CN118103024A - 无动物化妆品胶原 - Google Patents

Abstract

本文提供了包含非天然存在的多肽(诸如包含相对于全长胶原的一个或多个截短的非天然存在的多肽)的化妆品(例如，表面)制剂。本文提供的化妆品(例如，表面)制剂可用于个人护理产品(例如，化妆品)中。

Description

无动物化妆品胶原

交叉引用

本申请要求于2021年7月28日提交的美国临时申请号63/226,425的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

胶原是在体内各种结缔组织(包括肌腱、韧带、皮肤和头发)中发现的最丰富的蛋白质之一。胶原或胶原补充剂在医疗、化妆品和/或健康目的中受欢迎(例如，刺激皮肤生长、促进伤口愈合、强化指/趾甲或关节等)。大多数胶原补充剂的胶原衍生自动物，作为动物加工业的副产品。然而，这种衍生自动物的胶原可能会增加疾病传播和过敏的风险。此外，某些消费者通常出于各种其他原因对无动物的产品感兴趣。因此，仍然需要改进衍生自非动物来源的胶原的组合物和方法。

发明内容

在本公开内容的一个方面，提供了一种化妆品制剂，其包含：多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，其中所述化妆品制剂选自：霜剂、凝胶、凝胶霜、油、软膏、精华液、泡沫、洗剂、糊剂、香膏、溶液、混悬剂或粉末。在一些情况下，所述化妆品制剂为霜剂、凝胶霜或粉末。

另一方面，提供了化妆品制剂，其包含：(i)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；和(ii)一个或多个附加成分，所述一个或多个附加成分选自：乙酰丙酸、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、十一烯酸甘油酯、Simmondsia chinensis(霍霍巴)籽油、聚丙烯酸酯交联聚合物、角鲨烷、透明质酸钠、丙烯酸聚合物(卡波姆)、戊二醇、月桂醇磺基乙酸酯钠、油酰肌氨酸钠、油酸钠、Ricinuscommunis(蓖麻)籽油、Copernicia cerifera(巴西棕榈)蜡、小烛树蜡、Theobroma cacao(可可)籽脂、异壬酸异壬酯、地蜡、三异硬脂酸钛酸异丙酯、聚羟基硬脂酸、氧化铁、二氧化钛、乙酰丙酸钠和羟丙基瓜尔胶。

在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ ID NO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。在任何前述实施方案中，所述N末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。在任何前述实施方案中，所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在任何前述实施方案中，所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。在任何前述实施方案中，所述多肽的长度为至少50个氨基酸。在任何前述实施方案中，所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。在任何前述实施方案中，所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。在任何前述实施方案中，所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。在任何前述实施方案中，所述多肽为单体的。在任何前述实施方案中，所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。在任何前述实施方案中，所述多肽基本上不含其他胶原链。在任何前述实施方案中，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。在任何前述实施方案中，所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。在任何前述实施方案中，所述多肽为非羟基化的。在任何前述实施方案中，相对于天然存在的胶原，所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。在任何前述实施方案中，所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。在任何前述实施方案中，所述多肽以0.001％至30％w/w的量存在于所述化妆品制剂中。在任何前述实施方案中，所述化妆品制剂被配制用于表面施用。在任何前述实施方案中，所述化妆品制剂被配制用于施用于个体的皮肤或头发。在任何前述实施方案中，所述化妆品制剂进一步包含表面载体。在任何前述实施方案中，所述表面载体选自：脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾、气雾剂、扑粉、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、甘油单硬脂酸酯、醇、乳化剂、液体石油、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅酮、环戊硅氧烷和水。在任何前述实施方案中，所述化妆品制剂进一步包含防腐剂。在任何前述实施方案中，所述防腐剂选自：生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、苯氧乙醇、丁二醇、1,2己二醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、II、迷迭香提取物和乙二胺四乙酸(EDTA)。

在另一个方面，提供了个人护理产品，其包含任何前述实施方案中的所述化妆品制剂。在一些实施方案中，个人护理产品选自：所述个人护理产品选自：面膜、皮肤清洁剂、清洁霜、清洁洗剂、面部洗剂、身体洗剂、沐浴露、止汗剂、除臭剂、剃须膏、脱毛剂、面油、唇油、身体油、面部清洁剂、清洁乳、清洁贴、面部清洗剂、面部霜剂和身体霜剂和面部保湿剂、身体保湿剂、面部精华液、面部面膜、身体面膜、面部爽肤水、面部喷雾、眼部霜剂、眼部精华液、去角质配方、唇部香膏、唇膏、洗发水、护发素、沐浴露、头发精华液、头皮精华液、头发雾剂、头发喷雾、粉底、有色多功能霜、眼影、遮瑕膏、睫毛膏及其任何组合。

在又一个方面，提供了一种促进、改善和/或维持个体的年轻的皮肤的方法，所述方法包括：将任何前述实施方案中的化妆品制剂或个人护理产品施用于所述个体的皮肤，从而促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的紧致度。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的紧致度包括基于测量所述皮肤对负压的抵抗力(例如，使用)，使皮肤紧致度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的弹性。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的弹性包括基于测量变形后所述皮肤返回其原始位置的能力(例如，使用/>)，使皮肤弹性(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的亮度。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的亮度包括如由临床分级专家确定的使所述皮肤的亮度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的水合作用。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的水合作用包括基于所述皮肤的电容测量(例如，使用/>)，使皮肤水合作用(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的触觉质地。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的胶原含量。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的弹性蛋白含量。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的发红。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的发红包括如由临床分级专家确定的使所述皮肤的发红(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的视觉质地。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的细纹和/或皱纹。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的细纹和/或皱纹包括如由临床分级专家确定的使细纹和/或皱纹(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的表皮厚度。在一些实施方案中，改善所述个体的所述皮肤的表皮厚度包括如通过反射共焦显微镜(例如，使用/>)测量的使表皮厚度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的角质形成细胞生长和/或再生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的胶原产生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，在所述施用之后，所述皮肤中的成纤维细胞迁移、增殖和/或黏附增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，在所述施用之后，暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。在一些实施方案中，在所述施用之后，涉及选自以下信号传导通路的一个或多个基因的表达增加：VEGFA/VEGFR2信号传导通路、黏着斑信号传导通路、内皮素信号传导通路、EGF/EGFR信号传导通路、TGF-β信号传导通路及其任何组合。在一些实施方案中，其中涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的所述一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。在一些实施方案中，涉及黏着斑信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。在一些实施方案中，涉及内皮素信号传导通路的所述一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。在一些实施方案中，涉及EGF/EGFR信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。在一些实施方案中，涉及TGF-β信号传导通路的所述一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。

通过下面的详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述本公开内容的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。

附图说明

本文公开的主题的新颖特征在所附权利要求书中特别阐述。通过参考以下对其中利用了本文公开的主题的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将获得对本文公开的主题的特征和优点的更好理解，在附图中：

图1描绘了本公开内容的非天然存在的多肽与相应的天然存在的胶原的比对。图1公开了SEQ ID NO：33(SEQ ID NO：31的亚组)。

图2描绘了本公开内容的非天然存在的多肽与相应的天然存在的胶原的比对。图2公开了SEQ ID NO：34(SEQ ID NO：32的亚组)。

图3描绘了两种SDS-PAGE凝胶的图像，其显示来自微生物细胞培养物的上清液样品中的胶原蛋白条带。每个蛋白质的身份均标在每个条带上方。

图4A-图4C描绘了显示本公开内容的非天然存在的多肽在pH3.0处理之前和之后的条带的SDS-PAGE凝胶图像。

图5描绘了pH、多肽浓度和温度对本公开内容的示例性非天然存在的多肽的溶解时间的影响。

图6描绘了pH、多肽浓度和温度对含有本公开内容的示例性非天然存在的多肽的溶液的浊度的影响。

图7A和图7B描绘了pH和温度对含有本公开内容的示例性非天然存在的多肽的粉末的稳定性的影响，如通过多肽总量测量的。

图8A和图8B描绘了pH和温度对含有本公开内容的示例性非天然存在的多肽的粉末的稳定性的影响，如通过％全长多肽/降解测量的。

图9A-图9C描绘了pH和温度对含有本公开内容的示例性非天然存在的多肽的溶液的黏度的影响。

图10A-图10C描绘了pH和温度对含有本公开内容的示例性非天然存在的多肽的溶液的黏度的影响。

图11描绘了与基准相比，用本公开内容的示例性非天然存在的多肽处理的皮肤模型基底的紧致度增加。

图12A-图12C描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后永生化人角质形成细胞细胞系、人原代成纤维细胞和人原代角质形成细胞的活力。

图13描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后人原代角质形成细胞的增殖的剂量依赖性增加。

图14描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后原代人成纤维细胞产生的I型胶原的剂量依赖性增加。

图15描绘了在暴露于本公开内容的示例性非天然存在的多肽之后人真皮成纤维细胞的伤口愈合活性。

图16描绘了在暴露于城市灰尘之后用本公开内容的示例性非天然存在的多肽预处理的永生化人角质形成细胞系的活力。

图17描绘了本公开内容的示例性非天然存在的多肽的抗氧化能力。

具体实施方式

定义

本文所使用的术语仅用于描述特定情况的目的并且不旨在进行限制。如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该/所述”也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地另有说明。此外，就详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“具有”或其变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式是包含性的。

术语“约”或“大约”意指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受的误差范围内，这部分将取决于该值是如何测量或确定的，例如，测量系统的限制。例如，“约”可以意指根据给定值的实践，在1个或超过1个标准差之内。当本申请和权利要求书中描述了特定值时，除非另有说明，否则术语“约”应当被假定为意指特定值的可接受的误差范围。

术语“个体”、“患者”或“对象”在本文中可互换使用。这些术语均不需要或限于以卫生保健工作者(例如医生、注册护士、执业护士、医师助理、勤务人员或临终关怀工作者)的监督(例如持续或间歇)为特征的情况。

如本文所使用的，术语“包括/包含”或其变体应被理解为指示包括任何所列举的特征，但不排除任何其他特征。因此，如本文所使用的，术语“包括/包含”是包含性的并且不排除附加的、未列举的特征。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施方案中，“包括/包含”可以替换为“基本上由...组成”或“由...组成”。短语“基本上由......组成”在本文中用于要求指定的特征以及那些不会实质上影响所要求保护的公开内容的特征或功能的特征。如本文所使用的，术语“由......组成”用于指示仅存在所列举的特征。

贯穿本公开内容，各种实施方案以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对任何实施方案的范围的不灵活限制。因此，除非上下文另外明确指出，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内直至下限单位的十分之一的任何单独数值。例如，诸如1至6的范围的描述应当被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的任何单独值，例如1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围有多大，此均适用。这些介于中间的范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本公开内容内，但受到所述范围中任何具体排除的限制的影响。当所述范围包括一个或两个限制时，除非上下文另外明确指出，排除这些所包括的限制中的一个或两个的范围也包括在本公开内容中。

本文所用的术语“截短的胶原”通常是指小于全长(例如，天然)胶原的多肽，其中不存在全长(例如，天然)胶原的一个或多个部分。本文提供的非天然存在的多肽可以在C末端截短，在N末端截短，通过去除全长胶原序列的内部部分而截短(例如，内部截短)，在C末端和N末端两者截短，或者可以具有C末端截短和N末端截短之一或两者以及内部截短。在非限制性实施方案中，截短的胶原可以包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其同系物。在另一个非限制性实施方案中，截短的胶原可以包含根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其同系物。

当用于提及氨基酸位置时，“截短”包括所述氨基酸位置。例如，相对于全长多肽在氨基酸位置100处的N末端截短意指从全长多肽的N末端截短100个氨基酸(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置1至100)。类似地，在全长多肽(假设全长多肽有1000个氨基酸)的氨基酸位置901处的C末端截短是指从C末端截短100个氨基酸(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置901至1000)。类似地，在氨基酸位置101和200处的内部截短是指全长多肽的100个氨基酸的内部截短(即，截短的多肽缺少全长多肽的氨基酸位置101至200)。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。

作为非限制性示例，在本文的某些实施方案中提供了用于制造非天然存在的多肽(例如，无动物的胶原多肽或胶原样多肽，以及胶原片段和/或截短的胶原，诸如在基因工程微生物中表达和/或由基因工程微生物表达)的组合物、方法和系统。因此，在本公开内容的各个方面，本文提供的非天然存在的多肽包括胶原或胶原样多肽、重组胶原、胶原片段或截短的胶原。在某些实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原、胶原片段或截短的胶原)源自任何合适的来源，诸如来自哺乳动物或非哺乳动物来源。例如，在一些实施方案中，本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组胶原、胶原片段或截短的胶原)或其至少一部分衍生自(例如，修饰的、截短的、片段的，等等)鸟或禽类动物的胶原(例如原鸡(Gallus gallus)胶原)、淡水鱼或咸水鱼的胶原(例如，史氏鲟(Acipenser schrenckii)胶原)或其任何组合。

本文提供的非天然存在的多肽通常不存在于自然界中。一般而言，本文所述的非天然存在的多肽表现出与天然存在的胶原的一个或多个差异。在某些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的多肽(例如，截短的胶原)不同的氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽可具有与天然存在的胶原不同的结构。天然胶原的四级结构是三螺旋，通常由三个多肽组成。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽可以不具有或可以不形成天然胶原的四级结构。例如，在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽可以不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。在某些情况下，在形成天然胶原的三条多肽中，两条通常是相同的并且被称为α链。第三种多肽被称为β链。在某些情况下，典型的天然胶原可被称为AAB，其中胶原由两条α(“A”)链和一条β(“B”)链组成。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽不具有天然胶原的AAB结构。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽不含或基本上不含不同的胶原链(例如，本文所述的非天然存在的多肽可以包含α链胶原并且可以不含或基本上不含β链)胶原)。在一些方面，本文所述的非天然存在的多肽是单体的和/或不形成多聚体结构。在其他方面，本文所述的非天然存在的多肽在一些情况下可以与相同单体形成多聚体结构(例如同二聚体、同三聚体等)。

在一些方面，非天然存在的多肽是重组多肽(例如，在宿主细胞中重组制备)。在一个实施方案中，非天然存在的多肽是截短的胶原。其他非天然存在的胶原多肽包括嵌合胶原。嵌合胶原是一种多肽，其中胶原多肽的一部分与第二胶原多肽的一部分邻接。例如，包含来自一个物种的胶原的一部分与来自另一物种的胶原的一部分相邻的胶原分子是嵌合胶原。在另一个实施方案中，非天然存在的多肽包含融合多肽，该融合多肽包含另外的氨基酸，诸如分泌标签、组氨酸标签、绿色荧光蛋白、蛋白酶切割位点、GEK重复、GDK重复和/或β-内酰胺酶。

在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)例如相对于相应的天然胶原或天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。例如，在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于约10wt.％、小于约9wt.％、小于约8wt.％、小于约7wt.％、小于约6wt.％、小于约5wt.％、小于约4wt.％、小于约3wt.％、小于约2wt.％、小于约1wt.％、小于约0.9wt.％、小于约0.8wt.％、小于约0.7wt.％、小于约0.6wt.％、小于约0.5wt.％、小于约0.4wt.％、小于约0.3wt.％、小于约0.2wt.％、或小于约0.1wt.％糖基化。替代地和/或另外地，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于约95％、小于约90％、小于约85％、小于约80％、小于约75％、小于约70％、小于约65％、小于约60％、小于约55％、小于约50％、小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％的相应天然胶原或天然存在的胶原的总糖基化。例如，当来自物种XYZ的天然存在的胶原ABC具有20个糖基化(胶原ABC的全长或其一部分)时，预期非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包含小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1个糖基化。在一些实施方案中，那些较低水平的糖基化可以对一个或多个类型的糖基化(例如，O-糖基化或N-糖基化等)和/或糖基化残基(例如，半乳糖基羟赖氨酸(Gal-Hyl)、葡糖基半乳糖基羟胺酸(GlcGal–Hyl)等)具有特异性。在一些情况下，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有与天然存在的胶原不同的糖基化水平和/或糖基化模式。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽具有非天然存在量的羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽缺乏羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽包含比天然存在的胶原更少的羟脯氨酸。羟脯氨酸包括但不限于3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸和5-羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽的氨基酸序列中存在的小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或更少)的脯氨酸为羟脯氨酸。在一些方面，重组(例如，在重组宿主细胞中)产生的非天然存在的多肽可以具有比天然存在的胶原更少的羟脯氨酸。在一些情况下，本文提供的重组多肽在缺乏使重组多肽的一个或多个氨基酸(例如，脯氨酸)羟基化的酶的重组宿主细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞)中重组表达。在一些情况下，本文提供的重组多肽在缺乏脯氨酰4-羟化酶和/或脯氨酰3-羟化酶的宿主细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞)中重组表达。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。赖氨酰氧化涉及将赖氨酸残基转化为可与其他蛋白质形成交联的高反应性醛。天然存在的胶原可以具有一定程度的赖氨酰氧化。因此，非天然存在的多肽可以与天然胶原不同，因为非天然存在的多肽缺乏或基本上缺乏赖氨酰氧化。在一些情况下，本文提供的非天然存在的多肽的氨基酸序列中存在的小于约50％(例如，小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约20％、小于约15％、小于约10％或更少)的赖氨酸被氧化。

一般而言，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以具有与天然或全长胶原相似或基本上相似的功能并且/或者提供与天然或全长胶原相似或基本上相似的益处(例如，如本文所提供的)。在一些情况下，与天然或全长胶原相比，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可具有改善或增加的功能和/或益处(例如，如本文提供的)。在一些实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽与天然或全长胶原相比可具有一个或多个不同的功能。

本文公开的非天然存在的多肽通常具有与其单体结构相关的有利特性并且/或者缺乏能够与其他胶原链交联的氨基酸(例如，缺乏羟脯氨酸残基)。此外，与全长或天然胶原相比，本文公开的非天然存在的多肽的胶原水解产物还具有增加的溶解度。此外，与天然三螺旋胶原相比，单体结构更容易消化和生物利用，或者被消化蛋白酶分解。其他有利的特性包括在液体组合物中和在纯化过程中改进的物理特性，因为全长或天然胶原或胶原链相互作用形成更强的结构，该结构可以由于羟脯氨酸残基的存在而沉淀。

在某些优选的实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)包含与它们所衍生自的天然存在的哺乳动物或非哺乳动物胶原的至少一部分具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，天然氨基酸序列的一个或多个部分被删除，但该序列的其余部分与天然氨基酸序列基本上相似或相同。在某些示例性实施方案中，非天然存在的多肽具有与原鸡21型α1胶原或其截短物或片段具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，非天然存在的多肽具有与史氏鲟2型α1胶原或其截短物或片段至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，重组多肽是截短的胶原。在某些情况下，截短的胶原是比全长(例如，天然)胶原更小的多肽，其中全长(例如，天然的)胶原的一个或多个部分(例如，内部和/或末端部分)不存在。在各种情况下，本文提供的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)在C末端截短，在N末端截短，通过去除全长胶原多肽的内部部分而截短(例如，内部截短)，在C末端和N末端两者截短，或者包含C末端截短和N末端截短之一或两者以及内部截短。在一些情况下，非天然存在的多肽是天然存在的胶原的片段，其保留天然或天然存在的相应胶原的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的功能(例如，感兴趣的功能)。在一些情况下，术语截短的胶原与术语胶原片段可互换使用。在一些情况下，截短的胶原包括任何连续胶原片段，即至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的全长天然或天然存在的相应胶原。在一些实施方案中，截短是内部截短、胶原的N末端部分的截短、胶原的C末端部分的截短、内部部分截短或C末端和N末端截短。本文提供的截短的胶原可以被截短50个氨基酸至1250个氨基酸、50个氨基酸至1200个氨基酸、50个氨基酸至1150个氨基酸、50个氨基酸至1100个氨基酸、50个氨基酸至1050个氨基酸、50个氨基酸至1000个氨基酸、50个氨基酸至950个氨基酸、50个氨基酸至900个氨基酸、50个氨基酸至850个氨基酸、50个氨基酸至800个氨基酸、50个氨基酸至750个氨基酸、50个氨基酸至700个氨基酸、50个氨基酸至650个氨基酸、50个氨基酸至600个氨基酸、50个氨基酸至550个氨基酸、50个氨基酸至500个氨基酸、50个氨基酸至450个氨基酸、50个氨基酸至400个氨基酸、50个氨基酸至350个氨基酸、50个氨基酸至300个氨基酸、50个氨基酸至250个氨基酸、50个氨基酸至200个氨基酸、50个氨基酸至150个氨基酸或50个氨基酸至100个氨基酸(例如，相对于全长胶原)。在另一个实施方案中，截短的胶原被截短50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200或1250个氨基酸(例如，相对于全长胶原)。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在C末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在C末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在N末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以在N末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)相对于全长胶原可以在N末端和C末端两者被截短。在一些情况下，本文提供的多肽可以在N末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等；并且可以在C末端(相对于全长胶原)被截短任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽可以在N末端(相对于全长胶原)截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或更多个氨基酸；并且可以在C末端(相对于全长胶原)被截短10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

在一些实施方案中，本文提供的多肽(例如，其氨基酸序列)可以被内部截短(相对于全长胶原)任何合适数量的氨基酸残基，例如至多10、10至800、10至700、10至600、10至500、10至400、10至300、10至200、10至100、50至800、50至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200、50至100等。在一些情况下，本文提供的多肽可以被内部截短(相对于全长胶原)10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800个或更多个氨基酸。

本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含相对于全长(例如，天然)胶原的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然)鸡(原鸡)21型α1胶原(例如SEQ ID NO：31)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：31的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短、或其组合。在一些实施方案中，本文公开的截短的胶原可以包含相对于全长(例如，天然的)日本鲟鱼(史氏鲟)2型α1胶原(例如，SEQ ID NO：32)的截短。在一些实施方案中，本文公开的截短胶原可以包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：32的氨基酸序列具有至少约70％序列同一性(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更多)的氨基酸序列，其具有N末端截短、C末端截短、内部截短或其组合。下表1中提供了全长(例如，天然的)胶原的非限制性示例。

在一些情况下，本文提供的多肽的长度可以是至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少175个氨基酸、至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少350个氨基酸、至少400个氨基酸、至少450个氨基酸或至少500个氨基酸。

在其他实施方案中，本文公开的多肽可以是与鱼胶原可比的截短的胶原多肽，包括来自鲟鱼的其他物种，或来自产生适合鱼子酱的鱼子的其他物种，包括鲑鱼、硬头鳟、鳟鱼、圆鳍鱼、白鲑或鲤鱼，以及其他鱼类，诸如罗非鱼和鲨鱼。来自史氏鲟(日本鲟鱼)的合适的可比序列包括NCBI登录号BAO58965.1、BAO58966.1、BAO58967.1、BAT51012.1、BAR72360.1、BAR72359.1、BAR72358.1、BAR72357.1和BAR72356.1。来自小体鲟(Acipenserruthenus)(小体鲟鱼)的合适序列包括NCBI登录号A0A444UGW0、A0A444TZM6、A0A444UC45、A0A444UC53、A0A662YTX1、A0A662Z270、A0A662YZ39、A0A444U1F5、A0A444UJK3、A0A444UNU0、X5HZZ7、X5IHC1、A0A444UPK8、A0A444UBS1、A0A444UYQ7、A0A444TWQ3、A0A444ULY4、A0A444TZ23、A0A662YS48、A0A444U4C8、A0A444UD64、A0A662YX10、A0A662YXI2、A0A444TXQ4、A0A444TZ42、A0A444U8N8、A0A444UJU3、A0A444UQ51、A0A444U2T2、A0A662YJ50、A0A444V1V9、A0A444V113、A0A662YWR6、A0A662YW91、A0A444U5J5、A0A662YR93、A0A444UJB0、A0A444UFS4、A0A444UVK2、A0A444UJU1、A0A444ULY9、A0A444UKA7、A0A444U5L7、A0A444V6M4、A0A444V788、A0A444UFS9、A0A444UVP7、A0A444U4D9、A0A444UHN6、A0A662YJC1、A0A444V1E8、A0A444UPM0、A0A662YU87、A0A444TZS8、A0A444U200、A0A444V2E3、A0A662YXD3、A0A662YQA4、A0A444U1H9、A0A444V7I5、A0A444UFX8、A0A444V7B8、A0A444U2K4、A0A444V762、A0A444UQ49、A0A662YMD3、A0A662YWF2、A0A444UE44、A0A444UAR6、A0A444UX46、A0A444U5P4、A0A662YRG8、A0A444USC3、A0A444UK09、A0A444UNQ7、A0A444UN69、A0A444V5D9、E6Y298、A0A444TZY1、A0A444TYS0和E6Y299。

在其他实施方案中，多肽可以是与鸡胶原或其他家禽胶原(诸如来自家禽，包括鸡、火鸡、鹅和鸭)可比的截短的胶原多肽。来自原鸡(鸡)的合适的可比序列包括NCBI登录号V9GZR2、Q9PSS5、A0A3Q2UDI3、Q90802、A0A1D5PNH7、Q4TZW6、Q90803、Q91014、A0A1D5PPI0、A0A1D5P1A5、A0A3Q2U6K2、A0A3Q2U8F9、Q90689、A0A3Q2U3U6、P13731、A0A1D5PFE0、A0A3Q2TXZ7、Q5FY72、A0A1D5PR16、A0A1D5PKR6、F1NDF5、Q90589、P08125、F1NRH2、P32017、A0A1D5PW49、Q90800、P12108、E1C353、Q7LZR2、P02460、A0A1L1RNI7、Q90796、P12106、F1NQ20、Q9I9K3、P20785、A0A1D5PWN6、P15988、P12105、F1NIL4、O93419、P02467、A0A5H1ZRJ7、A0A1D5PKQ4、A0A5H1ZRK9、Q90W37、A0A1D5NY11、A0A1D5P959、P02457、A0A1D5PYU1、A0A1D5PE57、Q90ZA0、Q90584、A0A1L1RZW7、A0A1D5NVM0、A0A1D5P8P3、F1NIP0、F1P2Q3、A0A1D5PE74、Q9IAU4、A0A3Q2TTC1、F1NHH4、P32018、A0A1D5P0F4、R4GHP9、A0A3Q2UD12、A0A3Q2UMJ2、A0A3Q2U4U7、F1NX22、A0A1D5P8I8、A0A1L1RPW4、P13944、P15989、F1P2F0、A0A1D5PGD5和A0A3Q3AR07。

表1.全长胶原氨基酸序列

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在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ IDNO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至537；从氨基酸位置1至542；从氨基酸位置1至547；从氨基酸位置1至552；从氨基酸位置1至557；从氨基酸位置1至562；从氨基酸位置1至567；从氨基酸位置1至572；或从氨基酸位置1至577的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：31)具有N末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置726至957；从氨基酸位置731至957；从氨基酸位置736至957；从氨基酸位置741至957；从氨基酸位置746至957；从氨基酸位置751至957；从氨基酸位置756至957；从氨基酸位置761至957；从氨基酸位置766至957；从氨基酸位置769至957；从氨基酸位置774至957；从氨基酸位置779至957；或从氨基酸位置784至957的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：31)具有C末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如截短的胶原)可包含N末端截短和C末端截短两者。例如，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至537；从氨基酸位置1至542；从氨基酸位置1至547；从氨基酸位置1至552；从氨基酸位置1至557；从氨基酸位置1至562；从氨基酸位置1至567；从氨基酸位置1至572；或从氨基酸位置1至577的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ IDNO：31)具有N末端截短；并且在从氨基酸位置726至957；从氨基酸位置731至957；从氨基酸位置736至957；从氨基酸位置741至957；从氨基酸位置746至957；从氨基酸位置751至957；从氨基酸位置756至957；从氨基酸位置761至957；从氨基酸位置766至957；从氨基酸位置769至957；从氨基酸位置774至957；从氨基酸位置779至957；或从氨基酸位置784至957的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：31)具有C末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置557(相对于SEQ ID NO：31)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置746(相对于SEQ ID NO：31)处具有C末端截短。在另一个具体实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：31的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置557(相对于SEQ ID NO：31)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置769(相对于SEQ ID NO：31)处具有C末端截短。

在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ IDNO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置1至660；从氨基酸位置1至665；从氨基酸位置1至670；从氨基酸位置1至675；从氨基酸位置1至680；从氨基酸位置1至685；从氨基酸位置1至690；从氨基酸位置1至695；或从氨基酸位置1至700的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：32)具有N末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在从氨基酸位置855至1420；从氨基酸位置860至1420；从氨基酸位置865至1420；从氨基酸位置870至1420；从氨基酸位置875至1420从氨基酸位置880至1420；从氨基酸位置885至1420；从氨基酸位置890至1420；从氨基酸位置895至1420；或从氨基酸位置900至1420的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：32)具有C末端截短。在一些情况下，本文所述的非天然存在的多肽(例如截短的胶原)可包含N末端截短和C末端截短两者。例如，本文所述的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其中在从氨基酸位置1至660；从氨基酸位置1至665；从氨基酸位置1至670；从氨基酸位置1至675；从氨基酸位置1至680；从氨基酸位置1至685；从氨基酸位置1至690；从氨基酸位置1至695；或从氨基酸位置1至700的任何氨基酸位置(例如，相对于SEQ ID NO：32)具有N末端截短；并且在从氨基酸位置855至1420；从氨基酸位置860至1420；从氨基酸位置865至1420；从氨基酸位置870至1420；从氨基酸位置875至1420；从氨基酸位置880至1420；从氨基酸位置885至1420；从氨基酸位置890至1420；从氨基酸位置895至1420；或从氨基酸位置900至1420的任何氨基酸位置(相对于SEQ ID NO：32)具有C末端截短。在一个具体的实施方案中，本文公开的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列，或与之具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高)序列同一性的氨基酸序列，其在氨基酸位置680(相对于SEQ ID NO：32)处具有N末端截短；并且在氨基酸位置880(相对于SEQ ID NO：32)处具有C末端截短。

在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可包含本文提供的任何氨基酸序列。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以由本文提供的任何氨基酸序列组成。在一些情况下，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)可以基本上由本文提供的任何氨基酸序列组成。在具体实施方案中，非天然存在的多肽具有或包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8中任一项具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8中任一项的氨基酸序列组成或基本上由其组成。

在一些方面，非天然存在的多肽可包括任何嵌合胶原，其包括至少一种非连续胶原片段。例如，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中N末端胶原的一部分与C末端胶原的一部分邻接，其中N末端胶原的该部分和C末端胶原的该部分在天然或天然存在的相应胶原中不邻接。在另一个示例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中C末端胶原的一部分与N末端胶原的一部分邻接(例如，以翻转或相反的顺序-C末端胶原位于N末端胶原的部分的N末端)，其中C末端胶原的该部分和N末端胶原的该部分在天然或天然存在的对应胶原中邻接或不邻接。在另一个示例中，非天然存在的多肽可以是嵌合胶原，其中胶原多肽的一部分与第二胶原多肽的一部分邻接(例如，包含来自第一物种的胶原的一部分邻接来自第二物种的胶原的一部分的胶原分子是嵌合胶原，等等)。

下面提供了示例性氨基酸序列或编码重组多肽的核酸序列：

SEQ ID NO：1-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACCGGTTTTCCGGGTATGCCTGGTCGTAGCGGTGATCCGGG

TCGTAGCGGTAAAGATGGTCTGCCTGGTAGCCCGGGTTTTAAAG

GTGAAGTTGGTCAGCCAGGTAGCCCTGGTCTGGAAGGTCATCGT

GGTGAACCGGGTATTCCAGGTATTCCGGGTAATCAGGGTGCAA

AAGGTCAGAAAGGCGAAATTGGTCCTCCGGGTCTGCCAGGTGC

CAAAGGTTCTCCGGGTGAAACCGGTCTGATGGGTCCTGAAGGT

AGCTTTGGCCTGCCTGGTGCACCGGGTCCGAAAGGTGACAAAG

GTGAACCTGGTCTGCAGGGTAAACCGGGTAGCAGCGGTGCAAA

AGGCGAACCAGGTGGTCCGGGTGCTCCGGGTGAACCAGGCTAT

CCGGGTATTCCTGGTACTCAGGGTATTAAAGGCGATAAAGGTA

GCCAGGGTGAAAGCGGTATTCAGGGTCGTAAGGGTGAAAAAGG

CCGTCAGGGTAATCCAGGCCTGCAGGGCACCGAAGGTCTGCGT

GGCGAACAGGGCGAAAAAGGTGAGAAGGGTGACCCAGGCATT

CGT

SEQ ID NO：2-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRG

EPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLP

GAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQ

GIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEK

GDPGIR

SEQ ID NO：3-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGG

GCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAG

GGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACC

GCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGC

CAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGC

GCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAG

GTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAA

GGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCC

AAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTT

ATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGG

CTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAA

GGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGC

GTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTAT

TCGC

SEQ ID NO：4-原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的氨基酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRG

EPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLP

GAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQ

GIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEK

GDPGIR

SEQ ID NO：5-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGGGCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAGGGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACCGCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGCCAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGCGCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAGGTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAAGGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCCAAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTTATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGGCTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAAGGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGCGTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTATTCGCGGCATTAACGGTCAAAAGGGTGAAAGTGGGATACAAGGTCTTGTCGGTCCGCCCGGAGTTAGAGGCCAG

SEQ ID NO：6-原鸡(鸡)的截短的21型胶原α1多肽的氨基酸序列

DTGFPGMPGRSGDPGRSGKDGLPGSPGFKGEVGQPGSPGLEGHRG

EPGIPGIPGNQGAKGQKGEIGPPGLPGAKGSPGETGLMGPEGSFGLP

GAPGPKGDKGEPGLQGKPGSSGAKGEPGGPGAPGEPGYPGIPGTQ

GIKGDKGSQGESGIQGRKGEKGRQGNPGLQGTEGLRGEQGEKGEK

GDPGIRGINGQKGESGIQGLVGPPGVRGQ

SEQ ID NO：7-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的核苷酸序列

GTCTGCAGGGTATGCCTGGTGAACGTGGTGCAAGCGGTATTGCC

GGTGCAAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGTGAAAAAGGTCCGG

AAGGTGCCAGCGGTAAAGATGGTAGCCGTGGTCTGACCGGTCC

GATTGGTCCGCCTGGTCCGGCAGGTCCGAATGGCGAAAAAGGT

GAAAGCGGTCCGAGCGGTCCTCCGGGTGCAGCAGGTACTCGTG

GTGCACCGGGTGATCGCGGTGAAAATGGTCCACCGGGTCCTGC

CGGTTTTGCAGGTCCGCCAGGTGCAGATGGTCAGCCTGGTGCCA

AAGGCGAACAAGGCGAAGGTGGTCAGAAAGGTGATGCAGGCG

CTCCGGGTCCGCAGGGTCCTTCTGGTGCACCTGGTCCTCAGGGT

CCGACCGGTGTTTCTGGTCCGAAAGGCGCACGTGGTGCCCAGG

GTCCACCTGGTGCGACCGGTTTTCCTGGCGCAGCAGGTCGTGTT

GGTCCTCCAGGTCCTAATGGTAATCCGGGTCCAAGCGGTCCTGC

AGGTAGCGCAGGCAAAGATGGTCCTAAAGGTGTACGCGGTGAT

GCTGGTCCTCCTGGCCGTGCCGGTGATGCCGGT

SEQ ID NO：8-来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的氨基酸序列

GLQGMPGERGASGIAGAKGDRGDVGEKGPEGASGKDGSRGLTGPI

GPPGPAGPNGEKGESGPSGPPGAAGTRGAPGDRGENGPPGPAGFA

GPPGADGQPGAKGEQGEGGQKGDAGAPGPQGPSGAPGPQGPTGV

SGPKGARGAQGPPGATGFPGAAGRVGPPGPNGNPGPSGPAGSAGK

DGPKGVRGDAGPPGRAGDAG

SEQ ID NO：9-编码名为分泌信号序列1的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTT

TAGCGCATCGGCG

SEQ ID NO：10-分泌信号序列1的氨基酸序MKKIWLALAGLVLAFSASA

SEQ ID NO：11-编码名为分泌信号序列2的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAGGTTTCATGCTGTTCACCCTCCTCGCTGCGTTCTC

TGGTTTCGCGCAGGCT

SEQ ID NO：12-分泌信号序列2的氨基酸序列MKKGFMLFTLLAAFSGFAQA

SEQ ID NO：13-编码名为分泌信号序列3的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGATGATCACCCTGCGTAAACTGCCGCTGGCTGTTGCTGTTGC

TGCTGGTGTTATGTCTGCTCAGGCTATGGCT

SEQ ID NO：14-分泌信号序列3的氨基酸序列MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA

SEQ ID NO：15-编码名为分泌信号序列4的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAACCGCTATCGCTATCGCTGTTGCTCTGGCTGGTTT

CGCTACCGTTGCTCAGGCT

SEQ ID NO：16-分泌信号序列4的氨基酸序列MKKTAIAIAVALAGFATVAQA

SEQ ID NO：17-编码名为分泌信号序列5的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAGTTAAAGTTCTGTCTCTGCTGGTTCCGGCTCTGCTGGT

TGCTGGTGCTGCTAACGCT

SEQ ID NO：18-分泌信号序列5的氨基酸序列MKVKVLSLLVPALLVAGAANA

SEQ ID NO：19-编码名为分泌信号序列6的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAAAAAAACATCCTGTCTCTGTCTATGGTTGCTCTGTCTCT

GTCTCTGGCTCTGGGTTCTGTTTCTGTTACCGCT

SEQ ID NO：20-分泌信号序列6的氨基酸序列MKKNILSLSMVALSLSLALGSVSVTA

SEQ ID NO：21-编码名为分泌信号序列7的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGCTGAACCCGAAAGTTGCTTACATGGTTTGGATGACCTGCCT

GGGTCTGACCCTGCCGTCTCAGGCT

SEQ ID NO：22-分泌信号序列7的氨基酸序列MLNPKVAYMVWMTCLGLTLPSQA

SEQ ID NO：23-编码名为分泌信号序列8的分泌信号序列的核苷酸序列

ATGAAACAGGCTCTGCGTGTAGCGTTCGGTTTCCTGATACTGTG

GGCTTCTGTTCTGCACGCT

SEQ ID NO：24-分泌信号序列8的氨基酸序列MKQALRVAFGFLILWASVLHA

SEQ ID NO：25-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTCTGCAGGGTATGCCGGGTGAACGTGGTGCCAGCGGTATTG

CAGGTGCCAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGTGAAAAAGGTCC

GGAAGGTGCAAGCGGTAAAGATGGTAGCCGTGGTCTGACCGGT

CCGATTGGTCCGCCGGGTCCGGCCGGTCCGAATGGTGAAAAAG

GTGAAAGCGGTCCGAGCGGTCCGCCGGGTGCAGCCGGTACCCG

TGGTGCACCGGGTGATCGTGGTGAAAATGGTCCGCCGGGTCCG

GCCGGTTTTGCAGGTCCGCCGGGTGCCGATGGTCAGCCGGGTGC

AAAAGGTGAACAGGGTGAAGGTGGTCAGAAAGGTGATGCCGGT

GCACCGGGTCCGCAGGGTCCGAGCGGTGCCCCGGGTCCGCAGG

GTCCGACCGGTGTTAGCGGTCCGAAAGGTGCACGTGGTGCCCA

GGGTCCGCCGGGTGCAACCGGTTTTCCGGGTGCCGCAGGTCGTG

TTGGTCCGCCGGGTCCGAATGGTAATCCGGGTCCGAGCGGTCCG

GCAGGTAGCGCCGGTAAAGATGGTCCGAAAGGTGTTCGTGGTG

ATGCAGGTCCGCCGGGTCGTGCCGGTGATGCAGGTTAA

SEQ ID NO：26-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGCCTGCAAGGCATGCCAGGCGAGCGCGGCGCGTCTGGCATCG

CGGGCGCGAAGGGCGACCGCGGCGACGTGGGCGAGAAGGGCC

CTGAGGGCGCGTCCGGCAAGGACGGCTCTCGCGGCCTGACAGG

CCCAATCGGCCCTCCAGGCCCTGCGGGCCCAAACGGCGAGAAG

GGCGAGTCCGGCCCTTCTGGCCCACCTGGCGCGGCGGGCACAC

GCGGCGCGCCAGGCGACCGCGGCGAGAACGGCCCTCCAGGCCC

TGCGGGCTTCGCGGGCCCACCTGGCGCGGACGGCCAACCAGGC

GCGAAGGGCGAGCAAGGCGAGGGCGGCCAAAAGGGCGACGCG

GGCGCGCCTGGCCCACAAGGCCCTTCTGGCGCGCCAGGCCCTCA

AGGCCCAACAGGCGTGTCCGGCCCTAAGGGCGCGCGCGGCGCG

CAAGGCCCACCTGGCGCGACAGGCTTCCCAGGCGCGGCGGGCC

GCGTGGGCCCTCCAGGCCCTAACGGCAACCCAGGCCCTTCTGGC

CCAGCGGGCTCCGCGGGCAAGGACGGCCCTAAGGGCGTGCGCG

GCGACGCGGGCCCACCTGGCCGCGCGGGCGACGCGGGCTGA

SEQ ID NO：27-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTTTGCAAGGTATGCCAGGGGAACGGGGTGCGTCCGGGATAG

CCGGGGCAAAAGGTGATCGAGGCGATGTAGGAGAAAAAGGCC

CAGAAGGGGCGTCAGGTAAGGACGGATCTCGCGGCTTGACGGG

ACCTATCGGGCCTCCAGGTCCCGCCGGCCCTAATGGGGAAAAA

GGCGAGAGTGGGCCGTCTGGTCCGCCCGGCGCCGCTGGCACAC

GTGGAGCGCCGGGCGATCGTGGTGAGAACGGACCACCGGGTCC

TGCTGGTTTTGCGGGACCTCCGGGAGCAGACGGCCAGCCGGGC

GCTAAAGGTGAACAGGGTGAAGGTGGCCAAAAAGGCGATGCA

GGCGCACCGGGTCCGCAGGGCCCTTCAGGTGCACCGGGTCCAC

AGGGCCCAACTGGCGTTTCAGGGCCGAAAGGCGCAAGAGGTGC

TCAGGGTCCGCCCGGGGCAACTGGGTTTCCTGGAGCGGCCGGC

CGTGTTGGACCTCCGGGGCCGAACGGAAACCCTGGACCGTCTG

GACCAGCCGGTTCAGCGGGTAAGGATGGTCCTAAGGGTGTAAG

GGGTGACGCAGGTCCCCCTGGACGTGCAGGGGATGCGGGGTAGSEQ ID NO：28-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGGTTACAAGGTATGCCGGGAGAACGTGGAGCGTCAGGAATTG

CTGGGGCCAAAGGTGATCGTGGTGATGTTGGCGAGAAAGGGCC

CGAAGGCGCATCTGGTAAAGATGGCTCACGCGGGTTAACTGGA

CCAATCGGACCACCAGGCCCCGCTGGGCCTAATGGTGAAAAGG

GTGAAAGTGGCCCTTCTGGACCCCCAGGAGCCGCCGGTACACG

TGGAGCGCCAGGCGATCGTGGCGAAAACGGACCGCCCGGACCT

GCAGGTTTTGCGGGACCCCCTGGAGCAGACGGCCAACCAGGAG

CAAAAGGTGAGCAAGGTGAAGGTGGACAAAAGGGAGATGCCG

GAGCGCCAGGCCCCCAAGGCCCATCAGGAGCTCCAGGACCTCA

AGGTCCAACTGGTGTATCAGGGCCTAAGGGTGCGCGCGGCGCT

CAAGGACCGCCTGGCGCAACTGGCTTTCCGGGAGCTGCTGGTCG

TGTGGGCCCGCCTGGCCCAAACGGAAATCCAGGCCCTTCAGGC

CCGGCGGGCTCAGCCGGAAAAGACGGTCCGAAGGGAGTCCGTG

GAGATGCGGGACCGCCAGGACGCGCTGGCGATGCAGGCTAA

SEQ ID NO：29-编码来自史氏鲟(日本鲟鱼)的截短的2型胶原α1多肽的密码子优化的核苷酸序列

GGTTTACAGGGAATGCCAGGGGAACGCGGCGCCTCAGGGATTG

CCGGTGCTAAAGGAGATCGTGGCGACGTGGGTGAAAAGGGTCC

CGAGGGAGCATCAGGTAAGGATGGTTCCCGTGGTTTGACGGGA

CCTATTGGACCTCCGGGTCCTGCAGGTCCGAACGGCGAAAAGG

GGGAAAGCGGGCCTAGTGGTCCACCCGGCGCCGCAGGTACCCG

TGGTGCCCCAGGCGACCGCGGGGAGAATGGACCGCCTGGCCCT

GCCGGTTTTGCGGGTCCTCCAGGAGCCGATGGGCAGCCCGGTGC

AAAAGGAGAGCAGGGAGAGGGAGGTCAAAAGGGAGATGCCGG

CGCCCCGGGCCCTCAGGGACCAAGCGGTGCGCCAGGCCCCCAG

GGTCCTACGGGTGTTAGCGGGCCGAAAGGCGCACGCGGAGCGC

AGGGCCCACCTGGTGCAACAGGCTTCCCAGGAGCTGCGGGGCG

CGTCGGACCTCCGGGACCCAATGGAAACCCAGGTCCGTCAGGG

CCGGCAGGCTCCGCAGGGAAAGATGGTCCCAAAGGCGTGCGTG

GAGACGCAGGGCCCCCCGGACGCGCCGGCGATGCGGGATAA

SEQ ID NO：30-编码来自原鸡(鸡)的截短的21型胶原多肽的密码子优化的核苷酸序列

GATACTGGTTTCCCGGGGATGCCTGGGCGCTCAGGTGATCCGGG

GCGTAGTGGAAAAGACGGTCTGCCGGGGTCCCCGGGCTTTAAG

GGTGAGGTGGGTCAGCCCGGTAGTCCAGGTTTAGAAGGTCACC

GCGGAGAGCCCGGGATTCCAGGCATTCCTGGCAACCAGGGTGC

CAAGGGACAGAAAGGCGAAATTGGTCCGCCCGGCCTACCGGGC

GCGAAAGGTTCTCCTGGTGAAACCGGTCTCATGGGTCCGGAAG

GTAGCTTCGGCCTGCCCGGCGCACCTGGTCCGAAGGGCGATAA

GGGGGAGCCTGGGCTGCAAGGTAAACCGGGTAGTTCTGGCGCC

AAAGGTGAACCCGGCGGTCCCGGTGCGCCAGGGGAACCAGGTT

ATCCTGGTATTCCTGGAACCCAAGGAATTAAAGGTGACAAAGG

CTCACAGGGCGAAAGTGGTATACAGGGTCGCAAGGGCGAAAAA

GGACGTCAGGGCAATCCAGGCCTGCAGGGTACTGAAGGCCTGC

GTGGAGAACAGGGTGAGAAAGGTGAAAAAGGAGATCCTGGTAT

TCGC

在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含SEQ ID NO：2、4、6和8中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多肽包含与SEQ ID NO：2、4、6和8中任一项的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％等的序列同一性的氨基酸序列。替代地和/或另外地，非天然存在的多肽由SEQ ID NO：1、3、5、7和25-30中任一项的核酸序列编码。在一些实施方案中，非天然存在的多肽由与SEQ ID NO：1、3、5、7和25-30中任一项的核酸序列具有至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％等的序列同一性的核酸编码。

在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有或可以不含有来自天然胶原的一个或多个结构域。图1和图2描绘了本公开内容的示例性非天然存在的多肽(例如，截短的胶原)与相应的天然存在的胶原的比对。图1描绘了SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6的非天然存在的多肽与原鸡21型α1胶原(例如SEQ ID NO：31)的比对。图2描绘了SEQ ID NO：8的非天然存在的多肽与史氏鲟2型α1胶原的比对。图1和图2证明非天然存在的多肽可以具有在天然胶原中发现的一个或多个结构域(例如，胶原三螺旋重复结构域)。图1和图2进一步证明非天然存在的多肽可以缺乏天然胶原中发现的一个或多个结构域(例如，Von Willebrand因子A型(vWA)结构域、层粘连蛋白G结构域、纤维胶原C末端结构域)。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以含有一个或多个胶原三螺旋重复结构域。在一些方面，本文提供的非天然存在的多肽可以缺乏Von Willebrand因子A型(vWA)结构域、层粘连蛋白G结构域和纤维胶原C末端结构域中的一者或多者。

在一些实施方案中，非天然存在的多肽(例如，重组多肽)包括分泌信号序列。可以诱导非天然存在的多肽(例如，重组多肽)分泌到周质和/或细胞外空间(例如，当在重组宿主细胞中产生时)的任何合适的分泌信号序列(例如，疏水信号肽、Sec信号肽、Tat信号肽等)。示例性的分泌信号序列包括具有SEQ ID NO：10、12、14、16、18、20、22和24中任一项的氨基酸序列的肽。替代地和/或另外地，分泌信号序列包括由SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21和23中任一项的核酸序列编码的肽。分泌信号序列优选位于非天然存在的多肽的N末端(例如，重组多肽)。然而，预期分泌信号序列可以位于N末端以外的位置，在该处分泌信号序列保持功能。

如本文所述的非天然存在的多肽(例如，重组多肽)可以经由编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列来表达或产生。因此，本公开内容的另一个方面包括表达载体，其包含编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列。在一些实施方案中，表达载体是细菌表达载体。在一些实施方案中，表达载体是酵母表达载体。在一些实施方案中，表达载体是昆虫表达载体。可以诱导从编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸表达蛋白质的任何合适的表达载体。示例性细菌表达载体可以包括pGEX载体，其中谷胱甘肽S-转移酶被用作融合配偶体并且基因表达在tac启动子的控制下，或使用T7启动子的pET载体(例如，pET28载体等)。示例性酵母表达载体可以包括pPIC载体，其使用可用甲醇诱导的AOX1启动子。在一些实施方案中，表达载体是独立存在于宿主细胞(例如，表达重组多肽的细胞)中的质粒形式(例如，包括细菌人工染色体形式等)。在一些实施方案中，表达载体经由随机或靶向整合稳定整合至宿主细胞的染色体中。

在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸序列经密码子优化以在非动物细胞，优选在细菌细胞中表达。如本文所用，“密码子优化的”意指密码子组成被改进以用于在异源细胞(例如，微生物细胞、细菌细胞等)中的表达，而不改变所编码的氨基酸序列。密码子优化的核酸序列(例如，编码本文所述的非天然存在的多肽)的非限制性示例包括SEQ ID NO：25-30。

在一些实施方案中，表达载体可以包括一个或多个选择剂。选择剂包括某些糖(包括含半乳糖的糖)或抗生素(包括氨苄青霉素、潮霉素、G418等)。用于赋予对选择剂的抗性的酶包括β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。替代地和/或另外地，表达载体包括诱导型启动子或组成型启动子(例如，CMV启动子等)，使得编码重组蛋白的核酸可操作地连接至诱导型启动子或组成型启动子。例如，表达载体可以包括四环素诱导型启动子pTET、araC-ParaBAD诱导型启动子或IPTG诱导型lac启动子。如本文所用，“可操作地连接”启动子和核酸意指核酸的表达(例如，转录、翻译等)至少部分地处于启动子的控制之下。

在一些实施方案中，编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的核酸(例如SEQ IDNO：1、3、5、7和25-30中任一项的核酸)和表达载体可具有20至50bp长、20至40bp长、20至30bp长或30至40bp长的重叠。这种重叠可以使用DNA聚合酶(例如 GXL聚合酶(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase))使用PCR来添加。打开的表达载体和编码非天然存在的多肽(例如，重组多肽)的插入核酸可以使用任何合适的克隆系统(例如，/>克隆(takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)或SGI Gibson组件(us.vwr.com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc))一起组装成最终质粒。

此类制备的表达载体(或质粒)可用于产生基因工程化或修饰的生物体或重组细胞以产生本文所述的非天然存在的多肽(例如胶原、截短的胶原或胶原片段)。优选地，重组细胞含有至少一个拷贝的质粒或编码非天然存在的多肽(例如胶原、截短的胶原或胶原片段，优选原鸡胶原和/或史氏鲟胶原的或衍生自其的胶原、截短的胶原或胶原片段)的稳定整合的异源核酸序列。在一些实施方案中，重组细胞是微生物细胞。例如，当表达载体是细菌表达载体时，可以将表达载体插入(例如，经由任何合适的转化方法)用于蛋白质表达的细菌细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)，包括BL-21细胞等)中，以独立地存在于细菌的细胞质中(例如，作为质粒形式)或至少暂时和/或稳定地整合到细菌染色体中。

因此，转化的细胞可以在合适的培养基中培养。优选地，合适的培养基包括基本培养基并且以1.5等份将细胞与植物甘油一起冷冻，细胞与甘油的比例为50:50。对于蛋白质表达，可以将一小瓶冷冻培养细胞在适量的细菌培养基(例如，基本培养基、50mL、100mL等)中通过连续摇动培养物(例如，至少100rpm、至少200rpm、至少250rpm等)在至少36℃，优选约37℃下培养至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少过夜等。表2和表3显示了可用于细胞培养和培养的基本培养基的示例性配方。

表2.基本培养基配方

表3.痕量金属配方

七水合硫酸亚铁	27.8g/L(Spectrum，7782-63-0)
		七水合硫酸锌	2.88g/L(Spectrum，7446-20-0)
二水合氯化钙	2.94g/L(Spectrum，2971347)
		二水合钼酸钠	0.48g/L(Spectrum，10102-40-6)
四水合氯化锰	1.26g/L(Spectrum，13446-34-9)
		亚硒酸钠	0.35g/L(Spectrum，10102-18-8)
硼酸	0.12g/L(Spectrum，10043-35-3)

在一些实施方案中，然后可以将转化的细胞转移至较大体积的生长培养基(例如，基本培养基)中并生长至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、5至10小时、5至9小时、6至9小时，并且/或者替代地直到培养基中的细胞密度达到600的光密度(OD)。

另外地，发酵过程可以在范围为22℃至33℃、29℃至33℃、30℃至32℃、23℃至29℃或25℃至28℃的各种温度下进行。在一些实施方案中，发酵温度可以维持在恒定温度，并且在发酵完成后可以立即纯化非天然存在的多肽。替代地，可以将发酵温度维持所需的一段时间，并且当达到10-20的OD600的细胞密度时，可以降低温度以诱导蛋白质产生。在这样的实施方案中，通常，将温度从28℃降低至25℃。在发酵期间，可以通过添加诱导试剂来诱导细菌中的蛋白质表达。例如，当表达载体含有lac启动子并且编码非天然存在的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)的核酸处于lac启动子的控制下时，核酸的表达可以通过添加浓度范围为0.1-1.5mM、0.1-1.0mM或0.1-0.5mM的异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导。发酵可以持续20-24小时，或在一些实施方案中，持续40-60小时。

预期这样产生的重组细胞(例如，用表达载体转化的重组细菌)在细胞内表达由表达载体中的核酸编码的非天然存在的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)。然后，此类细胞内表达的多肽(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)可以被分泌(经由分泌信号序列)至细胞外空间(例如，进入培养基)。因此，在一些实施方案中，培养基可含有由核酸编码的分泌的重组蛋白(例如，截短的胶原、胶原片段或胶原)。

此外，在本公开内容的另一方面包括组合物，该组合物包含由核酸编码的非天然存在的多肽(例如重组胶原、截短的胶原、胶原片段或胶原)。在一些实施方案中，组合物可以包括包含编码非天然存在的多肽(例如，胶原、截短的胶原或其片段)的整合的异源核酸序列的重组细胞和/或用于重组细胞的培养基(例如，生长培养基、营养培养基等)。

替代地和/或另外地，组合物可包含来自重组细胞和/或培养基的纯化重组多肽。在一些实施方案中，从重组细胞生长并向其分泌重组多肽的培养基中纯化重组多肽。在一些实施方案中，重组多肽与标签(例如，组氨酸标签等)偶联，使得可以使用称为固定化金属亲和层析(IMAC)的亲和纯化来纯化重组多肽。替代地，可以经由柱层析纯化重组多肽。例如，可以通过均质生长培养基的酸处理来纯化重组多肽。在这样的示例中，可以使用5-50％硫酸将生长培养基(例如，发酵液)的pH降低至3至3.5。然后使用离心分离重组细胞。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测试酸化发酵液的上清液并确定其是否含有与起始沉淀相比相对高丰度的重组多肽。获得的重组多肽浆液通常是高盐的。为了实现体积和盐的减少，可以使用过滤步骤进行浓缩和渗滤步骤。例如，过滤步骤可以使用具有每个0.1m²的超滤盒的EMDMillipore切向流过滤系统来进行。在该示例中，使用两个并联的盒的总过滤面积可以是0.2m²。在TFF阶段可实现体积减少至1/5并且盐减少至1/19。最终的浆液可以在SDS-PAGE凝胶上运行以确认重组多肽的存在。然后可以在SDS-PAGE凝胶上分析纯化的重组多肽，以鉴定在每个相应多肽的预期大小下观察到的相应的粗且清晰的条带。可以使用反相和尺寸排阻HPLC色谱法进一步进行滴度和纯度的量化。优选纯化的重组多肽的纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。

在各个方面，本文提供包含本公开内容的多肽和一个或多个附加成分的组合物和制剂。本公开内容的组合物和制剂可以包括或掺入所有类型的媒介物和载体中。媒介物或载体可以是化妆品学或皮肤病学可接受的媒介物或载体。媒介物或载体的非限制性示例包括水、甘油、醇、油、含硅化合物、聚硅氧烷化合物和蜡。变化形式和其他适当的媒介物对于本领域技术人员来说是显而易见的并且适合用于本公开内容的组合物和制剂中。在某些方面，可以以这样的方式选择化合物、成分和试剂的浓度和组合，使得这些组合是化学相容的并且不形成从最终产品中沉淀的络合物。

在一些方面，本公开内容的组合物和制剂可以进一步包括表面活性剂、含聚硅氧烷化合物、UV剂、油和/或本说明书中确定的或本领域已知的其他成分。组合物可以是洗剂、霜剂、身体黄油、面膜、磨砂膏、洗液、凝胶、精华液、乳状液(例如水包油、油包水、水包聚硅氧烷、聚硅氧烷包水、水包油包水、油包水包油、聚硅氧烷包水包油等)、溶液(例如水性或水醇溶液)、无水基质(例如，唇膏或粉末)、软膏、奶、糊剂、气雾剂、固体形式、眼部啫喱、凝胶精华液、凝胶乳状液等。组合物可配制用于表面皮肤施用，在使用期间每天至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7次或更多次。

本公开内容的组合物和制剂可包含甘油三酯。非限制性示例包括小链、中链和大链甘油三酯。本公开内容的组合物和制剂还可包含防腐剂。防腐剂的非限制性示例包括苯氧乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、丁基氨基甲酸碘代丙炔酯、山梨酸钾、苯甲酸钠或其任何混合物。在一些实施方案中，本公开内容的组合物和制剂不含对羟基苯甲酸酯。

本公开内容的组合物和制剂可具有UVA和UVB吸收性质。本公开内容的组合物和制剂可具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更大或其中的任何整数或衍生数字的防晒系数(SPF)。本公开内容的组合物和制剂可以是防晒洗剂、喷雾或霜剂。

本公开内容的组合物和制剂还可以包括以下附加成分中的任一种、任何组合或全部：调理剂、保湿剂、pH调节剂、结构化剂、无机盐、防腐剂、增稠剂、含聚硅氧烷化合物、精油、香料、维生素、药物成分或抗氧化剂，或这些成分的任何组合或这些成分的混合物。这些成分的量可以为组合物重量或体积的0.0001％至99.9％，或者其间的任何整数或范围。

CTFA国际化妆品成分词典和手册(International Cosmetic IngredientDictionary and Handbook)(2004和2008)描述了可以在本公开内容的上下文中使用的多种非限制性化妆品成分。这些成分类别的示例包括：香料(人造和天然；例如葡糖酸、苯氧乙醇和三乙醇胺)、染料和色素成分(例如，Blue 1、Blue 1Lake、Red 40、二氧化钛、D&C蓝色4号、D&C绿色5号、D&C橙色4号、D&C红色17号、D&C红色33号、D&C紫罗兰色2号、D&C黄色10号、D&C黄色11号)、调味剂/芳香剂(例如，Stevia rebaudiana(甜叶菊)提取物和薄荷醇)、吸附剂、润滑剂、溶剂、保湿剂(包括例如，润肤剂、湿润剂、成膜剂、封闭剂和影响皮肤自然保湿机制的试剂)、防水剂、UV吸收剂(物理和化学吸收剂，诸如对氨基苯甲酸(“PABA”)和相应的PABA衍生物、二氧化钛、氧化锌等)、精油、维生素(例如，A、B、C、D、E和K)、痕量金属(例如，锌、钙和硒)、抗刺激剂(例如，类固醇和非类固醇抗炎药)、植物提取物(例如，芦荟、洋甘菊、黄瓜提取物、银杏、人参和迷迭香)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如，BHT和生育酚)、螯合剂(例如，EDTA二钠和EDTA四钠)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、pH调节剂(例如，氢氧化钠和柠檬酸)、吸附剂(例如，淀粉辛烯基琥珀酸铝、高岭土、玉米淀粉、燕麦淀粉、环糊精、滑石粉和沸石)，皮肤漂白和增白剂(例如，对苯二酚和烟酰胺乳酸酯)、湿润剂(例如，山梨糖醇、尿素、甲基葡糖醇聚醚-20、糖异构体和甘露醇)、去角质剂、防水剂(例如，氢氧化铝/镁硬脂酸盐)、皮肤调理剂(例如，芦荟提取物、尿囊素、红没药醇、神经酰胺、二甲硅油、透明质酸、生物糖胶-1、乙基己基甘油、戊二醇、氢化聚癸烯、油酸辛基十二烷基酯、葡糖酸内酯、葡糖酸钙、环己硅氧烷和甘草酸二钾)。

在一些实施方案中，本公开内容的组合物、制剂和/或个人护理产品包含选自以下的一个或多个附加成分：乙酰丙酸、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、十一烯酸甘油酯、Simmondsia chinensis(霍霍巴)籽油、聚丙烯酸酯交联聚合物、角鲨烷、透明质酸钠、丙烯酸聚合物(卡波姆)、戊二醇、月桂醇磺基乙酸酯钠、油酰肌氨酸钠、油酸钠、Ricinuscommunis(蓖麻)籽油、Copernicia cerifera(巴西棕榈)蜡、小烛树蜡、Theobroma cacao(可可)籽脂、异壬酸异壬酯、地蜡、三异硬脂酸钛酸异丙酯、聚羟基硬脂酸、氧化铁、二氧化钛、乙酰丙酸钠和羟丙基瓜尔胶。

在一些实施方案中，包含非天然存在的多肽(例如，重组多肽和/或纯化的重组多肽)的组合物可配制用于表面施用。表面施用包括施用在皮肤和/或角蛋白组织上。角蛋白组织包括作为哺乳动物最外层保护性覆盖物设置的含角蛋白层，并且包括但不限于嘴唇、皮肤、头发和指/趾甲。表面施用可用于化妆品目的。表面制剂可以是任何类型的表面制剂，包括但不限于粉末、霜剂、凝胶、凝胶霜、液体、洗剂、油等。在此类实施方案中，组合物可进一步包含载体分子(例如，媒介物)、防腐剂和/或附加成分中的至少一种。考虑任何合适的载体分子，并且示例性载体分子可包括水、油、醇、丙二醇或乳化剂。另外，考虑任何合适的防腐剂，并且示例性防腐剂包括氧化锌、对羟基苯甲酸酯、甲醛释放剂、异噻唑啉酮、苯氧乙醇或有机酸诸如苯甲酸、苯甲酸钠或丁二醇、己二醇或山梨酸钾。此类组合物通常是皮肤病学可接受的，因为当施用于皮肤和/或角蛋白组织时，它们不具有过度的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等。本公开内容的表面皮肤护理组合物可具有选定的黏度以避免在施用于皮肤和/或角蛋白组织后明显滴落或汇集。

一方面，包含非天然存在的多肽的组合物可以是个人护理产品(例如，化妆品)。在一些实施方案中，组合物被配制用于表面施用。组合物可以含有适合人类使用的其他化妆品成分。个人护理产品可用于预防或治疗紫外线辐射对人类皮肤或头发的损伤。个人护理产品可用于增加皮肤的紧致度、弹性、亮度、水合作用、触觉质地或视觉质地并且/或者刺激胶原产生。个人护理产品可用于减少深纹和皱纹、减少细纹和皱纹、均化肤色不均、增加皮肤光泽、减少光损伤、减少皮肤下垂、减少面部体积损失、增加皮肤屏障功能、减少皮肤发红、减少皮肤干燥、减少脱皮或剥落或增加胶原、弹性蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白的表达和/或产生。个人护理产品可施用于皮肤或头发。组合物包括例如面膜、皮肤清洁剂诸如肥皂、清洁霜、清洁洗剂、面部洗剂、身体洗剂、沐浴露、止汗剂、除臭剂、剃须膏、脱毛剂、面油、唇油、身体油、面部清洁剂、清洁乳、清洁贴、面部清洗剂、面部和身体霜剂和保湿剂、面部精华液、面部和身体面膜、面部爽肤水和雾剂、眼部霜剂和眼部护理、眼部精华液、去角质配方、唇部香膏和唇膏、洗发水、护发素和沐浴露、头发和头皮精华液、头皮精华液、头发雾剂和喷雾、粉底、有色多功能霜、眼影、遮瑕膏、睫毛膏和其他彩妆产品。

包含非天然存在的多肽的组合物可以进一步包含至少一种附加成分，该至少一种附加成分包括表面载体或防腐剂。表面载体可包括选自脂质体、可生物可降解的微胶囊、洗剂、喷雾、气雾剂、扑粉、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、甘油单硬脂酸酯、醇、乳化剂、液体石油、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅酮、环戊硅氧烷、水、双甘油(INCI：二甘油)和脂肪酸(例如，辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸)的表面载体。防腐剂可包含选自生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、苯氧乙醇、丁二醇、1,2己二醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、II、迷迭香提取物、EDTA、苯甲酸及其盐和氯己定的防腐剂。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品是无动物的。例如，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包括从动物获得的任何成分。在一些情况下，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品包含从植物获得的材料或具有植物来源的材料和/或由其制成。在一些情况下，本文提供的组合物、制剂和个人护理产品包含合成获得的材料或具有合成来源的材料(例如，在微生物细胞中产生，例如细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞)。在一些情况下，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包含动物衍生成分(ADI)。因此，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不含牛海绵状脑病(BSE)和/或传染性海绵状脑病(TSE)。在一些实施方案中，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品未在动物上进行测试。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包含任何可检测的遗传修饰的生物体或任何可检测的遗传修饰的生物体遗传物质。在一些情况下，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品的特征在于不存在活微生物区系，如通过菌落形成单位(CFU)测定所确定的。在一些情况下，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品的特征在于不存在活微生物区系DNA，如通过聚合酶链式反应(PCR)测定的。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包含已知会导致癌症或出生缺陷或其他生殖危害的任何天然存在的和/或合成的化学物质。此类成分的非限制性列表可在oehha.ca.gov/proposition-65/proposition-65-list上找到。在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包含任何致癌、诱变或生殖毒性(CMR)物质。在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品不包含高度关注物质(SVHC)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含有任何《濒危野生动植物种国际贸易公约》(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna andFlora，CITES)成分(例如，衍生自、获自或源自CITES保护的任何物种的任何成分)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不包含任何冲突矿物或冲突资源。

在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含香料。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品符合国际香料协会(International Fragrance Association，IFRA)的要求。

在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理品不包含任何已知的过敏原。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何来源的坚果或花生基材料。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不使用已经与坚果或花生基材料接触的设备进行加工。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何来源的椰子基材料。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不使用已经与椰子基材料接触的设备进行加工。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何来源的小麦基材料。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不使用已经与小麦基材料接触的设备进行加工。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何谷蛋白来源(例如，不含谷蛋白)。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何来源的乳糖或乳糖衍生物(例如，不含乳糖)。在一些情况下，组合物、制剂和/或个人护理产品不含任何来源的胶乳或胶乳衍生物(例如，不含胶乳)。

在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含选自以下的一个或多个成分：邻苯二甲酸酯、对羟基苯甲酸酯、三氯生、尿素、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、甲醛、甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮的混合物(例如)、矿物油、苯氧乙醇、矿脂、单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇、硫酸盐(例如，月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES))、棕榈酸视黄酯、环氧乙烷、1,4-二噁烷及其任何组合。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含农药。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含纳米颗粒(“无纳米”)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含黄曲霉毒素。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含霉菌毒素。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含多芳烃(PAH)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不含聚硅氧烷(例如，环硅氧烷)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不使用USP<467>或ICH Q3C(R6)中列出的任何溶剂来制造。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品不包含Swiss Ordinance 814.O18所定义的任何挥发性有机化合物。

在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品含有小于0.5ppm的砷。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品含有小于0.1ppm的汞。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品含有小于0.1ppm的镉。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品含有小于2ppm的铅。

在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品被认证为素食主义的(Vegan)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品被认证为零残忍的(Cruelty-Free)。在各个方面，组合物、制剂和/或个人护理产品被认证为清真的(Halal)。

在某些实施方案中，本文提供促进、维持和/或改善个体的年轻的皮肤(例如，皮肤的外观、皮肤的质地等)的方法，其包括向个体的皮肤施用组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)。促进和/或维持年轻的皮肤可以包括促进、维持和/或改善个体的皮肤的外观。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的外观更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的外观。促进和/或维持年轻的皮肤可以包括促进、维持和/或改善个体的皮肤的质地。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的质地更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的质地。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的紧致度。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的紧致度更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的紧致度。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的紧致度涉及增加皮肤的紧致度(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的紧致度增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如通过测量皮肤对负压的抵抗力确定的。在一些情况下，皮肤对负压的抵抗力是通过使用测量的。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的弹性。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的弹性更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的弹性。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的弹性涉及增加皮肤的弹性(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的弹性增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如通过测量变形后皮肤返回其原始位置的能力所确定的。在一些情况下，使用测量变形后皮肤返回其原始位置的能力。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的亮度。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的亮度更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的亮度。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的亮度涉及增加皮肤的亮度(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的亮度增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如由临床分级专家确定。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的水合作用。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的水合作用更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的水合作用。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的水合作用涉及增加皮肤的水合作用(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)后，皮肤的水合作用增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如通过测量皮肤的电容确定的。在一些情况下，皮肤的电容通过测量。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的触觉质地。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的触觉质地更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的触觉质地。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的视觉质地。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的视觉质地更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的视觉质地。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的胶原含量。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体皮肤的胶原含量更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的胶原含量。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的胶原含量涉及增加皮肤的胶原含量(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的胶原含量增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的弹性蛋白含量。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的弹性蛋白含量更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的弹性蛋白含量。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的弹性蛋白含量涉及增加皮肤的弹性蛋白含量(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的弹性蛋白含量增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以改善皮肤的发红。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体皮肤的发红更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的发红。在一些情况下，改善皮肤的发红涉及减少皮肤的发红(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的发红减少(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如由临床分级专家确定。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以改善皮肤的细纹和/或皱纹。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的细纹和/或皱纹更加接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的细纹和/或皱纹皮肤。在一些情况下，改善皮肤的细纹和/或皱纹涉及减少皮肤的细纹和/或皱纹(例如，减少量、减小尺寸等)(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的细纹和/或皱纹减少(例如，相对于施用之前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如由临床分级专家确定。

在各个方面，本文提供的方法包括将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤以促进、维持和/或改善皮肤的表皮厚度。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，个体的皮肤的表皮厚度更接近地类似于年轻个体(例如，小于30岁、小于25岁、小于20岁、小于15岁等)的皮肤的表皮厚度。在一些情况下，促进、维持和/或改善皮肤的表皮厚度涉及增加皮肤的表皮厚度(例如，相对于施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之前的皮肤)。在一些情况下，在施用本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)之后，皮肤的表皮厚度增加(例如，相对于施用前的皮肤)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％，如通过反射共焦显微镜测定。在一些情况下，反射共焦显微镜由进行。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加角质形成细胞生长(例如，增殖)。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，角质形成细胞生长(例如，增殖)增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％或更多。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加角质形成细胞再生。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，角质形成细胞再生增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加角质形成细胞再生。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，角质形成细胞再生增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加成纤维细胞的胶原产生。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，成纤维细胞的胶原产生增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加成纤维细胞迁移。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，成纤维细胞迁移增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加成纤维细胞增殖。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，成纤维细胞增殖增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加成纤维细胞黏附。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，成纤维细胞黏附增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)增加暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力(例如，在暴露于城市灰尘之前，将组合物、制剂和/或个人护理产品施用于皮肤)。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在一些实施方案中，本文公开的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)具有抗氧化能力。在一些实施方案中，可以使用氧自由基吸收能力(ORAC)测定来测量抗氧化能力。在一些实施方案中，抗氧化能力可以以Trolox当量单位测量。在一些实施方案中，组合物的抗氧化能力可以是至少约50μM、100μM、150μM、200μM、250μM或大于250μM Trolox当量单位。

在各个方面，本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，含有本公开内容的非天然存在的多肽)在施用于个体的皮肤后增加一个或多个基因(例如，涉及细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附等的一个或多个基因)的表达(由皮肤中存在的细胞，例如角质形成细胞、成纤维细胞)。在一些情况下，在将组合物、制剂和/或个人护理产品(例如，如本文所公开的，例如含有本公开内容的非天然存在的多肽)施用于个体的皮肤之后(例如，与施用组合物、制剂和/或个人护理产品之前的皮肤相比)，一个或多个基因的表达(例如，由皮肤中存在的细胞，例如成纤维细胞、角质形成细胞)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

在一些实施方案中，一个或多个基因涉及信号传导通路(例如，涉及细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附)。在一些情况下，一个或多个基因涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路。在一些情况下，涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及黏着斑信号传导通路。在一些情况下，涉及黏着斑信号传导通路的一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及内皮素信号传导通路。在一些情况下，涉及内皮素信号传导通路的一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及EGF/EGFR信号传导通路。在一些情况下，涉及EGF/EGFR信号传导通路的一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。

在一些情况下，一个或多个基因涉及转化生长因子-β(TGF-β)信号传导通路。在一些情况下，涉及TGF-β信号传导通路的一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。

本文的某些实施方案中提供了包含本文提供的一个或多个非天然存在的多肽(例如，用于化妆品用途)的(例如，表面)组合物、制剂和/或个人护理产品。在一些实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品提供任何合适量的本文提供的多肽，诸如以任何合适的量(例如，当给予或施用于个体或细胞时适合提供益处的量)。在一些具体实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品包含当(例如，表面)施用于个体的皮肤时适合为个体的皮肤提供有益效果的量。在具体的实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品包含约0.001％至约30％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)。在更具体的实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品包含约0.001％至约20％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约10％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约5％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约4％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约3％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约2％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约1％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)、约0.001％至约0.5％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)和约0.001％至约0.2％w/w的诸如本文所提供的多肽(或非天然存在的胶原多肽)。

在各种实施方案中，本文提供的非天然存在的多肽(例如，重组蛋白)的浓度或量以任何合适的量存在于本文提供的组合物、制剂和/或个人护理产品中，并且可以例如根据用途或制剂(例如凝胶、胶囊、液体、粉末等)而变化。组合物、制剂和/或个人护理产品中非天然存在的多肽(例如重组蛋白)的示例性浓度可以是至少约0.01％、至少约0.05％、至少约0.1％、至少约0.2％、至少约0.5％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％(w/v或w/w)。替代地和/或另外地，组合物、制剂和/或个人护理产品中非天然存在的多肽(例如重组蛋白)的示例性浓度可以是约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％(w/v或w/w)。替代地和/或另外地，组合物、制剂和/或个人护理产品中非天然存在的多肽(例如重组蛋白)的示例性浓度可以在约0.01％至约99％、约0.05％至约99％、约0.1％至约99％、约0.1％至约99％、约0.5％至约99％、约0.1％至约10％、约1％至约99％、约5％至约99％、约10％至约99％、约15％至约99％、约20％至约99％、约25％至约99％、约30％至约99％、约35％至约99％、约40％至约99％、约45％至约99％、约50％至约99％、约55％至约99％、约60％至约99％、约65％至约99％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％、约85％至约99％、约90％至约99％、约95％至约99％、约0.1％至约90％、约1％至约90％、约5％至约90％、约10％至约90％、约15％至约90％、约20％至约90％、约25％至约90％、约30％至约90％、约35％至约90％、约40％至约90％、约45％至约90％、约50％至约90％、约55％至约90％、约60％至约90％、约65％至约90％、约70％至约90％、约75％至约90％、约80％至约90％、约85％至约90％、约20％至约80％、约25％至约80％、约30％至约80％、约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％、约70％至约99％、约75％至约99％、约80％至约99％等(w/w或w/v)的范围内。替代地和/或另外地，组合物、制剂和/或个人护理产品中非天然存在的多肽(例如重组蛋白)的示例性浓度可以小于约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％等(w/w或w/v)。

在一些实施方案中，施用时间表根据对象的目的、性别、年龄或健康状况而变化。例如，在一些实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品每天一次、每天两次、每天三次、每天最多6次、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天等施用(例如，经表面)。替代地和/或另外地，在一些实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品以不规则的间隔或增加的间隔或减少的间隔多次施用(例如，经表面)。在某些实施方案中，组合物、制剂和/或个人护理产品以足以或有效促进、维持和/或改善如本文提供的年轻皮肤(例如，外观、质地等)的剂量和/或时间表经表面施用。

实施例

实施例1.本公开内容的非天然存在的多肽的生成。

该实施例示出了通过基因工程化微生物生成本公开内容的重组多肽以及此类生成的多肽的纯化过程。

合成SEQ ID NO：1、3、5和7的多核苷酸，并将这些多核苷酸中的至少一种插入pET载体中。设计pET载体与SEQ ID NO：1、3、5和7之间的重叠为20至30bp长，并使用用酶GXL聚合酶(takarabio.com/products/pcr/gc-rich-pcr/primestar-gxl-dna-polymerase)的PCR进行添加。使用/>Cloning(takarabio.com/products/cloning/in-fusion-cloning)将打开的pET载体和插入DNA(例如，SEQ ID NO：1的多核苷酸)一起组装成最终质粒。在所有情况下，核酸序列以公开为SEQ ID NO：9、11、13、15、17、19、21或23的分泌信号序列为先导。通过Sanger测序验证质粒序列。

用最终质粒转化细胞，并随后在基本培养基中培养，并与植物甘油以50:50的细胞与甘油比例冷冻成1.5等份。将一小瓶该冷冻培养物在50ml基本培养基中于37℃、200rpm下复苏过夜。本实施例中基本培养基的配方如表2和表3所示。然后将细胞转移至300ml基本培养基中并生长6-9小时以达到5-10的光密度(OD)600。

在范围为25℃至28℃的不同温度下进行发酵。对于一些发酵，将发酵的温度维持在恒定温度，并且在发酵完成后立即纯化多肽。对于其他发酵，将发酵温度维持所需的一段时间，并且当达到10-20的OD600的细胞密度时，降低温度以诱导蛋白质的产生。通常，将温度从28℃降低至25℃。通过向培养基中添加浓度范围为0.1-0.5mM的IPTG来进行诱导。发酵持续40-60小时。

如下对重组多肽进行纯化：使用5-50％硫酸将发酵液的pH降低至3-3.5。然后使用离心或离心后微滤将细胞分离。在聚丙烯酰胺凝胶上测试酸化发酵液的上清液，并发现与起始沉淀相比含有相对高丰度的重组多肽。为了实现体积和盐的减少，超滤进行浓缩和渗滤步骤。在SDS-PAGE凝胶上运行最终的多肽浆液以确认重组多肽的存在。

为了验证产生了所需蛋白质，收集来自携带SEQ ID NO：1、3、5或7的微生物的培养物的上清液，并通过如上所述降低它们的pH来纯化。通过SDS-PAGE分析酸化发酵液，并以相对纯度检测与预期大小的蛋白质相对应的条带。如图3所示，在每种相应蛋白质的预期大小处观察到粗且清晰的条带。随后通过反相和尺寸排阻HPLC色谱法和质谱法对样品进行分析以用于定量重组多肽滴度和纯度，这确认了各个感兴趣蛋白质的正确身份。

图4A-图4C描绘了在pH 3.0处理之前和之后本公开内容的非天然存在的多肽的SDS-PAGE凝胶。图4A描绘了在pH 3.0处理之前(泳道1)和之后(泳道2)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，所述发酵上清液含有具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的非天然存在的多肽。这种多肽的预期分子量约为17.9kDa。通过质谱法证实了多肽的身份(数据未显示)。图4B描绘了在pH 3.0处理之前(泳道3)和之后(泳道4)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，所述发酵上清液包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽。这种多肽的预期分子量约为17.6kDa。通过质谱法证实了多肽的身份(数据未显示)。图4C描绘了在pH 3.0处理之前(泳道3-5)和之后(泳道6-8)的发酵上清液的SDS-PAGE凝胶，该发酵上清液包含在各种细菌宿主菌株中产生的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽。

实施例2.产物的多肽序列确认和羟脯氨酸残基的缺失

使用质谱法来确认通过根据本公开内容的方法产生的SEQ ID NO：2的多肽序列。表4和表5提供了该多肽的肽图谱结果。

表4.SEQ ID NO：2的多肽的肽图谱。

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表5.SEQ ID NO：2的多肽的肽图谱。

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还进行分析以评估所产生的SEQ ID NO：2的多肽中存在的任何氨基酸或肽修饰(表6)。在少数情况下，进行了额外的验证性分析，以区分甲硫氨酸氧化与羟脯氨酸残基的存在。例如，基于MS/MS扫描的片段结果，显示胰蛋白酶肽T1(序列DTGFPGMPGR)包含甲硫氨酸氧化而不是脯氨酸羟基化。基于这些结果，最终确定胰蛋白酶肽1(T1)在第7位的甲硫氨酸具有氧化，并且在第5或第8位没有羟脯氨酸的证据。类似地，在胰蛋白酶肽9(T9)的第83位有另一个甲硫氨酸的情况下，多肽的第77、85、92、95和97位没有可检测水平的甲硫氨酸氧化、羟脯氨酸或第98位没有可检测水平的羟赖氨酸。因此，本公开内容的截短的胶原多肽与天然存在的胶原多肽的不同之处还在于它们缺乏羟脯氨酸残基。

表6.SEQ ID NO：2的多肽的氨基酸和肽修饰的分析。

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实施例3.用于美容品和个人护理产品的包含本公开内容的非天然存在的多肽的 粉末的制备。

该实施例展示了包含具有根据SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽的粉末的制备。在发酵实现合适的细胞密度和蛋白质表达水平后(参见例如实施例1)，将发酵液冷却直至≤15℃。此时，将浓硫酸溶液(98.5％wt)滴定至发酵罐中以将发酵液pH降低至3.0-3.2。将离心用作主要的发酵液澄清步骤以去除细胞生物量和较大的细胞碎片。然后使用微滤去除来自离心的含有产物的液流中的任何残留细胞和细胞碎片。超滤用于去除来自微滤渗透物液流中残留的盐、糖、可溶性发酵副产物和水。额外步骤包括用活性炭对蛋白质浓缩物进行脱色和除臭处理，添加防腐剂，调节pH(至pH 4-5)和无菌过滤。然后将配制的蛋白质浓缩物喷雾干燥以除去大部分水并生成最终的胶原粉末。然后根据表7中的规格对最终的胶原粉末进行合格化。

表7.胶原粉末的规格。

实施例4.用于美容品和个人护理产品的胶原溶液的制备。

然后使用来自实施例3的胶原粉末来制备多种适合掺入美容品和个人护理产品中的制剂。标准溶液是2％的胶原溶液。示例性制剂用如下的丁二醇制剂(表8)和甘油制剂(表9)制备。这些2％的溶液比较容易分析，并且适合于进一步配制美容品和个人护理产品。

表8.丁二醇制剂。

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表9.甘油制剂。

然后根据表10中描述的规格对所得2％胶原溶液进行合格化。

表10. 2％胶原溶液的规格。

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实施例5.由鲟鱼胶原粉制备各种化妆品产品。

包含本公开内容的非天然存在的多肽的粉末可用于制备如本文所述的用于美容品和个人护理的多种化妆品产品。该实施例展示了使用本公开内容的非天然存在的多肽的普遍适用的制剂。

用包含本公开内容的非天然存在的多肽的粉末制备制剂

混合和水合

每个制剂都是通过在添加粉末之前混合成分来开始的。随着混合的进行，然后逐渐添加粉末。使用分散盘或高剪切混合器可以实现粉末的更快水合。替代地，在将粉末掺入制剂中之前，将粉末在浓缩预混物中水合。为了促进水合并防止结块的形成，可以在水合之前将粉末与液体成分(例如，甘油、丙二醇)预混合成浆料。

温度和pH

在酸性或碱性组分的任何中和步骤之后掺入粉末。当在配制过程中将多肽暴露于较高温度(高达80℃)时，经验证配方的pH等于或高于5.0，以获得最佳结果。

粉末也可以使用高剪切混合器分散在无水体系中。在添加粉末之前将制剂混合。在混合过程中，逐渐添加粉末直至均匀分散。如果需要更细的颗粒，可能需要应用研磨步骤。

用本公开内容的非天然存在的多肽的2％溶液制备制剂。

混合和水合

具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽的2％溶液也可以使用标准加工工具容易地掺入制剂的水相中。

温度和pH

当溶液在低于40℃的温度下并在酸性或碱性成分的任何中和步骤之后添加到制剂中时，可以实现最佳效果。

表11.含有0.1％(w/w)的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽作为活性成分的凝胶霜制剂。

表12.含有0.1％(w/w)的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽作为活性成分的水性凝胶制剂。

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表13.含有0.1％(w/w)的具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽作为活性成分的唇膏制剂。

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实施例6.加工参数的确定以及本公开内容的非天然存在的多肽的粉末在各种化 妆品中使用的适合性。

溶解度

在0.1％(w/w)的浓度下测试包含具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽的粉末在不同溶剂中的溶解度。

下表14总结了溶解度结果。

表14.溶解度结果

溶解度水平定义如下：

可溶：掺入多肽并均化后获得澄清混合物。

有限的溶解度：在掺入多肽并均化后，观察到大量的悬浮颗粒或高水平的混浊。

溶解时间研究；加工参数对粉末溶解度、混合和水合的影响

使用柠檬酸或氢氧化钠将去离子水调节至不同的pH水平。不同pH的水被加热到不同的温度。将蛋白质掺入特定pH和温度的水中，通过顶置式混合器(RW20，IKA)以预定速度(207±3rpm)混合，并且在观察到没有可见固体物质时用计时器记录溶解时间。使用分光光度计(CM-5，Konica Minolta)测量颜色并以Gardner标度报告。使用浊度计(2100Q，Hach)测量浊度并以NTU报告。使用流变仪(Discovery HR-2，TA instruments)在峰值保持模式(60s)下，以10s^-1的剪切速率使用平行板在25℃下测量黏度。

测试变量：

多肽浓度：0.1％至1％(w/w)

初始pH：3至10

掺入温度：25℃至80℃

混合速度207+/-3rpm

输出：

溶解时间、最终pH、浊度、颜色。此类研究可用于确定化妆品制剂的最佳参数。总体上确定，升高温度会缩短溶解时间，但在较低pH下升高温度会增加浊度。发现增加多肽含量会增加溶解时间、浊度和颜色影响。发现增加初始pH会降低浊度。

溶解时间：发现增加多肽浓度会增加溶解时间，并且发现增加温度会减少溶解时间，如图5所示。

最终pH：发现多肽具有影响最终pH的缓冲作用。

浊度：经测定，升高温度和降低pH会导致沉淀和浊度增加。多肽浓度对浊度也有积极的影响，如图6所示。

颜色：发现颜色变化的主要驱动因素是多肽浓度。

pH和温度对配制粉末/压力测试的影响

将10mg/ml浓缩的多肽溶液(含有具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽)在一系列pH水平和温度下处理4小时，以确定这些条件对作为降解的度量的数量(mg/ml)和％全长多肽的影响。总体上没有观察到颜色差异。在80℃和pH低于4.0的处理样品中观察到不溶性颗粒。

图7A和图7B显示了在不同pH水平下随温度升高的稳定性。

图8A和图8B显示了全长多肽在不同pH水平下随温度升高的稳定性。

综合研究表明，优选在配制过程结束时、乳化之前添加多肽，或者如果pH大于或等于5.0，则在加热至80℃的阶段添加多肽。如果pH小于4.0，则优选在配制过程结束时掺入多肽；如果pH为4.0-5.0，则优选在低于50℃下添加多肽，并且如果pH大于或等于5.0，则可以在该过程中将多肽加热至80℃。

用含有1％(w/w)多肽的溶液评估pH或pH诱导的蛋白质降解对黏度的影响。

使用流变仪(Discovery HR-2，TA Instruments)，使用间隙为1mm的平行板测量产品的黏度曲线。在流扫模式下，剪切速率从0.1s^-1到1000s^-1变化，黏度表示为剪切速率的函数。所有样品均在25℃下进行测试。

图9A-图9C中显示了在5℃、50℃和80℃下pH对黏度的影响。在此多肽浓度下，没有观察到pH或pH诱导的多肽降解对黏度的明显影响。

图10A-图10C中显示了在pH 3.99、4.95和6.15时温度对黏度的影响。在此多肽浓度下，没有观察到温度或温度诱导的多肽降解对黏度的明显影响。

实施例7.包含本公开内容的非天然存在的多肽的制剂的毒理学分析。

在体外进行多种毒理学测定以筛选含有具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然多肽的制剂的任何潜在负面影响。

1)细菌回复突变测定

评估了多肽在四种不同的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株和大肠杆菌菌株中诱导诱变反应的能力。在不同剂量水平下筛选样品，所述筛选为将具有和不具有Arocolor^TM 1254诱导的大鼠肝微粒体(S9)的测试菌株接种在样品上。如果样品导致回复菌落增加高于自发背景水平，则样品被认为具有诱变性。该测定是本领域已知的并且按照OECD 4714化学品测试指南：细菌回复突变测定(OECD 4714Guideline for Testing ofChemicals:Bacterial Reverse Mutation Assay)进行。

在无菌去离子水中以5mg/板、1mg/板、0.5mg/板、0.1mg/板和0.05mg/板的5个浓度制备具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽的粉末。使用适当的溶剂对照进行测试，并将阳性对照在存在和不存在Aroclor诱导的大鼠肝S9的情况下接种于选择性基础琼脂培养基中并过夜培养。所有样品均接种三份。

结果表明，测试菌株对阳性对照诱变剂敏感，并表现出适当的诱变反应。自发回复率表明菌株对潜在基因毒性剂检测敏感。未发现该制剂对测试系统具有细胞毒性。使用S9活化混合物进行的代谢活化显示出活性微粒体制剂。无论是否存在S9酶激活，该制剂在任何浓度下均未显示出可检测到的基因毒性活性。

2)EpiDerm^TM皮肤模型体外毒性测试系统

利用本领域已知的MatTek公司的EpiDerm^TM体外毒性测试系统评估鲟鱼胶原的刺激潜力。简而言之，用物质对已培养形成多层、高度分化的人表皮模型的正常人源表皮角质形成细胞(NHEK)进行物质测试，并通过颜色反应监测，评估对线粒体酶琥珀酸脱氢酶的损害。该酶将水溶性黄色MTT转化为紫色不溶性产物，并且转化的MTT量与活细胞数量成正比。将Triton X-100(1％)用作阳性对照。结果描绘于表15中(GEL-CAV-A表示用具有SEQ IDNO：8的氨基酸序列的多肽处理)。

表15.体外毒性测试结果

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确定多肽的活力为50％的时间ET-50大于24小时，并且阳性对照为9.4小时。根据制造商，标准范围如表16所示。

表16.EpiDerm^TM皮肤模型体外毒性测试系统的标准范围

因此，该多肽具有在非刺激性范围内的预期体内皮肤刺激潜力。

3)EpiOcular^TM组织模型体外毒性测试系统

利用本领域已知的MatTek公司的EpiOcular^TM体外毒性测试系统评估多肽的刺激潜力。简而言之，用物质对已培养形成类似于角膜中发现的分层鳞状上皮的正常人源表皮角质形成细胞进行测试，并通过颜色反应监测，评估对线粒体琥珀酸脱氢酶的损害。该酶将水溶性黄色MTT转化为紫色不溶性产物，并且转化的MTT量与活细胞数量成正比。将TritonX-100(0.3％)用作阳性对照。结果描绘于表17中(GEL-CAV-A表示用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽处理)。

表17.体外毒性测试结果

确定活力为50％的时间ET-50，并且然后用于估计兔子Draize眼睛评分：如本领域已知的Draize＝-4.74+101.7/(ET-50)^0.5。发现该多肽的ET-50大于256分钟，并且估计的Draize眼部刺激评分为0(阳性对照为19.6分钟/Draize 18.2)。根据制造商，标准范围如表18所示。

表18.EpiOcular^TM组织模型体外毒性测试系统的标准范围

因此，该多肽具有非刺激性刺激分类。

4)重复性损伤性斑贴研究

使用本领域已知的封闭型重复性损伤斑贴研究评价多肽以确定其使具有正常皮肤的志愿者对象的皮肤敏感的能力。简而言之，重复性损伤性斑贴评估是一种改进的预测性斑贴研究，可以检测需要多次施用才能诱导足以引起过敏反应的细胞介导(IV型)免疫反应的弱敏化剂。使用此评估方法也可以检测刺激反应，尽管这不是本程序的主要目的。0.2％十二烷基硫酸钠水溶液作为阳性对照。

九十五(95)名对象完成了研究。在本研究所采用的条件下，没有证据表明对多肽制剂敏化。

实施例8.包含本公开内容的非天然存在的多肽的制剂的人类临床研究。

该实施例展示了抗衰老研究，以评估包含本公开内容的非天然存在的多肽的制剂与安慰剂产品相比的抗皱纹功效。面部皮肤健康、眼眶周围有明显皱纹的女性对象被纳入研究。皮肤水合作用效果通过Corneometer测量，皮肤弹性和紧致度效果通过Cutometer测量，并且表皮厚度通过Vivascope测量。此外，对细纹和皱纹、亮度和发红进行客观评估，并拍摄图像(Colorface)进行图像分析。评估在产品施用前、首次产品施用后立刻以及产品施用4周和12周后进行。对象填写有关产品特性的调查问卷。

测试制剂：0.1％(w/w)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽。

表19.凝胶霜制剂。

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参数：

P1：视觉评估：细纹和皱纹的外观、亮度、发红[经训练的评分员]

P2：肌肤水合作用

P3：皮肤弹性和紧致度

P4：真皮厚度

P5：摄影成像、全脸和侧面(左和右)、CP、Std60

P6：图像分析(例如，细纹和皱纹、黑斑)[Newtone]

P7：调查问卷(最多10个问题)[对象]

测试区

抗皱特性(皮肤粗糙度)的测量在眶周(即，鱼尾纹区域)进行。化妆品的皮肤保湿和紧致效果是在脸颊骨上进行评估的。该研究是以分割面设计进行的。

测试程序

第一天：适应后的基线测量：P1-P5

向对象分配测试产品

在监管下对象施用测试产品：P1-P5、P7

第2-85天：对象在家中施用测试产品，每天两次

第29天：适应后测量：P1-P5

第57天：经由电话进行合规性检查

第86天：适应后测量：P1-P5、P7、产品归还

第86天之后：P6

小组

100名女性对象(每种产品约33名)，年龄在35至70岁，根据proDERM评分为3至6，眼部有明显皱纹，没有进一步具体的纳入标准。每个产品预计有28名对象完成。探索性、随机、对象盲法、个体内比较、分割面、安慰剂对照；每个亚组的测试产品和安慰剂之间的比较，评估时间之间的比较(产品施用前第1天基线、产品施用后第一天、产品施用4周和12周后)。

分析

每个测试产品的时间比较P1-P4

P6、P7的描述性统计

每个测试产品与参考产品的比较是单独进行的

气候条件

所有调查均在完全配备空调的房间中进行，特别是在小组成员经过一段规定的适应期后，配备了用于上述测试的设备。最后一次施用通常在测量前一天晚上进行。

-通过测量总弹性和弹性恢复来确定皮肤紧致度

皮肤弹性是用测量的。测量原理基于抽吸法。在测量头中诱导设置为300mbar的真空。将测量区域的皮肤吸入测量头的开口中5秒，释放后进行另外5秒的测量期。使用光学测量系统，以非接触方式检测皮肤被吸入测量头的距离；该值可以衡量皮肤弹性。根据所得的测量曲线，计算2个参数：总弹性Uf和弹性松弛与总弹性的商Ur/Uf。

-皮肤水合作用

通过电容法使用CM 825(Courage&Khazaka，Cologne，Germany)测量角质层水合作用。测量原理基于测量头电容的变化，起到电容器的作用。在由金组成的导体之间建立了电场。通过这些方法，测量浅层皮肤的介电性。由于介电性作为皮肤含水量的函数而变化，因此可以测量角质层的水合作用。/>值的增加显示出皮肤保湿效果。

问卷-自我评估

研究结束时，对象通过最多10个问题的调查问卷来评价测试产品。该调查问卷由封闭式问题组成，并带有预定义的相同选项。如果调查问卷严重偏离给定的结构，则需要收取额外费用。

由经训练的评分员进行客观评估

细纹和皱纹的外观、亮度、发红。

-表皮厚度

1500是一种用于体内共焦扫描激光显微镜的设备。共焦显微镜是一种可以对混浊物体(例如，皮肤)进行光学切片的技术。通过这项技术，皮肤可以在其自然状态下进行体内成像，无需进一步制备。该方法能够依赖于皮肤类型对深度至多350μM的皮肤进行体内成像，因为皮肤内不同的微观结构会导致折射率的自然变化，从而提供具有对比度的图像。例如，折射率接近水(折射率1.33)的细胞质以非常低的对比度描绘。然而，黑色素和角蛋白(反射率1.7)具有相对较高的折射率，因此可作为天然造影剂。1500可以产生光学切片厚度小于5微米的活体皮肤切片，因此与组织学皮肤切片相当。/>宏观相机可以捕获测试区域的宏观图像，并将共焦图像与宏观图像相关联。

Newtone图像分析

色素斑

参数：比色可见度；斑点内部和外部的颜色参数(基于基线斑点检测)；计算对比度形态可见性-与皮肤的对比度：显眼区域(与肤色对比的表观表面检测，基于每个时间点的斑点检测)

方式：CP

视图：侧面

多色斑

参数：面积、L*、a*、b*、色素斑点内和外部、dE76对比度

方式：CP

视图：侧面

鱼尾纹皱纹

参数：显眼长度、显眼表面、显眼深度和显眼体积

方式：Standard60

视图：侧面

法令纹

参数：显眼长度、显眼表面、显眼深度和显眼体积

方式：Standard60

视图：正面

与辐射率相关的指标

参数：饱和度、光度、与辐射率相关的参数

方式：CP和Std60

视图：侧面

眼下皱纹

参数：显眼长度、显眼表面、显眼深度和显眼体积

方式：Standard60

视图：正面

额头皱纹

参数：显眼长度、显眼表面、显眼深度和显眼体积

方式：Standard60

视图：正面

皱纹分析

鱼尾纹、法令纹、眼下皱纹和额头皱纹

颜色/色调分析

色素斑、多色素斑、与光泽相关的指数、毛孔

实施例9.包含本公开内容的非天然存在的多肽的制剂增加了皮肤紧致度

对具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽的1％(w/w)制剂进行体外测试，并与报道皮肤紧致度益处的市售成膜剂进行比较。与安慰剂相比，1％(w/w)的多肽制剂显示出使皮肤紧致度增加约6.5％，并且超过了可比较的市售成膜剂，如图11所示。

安慰剂：98.5％(w/w)水、0.5％(w/w)羟丙基瓜尔胶、1％(w/w)苯氧乙醇，pH 7，含2％的NaOH溶液

1％(w/w)的多肽制剂：97.5％(w/w)水、1％(w/w)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的多肽、0.5％(w/w)羟丙基瓜尔胶、1％(w/w)苯氧乙醇，pH 7，含2％的NaOH溶液

1％(w/w)市售成膜剂：97.5％(w/w)水、1％(w/w)Aquaflex XL-30(Ashland)、0.5％(w/w)羟丙基瓜尔胶、1％(w/w)苯氧乙醇，pH 7，含2％的柠檬酸溶液

测试基底：Bioskin弹性模型(硬度0.18S)-Beaulax，日本

产品施用：2mg/cm；干燥时间：10分钟

使用质地分析仪(TA XT Plus Connect，Stable Micro Systems)，使用球形探针(d：1/2”)，将基底压缩至应变值的20％。测量施加目标应变所需的最大力。然后将产物施加至基底上(2mg/cm²)并使其干燥10分钟。重复测量并记录新的力值。使用以下公式报告相对于初始力的力变化：

实施例10.皮肤细胞的体外研究。

健康的皮肤主要由I型和III型胶原、透明质酸、纤连蛋白和弹性蛋白以及包含其他蛋白质(如层粘连蛋白和IV型胶原)的基底层组成。成纤维细胞是产生这些结构蛋白(包括胶原)的主要细胞类型。这些蛋白质统称为细胞外基质(ECM)，它们支持皮肤的结构。成纤维细胞产生的胶原会随着年龄的增长而减少，因此成纤维细胞是尝试挽救皮肤衰老的化妆品活性的主要目标。

角质形成细胞是形成表皮或皮肤外层的主要细胞类型。HaCaT细胞是一种衍生自成人皮肤的永生角质形成细胞细胞系。两种细胞类型均用于证明具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽(在图中表示为“Cav”)对皮肤的益处。这些细胞的更新率很高，并且首当其冲地受到日常污染和辐射的影响。它们受到所处环境的负面影响，导致炎症加剧和天然皮肤屏障受损。用于评估角质形成细胞健康的标志包括炎症标志物、细胞更新和DNA完整性。

1)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽对人成纤维细胞和角质形 成细胞无毒

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽在体外处理的人原代成纤维细胞、HaCaT细胞和人原代角质形成细胞没有显示出毒性迹象，如图12A-图12C所示，表明该产品在所测试的剂量下作为表面成分是安全的。

方案：

将细胞在汇合时接种到96孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基(以避免由于血清造成的任何影响)。将细胞用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽在相同的低血清培养基中处理24小时。用多肽处理后，保存上清液，并将细胞与MTT染料在37℃下温育60分钟。MTT被活细胞代谢为甲臜(formazan)盐。使用异丙醇溶解这些盐，并使用细胞板读数器对产生的颜色进行定量。

2)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽促进角质形成细胞生长和 再生

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽处理的角质形成细胞显示角质形成细胞生长和再生的剂量依赖性增加。在永生化HaCaT角质形成细胞中也看到了类似的结果。如图13(人原代角质形成细胞)所示，当与对照细胞相比，多肽表现出对角质形成细胞中细胞生长和再生的剂量依赖性刺激，在0.2％(w/w)和0.1％(w/w)处理下，细胞数量增加40％。

3)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽刺激胶原产生

具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽刺激体外成纤维细胞产生I型胶原，如图14所示。

ELISA方案：将原代人成纤维细胞在标准培养基DMEM/F12+10％ FBS中培养。上清液用于测定存在的I型胶原的水平。所用试剂盒为Takara I型前胶原C-肽检测ELISA试剂盒。按照制造商的方案测量上清液中I型胶原的数量。

在第二种分析方法中，报告多种人类胶原RNA水平的微阵列数据显示，在用多肽处理的成纤维细胞中这些胶原的表达增加至2.5-3倍。表20描绘了微阵列数据。

微阵列RNA分析方案：将细胞在汇合时接种到6孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基。用0.05％(w/w)的多肽和对照处理细胞。使用QIAGEN RNeasy试剂盒提取RNA并将提取的RNA用于分析。

表20.微阵列数据

除了胶原的上调之外，发现多肽可以提高涉及负责增殖、迁移和黏附的若干途径的多个基因的RNA水平。

上调途径：

VEGFA-VEGFR2信号传导通路

上调基因数量：74

下调基因数量：12

显着性：7.74

表21.VEGFA-VEGFR2信号传导通路中的示例性上调基因

黏着斑通路

上调基因数量：53

下调基因数量：0

显着性：9.93

表22.黏着斑通路中的示例性上调基因

内皮素通路

上调基因数量：48

下调基因数量：4

显着性：3.57

表23.内皮素通路中的示例性上调基因

EGF/EGFR信号传导通路

上调基因数量：32

下调基因数量：4

显着性：4.83

表24.EGF/EGFR信号传导通路中的示例性上调基因

TGF-β信号传导通路

上调基因数量：33

下调基因数量：3

显着性：6.92

表25.TGF-β信号传导通路中的示例性上调基因

4)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽促进伤口愈合活性

伤口愈合是一个动态过程，包括一系列事件，包括细胞增殖和迁移。成纤维细胞迁移和增殖通过分泌各种化学物质，包括胶原和其他基质蛋白，在伤口闭合中发挥至关重要的作用。

用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽处理体外人真皮成纤维细胞，在体外伤口愈合模型中显示出伤口愈合活性，如图15所示，由于细胞增殖并闭合通过刮擦成纤维细胞汇合层而诱导的间隙。另外，微阵列数据与具有伤口愈合益处的多肽一致。数据还显示，涉及细胞增殖、迁移和黏附的若干通路的基因上调。

方案：将细胞在汇合时接种到24孔板中。24小时后，将培养基更换为低血清培养基并将细胞饥饿6-8小时。饥饿后，对含有细胞的孔进行刮擦和处理。图像是在此时(时间0小时)和24小时后拍摄的。使用Image J软件分析图像。

5)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽增加暴露于城市灰尘污染 的角质形成细胞的细胞活力

在暴露于政府认证的城市灰尘样品之前，用具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽对HaCaT细胞进行预处理保护细胞。与没有多肽预处理(对照为没有预处理，没有城市灰尘暴露)相比，有多肽预处理的细胞活力大约高20％，如图16所示。

使用的城市灰尘浓度：2mg/ml。

方案：将细胞在汇合时接种到96孔板中。将细胞用多肽处理24小时(在将细胞暴露于城市灰尘之前对细胞进行预处理)。制备出所需的城市灰尘浓度，并将细胞暴露于其中24小时。城市灰尘暴露后，储存上清液以运行不同的炎症细胞因子，并将细胞与MTT染料在37℃下温育60分钟。MTT被活细胞代谢为甲臜盐。使用异丙醇溶解这些盐，并使用细胞板读数器对产生的颜色进行定量。

6)具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽具有抗氧化能力

氧自由基吸收能力(ORAC)测定(一种使用荧光读数的无细胞测定)用于显示鲟鱼胶原的抗氧化能力。数据以Trolox(维生素E)当量报告。以0.2％(w/w)溶液的形式，具有SEQID NO：8的氨基酸序列的非天然存在的多肽显示出与130μM Trolox相当的抗氧化特性，如图17所示。

尽管本文已经示出和描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以例举的形式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将构思到许多变化、改变和替换。应理解，在实施本公开内容的实施方案时可以采用本文所述本公开内容的实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开内容实施方案的范围，并且涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (67)

1.一种化妆品制剂，其包含：

多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，

其中所述化妆品制剂选自：霜剂、凝胶、凝胶霜、油、软膏、精华液、泡沫、洗剂、糊剂、香膏、溶液、混悬剂和粉末。

2.根据权利要求1所述的化妆品制剂，其中所述化妆品制剂为霜剂、凝胶霜或粉末。

3.一种化妆品制剂，其包含：

(i)多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成；和

(ii)一个或多个附加成分，所述一个或多个附加成分选自：乙酰丙酸、聚甘油-3甲基葡糖二硬脂酸酯、十一烯酸甘油酯、Simmondsia chinensis(霍霍巴)籽油、聚丙烯酸酯交联聚合物、角鲨烷、透明质酸钠、丙烯酸聚合物(卡波姆)、戊二醇、月桂醇磺基乙酸酯钠、油酰肌氨酸钠、油酸钠、Ricinus communis(蓖麻)籽油、Copernicia cerifera(巴西棕榈)蜡、小烛树蜡、Theobroma cacao(可可)籽脂、异壬酸异壬酯、地蜡、三异硬脂酸钛酸异丙酯、聚羟基硬脂酸、氧化铁、二氧化钛、乙酰丙酸钠和羟丙基瓜尔胶。

4.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少85％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

5.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

6.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

7.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

8.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：32具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成，或者所述多肽包含与SEQ ID NO：32的截短物具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

9.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中SEQ ID NO：32的所述截短物相对于SEQ ID NO：32包含N末端截短、C末端截短或两者。

10.根据权利要求9所述的化妆品制剂，其中所述N末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至750个氨基酸的N末端截短。

11.根据权利要求9或10所述的化妆品制剂，其中所述C末端截短是相对于SEQ ID NO：32的50个氨基酸至600个氨基酸的C末端截短。

12.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

13.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

14.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

15.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有至少98％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

16.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：8具有100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

17.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽具有50个氨基酸至1250个氨基酸的总截短。

18.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽的长度为至少50个氨基酸。

19.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽的长度为50个氨基酸至250个氨基酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽不包含以下中的一者或多者：层粘连蛋白G结构域、Von Willebrand因子A型(vWA)结构域和纤维胶原C末端结构域。

21.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含一个或多个胶原三螺旋重复。

22.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽为单体的。

23.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽不形成天然存在的胶原的稳定的三螺旋结构。

24.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽基本上不含其他胶原链。

25.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的羟基化水平。

26.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽中存在的少于10％的脯氨酸被羟基化。

27.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽为非羟基化的。

28.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽相对于天然存在的胶原具有非天然存在的糖基化水平。

29.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽包含小于5wt.％的糖基化。

30.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述多肽以0.001％至30％w/w的量存在于所述化妆品制剂中。

31.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述化妆品制剂被配制用于表面施用。

32.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述化妆品制剂被配制用于施用于个体的皮肤或头发。

33.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其中所述化妆品制剂进一步包含表面载体。

34.根据权利要求33所述的化妆品制剂，其中所述表面载体选自：脂质体、可生物降解的微胶囊、洗剂、喷雾、气雾剂、扑粉、可生物降解的聚合物、矿物油、甘油三酯油、硅油、甘油、甘油单硬脂酸酯、醇、乳化剂、液体石油、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯、蜡、山梨醇酐单硬脂酸酯、聚山梨酯、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、环甲基硅酮、环戊硅氧烷、水、双甘油(INCI：二甘油)和脂肪酸(例如，辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸)。

35.根据前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂，其进一步包含防腐剂。

36.根据权利要求35所述的化妆品制剂，其中所述防腐剂选自：生育酚、二碘甲基对甲苯基砜、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、顺式异构体1-(3-氯烯丙基)-3,5,7-三氮杂-1-氮鎓金刚烷氯化物、戊二醛、4,4-二甲基噁唑烷、7-乙基双环噁唑烷、苯氧乙醇、丁二醇、1,2己二醇、对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸、II、迷迭香提取物、乙二胺四乙酸(EDTA)、苯甲酸或其盐和氯己定。

37.一种个人护理产品，其包含前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂。

38.根据权利要求37所述的个人护理产品，其中所述个人护理产品选自：面膜、皮肤清洁剂、清洁霜、清洁洗剂、面部洗剂、身体洗剂、沐浴露、止汗剂、除臭剂、剃须膏、脱毛剂、面油、唇油、身体油、面部清洁剂、清洁乳、清洁贴、面部清洗剂、面部霜剂、身体霜剂、面部保湿剂、身体保湿剂、面部精华液、面部面膜、身体面膜、面部爽肤水、面部喷雾、眼部霜剂、眼部精华液、去角质配方、唇部香膏、唇膏、洗发水、护发素、沐浴露、头发精华液、头皮精华液、头发雾剂、头发喷雾、粉底、有色多功能霜、眼影、遮瑕膏、睫毛膏及其任何组合。

39.一种促进、改善和/或维持个体的年轻的皮肤的方法，所述方法包括：将前述权利要求中任一项所述的化妆品制剂或个人护理产品施用于所述个体的所述皮肤，从而促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤。

40.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的紧致度。

41.根据权利要求40所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的紧致度包括基于测量所述皮肤对负压的抵抗力(例如，使用)，使皮肤紧致度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

42.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的弹性。

43.根据权利要求42所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的弹性包括基于测量变形后所述皮肤返回其原始位置的能力(例如，使用)，使皮肤弹性(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

44.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的亮度。

45.根据权利要求44所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的亮度包括如由临床分级专家确定的使所述皮肤的亮度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

46.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的水合作用。

47.根据权利要求46所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的水合作用包括基于所述皮肤的电容测量(例如，使用)，使皮肤水合作用(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

48.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的触觉质地。

49.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的胶原含量。

50.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的弹性蛋白含量。

51.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的发红。

52.根据权利要求51所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的发红包括如由临床分级专家确定的使所述皮肤的发红(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

53.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的视觉质地。

54.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的细纹和/或皱纹。

55.根据权利要求54所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的细纹和/或皱纹包括如由临床分级专家确定的使细纹和/或皱纹(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)减少至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

56.根据权利要求39所述的方法，其中促进、改善和/或维持所述个体的年轻的皮肤包括改善所述个体的所述皮肤的表皮厚度。

57.根据权利要求56所述的方法，其中改善所述个体的所述皮肤的表皮厚度包括如通过反射共焦显微镜(例如，使用)测量的使表皮厚度(例如，相对于所述施用之前的所述皮肤)增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述施用之后，所述皮肤中的角质形成细胞生长和/或再生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述施用之后，所述皮肤中的胶原产生增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

60.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述施用之后，所述皮肤中的成纤维细胞迁移、增殖和/或黏附增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述施用之后，暴露于城市灰尘后的角质形成细胞活力增加(例如，相对于所述施用之前)至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约、至少约65％、至少约70％或至少约75％。

62.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述施用之后，涉及选自以下的信号传导通路的一个或多个基因的表达增加：VEGFA/VEGFR2信号传导通路、黏着斑信号传导通路、内皮素信号传导通路、EGF/EGFR信号传导通路、TGF-β信号传导通路及其任何组合。

63.根据权利要求62所述的方法，其中涉及VEGFA/VEGFR2信号传导通路的所述一个或多个基因选自：MYOC1、FLII、ROCK1、ROCK2、CLTC、LIMK1、EGR1及其任何组合。

64.根据权利要求62或63所述的方法，其中涉及黏着斑信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ITGA3、TNC、LAMC1、FLNA、TLN1、ZYX、DIAPH1及其任何组合。

65.根据权利要求62-64中任一项的方法，其中涉及内皮素信号传导通路的所述一个或多个基因选自：TRIOBP、WNK1、MMP2、VCAN、ACTA2、GNA12、EGR1及其任何组合。

66.根据权利要求62-65中任一项所述的方法，其中涉及EGF/EGFR信号传导通路的所述一个或多个基因选自：ATXN2、JAK1、RPS6KA2、ROCK1、SHC1、IQGAP1、PLCG1及其任何组合。

67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中涉及TGF-β信号传导通路的所述一个或多个基因选自：SMURF1、SPTBN1、PAK2、ROCK1、SHC1、TGFBR3、TGFBR1及其任何组合。