소화해야 한다.

일부 구현예에서, 세포 배양물로부터 재조합 실크 폴리펩타이드의 회수 및 분리는 하기와 같이 수행된다: i) 추출 및 분리, ii) 한외여과에 의한 우레아 제거, iii) 침전을 통한 세척, iv) 염 제거 및 단백질 농축, 및 v) 분무 건조.

일부 구현예에서, 조성물을 동결 건조시키기 위해서는, 이를 고체화될 때까지 냉각시키고, 감압 하에 위치시켜 조성물 내 휘발성 성분의 대부분이 승화되게 한다. 고체 잔류물은 미세 분말을 형성하기 위해 밀링을 필요로 하는 단일 덩어리를 형성할 수 있다. 전형적인 동결 건조된 분말은 다공성의 불규칙한 형상의 입자를 포함하며, 쉽게 수화된다. 동결 건조는 강한 열을 필요로 하지 않기 때문에, 휘발성 성분을 포함하는 분말을 제조하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 약 -100℃미만의 온도에서 급속 동결 건조된다.

재조합 실크 조성물의 형성 후, 재조합 실크 조성물의 결정화도를 증가시켜 조성물을 강화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 동일하게 유지되거나 감소한다. 일부 구현예에서, X선 결정학을 통해 측정된 재조합 실크 조성물의 결정화도 지수는 2% 내지 90%이다. 일부 다른 구현예에서, X선 결정학을 통해 측정된 재조합 실크 조성물의 결정화도 지수는 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6% 또는 적어도 7%이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 고체 또는 필름이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 분말이다. 일부 구현예에서, 고체 또는 필름은 실질적으로 균질할 것이며, 이는, 광학 현미경으로 검사 시, 재료가 임의의 내포물 또는 침전물을 갖지 않거나 소량으로 갖는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 광학 현미경은 재조합 실크를 3차원 격자로 정렬하기 위한 대용물로 사용될 수 있는 복굴절을 측정하는 데 사용될 수 있다. 복굴절은 광의 편광 및 전파에 따라 달라지는 굴절률을 갖는 재료의 광학 특성이다. 구체적으로, 복굴절로 측정된 높은 수준의 축 차수는 높은 인장 강도와 관련이 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 고체 및 필름은 최소 복굴절을 가질 것이다. 다양한 구현예에서, 고체는 비드이다. 일부 다른 구현예에서, 고체는 각질제거제로 기능한다. 재조합 실크 고체는 피부를 위한 부드러운 피부 스크럽 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 재료 형태는 롤, 펠릿, 시트 또는 플레이크이다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 중공 코어 및/또는 쉘을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질의 직경은 약 1 μm 내지 약 30 μm, 약 5 μm 내지 약 20 μm, 또는 약 10 μm 내지 약 50 μm 범위이지만, 물 중 재조합 실크 단백질의 직경은 약 20 μm 내지 약 80 μm, 약 30 μm 내지 약 70 μm, 또는 약 40 μm 내지 약 100 μm 범위이다.

용매

일부 구현예에서, 실크 폴리펩타이드는 하나 이상의 용매에 적용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 중공 코어는 액체 물 자체의 형태로, 또는 액체 수용액, 액체 물을 함유하는 에멀젼 또는 수성 분산액으로서의 액체 물 또는 글리세린과 같은 용매를 함유한다. 특정 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 재조합 실크 폴리펩타이드를 적어도 1 wt%, 약 2 wt%, 약 3 wt%, 약 4 wt%, 약 5 wt%, 약 6 wt%, 약 7 wt%, 약 8 wt%, 약 9 wt%, 약 10 wt%, 약 15 wt% 또는 약 20 wt% 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 글리세린 중 약 25 wt% 용액을 포함한다.

일부 구현예에서, 용매는 물이다. 이론에 제한됨 없이, 재조합 실크 폴리펩타이드를 물과 같은 용매에 적용하면, 팽창 또는 팽윤되어, 단백질이 물과 같은 용매를 함유하는 담체로 기능하는 재조합 실크 폴리펩타이드가 수득된다. 이러한 조성물은 팽창된 입자의 액체 또는 반액체 수성 현탁액을 직접 형성하기 위해 물에 침지된 후 건조되고 부분적으로 재수화 가능한 형태로 저장될 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 중공 코어의 일부를 팽창시킬 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 쉘의 일부를 팽창시킬 수 있다. 용매가 물인 이러한 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 히드로겔로 변형된다. 용매가 물인 다른 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 페이스트로 변형된다. 다양한 구현예에서, 재조합 실크 단백질 조성물을 추가로 가공하기 위해 열 및/또는 압력이 부가될 수 있다.

일부 구현예에서, 용매는 일반적으로 재조합 실크 폴리펩타이드의 총 중량에 대해 55 중량% 내지 90 중량% 범위의 비율로 존재한다. 이러한 범위는 60 중량%, 65 중량%, 70 중량%, 75 중량%, 80 중량% 및 85 중량%를 포함하여, 상기 범위 사이의 모든 특정 값과 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 다양한 상이한 pH 수준의 물, 글리세린, 알코올, 실록산 및 오일을 포함하는 다양한 용매에 불용성이다.

일부 구현예에서, 용매는 수성 유형이다. 이러한 구현예에서, 용매는 물이다. 용매의 pH는 6 내지 12 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 용매의 pH는 6이다. 일부 다른 구현예에서, 용매의 pH는 0 내지 5, 2 내지 7, 4 내지 9, 6 내지 11, 8 내지 13, 또는 10 내지 14 범위이다.

다른 구현예에서, 용매는 비교적 짧은 건조 시간을 달성하기 위해 다양한 휘발성 유기 용매의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 알코올이다. 용매는 물, 에틸 알코올, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, 이소프로판올, n-부틸 알코올, 피마자유, 오르가노폴리실록산 오일, 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르, 디메틸 설폭시드, 디메틸 포름아미드 및 테트라히드로푸란을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 오르가노폴리실록산 오일은 휘발성 실리콘, 비휘발성 실리콘, 또는 휘발성 실리콘과 비휘발성 실리콘의 혼합물일 수 있다. 이러한 맥락에서 사용된 "비휘발성"이라는 용어는, 주변 조건 하에서 액체이며, 약 100℃초과의 인화점(1 대기압 하에서)을 갖는 실리콘을 나타낸다. 이러한 맥락에서 사용된 "휘발성"이라는 용어는, 모든 다른 실리콘 오일을 나타낸다. 적합한 오르가노폴리실록산은 광범위한 휘발성 및 점도에 걸쳐있는 매우 다양한 실리콘에서 선택될 수 있다. 적합한 실리콘은 1991년 12월 3일자 허여된 미국 특허 제5,069,897호에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 폴리알킬실록산, 알킬 치환된 디메티콘, 디메티코놀, 폴리알킬아릴 실록산 및 이들의 혼합물을 포함하는 군에서 선택되는 오르가노폴리실록산이 사용될 수 있다. 폴리알킬실록산, 디메티콘 및 시클로메티콘이 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 용매는 식물성 오일과 수소첨가된 식물성 오일이다. 일부 구현예에서, 용매는 유리 지방산이다. 식물성 오일과 수소첨가된 식물성 오일의 예에는, 홍화유, 피마자유, 코코넛유, 면실유, 멘헤이든유(menhaden oil), 팜핵유, 팜유, 땅콩유, 대두유, 평지씨유, 아마인유, 미강유, 송유, 참깨유, 해바라기씨유, 전술한 공급원의 부분 및 완전 수소첨가된 오일, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 동물성 지방 및 오일, 예를 들어 대구 간 오일, 라놀린, 및 아세틸화 라놀린 및 이소프로필 라놀레이트와 같은 이의 유도체가 사용될 수 있다. 폴리프로필렌 글리콜의 C₄-C₂₀ 알킬 에테르, 폴리프로필렌 글리콜의 C₁-C₂₀ 카르복실산 에스테르, 및 디-C₈-C₃₀ 알킬 에테르가 또한 유용하며, 이들의 예에는, PPG-14 부틸 에테르, PPG-15 스테릴 에테르, 디옥틸 에테르, 도데실 옥틸 에테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다.

본 발명의 조성물에는 페트롤레이텀, 라놀린 및 라놀린 유도체, 스테롤(예를 들어, 에톡시화된 대두 스테롤), 고분자량 폴리부텐 및 코코아 버터와 같은 반고체 탄화수소가 실질적으로 없을 수 있다. 본원에 사용된 "실질적으로 없는"은, 반고체 탄화수소의 농도가 10% 미만 또는 5% 미만 또는 2% 미만 또는 0%임을 의미한다.

화장품 제형으로서의 재조합 실크 단백질

다양한 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 실크 화장품 또는 스킨케어 제품(예를 들어, 피부 또는 모발에 도포되는 용액)으로 컴파운딩될 것이다. 구체적으로, 재조합 실크 단백질은 재조합 실크 폴리펩타이드가 단량체 또는 덜 결정질인 형태로 베이스에 존재하는 화장품 또는 스킨케어 제품의 베이스로 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 재조합 실크 폴리펩타이드가 반결정질 형태로 베이스에 존재하는 화장품 또는 스킨케어 제품의 베이스로 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 재조합 실크 폴리펩타이드는 단량체 형태로 베이스에 존재하지 않는다.

대부분의 구현예에서, 화장품 제형은 물리적으로 안정하다. 이러한 구현예에서, 재조합 실크 단백질과 임의의 다른 성분은 연장된 기간 동안, 연장된 저장 수명으로 제형에 존재한다. 장기간 사용 시, 재조합 실크 조성물은 실질적으로 안정하게 유지되며, 성분은 제형에서 침전되지 않는다.

본 발명의 조성물은 대상의 피부, 손발톱, 모발 또는 점막과 조성물을 접촉시키는 방식으로 피부, 손발톱, 모발 또는 점막에 실크 단백질을 도포하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 인간 대상과 함께 사용된다.

대부분의 구현예에서, 화장품 제형은 화장품이 도포되는 대상 숙주에 비독성이거나 비알레르기성이다. 조직을 영구적으로 착색시키지 않고, 수성 세제를 이용한 통상의 세척에 의해 제거될 수 있는 모발 및 표피 접촉용 화장품 조성물을 제조하는 것이 또한 당업계에서 바람직하다.

다양한 구현예에서 논의된 고체, 필름, 에멀젼, 히드로겔 및 다른 재료는, 제형의 구현예 및 목적하는 효능에 따라, 다양한 습윤제, 연화제, 폐색제, 활성제 및 화장품 아쥬반트를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 담체로 기능한다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 피부, 모발 또는 손발톱과 표면에 하나 이상의 작용제를 전달하는 담체이다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물 중 가소제의 적합한 농도는 중량 기준으로, 1 중량% 내지 60 중량%, 10 중량% 내지 60 중량%, 10 중량% 내지 50 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 15 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량% 또는 15 중량% 내지 30 중량% 범위이다. 일부 구현예에서, 가소제는 글리세롤이다. 일부 구현예에서, 가소제는 트리에탄올아민, 트리메틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 수크로오스, 포화 지방산, 불포화 지방산이다.

물이 가소제로 사용되는 경우, 재조합 실크 조성물 중 물의 적합한 농도는 중량 기준으로, 5 중량% 내지 80 중량%, 15 중량% 내지 70 중량%, 20 중량% 내지 60 중량%, 25 중량% 내지 50 중량%, 19 중량% 내지 43 중량% 또는 19 중량% 내지 27 중량% 범위이다. 물이 또 다른 가소제와 조합으로 사용되는 경우, 이는 5 중량% 내지 50 중량%, 15 중량% 내지 43 중량% 또는 19 중량% 내지 27 중량% 범위로 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, 적합한 가소제는 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 물, 락트산, 아스코르브산, 인산, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트리에탄올아민, 산 아세테이트, 프로판-1,3-디올 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 가소제의 양은 재조합 실크 단백질의 순도와 상대적인 조성에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 고순도 분말은 가소제로 작용할 수 있는 저분자량 화합물과 같은 불순물을 적게 가질 수 있기 때문에, 더 높은 중량%의 가소제의 첨가를 필요로 한다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 습윤제 또는 연화제를 포함한다. 본원에 사용된 "습윤제"라는 용어는, 물 분자와 결합을 형성하는 흡습성 물질을 나타낸다. 적합한 습윤제에는, 비제한적으로, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 펜틸렌 글리콜, 트레멜라 추출물(tremella extract), 소르비톨, 디시안아미드, 소듐 락테이트, 히알루론산, 알로에 베라 추출물, 알파-히드록시산 및 피롤리돈카르복실레이트(NaPCA)가 포함된다.

본원에 사용된 "연화제"라는 용어는, 피부 표면의 갈리진 틈을 채우는 방식으로 피부에 부드럽거나 유연한 외관을 제공하는 화합물을 나타낸다. 적합한 연화제에는, 비제한적으로, 시어 버터, 코코아 버터, 스쿠알렌, 스쿠알란, 옥틸 옥타노에이트, 참깨유, 포도씨유, 올레산 함유 천연 오일(예를 들어, 스위트 아몬드유, 아르간유, 올리브유, 아보카도유), 감마 리놀레산 함유 천연 오일(예를 들어, 달맞이꽃유, 보리지유), 리놀레산 함유 천연 오일(예를 들어 홍화유, 해바라기유), 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.

"폐색제"라는 용어는, 피부 표면 상에 장벽을 형성하여 수분을 보유하는 화합물을 나타낸다. 일부 예에서, 연화제 또는 습윤제는 폐색제일 수 있다. 다른 적합한 폐색제는, 비제한적으로, 밀랍, 카누바 왁스, 세라미드, 식물성 왁스, 레시틴, 알란토인을 포함할 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 본원에 제시된 재조합 실크 조성물의 필름 형성 능력은, 재조합 실크 폴리펩타이드가 물 분자를 끌어당기는 작용을 하고 또한 습윤제로 작용하기 때문에, 수분 보유 장벽을 형성하는 폐색제를 만든다.

"활성제"라는 용어는, 스킨케어 제형 또는 자외선 차단제에서 공지된 유익한 효과를 갖는 임의의 화합물을 나타낸다. 다양한 활성제는, 비제한적으로, 아세트산(즉 비타민 C), 알파 히드록시산, 베타 히드록시산, 산화아연, 이산화티타늄, 레티놀, 니아신아미드, 다른 재조합 단백질(전장 서열 또는 하위서열 또는 "펩타이드"로 가수분해된 것), 구리 펩타이드, 쿠르쿠미노이드(curcuminoid), 글리콜산, 히드로퀴논, 코지산, l-아스코르브산, 알파 리포산, 아젤라산, 락트산, 페룰산, 만델산, 디메틸아미노에탄올(DMAE), 레스베라톨(resveratrol), 항산화제 함유 천연 추출물(예를 들어, 녹차 추출물, 소나무 추출물), 카페인, 알파 아르부틴, 코엔자임 Q-10 및 살리실산을 포함할 수 있다.

"화장품 아쥬반트"라는 용어는, 비제한적으로, 계면활성제, 유화제, 보존제 및 증점제를 포함하는 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 화장품을 생성하는 데 사용되는 다양한 다른 작용제를 나타낸다.

하기 기재되는 바와 같이, 다양한 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 분산 가능한 반고체 또는 겔 유사 구조를 형성할 수 있다. 재조합 실크 단백질이 스킨케어 제형으로 컴파운딩되는 다양한 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 피부 표면에서 분산 가능한 액체로 변환되는 겔 또는 필름과 같은 비가역적 3차원 구조를 형성할 수 있다.

다양한 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 물에 현탁되어("수성 현탁 단백질") 화장품 또는 스킨케어 제형에 혼입(즉, 컴파운딩)될 수 있는 필름, 겔 또는 베이스를 형성할 수 있다. 구현예에 따라, 수성 현탁 단백질 중 물에 대한 재조합 실크 단백질의 양은 재조합 실크 단백질 중 재조합 실크 폴리펩타이드 분말 대 첨가제의 상대적인 비에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 조성물은 중량 기준으로 재조합 실크 폴리펩타이드 분말을 10% 내지 33% 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 물 이외의 상이한 용매가 사용될 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 물에 현탁되어, 1% 내지 40%는 재조합 실크 단백질이고 60% 내지 99%는 물인 수성 현탁 단백질을 생성한다. 특정 구현예에서, 단백질 조성물은 물에 현탁되어, 10 중량%는 재조합 실크 폴리펩타이드 분말이고, 30 중량%는 첨가제이고, 60 중량%는 물인 수성 현탁 단백질을 생성한다. 특정 구현예에서, 단백질은 물에 현탁되어, 6 중량%는 재조합 실크 폴리펩타이드 분말이고, 18 중량%는 첨가제이고, 76 중량%는 물인 수성 현탁 단백질을 생성한다. 특정 구현예에서, 단백질은 물에 현탁되어, 10 중량%는 재조합 실크 폴리펩타이드 분말이고 90 중량%는 물인 수성 현탁 단백질을 생성한다.

구현예에 따라, 수성 현탁 단백질은 물에 재현탁되는 경우 선택적으로 가열 및 교반될 수 있다. 일부 구현예에서, 수성 현탁 단백질을 가열하고 교반하면 수성 현탁 단백질에서 재조합 실크 폴리펩타이드의 상 변환이 일어날 수 있다. 구체적으로, 수성 현탁 단백질을 가열하고 교반하면 원심분리에 의해 평가되는 3가지 별개의 상이 형성된다: 1) 원심분리 후 상청액과 구별되는 겔상; 2) 원심분리 후 상청액으로부터 여과될 수 있는 콜로이드상; 및 3) 상청액으로부터 콜로이드상을 여과한 후 남는 용액상. 가열, 교반 및 원심분리의 다양한 조합이 사용될 수 있으며, 단, 수성 현탁 단백질은 재조합 실크 폴리펩타이드의 분해를 방지하기 위해 장기간 열에 적용되지 않아야 한다. 특정 구현예에서, 단백질은 90℃에서 5분 동안 약한 교반에 적용되고, 16,000 RCF로 30분 동안 원심분리된다.

다양한 구현예에서, 수성 현탁 단백질의 다양한 상(즉, 콜로이드상, 겔상 및 용액) 또는 수성 현탁 단백질은 재조합 실크 단백질의 공급원을 제공하기 위해 화장품 또는 스킨케어 제형에 혼입될 수 있다. 구현예에 따라, 수성 현탁 단백질은 스킨케어 제형에 혼입되기 전 가열 유무 하에 교반에 적용될 수 있다. 선택적으로, 수성 현탁 단백질은 원심분리 및/또는 여과에 의해 상기 논의된 상에서 분리될 수 있다. 구현예에 따라, 스킨케어 제형은 에멀젼(예를 들어, 크림 또는 세럼) 또는 주로 수용액(예를 들어, 겔)일 수 있다. 특정 구현예에서, 재조합 실크 단백질은 수성 재현탁 없이 상기 논의된 화장품, 스킨케어 또는 헤어케어 제형 중 임의의 것에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물에서, 재조합 실크 단백질이 조성물에서 균일하게 분배되는 것을 보장하기 위해 균질화기 또는 유사한 장비가 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 수성 현탁 단백질은 가열 및 교반에 적용된 후, 편평한 표면 상에 캐스팅되고 필름으로 건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 수성 현탁 단백질은 가열 및/또는 교반에 적용되지 않고, 편평한 표면 상에 캐스팅되고 필름으로 건조될 수 있다. 이러한 구현예에서, 수성 현탁 단백질은 추가 처리에 적용되지 않고, 편평한 표면 상에 캐스팅되고 필름으로 건조될 수 있다. 일부 구현예에서, 수성 현탁 단백질은 에멀젼에 혼입된 후, 편평한 표면 상에 캐스팅되고 필름으로 건조될 수 있다. 구현예에 따라, 다양한 상이한 건조 조건이 사용될 수 있다. 적합한 건조 조건은 진공 유무 하 60℃ 또는 80℃에서의 건조를 포함한다. 진공을 사용하는 구현예에서, 15 Hg이 적합한 진공 양이다. 다른 건조 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다.

다양한 구현예에서, 수성 현탁 단백질만 포함하는 필름은 용융 온도가 낮다. 다양한 구현예에서, 수성 현탁 단백질만 포함하는 필름은 체온보다 낮고(약 34℃내지 36℃피부와 접촉 시 용융되는 용융 온도를 갖는다. 이론에 제한됨 없이, 재조합 실크 폴리펩타이드는 반고체 구조(즉, 필름)를 만들기에 충분한 분자간 상호작용을 형성하지만, 이러한 구조는 피부 접촉 시 가역적이며, 피부 표면에 분산된 후 재형성될 수 있다. 다양한 구현예에서, 필름은 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR: Fourier-transform infrared spectroscopy)으로 측정 시, 재조합 실크 단백질 또는 재조합 실크 분말에 비해 감소된 결정화도를 가질 것이다. 다양한 구현예에서, 수성 현탁 단백질을 포함하는 필름은 피부와 접촉 시 용융되지 않는다. 이러한 구현예에서, 필름은 장벽으로 기능한다. 다양한 구현예에서, 필름은 저밀도의 소수성 필름이다. 필름 또는 장벽의 두께는 약 1 μm 내지 약 50 μm, 약 10 μm 내지 약 30 μm, 또는 약 20 μm 내지 약 40 μm 범위일 수 있다. 피부와 접촉 시, 장벽은 표피층의 표면에 형성되어, 피부 표면에 견고하고 비특이적인 부착을 구현할 수 있다. 일부 구현예에서, 필름의 두께는 재조합 실크 단백질의 농도와 적용 표면적에 따라 변한다.

일부 구현예에서, 장벽은 오래 지속되며, 바람, 습도, 강력한(harsh) 첨가제, 오염, 마모, 먼지 및 기름(grease)을 포함하는 하나 이상의 환경적 스트레스 요인을 막는다. 장벽은 손으로 적어도 100회 문지름, 적어도 200회 문지름, 적어도 400회 문지름, 적어도 600회 문지름 또는 적어도 800회 문지름과 동등한 마모를 견딜 수 있다.

하나의 특정 구현예에서, 수성 현탁 단백질 또는 단백질을 에멀젼에 혼입(예를 들어, 균질화)한 후, 편평한 표면 상에 캐스팅하고 동결건조시켜 다공성 필름을 형성할 수 있다. 구현예에 따라, -80℃에서 30분 동안 필름을 동결시키는 것을 포함하는 다양한 기술이 동결건조에 사용될 수 있다. 다른 동결건조 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

다양한 구현예에서, 상기 기재된 필름은 국소 스킨케어 작용제로 사용될 수 있다. 이러한 필름은 피부에 직접 도포될 수 있으며, 재수화되어 피부에 혼입되는 분산 가능한 점성 물질을 형성할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 다양한 연화제, 습윤제, 활성제 및 다른 화장품 아쥬반트가 필름에 혼입될 수 있다. 이러한 필름은 피부에 직접 도포되어, 피부와의 접촉으로 인해 또는 피부에 필름을 가볍게 문지른 후에 피부에 흡착될 수 있다. 일부 구현예에서, 필름은 피부에 직접 도포되어, 추가의 문지름 또는 접촉 없이 피부에 흡착될 수 있다. 일부 구현예에서, 수용액에 재현탁된 단백질은 얼굴에 도포된 후, 미스트를 통해 프로필렌 글리콜과 같은 응고제에 노출되어 겔화 가능한 마스크를 형성할 수 있다.

구현예에 따라, 캐스팅되는 필름은 편평한 필름(즉, 표면 가변성이 없음)일 수 있거나 미세구조를 포함하는 몰드 상에 캐스팅될 수 있다. 특정 구현예에서, 피부의 표면을 찔러 활성제의 전달을 돕기 위해 미세바늘 구조 단백질을 포함하는 몰드 상에 캐스팅되는 필름.

대안적인 구현예에서, 수성 현탁 단백질은 화장품으로 사용되는 에멀젼에 첨가될 수 있다. 에멀젼은 피부 또는 모발에 도포된 후, 건조 시 피부의 표면 상에 필름을 형성할 수 있다. 하기 논의되는 바와 같이, 다양한 연화제, 습윤제, 활성제 및 다른 화장품 아쥬반트가 에멀젼에 혼입될 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 크림, 로션 및 겔과 같은 액체 또는 반고체일 수 있다. 본 발명의 주제에 유용한 조성물은 당업계에 공지된 매우 다양한 제품 형태로 제조될 수 있다. 이에는, 비제한적으로, 분말, 로션, 크림, 겔, 패치, 세럼, 앰풀, 분말, 스틱, 스프레이, 연고, 페이스트, 무스, 연고, 액체, 에멀젼, 발포체 또는 에어로졸이 포함된다. 이러한 제품 형태는 하기 추가로 논의되는 바와 같이, 비제한적으로, 용액, 에어로졸, 에멀젼, 겔, 고체 및 리포좀을 포함하는 몇 가지 유형의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에서 활성인 화합물은 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 국소적으로 전달될 수 있다.

일부 다른 구현예에서, 재조합 실크 조성물은 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 페이셜 클렌저, 팩 및 바디 오일과 같은 기본 화장품 조성물, 파운데이션, 립스틱, 마스카라 및 메이크업 베이스와 같은 색조 화장품 조성물, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너 및 헤어 젤, 비누와 같은 모발 제품 조성물 등일 수 있다. 화장품 제형은 선택적으로 화장품 조성물 제조 분야에서 통상적으로 사용되는 적어도 하나의 담체 및/또는 첨가제와 함께, 본원에 기재된 재조합 실크 조성물을 사용하여 당업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 적어도 하나의 화장제(cosmetic agent)를 포함한다. 화장제의 예에는, 연화제, 습윤제, 착색제, 안료, 방향제, 보습제, 점도 조절제 및 임의의 다른 화장품 형성제가 포함된다. 하나 이상의 화장제가 화장품 조성물에 포함될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비제한적으로, 피부 연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제 및 증점제를 포함하는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 추가 활성 성분이 또한 사용될 수 있다. 또한, 화장품 조성물은 향수, 안료, 항균제, 항산화제, 보존제 및 보습제와, 물리적 특성을 개선시키고자 하는 목적으로 무기 염 및 합성 중합체 물질을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 또한 로션을 통해 국소적으로 전달될 수 있다. 수중유 유형 및 유중수 유형의 로션 및 크림과 같은 단일 에멀젼 스킨케어 제제가 화장품 분야에 널리 공지되어 있으며, 본 발명에 유용하다. 수중유중수 유형과 같은 다중상 에멀젼 조성물이 또한 본 발명에 유용하다. 일반적으로, 이러한 단일 또는 다중상 에멀젼은 필수 성분으로 물, 연화제 및 유화제를 함유한다.

본 발명의 조성물은 또한 고체 제형(예를 들어, 왁스 기반 스틱, 비누 바 조성물, 분말, 비드, 각질제거제, 또는 액체 또는 분말 함유 와이프)으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 겔(예를 들어, 적합한 겔화제(들)를 사용한 수성 겔)로 제형화될 수 있다. 수성 겔에 적합한 겔화제에는, 비제한적으로, 천연 검, 아크릴산 및 아크릴레이트 중합체 및 공중합체, 및 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 히드록시메틸 셀룰로오스 및 히드록시프로필 셀룰로오스)가 포함된다. 오일(예컨대, 미네랄 오일)에 적합한 겔화제에는, 비제한적으로, 수소첨가된 부틸렌/에틸렌/스티렌 공중합체와 수소첨가된 에틸렌/프로필렌/스티렌 공중합체가 포함된다. 이러한 겔은 전형적으로 이러한 겔화제를 약 0.1 중량% 내지 5 중량% 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물에는 재조합 실크 단백질, 물(수성), 소듐 C14-16 올레핀 설포네이트, 글리세린, 코코아 베타인, 소듐 벤조에이트, 수산화소듐, 칼슘 글루코네이트, 소듐 히알루로네이트, 프로판디올, 잔탄검, 글루코노락톤 및 테트라소듐 글루타메이트 디아세테이트의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 조성물은 세정 세제, 비누, 세럼 또는 토너를 포함한다. 특정 구현예에서, 세럼은 수성 기반이다. 또 다른 특정 구현예에서, 토너는 알코올 기반이다.

본 발명에 유용한 조성물은 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 조성물이 에멀젼인 경우, 조성물의 약 1% 내지 약 10% 또는 약 2% 내지 약 5%는 유화제로 구성된다. 유화제는 비이온성, 음이온성 또는 양이온성일 수 있다. 적합한 유화제는, 예를 들어 문헌[INCI Handbook, pp. 1673-1686]에 개시되어 있다. 로션과 크림은 에멀젼으로 제형화될 수 있다.

또 다른 유형의 조성물은 연고일 수 있다. 연고는 동물성 또는 식물성 오일, 또는 반고체 탄화수소의 단순한 베이스를 포함할 수 있다. 연고는 약 0.1% 내지 약 2%의 증점제에 더하여 약 2% 내지 약 10%의 연화제를 포함할 수 있다. 증점제의 예에는, 셀룰로오스 유도체(메틸 셀룰로오스 및 히드록실 프로필메틸셀룰로오스), 합성 고분자량 중합체(예를 들어, 카르복시비닐 중합체 및 폴리비닐 알코올), 식물성 히드로콜로이드(예를 들어, 카라야검 및 트래거캔스검), 점토 증점제(예를 들어, 콜로이드 마그네슘 알루미늄 실리케이트 및 벤토나이트), 카르복시비닐 중합체, 카르복실산 중합체, 가교된 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 잔탄검, 및 이들의 혼합물이 포함된다.

본 발명에 유용한 조성물은, 상기 언급된 구성요소에 더하여, 피부, 모발 및 손발톱에 사용하기 위한 조성물에 당업계에 확립된 수준으로 통상적으로 사용되는 매우 다양한 추가의 유용성 재료 및/또는 수용성 재료를 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부에 직접 도포될 수 있거나, 와이프, 스폰지, 브러쉬 등과 같은 다른 전달 도구 상에 도포될 수 있다. 상기 조성물은 피부에 남거나, 피부에서 닦아내거나, 피부에서 씻어내도록 고안된 제품에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 피부 탱탱함/팽팽함 증가, 탄력 증가, 전반적인 피부 건강 개선, 수분 공급 증가, 상처 치유 촉진 및/또는 개선, 오염 방어 개선, 피부 노화 감소, 피부 취약성 감소, 콜라겐 및/또는 엘라스틴 손실 방지 및 역전, 피부 위축 방지, 세포 교체 촉진/가속화, 유전자 발현 증가, 피부 감촉 개선, 잔주름 및 주름살 예방 및 감소, 피부톤 개선, 피부 두께 증강, 모공 크기 감소, 피부 착색 최소화, 피부 광택 회복, 피로 징후 최소화, 피부 장벽 기능 개선, 피부 건조 최소화, 과다색소침착 예방, 감소 또는 치료, 피부의 미토콘드리아 기능 개선, 각질제거 개선, 독성 감소, 피부 매트화, 산화 스트레스 수준 감소, 오염 유도 산화 스트레스 약화, UVA 또는 UVB 유도 산화 스트레스 약화, 및 이들의 임의의 조합과 같이 피부의 외관을 개선시킨다.

다양한 구현예의 조성물은 오염물 및 다른 자극물에 대해 방어한다. 그 결과, 여드름, 장미증(성인 여드름)과 관련된 발적, 및 다른 염증성 병태와 같은 다수의 피부 상태가 화장품 제형의 도포에 의해 능동적으로 관리될 수 있다.

응고제

일부 구현예에서, 본원에서 제조된 실크 기반 조성물은 응고제에 노출된다. 이는 실크 기반 조성물에서 실크의 제어된 응집을 용이하게 하도록 조성물의 특성을 변화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 응고제에 액침된다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 응고제 미스트 또는 증기에 노출된다. 하나의 구현예에서, 수성 단백질 조성물은 응고제를 포함하거나 응고제에 액침되거나 응고제와 혼합된다. 일부 구현예에서, 필름과 같은 실크 기반 고체 또는 반고체는 응고제를 포함하는 증기에 액침되거나 이에 노출된다. 일부 구현예에서, 메탄올은 효과적인 응고제로 사용된다.

일부 구현예에서, 이소프로판올, 에탄올 또는 메탄올과 같은 알코올이 응고제 또는 용매로 사용된다. 일부 구현예에서, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 알코올이 응고제로 사용된다. 일부 구현예에서, 암모늄 설페이트, 소듐 클로라이드, 소듐 설페이트, 또는 20℃내지 60℃의 온도에서 효과적으로 염을 침전시키는 다른 단백질과 같은 염이 응고제로 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 비제한적으로, 하기 부류의 화학물질을 포함하는 물, 산, 용매 및 염 중 하나 이상의 조합이 응고제로 사용될 수 있다: 브뢴스테드 로우리(Bronsted-Lowry) 산, 루이스 산, 이원 수소화물 산, 유기 산, 금속 양이온 산, 유기 용매, 무기 용매, 알칼리 금속 염 및 알칼리 토금속 염. 일부 구현예에서, 산은 희석된 염산, 희석된 황산, 포름산 또는 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, t-부틸 알코올, 에틸 아세테이트, 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 LiCl, KCl, BeCl₂, MgCl₂, CaCl₂, NaCl, ZnCl₂, FeCl₃, 암모늄 설페이트, 소듐 설페이트, 소듐 아세테이트, 및 니트레이트, 설페이트 또는 포스페이트의 다른 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 응고제의 pH는 2.5 내지 7.5이다.

다른 첨가제

일부 구현예에서, 본원에서 제조된 실크 기반 조성물은 다른 첨가제에 노출된다. 이는 피부와 상호작용함에 따라 조성물의 특성을 변화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 첨가제에 액침된다. 일부 구현예에서, 실크 기반 조성물은 첨가제 미스트 또는 증기에 노출된다. 하나의 구현예에서, 수성 단백질 조성물은 첨가제를 포함하거나 첨가제에 액침되거나 첨가제와 혼합된다. 일부 구현예에서, 필름과 같은 실크 기반 고체 또는 반고체는 첨가제를 포함하는 증기에 액침되거나 이에 노출된다. 일부 구현예에서, 실크 기반 겔은 중공 분말 형성(예를 들어 실크 기반 겔과 첨가제가 함께 동시 분무 건조됨) 전 첨가제에 노출된다.

첨가제는 그 자체가 불활성이거나, 그 자체로 피부학적 이점을 보유할 수 있다. 첨가제는 본원에 기재된 필수 구성요소와 물리적으로 및 화학적으로 상용 가능해야 하며, 본 발명의 조성물과 관련된 안정성, 효능 또는 다른 사용 이점을 과도하게 손상시키지 않아야 한다. 본 발명에 이용되는 첨가제의 유형은 조성물에 대해 목적하는 제품 형태의 유형에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 첨가제는 산성 직물 염료이다.

피부에의 도포를 위한 목적하는 색상을 달성하기 위해 안료가 흔히 화장품 제형에 첨가된다. 이러한 안료는 공지되어 있으며, 목적하는 착색을 달성하는 데 필요한 농도는 용이하게 결정 가능하다. 안료는 무기 또는 유기일 수 있다. 무기 안료에는, 산화철(적색, 흑색, 갈색 색상), 망간 바이올렛, 울트라마린(녹색, 청색, 분홍색, 적색 또는 보라색 알루미늄 설포실리케이트), 아쿠아마린, 구리 분말, 마이카, 점토, 실리카 및 이산화티타늄이 포함된다. 화장품용으로 US FDA에서 승인된 유기 염료는 일반적으로 접두사 "D&C" 와 색상 및 번호의 접미사를 갖는다(예를 들어, D&C Green #3).

본 발명의 특정 구현예는 무수 안료 중량 기준으로, 착색제를 약 0% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 15% 또는 약 5% 내지 약 15% 함유한다. 이들은 통상적으로 알루미늄, 바륨 또는 칼슘 염 또는 플레이크이다. 염료는 약 0% 내지 약 3%의 농도로 존재할 수 있으며, 펄화제(pearlizing agent) 등은 0% 내지 약 10%의 농도로 존재할 수 있다. 재조합 실크 단백질과 조합된 이러한 염료는 안정하며, 긴 저장 수명을 갖는다. 이러한 조성물의 저장 수명은 약 6개월, 약 1년 또는 약 2년일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조성물의 저장 수명은 적어도 5년일 수 있다.

상기 조성물에 사용되는 안료, 착색제 또는 충전제 분말에 대한 특정한 제한은 없다. 각각은 체질 안료, 무기 백색 안료, 무기 유색 안료, 펄화제 등일 수 있다. 특정예는 탈크, 마이카, 마그네슘 카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 마그네슘 실리케이트, 알루미늄 마그네슘 실리케이트, 실리카, 이산화티타늄, 산화아연, 적색 산화철, 황색 산화철, 흑색 산화철, 울트라마린, 폴리에틸렌 분말, 메타크릴레이트 분말, 폴리스티렌 분말, 실크 분말, 결정질 셀룰로오스, 전분, 티탄화 마이카, 산화철 티탄화 마이카, 비스무트 옥시클로라이드 등이다.

추가의 안료/분말 충전제에는, 비제한적으로, 무기 분말, 예컨대 검, 초크, 산성 백토(Fuller's earth), 카올린, 세리사이트(sericite), 무스코바이트(muscovite), 플로고파이트(phlogopite), 합성 마이카, 레피돌라이트(lepidolite), 비오타이트(biotite), 리티아(lithia) 마이카, 베르미쿨라이트(vermiculite), 알루미늄 실리케이트, 전분, 스멕타이트(smectite) 점토, 알킬 및/또는 트리알킬 아릴 암모늄 스멕타이트, 화학적으로 개질된 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 유기 개질된 몬모릴로나이트 점토, 수화된 알루미늄 실리케이트, 발연 알루미늄 전분 옥테닐 석시네이트 바륨 실리케이트, 칼슘 실리케이트, 마그네슘 실리케이트, 스트론튬 실리케이트, 금속 텅스텐, 마그네슘, 실리카 알루미나, 제올라이트, 바륨 설페이트, 소성된 칼슘 설페이트(소성된 석고), 칼슘 포스페이트, 플루오린 아파타이트, 히드록시아파타이트, 세라믹 분말, 금속 비누(아연 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 아연 미리스테이트, 칼슘 팔미테이트 및 알루미늄 스테아레이트), 콜로이드 이산화실리콘, 및 보론 니트라이드; 유기 분말, 예컨대 폴리아미드 수지 분말(나일론 분말), 시클로덱스트린, 메틸 폴리메타크릴레이트 분말, 스티렌과 아크릴산의 공중합체 분말, 벤조구안아민 수지 분말, 폴리(에틸렌 테트라플루오라이드) 분말 및 카르복시비닐 중합체, 셀룰로오스 분말(예컨대, 히드록시에틸 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스), 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트; 무기 백색 안료, 예컨대 산화마그네슘이 포함된다. 다른 유용한 분말은 1997년 11월 18일자 허여된 미국 특허 제5,688,831호(El-Nokaly et al.)에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이러한 안료와 분말은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.

실크 단백질 이외에, 본 발명에 따른 조성물은 필름 형성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 필름 형성물질의 예에는, 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 아크릴계 중합체 또는 공중합체, 아크릴, 스티렌, 아크릴레이트-스티렌 및 비닐 수지, 비닐 공중합체, 폴리에스테르 중합체, 아릴설폰아미드 수지 및 알키드 수지가 포함된다.

일부 구현예에서, 상기 조성물은 양쪽성 계면활성제, 인지질 또는 왁스를 포함할 수 있다.

다른 첨가제의 예에는, 비제한적으로, 칸나비디올(cannabidiol), 발포성 계면활성제, 탈색제, 반사제, 엉킴 방지제/습식 빗질제(combing agent), 아미노산 및 이의 유도체, 항미생물제, 알레르기 저해제, 여드름 방지제, 노화 방지제, 주름살 방지제, 소독제, 진통제, 진해제, 항가려움제, 국소 마취제, 탈모 방지제, 모발 성장 촉진제, 모발 성장 저해제, 항히스타민제, 항감염제, 염증 저해제, 항구토제, 항콜린제, 혈관 수축제, 혈관 확장제, 상처 치유 촉진제, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질, 탈취제 및 발한 억제제, 약제, 피부 연화제 및 피부 보습제, 피부 탄력제, 헤어 컨디셔너, 모발 연화제, 모발 보습제, 비타민, 태닝제, 피부 미백제, 항진균제, 제모제, 면도제, 외용 진통제, 향수, 항자극제, 치질 치료제, 살충제, 포이즌 아이비 제품, 포이즌 오크 제품, 화상 제품, 기저귀 발진 방지제, 땀띠 작용제, 메이크업 제제, 비타민, 허브 추출물, 레티노이드, 플라보노이드, 센세이트(sensate), 항산화제, 피부 컨디셔너, 모발 미백제, 킬레이트제, 세포 교체 증강제, 자외선 차단제, 항부종제, 콜라겐 증강제, 및 이들의 혼합물이 포함된다.

적합한 비타민의 예에는, 비배타적으로, 티아민, 니코틴산, 비오틴, 판토텐산, 콜린, 리보플라빈, 비타민 B6, 비타민 B12, 피리독신, 이노시톨, 카미틴을 포함하는 비타민 B 복합체; 비타민 A, C, D, E, K 및 이들의 유도체, 예컨대 비타민 A 팔미테이트, 및 프로비타민, 예를 들어 (즉, 판테놀(프로비타민 B5) 및 판테놀 트리아세테이트), 및 이들의 혼합물이 포함된다.

자외선 차단제의 예에는, 비제한적으로, 아보벤존(avobenzone), 벤조페논, 보르넬론(bornelone), 부틸 파바(butyl paba), 신나미도프로필 트리메틸 암모늄 클로라이드, 디소듐 디스티릴바이페닐 디설포네이트, 파바, 포타슘 메톡시신나메이트, 부틸 메톡시디벤조일메탄, 옥틸 메톡시신나메이트, 옥시벤존, 옥토크릴렌, 옥틸 살리실레이트, 페닐벤즈이미다졸 설폰산, 에틸 히드록시프로필 아미노벤조에이트, 멘틸 안트라닐레이트, 아미노벤조산, 시녹세이트(cinoxate), 디에탄올아민 메톡시신나메이트, 글리세릴 아미노벤조에이트, 이산화티타늄, 산화아연, 옥시벤존, 파디메이트 O(Padimate O), 적색 페트롤레이텀, 및 이들의 혼합물이 포함된다.

재조합 실크 조성물과 조합되는 첨가제의 양은, 예를 들어 피부, 모발 또는 손발톱을 통해 침투하는 첨가제의 능력, 선택된 특정 첨가제, 목적하는 특정 이점, 첨가제에 대한 사용자의 민감성, 사용자의 건강 상태, 연령, 및 피부, 모발, 및/또는 손발톱 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 요약하면, 첨가제는 목적하는 피부, 모발 또는 손발톱 유익을 전달하거나 치료하고자 하는 특정 상태를 변형시키기에 충분히 높지만, 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 합리적인 위험 대 유익 비율로 심각한 부작용을 회피하기에 충분히 낮은 양인, "안전하고 효과적인 양"으로 사용된다.

본원에 예시적으로 개시된 본 발명은 적합하게는 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 구성요소, 성분 또는 단계의 부재 하에서 실시될 수 있다. 본 발명의 특성 및 본 발명을 수행하는 방식을 추가로 예시하기 위해 몇 가지 실시예가 하기에 제시되어 있다. 하지만, 본 발명은 이의 세부사항에 제한되는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예

실시예 1: 재조합 18B 폴리펩타이드 분말 형태

FLAG 태그를 갖는 재조합 18B 폴리펩타이드(서열번호 1)를 다양한 대규모 발효 로트를 통해 생산하고, 회수하고, 분말로 건조시켰다. 샘플 제조에 대한 세부사항은 하기에 제시된다.

구체적으로, "Methods and Compositions for Synthesizing Improved Silk Fibers"라는 발명의 명칭의 국제 공개공보 WO/2015/042164(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 개시된 바와 같이 유전자 변형된 효모 세포로 재조합 18B 폴리펩타이드를 생산하고, 호기성 발효기에서 배양하였다. 본 실시예에서, 사용된 발효기의 용적은 3,000 L 내지 26,000 L 범위였다. 72시간 동안 발효를 실행하였으며, 이러한 공정에는 배치 단계가 처음 5시간 내지 8시간 동안 30℃로 유지된 후, 글루코오스 공급이 시작될 때 25℃로 떨어지는 온도 변화가 있었다. 발효 공정은 15 g/L의 배치 글루코오스로 시작되었으며, 이는 처음 5시간 내지 8시간 내에 소비되었다. 글루코오스가 고갈된 후, 산소 흡수율(OUR)이 115 mmol O₂/L/h에 이를 때까지 지수적 공급을 작동시켰다. 이어서, OUR을 115 mmol O₂/L/h 내지 120 mmol O₂/L/h로 유지시키기 위해 공급 속도를 이에 맞춰 조정하였다. 호흡 지수(respiratory quotient)를 약 1.02로 유지시키는 방식으로 에탄올 축적을 제한하였다. 또한, 용존산소도 교반 캐스케이드를 이용하여 5% 포화로 제어하였다. 72시간 발효 후, 사멸한 효모와 이의 대사산물이 포함된 소비된 배지와 함께 18B 폴리펩타이드가 함유된 전체 세포 브로쓰(WCB: whole cell broth)가 생성되었다. 8 M 우레아를 WCB와 조합하여 18B 폴리펩타이드를 수성상에 용해시켰다. 이어서, 원심분리를 통해 수성상을 세포로부터 분리하였다. 용해된 실크 단백질이 함유된 농축물을 농축시키고, 한외여과로 세척하여 우레와 일부 불순물을 제거하였다. 단백질을 10 wt% 소듐 설페이트 용액을 사용하여 2개의 침전 단계로 추가로 정제하였다. 각각의 경우, 표적 단백질을 침전시킨 후, 무거운 상에서 원심분리를 통해 회수하였다. 염을 세척해내고, 단백질을 한외여과 또는 미세여과를 통해 농축시켜 물 중 단백질 고체 슬러리를 생성하였다. 이어서, 슬러리를 최종 18B 분말 형태로 분무 건조시켰다.

분무 건조는 하기와 같이 수행하였다: 냉각된 농축물을 2-유체 또는 공압 노즐을 통해 장형 분무 건조기에 공급하였다. 미립화된 단백질 슬러리를 고온의 건조한 공기와 병류로 건조시키고, 대부분의 단백질 분말을 사이클론에 수집하였다. 사이클론의 외부 온도는 99℃± 2℃로 상대 습도는 <12%로 제어하였다. 이러한 조건은, 사이클론에 수집된 분말이 3 wt% 이하의 수분을 보유하게 하였다. 사이클론에서 포획되지 않은 분말은 백하우스(baghouse)에 수집되었다.

건조기의 작동 매개변수는 수율을 최적화하고, 20 μm 초과 내지 50 μm 미만의 입자 크기 중앙값을 생성하도록 제어하였다. 이러한 매개변수에는, 비제한적으로, 분무화 노즐에서의 공기 대 액체 공급비(ALR), 열풍 주입구 온도 및 유속, 및 농축물의 고체 농도가 포함된다. 목표 매개변수에서 벗어나면, 불충분한 건조, 건조기 벽 상의 증착으로 인한 유의한 분말 손실, 또는 백하우스로의 유의한 분말 손실이 초래될 수 있다.

사이클론 후, 분말을 60-메쉬 체를 통과시켜 큰 입자를 제거한 후, 최종 생성물로 수집하였다. 분말을 냉각시키는 동안 습한 주변 공기에의 노출을 최소화하도록 주의를 기울였다.

백하우스에서 수집된 분말은 종종 수분 함량이 일반적으로 3% 초과이고 18B 단백질 함량이 낮다는 점에서 사이클론에 비해 불충분한 품질이었다. 따라서, 백하우스 분말을 사이클론 생성물과 별도로 수집하였다.

도 1a에 제시된 바와 같이, 건조 및 수화된 상태의 18B 분말은 중공 입자로 존재한다. 이러한 형태는 주사 전자 현미경(SEM)과 광학/편광 현미경 둘 모두에 의해 입증되었다. SEM은 2차 전자를 통해 재료의 형태를 평가하기 위해 초점 전자 빔을 사용하였다. 1 mm 내지 10 nm의 스케일 또는 10X 내지 100,000X의 배율로 현미경 사진을 수집하기 위해 전자 빔을 점방식(raster) 패턴으로 스캐닝하였다. SEM 방법은 저진공(1 torr 내지 10 torr)을 사용하여, 생물학적 샘플을 탈수시키거나 스퍼터 코팅할 필요성을 없앴다.

분말 형태를 조사하기 위해 편광 광학 현미경을 또한 사용하였다. 4X 대물렌즈가 장착된 Leica DM750P 편광 현미경을 사용하여 광학 및 편광 이미지를 얻었다. 현미경을 보조 PC 기반 이미지 분석 Leica Application Suite, LAS V4.9에 연결하였다. 편광 현미경의 경우, 분석기/Bertrand 렌즈 모듈은 모듈의 하단 로커를 우측으로 플리핑(flipping)하는 방식으로 연결하였지만("A" 위치/분석기 인(in)), 분석기/Bertrand 렌즈 모듈의 상단 로커는 좌측에 플리핑하였다("O" 위치/Bertrand 렌즈 아웃(out)). 이러한 설정은, 편광자와 분석기를 통과하는 광의 허용된 진동 방향이 90°로 향하는 광학 정렬 상태인 "교차 편광 모드"에서의 분석을 가능하게 하였다.

도 1a는, 건조 상태에서 온전한 및 깨진 분말 입자의 SEM 이미지를 보여준다. 분말 입자가 깨져 열렸을 때, 가시적인 중공 코어와 얇은 막인 외부 쉘이 드러났다. 온전한 분말 입자의 직경은 대략 100 μm였다.

도 1b는, 수화된 상태에서 18B 분말의 중공 쉘 형태의 광학 및 편광 현미경 이미지를 보여준다. 분말 입자의 외부 가장자리에서만 몰타 십자(maltese cross)가 관찰되었다. 고체 입자는 분말 입자의 전체 두께에 걸쳐 몰타 십자를 나타낼 것이다.

18B 분말의 분해를 평가하기 위해, 18B 분말을 다양한 용매에 적용하였다. 18B 분말은 육안 검사와, 크기 배제 크로마토그래피(HPLC-SEC) 및 역상 HPLC(RP-HPLC)로 측정 시, 물에 불용성이었다. 본 실시예에서, 18B 분말은 용매에 1 wt% 내지 10 wt%로 분산되었다. 용액을 22℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 16,000 RCF로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 분말을 펠릿화하였다. 펠릿에서 상청액을 부어 버렸다. 상청액과 펠릿을 모두 HPLC-SEC와 역상 HPLC를 이용하여 18B 분말 함량을 측정하였다. HPLC-SEC의 경우, 샘플을 5 M 구아니딘 티오시아네이트에 용해시키고, Yarra SEC-3000 SEC-HPLC 컬럼에 주입하여 분자량을 기준으로 구성요소를 분리하였다. 검출 양식으로 굴절률을 사용하였다. 18B 응집물, 18B 단량체, 저분자량(1 kDa 내지 8 kDa) 불순물, 중간 분자량 불순물(8 kDa 내지 50 kDa) 및 고분자량 불순물(110 kDa 내지 150 kDa)을 정량화하였다. 관련 조성을 질량%와 면적%로 보고하였다. 모든 단백질의 >90%가 서로 약 7% 이내의 dn/dc 값(굴절률의 반응 인자)을 나타내었다는 가정 하에, BSA를 일반 단백질 표준물로 사용하였다. 폴리(에틸렌 옥시드)를 머무름 시간 표준물로 사용하였고, BSA 교정기를 방법의 일관된 수행을 보장하기 위한 확인 표준물로 사용하였다. 그 결과, 18B 분말은 물에 불용성이었다.

역상 고성능 액체 크로마토그래피("RP-HPLC")를 사용하여 분말 중 18B 폴리펩타이드 단량체의 중량 기준 양을 측정하였다. 샘플을 5 M 구아니딘 티오시아네이트(GdSCN) 시약을 사용하여 용해시키고, Agilent Poroshell 300SB C3 2.1x75 mm 5 μm 컬럼에 주입하여 소수성을 기준으로 구성요소를 분리하였다. 검출 양식은 215 nm(360 nm 기준)에서의 펩타이드 결합의 UV 흡광도였다. 18B-FLAG 분말 표준과 비교하여 18B-FLAG 단량체의 샘플 농도를 결정하였으며, 여기서 18B-FLAG 단량체 농도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 사용하여 이전에 결정되었다. 높은 수준의 분해되지 않은 18B 단량체가 관찰되었다.

실시예 2: 다양한 용매에서의 재조합 18B 폴리펩타이드 분말의 팽창

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말은, 분말을 분산시키는 데 사용되는 용매에 따라 상이한 팽창 또는 팽윤을 나타냈다. 18B 분말은 수성 용매, 오일 또는 실리콘을 포함하는 다양한 용매에 분산될 수 있다.

분말 입자는 분말을 분산시키는 데 사용되는 용매에 따라 팽윤의 차이를 나타냈다. 도 2a는, 용매가 없는 18B 분말과 비교하여, pH 6의 물과 글리세린 포함하는 다양한 상이한 용매 중에 재현탁된 18B 분말의 광학 현미경 이미지를 보여준다. 상이한 용매 중에 18B 분말을 1 wt% 수준으로 현탁시켜 광학 현미경 이미지를 얻었다. 용액을 제조하기 위해, 분말을 저울 위에 모아 놓은 후, 50 mL 원추형 튜브와 같은 혼합 용기에 부었다. 이어서, 피펫을 사용하여 용매를 분말 위에 분배하였다. 이어서, 혼합 용기를 수동으로, 볼텍싱으로 또는 플래너터리 혼합기(planetary mixer)를 이용하여 격렬하게 진탕시켰다. 18B 분말 현탁액의 점적액을 유리 슬라이드 상에 로딩하고, 유리 커버슬립을 덮었다. 10X 대물렌즈가 장착된 Leica DM750P 광학 현미경을 사용하여 광학 현미경 이미지를 얻었다. 현미경을 보조 PC 기반 이미지 분석 Leica Application Suite, LAS V4.9에 연결하였다.

도 2b는, 건조 상태의 18B 분말과 수용액에의 노출 후 18B 분말의 사진을 보여준다. 18B 분말은 현저하게 팽창되어, 물에서 자체 중량의 약 6배 내지 10배에 달하였다. 분말 직경%의 정량화 또한 물에서 증가하였다. 분말 직경의 정량화는 ImageJ 소프트웨어와 입자 분석기 기능을 사용하여 수행하였다. 건조 분말의 직경은 5 μm 내지 25 μm이었고, 물에 수화된 분말의 직경은 20 μm 내지 80 μm이었다.

실시예 3: 염색된 재조합 18B 폴리펩타이드 분말의 생성

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 염색을 평가하기 위해, 산성 직물 염료를 제조업체의 지침에 따라 제조하고, 18B 분말과 혼합하고, 5분 넘게 인큐베이션하였다. 과량의 염료를 헹구어내기 위해, 샘플을 16,000 RCF로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 상청액을 부어 버리고, 염색된 분말을 튜브 하단에 펠릿화하였다. 탈이온(DI)수를 펠릿에 첨가하고, 펠릿을 재현탁시켰다. 상청액이 투명해질 때까지 이러한 과정을 수차례 반복하였다.

도 3a는, 물, 산성 직물 염료 및 18B 분말의 혼합물을 사용하여 염색된 18B 분말을 생성하는 개략도를 보여준다. 이러한 혼합물로 선명한 색상을 용이하고 신속하게 흡수한 염색된 18B 분말을 얻었다.

도 3b는, 18B 분말이 최종 분말 상태에서 염색될 수 있음을 보여준다. 18B 분말은 또한 분무 건조 또는 최종 분말 상태 전에 염색되었다. 피부에 직접 도포된 유색 분말의 슬러리는 선명한 색상을 나타냈다.

도 3c는, 크림 에멀젼에 첨가된 상이한 농도의 염색된 18B 분말(0 wt%, 1 wt% 및 2 wt%)을 보여준다. 명백하게, 염색된 18B 분말은 크림 에멀젼에 색상을 부가할 수 있었으며, 선명함은 18B 분말 농도로 결정되었다.

도 3d는, 4℃에서 6개월 저장 후 염색된 18B 분말의 색상 견뢰도 안정성을 보여준다. 4℃에서 6개월 저장 후 침출이 관찰되지 않았다.

실시예 4: 재조합 18B 폴리펩타이드 분말로부터 필름의 형성

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말로부터 필름의 형성을 평가하기 위해, 온건한 교반 하에서 18B 분말을 탈이온수 중에 1 wt%로 분산시키는 방식으로 실크 용액을 제조하였다. 필름을 폴리디메틸실록산 기재 위에 캐스팅하고, 주변 조건에서(22℃및 40% 습도) 밤새 두었다. 필름을 깨뜨린 후, SEM을 통해 이미지화하였다. 실시예 3에 기재된 방법에 따라 산성 직물 염료를 제조하였다.

도 4의 개략도는, 1 wt% 18B 분말 용액과 같은 수화된 용액으로서의 18B 분말이 피부 상에 건조되어 표피층의 표면 상에 얇고 균질한 장벽을 형성하며, 이는 피부에 고도로 견고하며(즉, 피부 표면에 견고하고 비특이적인 부착이 이루어짐), 이를 통해 피부에 방어를 제공할 수 있음("18B 분말 장벽")을 시사한다. 18B 분말은 최외 표피층의 필수적인 장벽 기능을 보강하고 강화하는 장벽으로 작용한다. 이러한 기계적 모델을 이러한 장벽이 없는 피부(피부가 오염, 마모, 먼지 및 기름을 포함하는 환경적 스트레스 요인에 의해 손상됨)와 비교하였다.

도 5a는, 본 실시예에 기재된 방법의 개략도와, 피부에 2 mg/cm²로 도포될 때 약 1 μm 두께의 얇은 필름으로 합쳐지는 건조된 1 wt% 18B 분말 용액의 SEM 이미지를 보여준다. 수화된 18B 분말이 건조됨에 따라, 입자는 도 5a에서 화살표로 표시된 바와 같이 분명하게 얇은 필름으로 합쳐졌다.

도 5b는, 용액 농도와 표면적에 따라 변화하는 필름 두께를 보여준다. 피부에 50 mg/cm²로 도포된 건조된 1 wt% 18B 분말 용액은 약 10 μm 두께의 필름을 생성하였다. 피부에 250 mg/cm²로 도포된 건조된 1 wt% 18B 분말 용액은 약 20 μm 두께의 필름을 생성하였다. 피부에 500 mg/cm²로 도포된 건조된 1 wt% 18B 분말 용액은 약 30 μm 두께의 필름을 생성하였다.

도 5c는, 직물 염료로 염색된 2 wt% 18B 분말 용액과, 염색된 2 wt% 18B 분말을 2 mg/cm²로 도포하고, 세척하여 결합되지 않은 색상을 제거하기 전과 후 피부의 이미지를 보여준다. 구체적으로, 2 wt% 18B 분말 용액을 2 mg/cm²로 피부에 도포한 경우, 균질한 코팅이 관찰되었다.

실시예 5: 오래 지속되는 장벽으로서의 재조합 18B 폴리펩타이드 분말

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 장기적 이점을 평가하기 위해, 18B 분말 장벽을 도 6a에 제시된 바와 같이 단백질을 형광으로 태깅하는 방식으로 가시화하였다.

도 6b는, 18B 분말 장벽에 대한 반복된 마모의 영향을 조사하기 위한 실험 설계를 보여준다. 형광으로 태깅된 18B 분말 장벽을 피부에 도포하고, 10분 이하로 건조시켰다. 200 g 덩어리를 백색 면 와이프 상에 위치시키고, 지정된 횟수(또는 "문지름") 동안 손등 위에서 끌었다.

도 6c는, 맨 피부("대조군")와 비교하여, 문지름 없음, 100회 문지름 및 600회 문지름의 반복된 마모에 적용된 18B 분말 장벽의 이미지를 보여준다. 18B 분말 장벽은 반복된 마모에 노출된 후에도 피부에 고도로 견고하였다. 이미지에서 확인할 수 있는 바와 같이, 18B 분말 장벽은 100회 문지름 후 및 심지어 600회 문지름 후에도 거의 실질적으로 온전한 상태로 가시화될 수 있다.

도 6d는, 습식 와이프를 1회 내지 5회 통과시킨 후 피부 상의 18B 분말 장벽의 이미지를 보여준다. 제시된 바와 같이, 18B 분말 장벽은 최소한의 세척 후 물로 쉽게 제거되었다.

도 6e는, 제1, 제2, 제4 및 제5 회차 통과를 포함하는 최소한의 온건한 다회 통과 후 습식 와이프의 이미지를 보여준다. 제시된 바와 같이, 습식 와이프는 단 몇 차례 통과로 실크 기반 장벽을 완전히 제거하였다. 결과는, 실크 기반 필름이 피부 상에서의 일상적인 손모(wear and tear)를 모방하는 반복된 마모 손상을 견뎌냈음을 시시하였다. 필름을 제거하는 데에는 공격적인 문지름 또는 강력한 용매가 필요하지 않았다. 이는, 필름이 시간 경과에 따라 축적되거나 불쾌한 심미를 생성하지 않았음을 의미한다. 필름은 또한 피부의 천연 장벽 기능(예를 들어, 모공을 막음)을 방해하지 않았다. 이러한 이점은, 18B 단백질 장벽이 마모에 강하지만, 쉽게 닦아내어지기 때문에, 일부 중합체의 통상의 문제인 시간 경과에 따른 축적을 나타내지 않았음을 강조한다.

형광 실크 분말을 제조하기 위해, 18B 분말을 보레이트 완충액과(25 mg의 18B 분말을 5 mL의 완충액에) 조합하였다. NHS-플루오레세인(3 mg, Thermo Fisher)을 300 uL의 DMSO에 용해시켰다. 216 uL의 DSMO-염료 용액을 실크 용액과 조합하였다. 이러한 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션하고, 24시간 동안 물에 대해 투석하였다. 투석된 용액을 수집하고, 16,000 RCF로 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상청액을 부어 버리고, 추가의 물로 교체하였다. 펠릿을 재현탁시키기 위해 격렬한 진탕을 통해 펠릿을 붕괴하였다. 원심분리와 상청액 교환 단계를 총 4회 더 반복하였다. 생성된 실크 펠릿을 동결건조시키고, 분말로 분쇄하였다. 이어서, 18B 분말을 재현탁시켜 탈이온수 중 2 wt% 실크 용액을 제조하고, 손등의 영역에 2 mg/cm²로 도포하고, 5분 내지 10분 동안 건조시켰다. 청색광(467 nm 내지 498 nm)을 이용하여 18B 단백질 장벽을 여기시키고, 513 nm 내지 556 nm 필터로 반사된 광을 관찰하는 방식으로 손등의 영역을 이미지화하였다. 18B 단백질 장벽의 강도를 평가하기 위해 캡처된 이미지를 흑백으로 전환시켰다. 피부로부터 18B 단백질 장벽의 세정력을 평가하기 위해, 습식 와이프(Water Wipes)를 손등 영역 위에 수차례 통과시켰다. 매 통과마다 새로운 습식 와이프를 사용하였다. 각 통과 후, 손등과 각각의 와이프를 이미지화하였다.

실시예 6: 오염 세척을 개선시키기 위한 재조합 18B 폴리펩타이드 분말의 사용

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 방어적 이점을 평가하기 위해, 오염 등급 연구를 수행하였다. 18B 분말이 오염 세척을 개선시키는 이점을 나타냈다고 확인되었다.

연구에서, Fitzpatrick 피부 유형 I, II, III 또는 IV를 갖는 35세 내지 56세 사이의 5명의 여성 대상을 모두 연구에 등록시켰다. 5명의 대상 모두 성공적으로 시험 절차를 완료하였다. 기준선 또는 도포 후 및 헹굼 전에, 숙련된 기술자가 각각의 대상의 우측 또는 좌측 팔뚝에 1.5 in² 시험 부위를 표시하고, 대략 0.3 g의 시험 물품 또는 물 중 2 wt% 18B 분말 용액을 하나의 지정된 시험 부위에 도포하고, 10분 동안 공기 중에서 건조시켰다. 시험 물품은 탈이온수와 1% 보존제(Biotinistat)를 이용하여 제조하였다. 이어서, 환경 오염물 또는 탄소의 적용을 시험 물품을 함유하는 시험 부위와, 또한 나머지 미처리 대조군 시험 부위 상에 분무하였다. 기술자는, 각각의 부위가 하기에 제시되는 바와 같이 적어도 표시 수준 3의 가시 먼지(visible dirt) 점수를 갖도록, 각각의 시험 부위를 덮기에 충분한 양의 탄소 또는 먼지를 도포하였다. 점수는 두 가지 시험 부위 모두에서 동일해야 했다. 이어서, 가시 먼지에 대한 기술자 및 대상 평가를 기록하였다. 도포 후-헹굼 전 평가 후, 기술자는 45초 동안 미지근한 물로 각각의 시험 부위를 헹구고, 평가를 반복하였다. 평가 점수의 감소는 가시 먼지의 개선 또는 감소를 나타냈다. 증가는 악화를 나타냈다.

이러한 시험에 사용된 등급 수준은 하기와 같았다: 0 = 먼지 없음; 1 = 약간의 먼지가 존재함; 2 = 중간 정도로 먼지가 존재함(중간 정도로 가시적임); 3 = 현저한 먼지가 존재함(매우 가시적임); 및 4 = 심각한 먼지가 존재함(극도로 가시적임).

도 7a와 도 7b는, 18B 분말 용액이 탄소 입자에 미치는 영향을 조사하기 위한 오염 등급 연구의 결과를 보여준다. 18B 분말을 탈이온수 중에 2 wt% 18B 분말로 현탁시킨 제3자, 이중맹검, 비히클 제어 임상 연구에서, 18B 분말 용액은 기준선과 비교하여 기술자에 의해 관찰된 가시 탄소 입자에 대해 평균 등급 수준 0.4로 90% 개선을 나타냈다. 이러한 결과는, 기준선과 비교하여 기술자에 의해 관찰된 가시 탄소 입자에 대해, 각각, 40% 및 45% 개선을 나타내었던 미처리 부위 및 비히클 대조군 부위와 대조적이었다. 미처리 부위에 대한 평균 등급 수준은 2.4였고, 비히클 대조군 부위의 경우에는 2.2였다. 결과에 기반하여, 18B 분말 용액은 피부 상에 통기성 장벽을 형성하여, 환경적 스트레스 요인에 대한 중요한 방어로 작용하였다.

도 7c는, 대조군과 비교하여, 가수분해된 실크와 18B 분말 용액을 사용하여 폴리우레탄 재료 또는 모조(faux) 피부 상에서 수행된 오염 세척의 이미지를 보여준다. 구체적으로, 1 wt% 18B 분말 용액을 모조 피부에 2 mg/cm²로 도포한 후, 건조시켰다. 그 후, 2.5 mg/cm²의 탄소 입자를 표면 상에 브러싱하였다. 마지막으로, 모조 피부를 헹구고, 두드려 건조시켰다. 가수분해된 실크와 달리, 18B 분말은 오염 흡착에 저항하는 능력을 나타냈다. 피부 대용품 상에 코팅된 18B 분말은 보다 장기적인 필름 형성, 최소 오염 흡착 및 개선된 오염 세척 특성을 나타냈다.

도 7d는, 대조군과 비교하여, 1 wt% 및 2.5 wt% 18B 분말 용액을 사용하여 모발에서 수행된 오염 세척, 및 세척 후 생성된 헹굼수의 이미지를 보여준다. 18B 분말은 헹굼 시 피부와 모발로부터 오염의 제거를 개선시켰다. 1 wt% 및 2.5 wt%의 2가지 18B 분말 용액을 모발에 도포하였다. 이어서, 10 mg의 탄소를 추가하였다. 헹굼 후, 헹굼수를 16,000 RCF로 15분 동안 원심분리하고, 관찰하였다. 모발 착색과 헹굼수 중 탄소 입자 펠릿 크기를 검사한 결과, 18B 분말을 갖는 모발이 18B 분말 함량이 증가됨에 따라 증가된 오염 제거를 나타내었다는 것이 명백했다.

실시예 7: 클렌저로 제형화된 재조합 18B 분말

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 세정 효과를 조사하기 위해, 흑색 아이쉐도우(Lancome), 18B 분말 및 표준 세정제를 사용하여 연구를 수행하였다. 흑색 아이쉐도우(Lancome)를 팔뚝 영역에 고르게 도포하였다. 18B 분말, 챠콜 블랙 및 쌀겨가 포함된 각질제거제 3/8 티스푼을 아이쉐도우에 도포하였다. 약지로 해당 영역을 시계 방향 및 반시계 방향으로 20회 문질렀다. "각질제거제 미함유"로 표지된 샘플을 또한 임의의 각질제거제 없이 문질렀으며, "미처리" 샘플은 문지르지 않았다. 이어서, 각각의 영역을 45초 동안 수돗물로 헹구었다. 도 8a는, 18B 분말, 챠콜 블랙 및 쌀겨를 포함하는 다양한 건조 물질을 흑색 아이쉐도우 위의 피부에 문지른 이미지와, 물 헹굼 후 이미지를 보여준다. 건조 상태에서 피부에 문지른 경우, 18B 분말은 챠콜 블랙 및 쌀겨와 같은 표준 성분과 비교하여 메이크업(예를 들어, 흑색 아이쉐도우)을 효과적으로 제거하였다.

클렌저로서의 18B의 연성(softness)을 조사하기 위해, 각질제거제가 흑색 배경을 덮고 있는 테플론 테이프의 표면을 완전히 덮도록(테플론 테이프의 표면의 직경은 1 cm이고, 사용된 각질제거제의 양은 대략 1/4 티스푼이었음), 각질제거제를 2 g/mm² 편평한 표면과 백색 테플론 테이프 사이에 위치시켰다. 테플론이 매우 부드럽기 때문에, 이것이 각질제거제와 같은 단단한 것에 노출되면 늘어지고 얇아져서, 흑색 배경을 노출시킨다. 테플론 테이프의 표면을 광학 현미경을 이용하여 반사 모드로 이미지화하였다. 도 8b는, 대조군, 및 쌀겨, 대나무 줄기 및 호호바 비드를 포함하는 다른 표준 성분과 비교하여, 피부 대용품 상에 각질제거제로 사용된 18B 분말의 현미경 이미지를 보여준다. 18B 분말은 놀라울 정도로 부드러우면서 효과적으로 세정한다는 점에서 독특하였다. 18B 분말은 백색 테플론을 통해 흑색이 훨씬 덜 보이는 것으로 확인된 바와 같이 표준 성분보다 훨씬 덜 마모성이었다.

세정 용액으로 18B 분말 용액을 사용하는 것을 조사하기 위해, 18B 분말을 탈이온수에 첨가하는 방식으로 순수한 용액을 제조하였다. 2 cm² 면적의 모조 가죽(폴리우레탄 재료)을 탄소 입자(직경 5 μm)로 코팅하였다. 과량의 입자를 쓸어버렸다. 200 μl의 용액을 해당 영역에 도포하고, 직교하는 모든 4가지 방향으로 총 14회 문질렀다. 샘플을 흐르는 탈이온수 아래에서 45초 동안 헹구고, 두드려 건조시켰다. 도 8c는, 대조군 및 가수분해된 실크 용액과 비교하여, 피부 대용품 상에 클렌저로 사용된 10 wt% 18B 분말 용액을 보여준다. 구체적으로, 시험된 조건은 음성 대조군(오염이 추가되지 않음)과 양성 대조군(세정 또는 문지름 없이 오염이 추가됨), 물, 문지르지만 클렌저 없음, 10 wt% 가수분해된 실크 용액, 및 10 wt% 18B 분말 용액을 포함하였다. 현저하게, 가수분해된 실크와 비교하여, 18B 분말은 피부 대용품으로부터 오염을 보다 효과적으로 제거하였다.

베이스 겔 클렌저 제형에서 18B 분말의 세정 효과를 조사하기 위해, 흑색 아이라이너(Sephora)를 팔뚝에 도포하고, 10분 동안 건조시켰다. 팔뚝을 45초 동안 수돗물 하에 두었다. 100 μl의 시험 물품을 아이라이너 위 1 cm 너비 영역에 도포하였다. 시험 물품을 총 14회 위아래로 문질렀다. 최종적으로, 샘플을 탈이온수 아래에서 45초 동안 헹구었다. 도 8d는, 18B 분말 미함유 물과 비교하여, 클렌저로 사용된 다양한 농도의 18B 분말 용액을 보여준다. 구체적으로, 18B 분말은 베이스 겔 클렌저 제형에 첨가된 후에도 세정을 개선시켰다. 또한, 세정 효과는 반드시 실크 농도에 비례하지 않았다. 본 실시예에 사용된 18B 분말 용액은 0 wt%, 1 wt%, 2 wt% 및 5 wt%의 농도로 다양하였다. 도 8e는, 본 실시예에 사용된 18B 분말 겔 클렌저의 성분 목록을 보여준다.

실시예 8: 재조합 18B 폴리펩타이드 분말의 항노화 효과

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 항노화 효과를 조사하기 위해, 임상 시험을 수행하였다. 본 시험은, 하기 추가로 기재되는 바와 같이 전문가 채점, 기기 평가 및 주관적 패널 설문지를 사용한 제3자, 이중맹검, 비히클 제어 임상 시험(n=33)을 포함하였다. 2 wt% 18B 분말 제형을 비히클 단독 대조군과 비교하였다. 본 연구에 사용된 제형은 2 wt% 18B 실크 성분에 더하여 하기 성분을 함유하였다: 물, 카프릴산/카프르산 트리글리세리드, 올리브유 글리세레스-8 에스테르, 글리세린, 코코넛 알칸, 메틸 글루세스-20, 히드록시에틸 아크릴레이트/소듐 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체, 토코페롤, 디포타슘 글리시리제이트, 코코-카프릴레이트/카프레이트, 펜틸렌 글리콜, 클로르페네신, 카프릴릴 글리콜, 디소듐 EDTA, 페녹시에탄올.

도 9a는, 피부의 탱탱함과 탄력에 대한 2 wt% 18B 분말 용액의 평균 개선%의 그래프를 보여준다. * = 기준선 측정과 비교하여 2 wt% 샘플의 p<0.05. 탱탱함의 경우 R0를 측정하고 탄력의 경우 R5를 측정하는 Cutometer를 사용한 기기 측정은, 12주에 기준선에 비해 통계적인 개선을 나타냈다. R0는 힘에 대한 피부의 수동적 거동을 보여주는 매개변수였다. R5는 순(net) 탄력을 나타내는 매개변수였다. 피부 탱탱함은 2 wt% 18B 분말 제형에 대해 기준선에 비해 10% 평균 개선을 나타냈다. 피부 탄력은 2 wt% 18B 분말 제형에 대해 기준선에 비해 25% 평균 개선을 나타냈다. 비히클 대조군은 기준선에 비해 통계적 개선을 나타내지 않았다. * = 기준선 측정과 비교하여 2 wt% 18B 분말 용액의 p<0.05.

도 9b는, 8주 기간에 걸쳐 중앙 안면부 리프팅, 탄력, 탱탱함 및 전반적인 피부 건강 외관에 대한 2 wt% 18B 분말 용액의 통계적 개선의 그래프를 보여준다. 전문가 채점은 중앙 안면부 리프팅, 탱탱함, 탄력 및 전반적인 피부/건강한 외관에서 빈 비히클 대조군에 비해 통계적 개선을 나타냈다. * = 기준선 측정과 비교하여 2 wt% 샘플의 p<0.05.

도 9c는, 대상이 2 wt% 18B 분말 용액을 4주 동안 사용한 후 주관적 패널 설문지에 대한 피부 결과를 보여준다. 주관적 패널 설문지는, 탱탱함, 처짐, 잔주름 및 주름살, 팽팽해진 피부, 및 전반적인 피부의 건강 영역에서 4주차에 빈 비히클 대조군과 비교하여 통계적 개선을 나타냈다. 탱탱함, 처짐, 잔주름 및 주름살, 팽팽해진 피부 영역에서, 약 20% 평균 개선이 있었다. 전반적인 피부의 건강 영역에서, 약 10% 평균 개선이 있었다.

본 연구는, 2가지 안면 피부 처리인, 단순 피부 크림 제형("빈 비히클")과 실크 함량이 2 wt%인 단순 피부 크림 제형("2% 실크 제형")의 12주, 이중맹검, 비히클 제어 단항 평가(monadic evaluation)였다. 패널 크기는 샘플당 33명이었다. 빈 비히클의 경우, 평균 연령은 59세 +/- 6세였고, Fitzpatrick 피부 유형은 II, III, IV 및 V였다. 2% 실크 제형의 경우, 평균 연령은 58세 +/- 6세였고, Fitzpatrick 피부 유형은 I, II, III, IV 및 V였다. 0주차("기준선"), 4주차, 8주차 및 12주차에 Cutometer(MPA 580; Courage+Khazaka, Cologne Germany)를 사용한 기기 평가. Cutometer MPA 580(Courage + Khazaka, Germany)은 피부 표면에 흡인력을 가하여, 프로브의 구멍으로 피부를 끌어당기고, 광학 측정 시스템을 사용하여 침투 깊이를 결정하는 방식으로 피부의 점탄성 특성을 측정하였다. 피부 탄력은 R5(Ur/Ue) 매개변수를 사용하여 보고하였으며, 피부가 더 탄력이 있을수록 이 값은 증가한다. 피부 탱탱함은 R0(Uf) 매개변수를 사용하여 보고하였으며, 피부가 더 탱탱할수록 이 값은 감소한다. 임상 등급화는 기준선과, 4주차, 8주차 및 12주차에 수행하였다. 모든 등급화는 필요한 경우 오버헤드 조명뿐 아니라 조명 확대 루프를 사용하여 모든 대상에 대해 동일한 방에서 수행하였다. 각 시점에서 동일한 조명 조건을 보장하기 위해 방에 자연광을 차단하였다. 직접 측정할 수 없는 다양한 증상의 강도 또는 빈도, 주관적 특징 또는 태도를 측정하기 위해 시각 통증 척도(VAS: Visual Analog Scale)가 임상 연구에서 통상적으로 사용된다. VAS는 신뢰할 수 있는 척도이며, 단순한 순서 척도보다 작은 변화에 더 민감하다. VAS 항목에 응답할 때, 전문 채점자는 양쪽 끝점 또는 앵커 응답 사이의 라인(10 cm)을 따라 위치를 표시하는 방식으로 진술에 대한 동의 수준을 명시하였다. 간단한 VAS를 사용하여 10 cm 수평선의 끝을 좌측(최상)에서 우측(최악)으로 향하는 극한 한계로 정의한 효능 매개변수를 평가하였다. 치료 4주, 8주 및 12주 후 대상의 치료에 대한 인식과 피부에 미치는 영향을 측정하기 위해 주관적 설문지를 사용하였다. 질문은 5점 척도로 진술에 대한 대상의 동의를 묻는 것이었다.

실시예 9: 재조합 18B 폴리펩타이드 분말의 상처 치유 효과

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 18B 분말의 상처 치유 효과를 평가하기 위해, 상처 스크래치 모델을 이용하였다. 상처 스크래치 모델은 시험 물질의 세포 이동 유도 가능성에 대한 시험관내 정성적 평가를 제공하였다. 첫 번째 모델에서, 피부의 표피에서 발견되는 우세한 유형인 각질형성세포를 사용하였다. 정상 신생아 인간 표피 각질형성세포(HEK cat.# 102-05n, Cell Applications, San Diego, CA)를 96웰 플레이트 내 각질형성세포 성장 배지(KGM; 최적 성장 조건, 또는 10%KGM/90%DMEM; 차선 성장 조건)에서 컨플루언스(confluence)까지 성장시켰다. 그 후, 단층을 10 μl 피펫 팁을 사용하여 스크래칭하고, 헹구고, 시험 물질(100 μg/mL 멸균 증류수에 희석된 18B 분말)과 함께 48시간 동안 중복실험으로 인큐베이션하였다. 실험의 종결 시, 세포를 트리클로로아세트산에 고정시키고, 설포로다민 B로 염색하였다. EVOS 5000 이미징 시스템(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다. Celleste 5.0 소프트웨어(Thermofisher)를 이용하여 스크래치 상처 봉합을 분석하였다.

도 10은, 스크래치가 만들어진지 48시간 후 각질형성세포 상처 스크래치 모델의 광학 현미경 이미지와, 100 μg/mL의 18B 분말 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 상처 봉합의 컴퓨터 생성 정량화를 보여준다. 세포를 18B 분말(100 μg/mL) 존재 유무 하에 인큐베이션하고, 상처 봉합 정도에 대해 분석하였다. 상처 봉합의 정량화는 18B 분말 처리된 샘플에서 증가된 상처 봉합을 나타냈으며, 이는 컴퓨터 생성된 정량화를 통해 상처에서의 증가된 노이즈 축적으로 표시되었다.

두 번째 모델에서, 섬유아세포를 사용하였다. 정상 신생아 인간 진피 섬유아세포(aHDF p.4 cat.# 106-05a, Cell Applications, San Diego, CA)를 12웰 플레이트 내 DMEM(Invitrogen, Carlsbad, CA) + 10%FBS(Sigma, St. Louis) 및 Pen/Strep/Fungizone 용액(Lonza, Switzerland)에서 초기 서브컨플루언스(subconfluence)까지 성장시켰다. 실험 당일 배지를 1 wt% 소태아 혈청만 함유하는 것으로 교환하고, 세포 배양물을 20 μl 피펫 팁을 사용하여 스크래칭하고, 헹구고, 멸균 증류수에 25 μg/mL 및 50 μg/mL로 희석된 18B 분말과 함께 24시간 동안 중복실험으로 인큐베이션하였다. 물 및 10 wt% 소태아 혈청에 노출시킨 세포는, 각각, 음성 및 양성 대조군이었다. 실험의 종결 시, 세포를 트리클로로아세트산에 고정시키고, 설포로다민 B로 염색하였다. EVOS 5000 이미징 시스템(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)을 이용하여 현미경 사진을 찍었다. Celleste 5.0 소프트웨어(Thermofisher)를 이용하여 스크래치 상처 봉합을 분석하였다.

도 11a는, 스크래치가 만들어진지 24시간 후 섬유아세포 상처 스크래치 모델의 광학 현미경 이미지와, 양성 대조군과 비교하여 다양한 농도의 18B 분말(25 μg/mL 및 50 μg/mL) 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 상처 봉합의 정량화를 보여준다. 세포를 18B 분말(25 μg/mL 및 50 μg/mL) 존재 유무 하에 인큐베이션하고, 상처 봉합 정도에 대해 분석하였다.

도 11b는, 물만 있었던 경우 24%와 비교하여 53%의 스크래치 커버리지를 산출한 양성 대조군과 비교하여, 다양한 농도의 18B 분말(25 μg/mL 및 50 μg/mL) 유무 하에 세포를 인큐베이션한 후 섬유아세포 이동에 의한 상처 부위 커버리지%의 정량화를 보여준다. 섬유아세포 이동에 의한 상처 부위 커버리지%의 정량화는 Celleste 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. 50 μg/mL 18B 분말 샘플은 18B 분말 처리된 샘플에서 약 12% 개선된 스크래치 커버리지를 나타냈다. 25 μg/mL 18B 분말 처리된 샘플에서는 5%의 약간의 증가가 측정되었다. 이러한 모델은 상처 치유 가능성의 용량 의존성을 시사하였다.

실시예 10: 다양한 용매에서 재조합 18B 분말의 추가 팽윤 특징

실시예 2에 기재된 바와 같이, 분말 입자는 분말을 분산시키는 데 사용되는 용매에 따라 팽윤의 차이를 나타냈다. 상이한 용매 중에 분말을 0.062 wt% 수준으로 현탁시켜 광학 현미경 이미지를 얻었다. 분말 현탁액의 점적액을 유리 슬라이드 상에 로딩하고, 유리 커버슬립을 덮었다. 금속 현미경, 프로그래밍 가능한 전동 스테이지, 자동 초점 기능, 고해상도 CCD 카메라 및 Bettersize 입자 크기측정 소프트웨어가 장착된 BeVision M1 입자 분석기를 이용하여 입자 크기 데이터와 광학 현미경 이미지를 얻었다. 10X 대물렌즈를 사용하여 반경 0.5 cm의 원형 스캐닝 영역을 설정하였다.

탈이온수(DI, pH 6) 및 PBS(인산염 완충 염수, 7.2 pH)는, 각각, 입자 직경의 50%가 50 μm 미만이고, 최대 직경이 118 μm 및 116 μm로 유사하게 분말을 팽창 또는 팽윤시켰다. 대조적으로, 펜틸렌 글리콜, 실리콘 및 글리세린은 입자 직경의 100%가 75 μm 미만으로 입자를 덜 팽윤시켰다. 올리브유는 분말 직경의 50%가 30 μm 미만으로 상이한 거동을 나타냈지만; 최대 입자 직경은 116 μm로 DI 및 PBS에서와 유사하였다. 이러한 결과를 입자 직경의 100%가 60 μm 미만인 건조된 상태 그대로의 분말과 비교하였다.

도 12a는, 미용 및 퍼스널 케어 제형에 사용되는 다양한 상이한 용매에 재현탁시킨 후 광학 현미경으로 관찰한 대표적인 분말 형태를 보여준다.

도 12b는, 이미지 분석에 따라 결정된 다양한 용매에서의 분말 직경의 정량화를 보여준다. 데이터는 도 12c에 제시된 바와 같이 직경 빈당 입자의 누적 백분율로 표 및 그래프의 형태로 제시되었다.

실시예 11: 재조합 18B 분말의 용해도

다양한 농도의 재조합 18B 단백질 분말을 탈이온수 중에 1% wt 내지 10% wt로 분산시켰다. 용액을 22℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 16,000 RCF로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 재조합 18B 분말을 펠릿화하였다. 펠릿에서 상청액을 부어 버렸다. 상청액을 5 M 구아니딘 티오시아네이트에 용해시키고, Yarra SEC-3000 SEC-HPLC 컬럼에 주입하여 분자량을 기준으로 구성요소를 분리하였다. 검출 양식으로 굴절률을 사용하였다. 재조합 18B(18B) 응집물, 18B 단량체, 저분자량(1 kDa 내지 8 kDa) 불순물, 중간 분자량 불순물(8 kDa 내지 50 kDa) 및 고분자량 불순물(110 kDa 내지 150 kDa)을 정량화하였다. 관련 조성을 질량%로 보고하였다. 모든 단백질의 90% 초과가 서로 약 7% 이내의 dn/dc 값(굴절률의 반응 인자)을 나타낸다는 가정 하에, BSA를 일반 단백질 표준물로 사용하였다. 폴리(에틸렌 옥시드)를 머무름 시간 표준물로 사용하였고, BSA 교정기를 방법의 일관된 수행을 보장하기 위한 확인 표준물로 사용하였다.

도 13a는, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 결정된 다양한 재조합 18B 단백질 분말 용액의 용해도 정량화를 보여준다. 전장 18B 단백질 분자는 50.6 kDa 내지 78.1 kDa 영역에서 발견되었다. 18B 단백질 응집물은 대략 113.2 kDa에서 발견되었고, 18B 단백질의 짧은 길이 버전은 2.6 kDa 내지 50.8 kDa에서 발견되었다. 이러한 모든 단백질 종을 추출물에서의 18B 단백질 용해도 계산에 사용하였다. 수성 추출물에서 측정된 18B 단백질의 양은 용액 농도에 비례하지 않았으며, 이는 최대 용해도에 도달하지 못했음을 나타낸다. 탈이온수 중 10% wt/wt 18B 단백질 분말이 대략 현탁 능력의 상한이었다는 점에 주목해야 한다(즉, 탈이온수 중 10% wt/wt 초과의 18B 단백질에서, 분말은 완전히 습윤되지 않았음). 도 13b는, 용해도 결과의 표를 보여준다. 재조합 18B 단백질 분말은 HPLC SEC로 측정 시 탈이온수에서 제한된 용해도를 나타냈다. 단백질의 11% 미만이 수성 용매에 분배되었다.

실시예 12: 재조합 18B 분말의 가속화된 상처 치유 효과

Fitzpatrick 분류에 기초한 피부 유형 II의 41세 백인 여성에서 복부성형술로부터 인간 피부를 얻었다. 총, 평균 직경 11 mm(± 1 mm)의 인간 피부 외식편 21개와 10 x 15 mm 크기의 직사각형 외식편 21개를 준비하였다. 외식편을 습한 5% CO₂ 분위기에서 37℃의 배양 배지 중에 보관하였다. 0일차에, 2 mm 직경 펀치를 사용하여 배치의 각각의 외식편의 중앙에 기계적 상처를 생성하였다. 0일차 상처 후, 1일차, 4일차 및 6일차에, 빈 비히클(PBS + 0.9% Botanistat 보존제)과, 재조합 18B 단백질 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제 중 5% 재조합 18B 단백질) 또는 빈 비히클 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제)을 2 mg/cm²의 표면적 상에 국소 도포하고, 작은 스패출라를 사용하여 펴 발랐다. 미처리 대조군 외식편은 배양 배지의 교체를 제외하고 임의의 처리를 수행하지 않았다. 배양 배지의 절반(1 ml)을 1일차, 4일차 및 6일차에 새롭게 교체하였다. 0일차에, 각 처리 조건의 3개의 외식편을 수집하고, 2개의 부분으로 절단하였다. 샘플의 절반은 완충 포르말린 용액 중에 고정시키고, 절반은 -80℃에서 보관하였다. 4일차 및 8일차에, 각 배치의 3개의 외식편을 수집하고, 동일한 방식으로 처리하였다. 완충 포르말린 중에서 24시간 동안 고정화시킨 후, 샘플을 탈수시키고, Leica PEARL 탈수 자동매트를 사용하여 파라핀 중에 함침시켰다. 이어서, 샘플을 Leica EG 1160 포매 스테이션을 사용하여 포매하였다. Leica RM 2125 Minot 유형 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께 절편을 만든 후, 절편을 Superfrost®조직학용 유리 슬라이드 상에 장착하였다.

동결된 샘플을 Leica CM 3050 저온 유지 장치(cryostat)를 사용하여 7 μm 두께 절편으로 절단하였다. 이어서, 절편을 Superfrost®플러스 실란화 유리 슬라이드 상에 장착하였다. Leica DMLB 또는 Olympus BX43 현미경을 사용하여 현미경 관찰을 수행하였다. 사진을 CellSens 저장 소프트웨어가 장착된 수치형 DP72 Olympus 카메라를 이용하여 디지털화하였다. Masson's trichrome, Goldner 변형에 따른 파라핀 처리된 절편의 염색 후 표피 및 진피 구조의 세포 생존능과 상처 봉합 측정을 수행하였다.

그 결과, 재조합 18B 단백질은 상처 부위에서 세포 이동을 증가시키는 방식으로 생체외 인간 피부 모델에서 가속화된 상처 봉합을 뒷받침하였다. 인간 피부 외식편을 상처내고, 재조합 18B 단백질 샘플로 8일 동안 처리하였다.

도 14a는, 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 재조합 18B 단백질은 4일차 및 8일차 시점에서 모두 표피 길이의 정도에 있어서 빈 비히클과 미처리 대조군을 능가하는 것으로 나타났다. 도 14b는, 재조합 18B 단백질이 빈 비히클과 비교하여 4일차에 표피 혀 길이의 68% 증가를 유도하였음을 보여준다(** = 미처리 및 빈 비히클 대조군과 비교하여 p<0.01). 8일차에, 재조합 18B 단백질은 빈 비히클과 비교하여 8일차에 표피 혀 길이의 42% 증가를 유도하였다(* = 미처리 및 빈 비히클 대조군과 비교하여 p<0.05).

실시예 13: 기저 수준의 산화 스트레스와 청색광 조사에 의해 야기되는 산화 스트레스를 감소시키는 재조합 18B 분말

Fitzpatrick 분류에 기초한 피부 유형 II의 52세 백인 여성에서 복부성형술 시 평균 직경 12 mm(± 1 mm)의 인간 피부 외식편 27개를 준비하였다. 외식편을 습한 5% CO₂ 분위기에서 37℃의 배양 배지 중에 살아있는 상태로 보관하였다. 본 연구는 공여자 서면 동의 후 수술 잔류물에서 얻은 생검에 대해 수행하였다. 0일차, 1일차 및 4일차 청색광 조사 30분 전, 재조합 18B 단백질 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제 중 2% 재조합 18B 단백질) 또는 빈 비히클 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제)을 2 mg/cm²의 표면적 상에 국소 도포하고, 작은 스패출라를 사용하여 펴 발랐다. 미처리 대조군 외식편은 배양 배지의 교체를 제외하고 임의의 처리를 수행하지 않았다. 배양 배지의 절반(웰당 1 mL)을 1일차 및 4일차에 새롭게 교체하였다. 4일차에, 외식편은 청색광 조사에 대해 예정되어 있었고, 1 ml HBSS(Hanks 평형 염 용액)에 넣고, Solarbox®장치를 사용하여 63.75 J/cm²의 선량으로 3시간 동안 청색광을 조사하였다. 조사되지 않은 미처리 외식편은 조사 처리 동안 암실에서 1 mL의 HBSS 중에 유지시켰다. 조사 종결 시, 모든 배치를 배양 배지에 다시 넣었다. 샘플을 희생시킬 준비가 되었을 때, 이를 수집하여 2개의 부분으로 절단하였다. 샘플의 절반은 완충 포르말린 중에 고정시키고, 절반은 -80℃에서 보관하였다. 완충 포르말린 중에서 24시간 동안 고정화시킨 후, 샘플을 탈수시키고, Leica PEARL 탈수 자동매트를 사용하여 파라핀 중에 함침시켰다. 샘플을 Leica EG 1160 포매 스테이션을 사용하여 포매하였다. Leica RM 2125 Minot 유형 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께 절편을 만들고, 절편을 Superfrost®조직학용 유리 슬라이드 상에 장착하였다. Leica DMLB, Olympus BX43 또는 Olympus BX63 현미경을 사용하여 현미경 관찰을 실현하였다. 사진을 celSens 저장 소프트웨어가 장착된 수치형 DP72 또는 DP74 Olympus 카메라를 이용하여 디지털화하였다. Masson's trichrome 염색, Goldner 변형 후 포름알데히드 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 피부 절편에 대해 표피 및 진피 구조의 세포 생존능을 관찰하였다. 세포 생존능을 현미경 관찰로 평가하였다. PBS-BSA 0.3% 중에 1:400으로 희석한 단클론 항-8-OHdG 항체(Gentaur, ref. 50-MOG, 클론 N45-1)를 이용하여 FFPE 피부 절편에 대해 8-OHdG 면역염색을 수행하고, Vectastain 키트 벡터 증폭기 시스템 아비딘/비오틴을 사용하여 실온에서 밤새 인큐베이션하고, 산화되면 보라색 염색을 나타내는 퍼옥시다아제 기질인 VIP(Vector laboratories, Ref. SK-4600)를 통해 밝혀냈다. 면역염색을 수동으로 수행하고, 현미경 관찰로 평가하고, 이미지 분석으로 반정량화하였다.

반정량화된 이미지 분석은 하기와 같이 수행하였다: 먼저, 염색을 검출하고, 염색에 상응하는 픽셀을 선택하였다 - 이를 마스크 1에 할당함. 이어서, 드로잉을 통해 ROI(즉, 표피층)의 선택을 선택하고, 또 다른 마스크 2에 할당하였다. 다음으로, 마스크의 중첩부(즉, 면역염색과 ROI가 중첩되는 부분)를 마스크 3에 할당하였다. 최종적으로, 염색(즉, 마스크 3)으로 덮인 표피(즉, 마스크 2)의 백분율을 계산하고, "염색된 표면%"로 지정하였다. 도 15a는, 재조합 18B 단백질이 핵 산화 마커(8-OHdG)의 감소로 측정되는 바와 같이 산화 스트레스의 기저 수준을 감소시켰음을 나타낸다. 나아가, 재조합 18B 단백질은 또한 청색광 유도 핵 산화(8-OHdG)를 감소시켰다. 핵 및 미토콘드리아 DNA 산화는 이러한 염기의 높은 이온화 가능성으로 인해 구아닌 잔기에서 가장 쉽게 일어났다. 8-옥소-2'-데옥시구아노신(8-oxo-dG) 또는 히드록시데옥시구아노신(8-OHdG)은 인간에서 자유 라디칼 유도 산화 병변의 우세한 형태 중 하나이다. 히드록실 라디칼과 구아닌 염기의 C-8 위치의 이중 결합의 상호작용은 8-OHdG의 생성을 유도한다. 이러한 안정한 산화 변형 DNA 산물은 DNA에 대한 산화 손상 정도를 반영하는 데 광범위하게 사용되어 왔다.

도 15b는, 2% 재조합 18B 단백질의 단순 용액(PBS 및 0.9% Botanistat 보존제 중에 현탁됨)은 8-OHdG 염색을 미처리된 샘플과 비교하여 37% 감소시켰고, 빈 비히클과 비교하여 42% 감소시켰다(p<0.01). 청색광 조사는 미처리 대조군의 8-OHdG 염색에서 18% 증가를 유도하였으며(p<0.01), 2% 재조합 18B 단백질 용액으로 처리된 샘플은 8-OHdG 염색이 청색광 조사된 미처리 대조군과 비교하여 43% 감소되었고, 청색광 조사된 빈 비히클과 비교하여 42% 감소되었다(p<0.01).

실시예 14: 오염 유도 산화 스트레스를 약화시키는 재조합 18B 분말

Fitzpatrick 분류에 기초한 피부 유형 II-III의 59세 백인 여성에서 복부성형술 시 평균 직경 12 mm(± 1 mm)의 인간 피부 외식편 35개를 준비하였다. 외식편을 습한 5% CO2 분위기에서 37℃의 배양 배지 중에 살아있는 상태로 보관하였다. 본 연구는 공여자 서면 동의 후 수술 잔류물에서 얻은 생검에 대해 수행하였다.

0일차, 3일차 및 4일차 오염물 노출 전, 재조합 18B 단백질 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제 중 2% 재조합 18B 단백질) 또는 빈 비히클 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제)을 2 mg/cm²의 표면적 상에 국소 도포하고, 작은 스패출라를 사용하여 펴 발랐다. 미처리 대조군 외식편은 배양 배지의 교체를 제외하고 임의의 처리를 수행하지 않았다. 배양 배지의 절반(웰당 1 mL)을 1일차에 새롭게 교체하고, 4일차에 오염물 노출 후 전부 교체하였다(웰당 2 mL). 4일차에, 오염 노출에 예정된 외식편을 웰당 900 μl의 HBSS가 포함된 PolluBox®시스템에 위치시키고, 폴리시클릭 방향족 탄화수소 + 중금속과 0.9% NaCl의 혼합물(오염물 용액 1 ml당 0.9% NaCl 150 μl)을 전체 오염 용액 총 3 mL를 사용하여 1.5시간 동안 분무하는 방식으로 노출시켰다. 미처리 대조군 외식편은 1 mL의 HBSS 중에 유지시켰다. 오염물 노출 종결 시, 모든 외식편을 2 mL의 새로운 배양 배지에 다시 넣었다. 샘플을 희생시킬 준비가 되었을 때, 이를 수집하여 3개의 부분으로 절단하였다. 하나의 부분은 완충 포르말린 중에 고정시키고, 두 번째 부분은 -80℃에서 동결시키고, 마지막 부분은 RNA Later®에 넣었다. 완충 포르말린 중에서 24시간 동안 고정화시킨 후, 샘플을 탈수시키고, Leica PEARL 탈수 자동매트를 사용하여 파라핀 중에 함침시켰다. 샘플을 Leica EG 1160 포매 스테이션을 사용하여 포매하였다. Leica RM 2125 Minot 유형 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께 절편을 만들고, 절편을 Superfrost®조직학용 유리 슬라이드 상에 장착하였다. 동결된 샘플을 Leica CM 3050 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm 두께 절편으로 절단하였다. 이어서, 절편을 Superfrost®플러스 실란화 유리 슬라이드 상에 장착하였다. Leica DMLB, Olympus BX43 또는 Olympus BX63 현미경을 사용하여 현미경 관찰을 실현하였다. 사진을 celSens 저장 소프트웨어가 장착된 수치형 DP72 또는 DP74 Olympus 카메라를 이용하여 디지털화하였다. Masson's trichrome 염색, Goldner 변형 후 포름알데히드 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 피부 절편에 대해 표피 및 진피 구조의 세포 생존능을 관찰하였다. 세포 생존능을 현미경 관찰로 평가하였다. PBS-BSA 0.3%-Tween 20(0.05%) 중에 1:400으로 희석한 단클론 항-포스포(S40) Nrf2 항체(Abcam, ref. ab76026, 클론 EP1809Y)를 이용하여 FFPE 피부 절편에 대해 Nrf2 면역염색을 수행하고, Vectastain 키트 벡터 증폭기 시스템 아비딘/비오틴을 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 퍼옥시다아제의 보라색 기질인 VIP(Vector Laboratories, ref. SK-4600)를 통해 밝혀냈다.

면역염색을 현미경 관찰로 평가하였다. PBS-BSA 0.3%-Tween 20(0.05%) 중에 1:200으로 희석한 단클론 항-IL-1α 항체(Novus Biologicals, NBP2-45400, 클론 OTI2F8)를 이용하여 FFPE 피부 절편에 대해 IL-1α 면역염색을 수행하고, Vectastain 키트 벡터 증폭 시스템 아비딘/비오틴을 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 퍼옥시다아제의 보라색 기질인 VIP(Vector Laboratories, ref. SK-4600)를 통해 밝혀냈다.

면역염색을 현미경 관찰로 평가하였다. 면역염색을 수동으로 수행하고, 현미경 관찰로 평가하고, 이미지 분석으로 반정량화하였다. 반정량화된 이미지 분석은 하기와 같이 수행하였다: 먼저, 염색을 검출하고, 염색에 상응하는 픽셀을 선택하였다 - 이를 마스크 1에 할당함. 이어서, 드로잉을 통해 ROI(즉, 표피층)의 선택을 선택하고, 또 다른 마스크 2에 할당하였다. 다음으로, 마스크의 중첩부(즉, 면역염색과 ROI가 중첩되는 부분)를 마스크 3에 할당하였다. 최종적으로, 염색(즉, 마스크 3)으로 덮인 표피(즉, 마스크 2)의 백분율을 계산하고, "염색된 표면%"로 지정하였다.

그 결과, 재조합 18B 단백질은 세포 항산화 시스템의 오염 유도 발현 및 염증을 감소시켰다. 산화 스트레스 하에서, 세포 항산화 시스템이 촉발된다. 즉, 핵 인자 에리트로이드 2관련 인자 2(Nrf2)는 인산화에 의해 활성화되어, 세포질에서 핵으로 이동한다. 핵에 들어가면, Nrf2는 전체 항산화제 시스템의 마스터 조절인자인 항산화제 반응 요소(ARE) 또는 인간 항산화제 반응 요소(hARE)의 위치에 있는 DNA에 결합한다. 또한, 산화 스트레스 하에서, 염증 캐스케이드가 촉발된다. 표피에서, 인터류킨 1(IL-1)은 각질형성세포 증식, 면역 및 항미생물 반응, 염증 및 지질 합성을 조절할 수 있다. 일반적으로, IL-1은 염증의 생성뿐 아니라, 발열 및 패혈증의 촉진을 담당한다. 본 연구에서, IL-1α를 연구하였다.

도 16a는, 오염에 노출되거나 노출되지 않은, 미처리군, 빈 비히클 및 2% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 16b는, PBS 및 0.9% Botanistat 보존제 중에 현탁된 2% 재조합 18B 단백질 용액이, 오염에 노출될 때 미처리군(49% 적음, p<0.01) 및 빈 비히클(40% 적음, **p<0.01) 샘플과 비교하여 Nrf2 발현(염색된 표면%)의 유의한 감소를 유도하였음을 보여준다. 오염에 노출된 미처리 샘플이 노출되지 않은 미처리 샘플과 비교하여 68%의 유의한 증가를 나타냈다(p<0.01)는 점에 주목해야 한다. 또한, 빈 비히클이 오염에 노출될 때 미처리군(15% 적음, p<0.01) 샘플과 비교하여 Nrf2 발현을 감소시켰지만, 2% 재조합 18B 단백질 샘플보다는 훨씬 낮은 정도였다는 점에 주목해야 한다.

도 16c는, 오염에 노출되거나 노출되지 않은, 미처리군, 빈 비히클 및 2% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 16d는, 빈 비히클과 비교하여, 2% 재조합 18B 샘플이 오염에 노출될 때 미처리군(19% 적음, p<0.01) 및 빈 비히클(26% 적음, **p<0.01) 샘플과 비교하여 IL-1α 발현의 유의한 감소를 유도하였음을 보여준다. 오염에 노출된 미처리 샘플이 노출되지 않은 미처리 샘플과 비교하여 47%의 유의한 증가를 나타냈다(p<0.01)는 점에 주목해야 한다.

실시예 15: UVA/UVB 유도 산화 스트레스를 약화시키는 재조합 18B 분말

Fitzpatrick 분류에 기초한 피부 유형 II의 52세 백인 여성에서 복부성형술 시 평균 직경 11 mm(± 1 mm)의 인간 피부 외식편 30개를 준비하였다. 외식편을 습한 5% CO₂ 분위기에서 37℃의 BEM 배양 배지(BIO-EC 외식편 배지) 중에 살아있는 상태로 보관하였다. 0일차, 1일차 및 4일차 UV 조사 전, 재조합 18B 단백질 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제 중 2% 재조합 18B 단백질) 또는 빈 비히클 샘플(PBS + 0.9% Botanistat 보존제)을 2 mg/cm²의 표면적 상에 국소 도포하고, 작은 스패출라를 사용하여 펴 발랐다. 미처리 대조군 외식편은 배양 배지의 교체를 제외하고 임의의 처리를 수행하지 않았다. 배양 배지의 절반(웰당 1 mL)을 1일차에 새롭게 교체하고, 4일차에 전부 교체하였다(웰당 2 mL). 4일차에, "UVA" 배치에 UV 시뮬레이터 Vibert Lourmat RMX 3W를 사용하여 4 MED(최소 홍반 선량)에 해당하는 18 J/cm²의 UVA 선량을 조사하였다. "UVB" 배치에 UV 시뮬레이터 Vibert Lourmat RMX 3W를 사용하여 2 MED(최소 홍반 선량)에 해당하는 0.3 J/cm²의 UVB 선량을 조사하였다. 조사되지 않은 배치는 암실에서 HBSS 중에 보관하였다. 조사 종결 시, 모든 외식편을 2 mL의 배양 배지에 다시 넣었다. 샘플을 희생시킬 준비가 되었을 때, 이를 수집하여 2개의 부분으로 절단하였다. 하나의 부분은 완충 포르말린 중에 고정시키고, 두 번째 부분은 -80℃에서 동결시켰다. 완충 포르말린 중에서 24시간 동안 고정화시킨 후, 샘플을 탈수시키고, Leica PEARL 탈수 자동매트를 사용하여 파라핀 중에 함침시켰다. 샘플을 Leica EG 1160 포매 스테이션을 사용하여 포매하였다. Leica RM 2125 Minot 유형 마이크로톰을 사용하여 5 μm 두께 절편을 만들고, 절편을 Superfrost®조직학용 유리 슬라이드 상에 장착하였다. 동결된 샘플을 Leica CM 3050 저온 유지 장치를 사용하여 7 μm 두께 절편으로 절단하였다. 이어서, 절편을 Superfrost®플러스 실란화 유리 슬라이드 상에 장착하였다. Leica DMLB, Olympus BX43 또는 Olympus BX63 현미경을 사용하여 현미경 관찰을 실현하였다. 사진을 celSens 저장 소프트웨어가 장착된 수치형 DP72 또는 DP74 Olympus 카메라를 이용하여 디지털화하였다. Masson's trichrome 염색, Goldner 변형 후 포름알데히드 고정되고 파라핀 포매된(FFPE) 피부 절편에 대해 표피 및 진피 구조의 세포 생존능을 관찰하였다. PBS-BSA 0.3%-Tween 20(0.05%) 중에 1:400으로 희석한 단클론 항-포스포(S40) Nrf2 항체(Abcam, ref. ab76026, 클론 EP1809Y)를 이용하여 FFPE 피부 절편에 대해 Nrf2 면역염색을 수행하고, Vectastain 키트 벡터 증폭기 시스템 아비딘/비오틴을 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 퍼옥시다아제의 보라색 기질인 VIP(Vector Laboratories, ref. SK-4600)를 통해 밝혀냈다. 자동화 슬라이드 처리 시스템(Autostainer, Dako)을 사용하여 면역염색을 수행하고, 현미경 관찰로 평가하였다. PBS-BSA 0.3%-Tween 20(0.05%) 중에 1:1600으로 희석한 단클론 항-티민 이량체 항체(Kamiya, ref. MC-062, 클론 KTM53)를 이용하여 FFPE 피부 절편에 대해 티민 이량체 면역염색을 수행하고, Vectastain 키트 벡터 증폭기 시스템 아비딘/비오틴을 사용하여 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 산화되면 보라색 신호를 나타내는 퍼옥시다아제 기질인 VIP(Vector laboratories, Ref. SK-4600)를 통해 밝혀냈다. 면역염색을 수동으로 수행하고, 현미경 관찰로 평가하고, 이미지 분석으로 반정량화하였다.

반정량화된 이미지 분석은 하기와 같이 수행하였다: 먼저, 염색을 검출하고, 염색에 상응하는 픽셀을 선택하였다 - 이를 마스크 1에 할당함. 이어서, 드로잉을 통해 ROI(즉, 표피층)의 선택을 선택하고, 또 다른 마스크 2에 할당하였다. 다음으로, 마스크의 중첩부(즉, 면역염색과 ROI가 중첩되는 부분)를 마스크 3에 할당하였다. 최종적으로, 염색(즉, 마스크 3)으로 덮인 표피(즉, 마스크 2)의 백분율을 계산하고, "염색된 표면%"로 지정하였다. 일광화상을 입은 세포의 수를 정량화하기 위해, 조직학으로 호산구성 세포질과 세포자멸성 핵을 갖는 세포의 수를 계수하였다.

그 결과, 재조합 18B 단백질은 표피에의 UVA/UVB 노출과 관련된 부정적인 효과, 즉 세포 생존능, 티민 이량체 발현 및 Nrf2 발현을 약화시켰다. 자외선은 DNA의 티민 염기와 시토신 염기의 이중결합에 의해 흡수된다. 이렇게 부가된 에너지는 결합을 열어 이웃하는 염기와 반응할 수 있게 한다. 이웃이 또 다른 티민 또는 시토신 염기인 경우, 이는 2개 염기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있다.

도 17a는, UVB에 노출되거나 노출되지 않은, 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17b는, 5% 재조합 18B 단백질(PBS 및 0.9% Botanistat 보존제 중에 현탁됨)이 UVB에 노출될 때 미처리 군 및 빈 비히클 샘플과 비교하여 상당히 유리한 세포 생존능을 나타냈음을 보여준다. 재조합 18B 단백질 샘플은 미처리군(40% 적음, *=p<0.05) 및 빈 비히클 대조군(39% 적음, *=p<0.05)과 비교하여 일광화상을 입은 세포의 수를 감소시켰으며; 재조합 18B 단백질은 UVB 노출에 의해 유도된 변경을 약간 보호하였다.

도 17c는, UVB에 노출되거나 노출되지 않은, 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17d는, 5% 재조합 18B 단백질(PBS 및 0.9% Botanistat 보존제 중에 현탁됨)이 미처리 군 및 빈 비히클 대조군과 비교하여 티민 이량체의 약화된 발현을 나타냈음을 보여준다. 5% 재조합 18B 단백질은 미처리 대조군과 비교하여 49% 및 빈 비히클과 비교하여 32%로 티민 이량체 발현의 유의한 감소를 유도하였다(** = p<0.01). UVB로 조사된 미처리 샘플은, 티민 이량체의 발현을 나타내지 않은 조사되지 않은 미처리 샘플과 비교하여 티민 이량체 면역염색에 대해 양성인 표피 표면을 20.4% 나타냈다.

도 17e는, UVA에 노출되거나 노출되지 않은, 미처리군, 빈 비히클 및 5% 재조합 18B 단백질 샘플의 생체외 조직의 조직학적 단면도를 보여준다. 도 17f는, 5% 재조합 18B 단백질(PBS 및 0.9% Botanistat 보존제 중에 현탁됨)이 UVA에의 노출 후 Nrf2 염색의 약화된 발현을 나타냈음을 보여준다. UVA 조사는 노출되지 않은 샘플과 비교하여 표피에서 활성화된 Nrf2의 발현의 유의한 증가를 유도하였다(40% 많음, p<0.01). 5% 재조합 18B 단백질은 UVA 노출 시 빈 비히클(26%, *=p<0.1) 및 미처리 대조군(53%, p<0.01)과 비교하여 Nrf2 발현의 감소를 나타냈다. 또한, 빈 비히클은 UVA에 노출될 때 미처리군(36% 적음, p<0.01) 샘플과 비교하여 Nrf2 염색을 감소시켰지만, 2% 재조합 18B 단백질 샘플보다는 낮은 정도였다.

실시예 16: 재조합 18B 분말의 매트화 효과

9명 대상 연구에서, 대상의 2/3는 2% 18B 단백질 제형과 비교하여 빈 비히클 제형에 대해 기준선 대비 광택의 큰 증가를 경험하였다.

사전 연구 방문에서, 잠재적으로 자격이 있는 지원자들은 깨끗한 얼굴로(메이크업 없이) 도착했으며, 기름진 이마에 대해 육안으로 스크리닝되었고, 적격한 것으로 확인되면, 동의 절차를 완료하였다. 대상은 Fitzpatrick 분류에 기초한 피부 유형이 I-II이고 Sebumeter®로 측정 시 이마에 중간 내지 심각한 피지가 있는 18세 내지 65세(18세와 65세 포함) 여성이었다. 후보자는 포함/제외 기준을 충족하는 건강한 여성의 풀에서 모집되었다. 포함 기준은 하기와 같았다: a) 18세 내지 65세 여성; b) Fitzpatrick 피부 유형 I-II; c) 고지에 입각한 동의서를 읽고, 이해하고 서명할 수 있음; d) Sebumeter®로 측정 시 이마에 중간 내지 심각한 피지가 있음; e) PSV/DOT 방문 시 깨끗한 얼굴로 올 수 있어야 함(마지막 세안 후 도포된 메이크업 또는 국소 제품이 없어야 함); f) 방문 시 모자, 가발 또는 다른 머리 가리개를 착용하지 않고, 방문 동안 이마에 모발이 닿지 않도록 머리띠를 착용하거나 제공받기로 동의함; g) 모든 연구 요구사항 및 제한사항을 따를 의향과 능력이 있음.

제외 기준은 하기와 같았다: a) 인터뷰에 의해 결정된 바, 임신, 수유 또는 임신 계획 중임; b) 스킨케어 제품, 화장품, 보습제, 자외선 차단제, 향수 또는 IP 내 임의의 성분에 대해 임의의 알려진 민감성 또는 알레르기가 있음; 시험 부위에 연구에 방해가 될 수 있는 임의의 문신, 자국, 흉터, 생채기, 점 또는 다른 잡티가 있음; d) 얼굴에 지성 피부 이외의 피부 상태가 있음(예를 들어, 건선, 습진 등); e) 연구 방문 전 30일 이내에 COVID-19 감염이 확인되었거나 의심되는 병력이 있음; f) 연구 방문 전 14일 이내에 COVID-19 감염된 사람 또는 사람들과 접촉했음; g) 연구 방문 전 14일 이내에 개인 또는 개인의 가족 구성원이 해외 여행을 한 적이 있음; h) 연구 방문 전 2주 이내에 COVID-19의 하기 자가 진단 증상 중 임의의 것을 경험한 적이 있음; i) 현재 또 다른 연구에 참여 중이거나 본 연구 기간 동안 또 다른 연구에 참여할 계획이 있음; j) Dermico Lab, 수석 연구원 또는 연구 후원자의 직원, 계약자 또는 직계 가족임; j) 수석 연구원 또는 그의 정당하게 지정된 대리인이 피부 반응 또는 시험 결과 해석에 영향을 미칠 수 있다고 여긴 기타 조건 또는 요인.

이마 위 3개의 부위에서 광택의 기준선(BL) 측정을 수집하였다. 2개의 부위(각 눈 위에 하나씩)를 무작위 방식으로 처리하였으며, 콧대 위 중앙 부위는 대조군으로 작용하도록 미처리된 상태로 유지하였다. 빈 비히클 크림 제형과 2% 18B 단백질 제형의 2가지 제품을 시험하였다. 비히클 대조군에는 하기가 함유되어 있었다: 물(>50%), 카프릴산/카프르산 트리글리세리드(5% 내지 15%), 올리브유 글리세레스-8 에스테르(1% 내지 5%), 글리세린(1% 내지 5%), 히드록시에틸 아크릴레이트/소듐 아크릴로일디메틸 타우레이트 공중합체(1% 내지 5%), 페녹시에탄올(0.1% 내지 1%), 카프릴릴 글리콜(0.1% 내지 1%), 클로르페네신(0.1% 내지 1%), 토코페롤(0.1% 내지 1%), 디소듐 EDTA(0.01% 내지 0.1%).

처리 절차는 하기와 같았다: 대략 32 mg의 시험 제품을 마이크로피펫을 사용하여 지정된 4 cm x 4 cm 시험 부위에 도포하였다. 제품을 깨끗한 골무를 사용하여 시험 부위 위에 펴 바르고, 완전히 흡수될 때까지 마사지하였다. 대상을 대략 30분 동안 제어된 환경에서 기다리게 하고, 광택 측정을 반복하였다.

이러한 표면에 전달된 광의 직접 반사 측정으로 표면의 광택을 표시하였다. GL 200 프로브 헤드에서, 평행한 백색 광을 0° 각도로 거울에 보냈고, 거울은 이를 60° 각도로 피부 표면에 반사하였다. 광의 일부는 동일한 각도로 직접 반사되었고, 광의 일부는 표면에 의해 흡수되고, 산란되어 상이한 각도로 반사되었다. 직접 반사된 광은 또 다른 거울에서 광 센서로 반사되었다. 확산되어 산란된 광이 또한 피부에 대해 0° 각도에서 위를 향하는 상이한 센서로 측정되었다. 이러한 확산되어 산란된 광은 상이한 개별 피부의 구조, 밝기 및 색상으로 인한 가변성을 제한하거나 제거하기 위해 시도된 확산 산란 보정(DSC)을 가능하게 하였다.

도 18은, 재조합 18B 분말이 빈 비히클과 비교 시 피부에 대한 매트화 효과를 나타냈음을 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> BOLT THREADS, INC. <120> RECOMBINANT SILK COMPOSITIONS AND METHODS OF MAKING THEREOF <130> BTT-037WO <140> PCT/US2021/042084 <141> 2021-07-16 <150> 63/055,894 <151> 2020-07-23 <160> 1406 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 945 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Gly Gln Gln Gly 20 25 30 Pro Gly Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly 35 40 45 Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro 50 55 60 Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly 65 70 75 80 Ser Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Gln 85 90 95 Gln Gly Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gly Ser Gly Gly Gln Gln Gly Pro 100 105 110 Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala 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Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Ala 130 135 140 Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Arg Ala Gly Ala Gly Gly 165 170 <210> 1116 <400> 1116 000 <210> 1117 <400> 1117 000 <210> 1118 <400> 1118 000 <210> 1119 <400> 1119 000 <210> 1120 <400> 1120 000 <210> 1121 <400> 1121 000 <210> 1122 <400> 1122 000 <210> 1123 <400> 1123 000 <210> 1124 <400> 1124 000 <210> 1125 <400> 1125 000 <210> 1126 <400> 1126 000 <210> 1127 <400> 1127 000 <210> 1128 <400> 1128 000 <210> 1129 <400> 1129 000 <210> 1130 <400> 1130 000 <210> 1131 <400> 1131 000 <210> 1132 <400> 1132 000 <210> 1133 <400> 1133 000 <210> 1134 <400> 1134 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Ala Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Ser Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Gly Tyr Gly 130 135 140 Gln Gly Gln Gly Ala 145 <210> 1227 <400> 1227 000 <210> 1228 <400> 1228 000 <210> 1229 <400> 1229 000 <210> 1230 <400> 1230 000 <210> 1231 <400> 1231 000 <210> 1232 <400> 1232 000 <210> 1233 <400> 1233 000 <210> 1234 <211> 161 <212> PRT <213> Trichonephila clavipes <400> 1234 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly 1 5 10 15 Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala 50 55 60 Gly Tyr Ser Arg Gly Gly Arg Ala Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly 65 70 75 80 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 85 90 95 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Ala Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly 130 135 140 Tyr Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala <210> 1235 <400> 1235 000 <210> 1236 <400> 1236 000 <210> 1237 <400> 1237 000 <210> 1238 <400> 1238 000 <210> 1239 <211> 186 <212> PRT <213> Nephilingis cruentata <400> 1239 Gly Ala Gly Ala Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gly Ala Ala Ala 20 25 30 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Thr 35 40 45 Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 50 55 60 Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 65 70 75 80 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Asp Gly Ala Gly Ala 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala 130 135 140 Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala 145 150 155 160 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 165 170 175 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 <210> 1240 <400> 1240 000 <210> 1241 <400> 1241 000 <210> 1242 <400> 1242 000 <210> 1243 <400> 1243 000 <210> 1244 <400> 1244 000 <210> 1245 <400> 1245 000 <210> 1246 <211> 132 <212> PRT <213> Uloborus diversus <400> 1246 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser 20 25 30 Ala Ile Asn Thr Gln Thr Val Thr Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Gln 35 40 45 Ser Ser Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Tyr Gly Thr Gly Ala Gly Thr 50 55 60 Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Gly 65 70 75 80 Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Arg Ala Ala 85 90 95 Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser 100 105 110 Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Tyr Gly Ala 115 120 125 Gly Ala Ala Ala 130 <210> 1247 <400> 1247 000 <210> 1248 <400> 1248 000 <210> 1249 <211> 198 <212> PRT <213> Uloborus diversus <400> 1249 Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Arg Gly Gln Ala Gly Tyr Ile Gln Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Val Gly Tyr Gly 20 25 30 Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg 65 70 75 80 Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Gly Ala Asp Ala Gly Tyr Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Tyr 115 120 125 Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala 130 135 140 Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Tyr Leu Gly Gln Ala Gly Tyr Gly 145 150 155 160 Gln Gly Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly 165 170 175 Tyr Gly Gly Gln Ala Gly Tyr Gly Gln Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ser 180 185 190 Ala Ala Ala Ser Ser Ala 195 <210> 1250 <400> 1250 000 <210> 1251 <400> 1251 000 <210> 1252 <400> 1252 000 <210> 1253 <400> 1253 000 <210> 1254 <400> 1254 000 <210> 1255 <400> 1255 000 <210> 1256 <400> 1256 000 <210> 1257 <400> 1257 000 <210> 1258 <400> 1258 000 <210> 1259 <400> 1259 000 <210> 1260 <400> 1260 000 <210> 1261 <400> 1261 000 <210> 1262 <400> 1262 000 <210> 1263 <400> 1263 000 <210> 1264 <400> 1264 000 <210> 1265 <400> 1265 000 <210> 1266 <400> 1266 000 <210> 1267 <400> 1267 000 <210> 1268 <400> 1268 000 <210> 1269 <400> 1269 000 <210> 1270 <400> 1270 000 <210> 1271 <400> 1271 000 <210> 1272 <400> 1272 000 <210> 1273 <400> 1273 000 <210> 1274 <400> 1274 000 <210> 1275 <400> 1275 000 <210> 1276 <400> 1276 000 <210> 1277 <400> 1277 000 <210> 1278 <400> 1278 000 <210> 1279 <400> 1279 000 <210> 1280 <400> 1280 000 <210> 1281 <400> 1281 000 <210> 1282 <400> 1282 000 <210> 1283 <400> 1283 000 <210> 1284 <400> 1284 000 <210> 1285 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Gly Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly 50 55 60 Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala 85 90 95 Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Gly 130 135 140 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly 145 150 155 160 Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly 165 170 175 Arg Gln Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 180 185 190 <210> 1313 <400> 1313 000 <210> 1314 <400> 1314 000 <210> 1315 <400> 1315 000 <210> 1316 <400> 1316 000 <210> 1317 <400> 1317 000 <210> 1318 <400> 1318 000 <210> 1319 <400> 1319 000 <210> 1320 <400> 1320 000 <210> 1321 <400> 1321 000 <210> 1322 <400> 1322 000 <210> 1323 <400> 1323 000 <210> 1324 <400> 1324 000 <210> 1325 <400> 1325 000 <210> 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Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 100 105 110 Gly Tyr Gly Gln Gly Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gln Gly 130 135 140 Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Ala Ser Ala Ala Ala Ala 165 <210> 1346 <400> 1346 000 <210> 1347 <400> 1347 000 <210> 1348 <400> 1348 000 <210> 1349 <400> 1349 000 <210> 1350 <400> 1350 000 <210> 1351 <400> 1351 000 <210> 1352 <400> 1352 000 <210> 1353 <400> 1353 000 <210> 1354 <400> 1354 000 <210> 1355 <400> 1355 000 <210> 1356 <400> 1356 000 <210> 1357 <400> 1357 000 <210> 1358 <400> 1358 000 <210> 1359 <400> 1359 000 <210> 1360 <400> 1360 000 <210> 1361 <400> 1361 000 <210> 1362 <400> 1362 000 <210> 1363 <400> 1363 000 <210> 1364 <400> 1364 000 <210> 1365 <400> 1365 000 <210> 1366 <400> 1366 000 <210> 1367 <400> 1367 000 <210> 1368 <400> 1368 000 <210> 1369 <400> 1369 000 <210> 1370 <400> 1370 000 <210> 1371 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Gly Ala Gly Gln Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala 165 170 <210> 1384 <211> 181 <212> PRT <213> Aliatypus gulosus <400> 1384 Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Ile Ile Thr Thr Lys Ser Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Ala Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ser Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Ser Ser Ala Asn Ala Ala Ala Ser Ala Phe Ala Gln Ser Phe 35 40 45 Ser Ser Ile Leu Leu Glu Ser Gly Tyr Phe Cys Ser Ile Phe Gly Ser 50 55 60 Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Ile Ala Ser Ala Ala Ser Arg 65 70 75 80 Ala Ala Ala Glu Ser Asn Gly Tyr Thr Thr His Ala Tyr Ala Cys Ala 85 90 95 Lys Ala Val Ala Ser Ala Val Glu Arg Val Thr Ser Gly Ala Asp Ala 100 105 110 Tyr Ala Tyr Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ala Leu Ser His Ala Leu Leu 115 120 125 Tyr Thr Gly Arg Leu Asn Thr Ala Asn Ala Asn Ser Leu Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Ala Tyr Ala Phe Ala Asn Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Ser Ser 145 150 155 160 Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ser Ala Ser Gly Ala Ala Ser Ala Ser Gly 165 170 175 Ala Gly Ser Ala Ser 180 <210> 1385 <211> 126 <212> PRT <213> Plectreurys tristis <400> 1385 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ala Ser Thr Ser Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ser Gly Ala Gly Ala 35 40 45 Gly Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 50 55 60 Phe Gly Ser Gly Leu Gly Leu Gly Tyr Gly Val Gly Leu Ser Ser Ala 65 70 75 80 Gln Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Ala Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala 85 90 95 Gln Ala Gln Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala Gln Ala 100 105 110 Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 <210> 1386 <211> 239 <212> PRT <213> Plectreurys tristis <400> 1386 Gly Ala Ala Gln Lys Gln Pro Ser Gly Glu Ser Ser Val Ala Thr Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Thr Ser Val Thr Ser Gly Gly Ala Pro Val Gly Lys 20 25 30 Pro Gly Val Pro Ala Pro Ile Phe Tyr Pro Gln Gly Pro Leu Gln Gln 35 40 45 Gly Pro Ala Pro Gly Pro Ser Asn Val Gln Pro Gly Thr Ser Gln Gln 50 55 60 Gly 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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 1398 <211> 42 <212> PRT <213> Argiope aurantia <400> 1398 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Gln Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ser Gly Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gly Leu Gly Pro Tyr Gly 20 25 30 Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 1399 <211> 46 <212> PRT <213> Deinopis spinosa <400> 1399 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gln Tyr Gly Pro Gly Thr Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Ser Gly Gln 20 25 30 Gln Gly Pro Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 <210> 1400 <211> 42 <212> PRT <213> Trichonephila clavata <400> 1400 Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Leu Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly 1 5 10 15 Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ala Gly Tyr Gly Pro Ser Gly Leu Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 <210> 1401 <211> 1600 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> SITE <222> (7)..(11) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (15)..(19) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (23)..(27) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (31)..(35) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (39)..(43) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (47)..(51) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (55)..(59) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (63)..(67) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (4)..(67) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (71)..(80) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (87)..(91) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (95)..(99) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (103)..(107) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (111)..(115) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (119)..(123) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (127)..(131) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (135)..(139) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (143)..(147) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (84)..(147) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (151)..(160) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (167)..(171) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (175)..(179) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (183)..(187) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (191)..(195) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (199)..(203) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (207)..(211) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (215)..(219) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (223)..(227) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (164)..(227) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (231)..(240) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (247)..(251) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (255)..(259) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (263)..(267) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (271)..(275) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (279)..(283) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (287)..(291) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (295)..(299) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (303)..(307) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (244)..(307) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (311)..(320) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (327)..(331) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (335)..(339) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (343)..(347) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (351)..(355) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (359)..(363) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (367)..(371) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (375)..(379) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (383)..(387) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (324)..(387) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (391)..(400) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (407)..(411) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (415)..(419) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (423)..(427) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (431)..(435) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (439)..(443) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some 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4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (551)..(560) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (567)..(571) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (575)..(579) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (583)..(587) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (591)..(595) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (599)..(603) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (607)..(611) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (615)..(619) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (623)..(627) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (564)..(627) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (631)..(640) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (647)..(651) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (655)..(659) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (663)..(667) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (671)..(675) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (679)..(683) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (687)..(691) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (695)..(699) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (703)..(707) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (644)..(707) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (711)..(720) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (727)..(731) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (735)..(739) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (743)..(747) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (751)..(755) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (759)..(763) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (767)..(771) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," 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"GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (831)..(835) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (839)..(843) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (847)..(851) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (855)..(859) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (863)..(867) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (804)..(867) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (871)..(880) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (887)..(891) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (895)..(899) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (903)..(907) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (911)..(915) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (919)..(923) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (927)..(931) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (935)..(939) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (943)..(947) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (884)..(947) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (951)..(960) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (967)..(971) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (975)..(979) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (983)..(987) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (991)..(995) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (999)..(1003) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1007)..(1011) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1015)..(1019) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1023)..(1027) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (964)..(1027) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1031)..(1040) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1047)..(1051) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1055)..(1059) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1063)..(1067) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1071)..(1075) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1079)..(1083) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1087)..(1091) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1095)..(1099) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1103)..(1107) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1044)..(1107) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1111)..(1120) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1127)..(1131) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1135)..(1139) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1143)..(1147) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1151)..(1155) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1159)..(1163) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1167)..(1171) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1175)..(1179) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1183)..(1187) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1124)..(1187) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1191)..(1200) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1207)..(1211) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1215)..(1219) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1223)..(1227) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1231)..(1235) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1239)..(1243) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1247)..(1251) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1255)..(1259) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1263)..(1267) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1204)..(1267) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1271)..(1280) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1287)..(1291) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1295)..(1299) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1303)..(1307) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1311)..(1315) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1319)..(1323) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1327)..(1331) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1335)..(1339) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1343)..(1347) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1284)..(1347) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1351)..(1360) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> 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"SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1479)..(1483) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1487)..(1491) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1495)..(1499) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1503)..(1507) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1444)..(1507) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1511)..(1520) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1527)..(1531) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1535)..(1539) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1543)..(1547) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1551)..(1555) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1559)..(1563) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1567)..(1571) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1575)..(1579) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1583)..(1587) <223> This region may encompass "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," wherein some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1524)..(1587) <223> This region may encompass 4-8 repeating "GPG-X1" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," and some positions may be absent <220> <221> SITE <222> (1591)..(1600) <223> This region may encompass 6-10 residues <220> <221> SITE <222> (1)..(1600) <223> This sequence may encompass 2-20 "GGY-[GPG-X1]n1-GPS-(A)n2" repeating units, wherein X1 is "SGGQQ," "GAGQQ," "GQGPY," "AGQQ" or "SQ," n1 is 4-8 and n2 is 6-10 and some positions may be absent <400> 1401 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 35 40 45 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 50 55 60 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 85 90 95 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 100 105 110 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 115 120 125 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 130 135 140 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 165 170 175 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 180 185 190 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 195 200 205 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 210 215 220 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 225 230 235 240 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 245 250 255 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 260 265 270 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 275 280 285 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 290 295 300 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 305 310 315 320 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 325 330 335 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 340 345 350 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 355 360 365 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 370 375 380 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 385 390 395 400 Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 405 410 415 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 420 425 430 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 435 440 445 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Gly Xaa Xaa 450 455 460 Xaa Xaa Xaa Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 465 470 475 480 Gly Gly 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Claims (127)

1. 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 실크 기반 조성물을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 입자가 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 외부 쉘에 개구부를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 건조 분말 형태인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 용매가 수성 용매, 알코올, 유성 용매 또는 실리콘을 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 용매가 물, 글리세린, 탈이온수, 올리브유, 펜틸렌 글리콜 및 실리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 용매용 담체인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 재조합 거미 실크 입자가 용매와 혼합 시 팽윤되는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 건조한 경우, 상기 외부 쉘의 직경이 5 μm 내지 25 μm인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 외부 쉘의 직경이 용매와 혼합 시 최대 120 μm까지 팽윤되는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 외부 쉘 두께가 상기 재조합 실크 입자 직경의 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 복수의 재조합 실크 입자를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 용매에서 1% wt/wt 내지 10% wt/wt의 농도로 상기 조성물에 존재하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 재조합 거미 실크를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 폴리펩타이드를 적어도 1 중량% 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 수불용성인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 비드인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 분말이 분무 건조된 것인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
20. 제1항에 있어서, 재조합 실크 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 분무 건조시켜 상기 재조합 실크 입자를 포함하는 건조 분말을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 염료를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 계면활성제 또는 습윤제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하는 단계가 중공 코어를 팽창시키는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물이 화장품 또는 스킨케어 제형인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물이 피부의 탱탱함, 탄력, 전반적인 피부 건강, 상처 치유 또는 외관을 개선시키는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물을 피부에 도포하면 산화 스트레스가 감소하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 산화 스트레스가 기저 수준의 산화 스트레스, 청색광 조사에 의해 야기되는 산화 스트레스, 오염 유도 산화 스트레스, UVA 유도 산화 스트레스 및 UVB 산화 스트레스로 이루어지는 군에서 선택되는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
28. 제1항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물을 피부에 도포하면 피부의 표면이 매트해지는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
29. 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 실크 기반 조성물을 형성하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 입자가 용매용 담체이고, 재조합 실크 입자가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
30. 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와 용매를 혼합하여 실크 기반 조성물을 형성하는 단계(여기서 재조합 실크 입자는 용매용 담체로 기능함);
    실크 기반 조성물을 표면에 도포하는 단계; 및
    실크 기반 조성물을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 포함하는, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 표면이 피부, 모발 또는 손발톱을 포함하는, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 건조된 실크 기반 조성물이 상기 표면 상에 장벽을 형성하는, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 장벽이 실질적으로 균질한, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
34. 제30항에 있어서, 상기 실크 기반 고체 또는 히드로겔이 비드인, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
35. 제30항에 있어서, 상기 실크 기반 고체 또는 히드로겔이 필름인, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
36. 제30항에 있어서, 상기 실크 기반 고체 또는 히드로겔이 화장품 또는 스킨케어 제형인, 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 제조하는 방법.
37. 실크 단백질 분말과 용매를 포함하는 실크 기반 제형을 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 재조합 실크 분말이 중공 코어를 포함하며 용매용 담체인, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 재조합 실크 분말이 용매용 담체인, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
39. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 조성물 또는 재조합 실크 입자에 염료를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
40. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 제형을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
41. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 제형을 에멀젼에 혼합하여 실크 기반 에멀젼을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 실크 기반 에멀젼을 건조시켜 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
43. 제40항 또는 제42항에 있어서, 첨가제와 실크 기반 고체 또는 히드로겔을 혼합하여 강화된 실크 기반 제형을 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
44. 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 실크 기반 제형을 응집시켜 실크 기반 제형 중에 응집된 실크를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
45. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 제형이 겔상을 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
46. 제37항에 있어서, 상기 실크 단백질 분말이 재조합 거미 실크인, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 재조합 실크가 전장 실크 단백질을 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
48. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 제형이 스킨케어 또는 화장품 제형인, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
49. 제37항에 있어서, 상기 용매가 수성 용매, 알코올, 유성 용매 또는 실리콘을 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
50. 제49항에 있어서, 상기 알코올이 글리세롤인, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
51. 제49항에 있어서, 상기 유성 용매가 유리 지방산을 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 유리 지방산이 올리브유, 포도씨유 또는 트리글리세리드를 포함하는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
53. 제37항에 있어서, 상기 실크 기반 제형이 피부 또는 물과 접촉하거나 부드럽게 문지르면 분산되는, 실크 기반 제형을 제조하는 방법.
54. 외부 쉘과 상기 외부 쉘 내 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는 조성물.
55. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 용매용 담체를 형성하도록 적합화된 것인, 조성물.
56. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 분말 형태인, 조성물.
57. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 재조합 거미 실크를 포함하는, 조성물.
58. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 외부 쉘에 개구부를 포함하는, 조성물.
59. 제54항에 있어서, 용매를 추가로 포함하는, 조성물.
60. 제59항에 있어서, 상기 용매가 수성 용매, 알코올, 유성 용매 또는 실리콘을 포함하는, 조성물.
61. 제79항에 있어서, 상기 용매가 물, 글리세린, 탈이온수, 올리브유, 펜틸렌 글리콜 및 실리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는, 조성물.
62. 제59항에 있어서, 상기 재조합 거미 실크 입자가 건조 상태와 비교하여 용매와 혼합 시 팽윤되는, 조성물.
63. 제59항에 있어서, 복수의 재조합 실크 입자를 포함하는, 조성물.
64. 제63항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 용매에서 1% wt/wt 내지 10% wt/wt의 농도로 상기 조성물에 존재하는, 조성물.
65. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 건조한 경우, 상기 외부 쉘의 직경이 5 μm 내지 25 μm인, 조성물.
66. 제65항에 있어서, 상기 외부 쉘의 직경이 용매와 혼합 시 최대 120 μm까지 팽윤되는, 조성물.
67. 제54항에 있어서, 상기 외부 쉘 두께가 상기 재조합 실크 입자 직경의 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만인, 조성물.
68. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
69. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
70. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 수불용성인, 조성물.
71. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 쉘을 포함하는, 조성물.
72. 제54항에 있어서, 상기 분말이 분무 건조된 것인, 조성물.
73. 제54항에 있어서, 피부의 각질을 벗겨내는, 조성물.
74. 제54항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 염색된 것인, 조성물.
75. 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는 재조합 실크 입자와,
    용매를 포함하는 조성물.
76. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 용매용 담체인, 조성물.
77. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 외부 쉘에 개구부를 포함하는, 조성물.
78. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 분말 형태인, 조성물.
79. 제75항에 있어서, 상기 용매가 수성 용매, 알코올, 유성 용매 또는 실리콘을 포함하는, 조성물.
80. 제79항에 있어서, 상기 용매가 물, 글리세린, 탈이온수, 올리브유, 펜틸렌 글리콜 및 실리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는, 조성물.
81. 제79항에 있어서, 상기 재조합 거미 실크 입자가 용매와 혼합 시 팽윤되는, 조성물.
82. 제79항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 건조한 경우, 상기 외부 쉘의 직경이 5 μm 내지 25 μm인, 조성물.
83. 제82항에 있어서, 상기 외부 쉘의 직경이 용매와 혼합 시 최대 120 μm까지 팽윤되는, 조성물.
84. 제79항에 있어서, 상기 외부 쉘 두께가 상기 재조합 실크 입자 직경의 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만인, 조성물.
85. 제79항에 있어서, 복수의 재조합 실크 입자를 포함하는, 조성물.
86. 제85항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 용매에서 1% wt/wt 내지 10% wt/wt의 농도로 상기 조성물에 존재하는, 조성물.
87. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 조성물.
88. 제87항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는, 조성물.
89. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 수불용성인, 조성물.
90. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 쉘을 포함하는, 조성물.
91. 제75항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 비드인, 조성물.
92. 제75항에 있어서, 상기 분말이 분무 건조된 것인, 조성물.
93. 제75항에 있어서, 계면활성제 또는 습윤제를 포함하는, 조성물.
94. 제75항에 있어서, 상기 중공 코어가 용매에 의해 팽창되는, 조성물.
95. 제75항에 있어서, 화장품 또는 스킨케어 제형인, 조성물.
96. 제75항에 있어서, 피부를 세정하는, 조성물.
97. 제75항에 있어서, 염료를 추가로 포함하는, 조성물.
98. 실크 단백질 입자와 용매를 포함하며, 여기서 실크 단백질 입자가 중공 코어를 포함하고 용매를 운반하는 실크 화장품 또는 스킨케어 제품.
99. 제98항에 있어서, 상기 실크 단백질 입자가 수불용성인, 조성물.
100. 제98항에 있어서, 상기 실크 화장품 또는 스킨케어 제품이 고체, 히드로겔 또는 필름인, 조성물.
101. 반고체를 포함하며, 여기서 반고체가 분산되어 응집되지 않은 재조합 실크 단백질과 용매를 포함하는 재조합 실크 화장품 또는 스킨케어 제품.
102. 제101항에 있어서, 상기 반고체가 피부와 접촉 시 잔류물을 제거하는, 재조합 실크 화장품 또는 스킨케어 제품.
103. 제101항에 있어서, 상기 반고체가 히드로겔인, 재조합 실크 화장품 또는 스킨케어 제품.
104. 제54항 내지 제103항 중 어느 한 항의 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부의 외관을 개선시키는 방법.
105. 제104항에 있어서, 상기 조성물이 재조합 실크 단백질을 약 1 wt% 포함하는, 피부의 외관을 개선시키는 방법.
106. 제104항에 있어서, 상기 재조합 실크 단백질이 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 피부의 외관을 개선시키는 방법.
107. 제104항에 있어서, 피부의 개선된 외관이 피부 탱탱함/팽팽함 증가, 탄력 증가, 전반적인 피부 건강 증가, 수분 공급 증가, 상처 치유 개선, 산화 스트레스 수준 감소, 오염 유도 산화 스트레스 약화, UVA 또는 UVB 유도 산화 스트레스 약화, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군에서 선택되는 적어도 하나의 결과를 제공하는, 피부의 외관을 개선시키는 방법.
108. 제54항 내지 제103항 중 어느 한 항의 조성물을 표면에 도포하여 필름 또는 비드를 형성하는 단계; 및
     표면에서 필름 또는 비드를 제거하는 단계를 포함하는, 표면을 세정하는 방법.
109. 재조합 실크를 포함하는 조성물을 건조시켜 재조합 실크 입자를 포함하는 건조된 분말을 형성하는 단계를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
110. 제109항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 담체로 작용하도록 적합화된 것인, 실크 기반 조성물을 제조하는 방법.
112. 재조합 실크 단백질을 포함하는 건조된 분말을 포함하는 조성물.
113. 제112항에 있어서, 상기 건조된 분말이 중공 코어와 외부 쉘을 포함하는 재조합 실크 입자를 포함하는, 조성물.
114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 담체로 작용하도록 적합화된 것인, 조성물.
115. 정제된 실크 단백질 용액을 수득하는 단계; 및
     상기 실크 단백질 용액의 수분이 3 중량% 이하가 될 때까지 상기 용액을 고온의 건조한 공기에 분무하여 실크 분말을 형성하는 단계(여기서 상기 실크 분말은 재조합 실크 입자를 포함함)를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
116. 제115항에 있어서, 상기 실크 분말을 여과하여 상기 실크 분말에서 큰 입자를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자의 입자 직경 중앙값이 20 μm 내지 50 μm인, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
118. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 외부 쉘과 중공 코어를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
119. 제118항에 있어서, 상기 외부 쉘 두께가 상기 재조합 실크 입자 직경의 20% 미만, 15% 미만 또는 10% 미만인, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
120. 제118항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 상기 외부 쉘에 개구부를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
121. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 용매와 혼합 시 팽윤되는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
122. 제121항에 있어서, 상기 용매가 물, 글리세린, 탈이온수, 올리브유, 펜틸렌 글리콜 및 실리콘으로 이루어지는 군에서 선택되는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
123. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 재조합 거미 실크를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
124. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 서열번호 2를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
125. 제124항에 있어서, 상기 폴리펩타이드가 서열번호 2의 적어도 2개의 연결된 반복 단위를 포함하는, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
126. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 수불용성인, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
127. 제115항에 있어서, 상기 재조합 실크 입자가 비드인, 재조합 실크 입자를 포함하는 실크 분말을 제조하는 방법.
     

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