CN101952306B - Mntf肽的化妆和皮肤病制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含用于化妆和皮肤病目的的运动神经营养因子(MNTF)肽和它们的类似物的方法和组合物。

Description

MNTF肽的化妆和皮肤病制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年2月21日提交的题为“运动神经营养因子肽的化妆和皮肤病制剂”的美国临时专利申请No.61/066,670的优先权，其内容通过引用整体并入本文。 

背景技术

本公开内容总的涉及化妆和皮肤病制剂，其包含改善皮肤外观、减少或抑制皮肤的环境损伤或所述的一些组合的肽。 

紫外线辐射(UV)是皮肤(皮肤(cutaneous))衰老的主要致病因素。已报道反复暴露于紫外线辐射(例如阳光)可引起皮肤过早老化(被称为“光-衰老”的疾病)(John J.Voorhees，New England J.Med，Nov.13，1997)。光衰老皮肤的特征在于皱纹、褐斑的存在、色素沉着和/或表面粗糙度的变化。所述变化不是皮肤组织自然、正常衰老过程的一部分。另外，暴露于环境因素(如烟雾、饮酒、烟草和应激)也可导致皮肤的过早衰老。此外，与各种皮肤损伤(如割伤，烧伤)及皮肤疾病(如皮肤感染，痤疮)相关的发炎反应也导致皮肤的过早衰老。 

化妆工业正不断寻找新型成分以对抗皮肤过早衰老的不良反应及方法以减少与疑似处的皮肤发炎相关的不良反应。因此，需要具有新型的化妆和/或皮肤病组合物以对抗与皮肤过早衰老相关的疾病。 

UV和自由基引起的皮肤衰老的一般方面

有对于导致皮肤过早老化的皮肤中累积的细胞损伤的各种致病因素。其中所述的为由UV光(例如阳光)、烟雾、毒素、香烟烟雾、X射线、药物和其他环境应激所致的氧化过程和相关的自由基损伤。尽管可使用防晒霜来减少皮肤癌和日光灼伤，但其不可完全防止皮肤光衰老，因为日光灼伤和光衰老可为不同类型的紫外(例如UVA、 UVB、UVC)线及由某种UV引起的活性氧诱发损伤的所致。 

通常而言，当皮肤受到所述的潜在损伤变化时，有细胞修复和/或更新的足够细胞能量三磷酸腺苷(ATP)。然而，随着个人年龄增大，提供抗氧化活性的酶(如超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶)变得越来越少，其导致可减轻自由基、活性氧和/或过氧化物的抗氧化酶的减少。手、脸、颈部和臂之类的器官为长期暴露于光下的区域，且所述阳光下的连续暴露可导致真皮层中自由基的产生。 

某些皮肤成分对自由基诱导的氧化应激或伴随和/或随后真皮中发炎改变尤其敏感。皮肤蛋白胶原对自由基损伤和由此产生的胶原交联尤其敏感。胶原交联的特征在于正常的弹性/流动性的胶原转变为僵硬和缺乏弹性/流动性。其结果为衰老的外观(例如皱纹)和在皮肤中减少的张力。另外，痤疮的存在也与自由基/过氧化物产生有关。 

本领域认为抗氧化剂能给自由基赠送一个电子，这可稳定自由基且停止化学反应链和潜在损伤。以相似的方式，抗氧化剂可预防自由基损伤，这可减慢衰老过程。 

已发现胚胎运动神经元的存活取决于源自相关的发育中骨骼肌的特定营养物质。已报道某些骨骼肌产生能够通过预防胚胎运动神经元的衰退和随后的自然细胞死亡来增强运动神经元存活和发育的物质。这些物质被广泛称为神经营养因子(NTF)，其为对选定神经元群的存活、生长、维持及功能性能力起促进作用的一类专化蛋白质(例如Chau，et al.，1990，Chin.J Neuroanat.6：129)。 

US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299公开了运动神经元营养因子(MNTF)，其为对运动神经元显示营养作用的肽。 

发明概述 

本发明源自MNTF肽和MNTF肽类似物的意外发现，当其被施用给皮肤时可抑制和减少光损伤、氧化损伤、皱纹及皮肤衰老和相关疾病的其他症状。可使用所述肽来改善皮肤的外观，如通过改善皮肤色调、减少疤痕、减少或抑制瘢痕疙瘩形成及促进皮肤再生。 

本发明描述了显示出所述特性的衍生化和非衍生化形式的新型MNTF肽。本公开内容也描述了其他地方描述的也显示出所述特性的MNTF肽的使用。在一实施方式中，本发明涉及局部组合物，其包含具有至少含SEQ ID NO：1的残基17和18的氨基酸序列及化妆学、皮肤病学或药学可接受载质的MNTF肽。在局部组合物的某些实施方式中，MNTF肽或其类似物选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：27或它们的功能衍生物。在局部组合物的某些实施方式中，MNTF肽或其类似物选自SEQ ID NO：2和8～21的任一个或它们的功能衍生物。 

在一实施方式中，MNTF肽或其类似物通过与渗透增强剂共价键合而被N-末端修饰，由此所述组合物渗透进皮肤的能力被提高。渗透增强剂可包含亲脂性部分。一合适的增强剂为2～22碳的脂肪酸链，其中所述脂肪酸链被羟基化或非羟基化、饱和或不饱和、线性化或分支化、硫化或非硫化、环化或非环化，或生物素基，或选自苄氧羰基(Z)、叔丁氧羰基(tBoc)、9-芴甲基氧基羰基(Fmoc)和烯丙氧基-羰基(Alloc)的保护基。优选的作为渗透增强剂有用的脂肪酸和它们的盐包括、但不限于：cabrylic酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸、神经酸。从约2～22碳的烷基链也为合适的渗透增强剂。 

同样提供组合物，其中MNTF肽i)被包裹于选自下列的载体中：巨囊、微囊、纳米囊、脂质体、乳糜微粒和微海绵，或ii)被吸附于选自下列的材料上：粉状有机聚合物、滑石、皂粘土及其他矿物支持物，或iii)与选自下列的其他成分混合：提取的脂质、蔬菜提取物、脂溶性有效成分、水溶性有效成分、无水凝胶、乳化聚合物、表面张力活性聚合物、合成的脂质、凝胶化聚合物、组织提取物、海洋提取物、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、太阳光过滤剂和抗氧化剂。 

优选本文提供的MNTF组合物包含对于促进皮肤的恢复或保护而言有效量的MNTF肽。可用化妆学、皮肤学或药学可接受的载质，优选作为局部制剂施用所述组合物。 

本发明包括为化妆、抗发炎、抗氧化损伤、抗光衰老或抗皱纹的目的或所述目的的一些结合施用包含MNTF肽或其类似物的组合物的方法。 

本发明另一方面涉及通过施用MNTF组合物恢复或保护皮肤的方法。所述方法还包括减少或抑制光损伤相关的发炎或自由基损伤、减少皮肤中过氧化物或自由基的产生、减少皱纹、改善皮肤色调、减少UV或光损伤、促进皮肤再生。 

本发明另一方面涉及通过以对改善或减少所述痤疮疤痕而言的有效量局部施用MNTF组合物而改善痤疮疤痕的方法。 

本发明另一方面涉及通过以对减少所述瘢痕疙瘩形成而言的有效量施用MNTF组合物而减少受试者中的瘢痕疙瘩形成的方法。MNTF肽和MNTF肽类似物基于序列SEQ ID NO：1，其为在其他地方已公开的33聚体肽(即33个残基的多肽)。如本文所述，在本文所述的组合物和方法中有用的MNTF肽和MNTF肽类似物优选包括SEQ IDNO：1的少至2个和多至全部33个连续氨基酸残基。在一优选的实施方式中，本文所述的MNTF肽和MNTF肽类似物至少包含在SEQID NO：1的残基17和18处存在的FS(SEQ ID NO：8)残基。 

在另一实施方式中，所述MNTF肽或其类似物包含SEQ ID NO：1的苯丙氨酸-丝氨酸二肽和SEQ ID NO：1中的1～30个额外的氨基酸、任选具有在SEQ ID NO：1中所述序列的1～5个连续氨基酸取代的所述MNTF肽或其类似物、或酯、酰胺、前药和/或它们的盐形式。 

在其他的实施方式中，MNTF肽由i)SEQ ID NO：1的2个和6个之间的连续氨基酸；ii)SEQ ID NO：1的2个和5个之间的连续氨基酸；iii)SEQ ID NO：1的3个和5个之间的连续氨基酸；iv)SEQID NO：1的至少2个连续氨基酸；v)SEQ ID NO：1的至少3个连续氨基酸；或vi)它们中任一项的类似物，例如i)～v)中任一项的功能衍生物构成。在i)、iv)和v)中所述MNTF肽不具有由SEQ ID：2构成的氨基酸序列。通过举例，合适的MNTF肽和MNTF肽类似物可具有SEQ ID NO：1～27中任一个的氨基酸序列。 

LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQID NO：1) 

FSRYAR(SEQ ID NO：2) 

WMLSAFS(SEQ ID NO：3) 

MLSAFSRYAR(SEQ ID NO：4) 

FSRYARCLAE G(SEQ ID NO：5) 

CWMLSAFSRY ARC(SEQ ID NO：6) 

MLSAFSRYAR CLAEGHDGPT Q(SEQ ID NO：7) 

FS(SEQ ID NO：8) 

FSR(SEQ ID NO：9) 

AFS(SEQ ID NO：10) 

FSRY(SEQ ID NO：11) 

SAFS(SEQ ID NO：12) 

AFSR(SEQ ID NO：13) 

LSAFS(SEQ ID NO：14) 

SAFSR(SEQ ID NO：15) 

AFSRY(SEQ ID NO：16) 

FSRYA(SEQ ID NO：17) 

MLSAFS(SEQ ID NO：18) 

LSAFSR(SEQ ID NO：19) 

SAFSRY(SEQ ID NO：20) 

AFSRYA(SEQ ID NO：21) 

SRYAR(SEQ ID NO：22) 

RYAR(SEQ ID NO：23) 

YAR(SEQ ID NO：24) 

SRYA(SEQ ID NO：25) 

RYA(SEQ ID NO：26) 

SRY(SEQ ID NO：27) 

附图说明

图1为示在人瘢痕疙瘩成纤维细胞应答本文所述的MNTF肽(Pal-六肽)的增殖中的剂量性依赖性减少/抑制的条形图。 

图2A为示可显示本文所述MNTF分子(Pal-六肽)对角质形成细胞中γ-干扰素依赖性的一氧化氮产生(即发炎的指标)的抑制/减少的作用的剂量依赖性数据的条形图。图2B为示由本文所述的MNTF六肽的角质形成细胞中一氧化氮产生减少的条形图。 

图3A为示可显示本文所述MNTF分子(Pal-六肽)对内源和外源性细胞过氧化物水平(即抗氧化能力的指标)的抑制/减少的作用的剂量依赖性数据的条形图。图3B为示由本文所述的MNTF六肽的内源和外源性细胞过氧化物水平的减少的条形图。 

图4A为比较如通过UV(UVA)诱导的β-胡萝卜素的自由基漂白的减少(即抗氧化能力的指标)所测量的对应于β-胡萝卜素(菱形)和对应于本文所述的MNTF肽(Pal-六肽，三角形)的色指数的坐标图。图4B为比较如通过测量β-胡萝卜素的漂白的减少所测量的对应于β-胡萝卜素(菱形)和对应于本文所述的MNTF六肽(“肽”，三角形)的色指数的坐标图。 

图5为示棕榈酰化MNTF六肽(图5A)和非棕榈酰化MNTF六肽(图5B)对刺激成纤维细胞中透明质酸的作用的条形图。 

发明详述 

本公开内容涉及包含MNTF肽(即MNTF蛋白的一部分，其已之前被描述为显示出神经营养活性)的组合物具有重要的皮肤病和化妆用途的意外发现。所述组合物包括化妆学及皮肤病学可接受的组合物(例如本文所述的MNTF肽的局部应用制剂)。 

本文公开了源自显示出化妆学和皮肤病学有益特性的MNTF的肽。本文所述肽可选地和可互换地被称为“MNTF肽”及“表皮因子肽”。描述了制备和使用包括一种或多种所述肽的组合物的方法，所述组合物对于化妆和皮肤病目的有用。 

本公开内容包括对减少皱纹、痤疮和其他皮肤疤痕的外观是有效的组合物。所述组合物对刺激胶原更新、改善皮肤张力(即其软化皮肤、紧致皮肤或两者)、还改善皮肤外观(例如皮肤光泽)、氧化和辐射引发的皮肤损伤是有用的。 

可给皮肤局部施用本文所述组合物来刺激皮肤成纤维细胞的产生以达到各种化妆和皮肤病疗效。所述施用可重建表皮基质分子、通过刺激胶原的产生和增厚表皮来再生皮肤的上层、抑制触发发炎的炎症介质(如白介素)、及另外抑制或预防对皮肤的氧化和发炎损伤。 

暴露于有害辐射(例如UV光或阳光)可引起在真皮层中炎症介质(如白介素)的释放，其可导致活性炎症物质的创建及在皮肤和邻近组织中发炎。当对受试者的皮肤局部使用本文所述组合物时，其显示出抗发炎、抗氧化(例如抗自由基)特性。 

本公开内容包括保护皮肤以免出现衰老症状(例如与暴露于UV光有关的衰老症状)的方法。所述方法包括对皮肤使用包含本文所述MNTF肽或其类似物的制剂。例如，所述组合物提供保护以防出现与紫外光的UV-A、UV-B和UV-C类型有关的症状。 

可使用本文所述组合物来抑制、预防或减少皮肤中的化妆或皮肤病变化。所述使用包括对皮肤使用本文所述的MNTF肽或其类似物，优选以化妆或皮肤病制剂。可被抑制、减少或预防的皮肤的化妆和皮肤病学变化包括在皮肤的外观和/或张力中的变化，例如皱纹和褐斑的发展。 

可使用本文所述组合物来促进皮肤水化和用于一般的皮肤护理(即普通的皮肤保养)。所述组合物可在被使用组合物的皮肤中抑制、减少或预防日光灼伤、皱纹、光损伤、痤疮、与皮肤衰老有关的其他疾病、日光性皮肤病(heliodermia)、自由基损伤、及发炎。 

在一实施方式中，本公开内容涉及包含本文所述组合物、用其涂或用其浸渍的化妆或皮肤病擦(例如垫，小毛巾、拭子、或其他吸收性材料)。所述擦是用于给皮肤局部施用本文所述化合物的方便装置。 

MNTF肽及其类似物

本文所述化妆和皮肤病化合物包括至少一种MNTF肽或其类似物。在本公开内容所述的用于所述目的的MNTF肽和其类似物包括氨基酸序列SEQ ID NO：1代表的部分MNTF分子的至少两个连续氨基酸残基。在一优选的实施方式中，所述肽至少包含在SEQ ID NO：1的残基17和18处存在的FS(苯丙氨酸和丝氨酸)(SEQ ID NO：8)残基。肽和其类似物可在FS(SEQ ID NO：8)残基的氨基-末端或羧基-末端上包含SEQ ID NO：1的更多连续氨基酸残基。合适的MNTF肽的例子包括在美国专利No.6,309,877、美国专利No.7,183,373、美国专利No.6,841,531、美国专利No.6,759,389、和美国专利申请公开No.2006/0052299中报道的例子。 

本文所述MNTF肽和其肽类似物包括源自MNTF的肽(即具有SEQ ID NO：1的两个或更多个连续残基的肽)和所述肽的功能衍生物。MNTF肽的合适例子包括具有SEQ ID NO：1～27之一的氨基酸序列的肽及所述肽的功能衍生物。可以盐、酯和其他普通的剂型使用MNTF肽和其类似物。合适的类似物包括例如其中一个或多个氨基酸残基被非天然存在的(例如D-异构体)氨基酸残基取代的肽。其他类似物包括其中SEQ ID NO：1的一个或多个氨基酸残基被如表I、II和III所述的同义氨基酸残基取代的肽。 

表I 

同义氨基酸的优选组 

氨基酸 同义组 

Ser    Ser、Thr、Gly、Asn 

Arg    Arg、Gln、Lys、Glu、His 

Leu    Ile、Phe、Tyr、Met、Val、Leu 

Pro    Gly、Ala、Thr、Pro 

Thr    Pro、Ser、Ala、Gly、His、Gln、Thr 

Ala    Gly、Thr、Pro、Ala 

Val    Met、Tyr、Phe、Ile、Leu、Val 

Gly    Ala、Thr、Pro、Ser、Gly 

Ile    Met、Tyr、Phe、Val、Leu、Ile 

Phe    Trp、Met、Tyr、Ile、Val、Leu、Phe 

Tyr    Trp、Met、Phe、Ile、Val、Leu、Tyr 

Cys    Ser、Thr、Cys 

His    Glu、Lys、Gln、Thr、Arg、His 

Gln    Glu、Lys、Asn、His、Thr、Arg、Gln 

Asn    Gln、Asp、Ser、Asn 

Lys    Glu、Gln、His、Arg、Lys 

Asp    Glu、Asn、Asp 

Glu    Asp、Lys、Asn、Gln、His、Arg、Glu 

Met    Phe、Ile、Val、Leu、Met 

Trp    Trp 

表II 

同义氨基酸的更优选组 

氨基酸 同义组 

Ser    Ser 

Arg    His、Lys、Arg 

Leu    Ile、Phe、Met、Leu 

Pro    Ala、Pro 

Thr    Thr 

Ala    Pro、Ala 

Val    Met、Ile、Val 

Gly    Gly 

Ile    Ile、Met、Phe、Val、Leu 

Phe    Met、Tyr、Ile、Leu、Phe 

Tyr    Phe、Tyr 

Cys    Ser、Cys 

His    Arg、Gln、His 

Gln    Glu、His、Gln 

Asn    Asp、Asn 

Lys    Arg、Lys 

Asp    Asn、Asp 

Glu    Gln、Glu 

Met    Phe、Ile、Val、Leu、Met 

Trp    Trp 

表III 

同义氨基酸的最优选组 

氨基酸 同义组 

Ser    Ser 

Arg    Arg 

Leu    Ile、Met、Leu 

Pro    Pro 

Thr    Thr 

Ala    Ala 

Val    Val 

Gly    Gly 

Ile    Ile、Met、Leu 

Phe    Phe 

Tyr    Tyr 

Cys    Ser、Cys 

His    His 

Gln    Gln 

Asn    Asn 

Lys    Lys 

Asp    Asp 

Glu    Glu 

Met    Ile、Leu、Met 

Trp    Trp 

本文所述MNTF肽及MNTF肽类似物的氨基酸残基可为天然存在或合成的氨基酸残基。可在化合物中利用氨基酸残基的L-和D-对映体。本文对氨基酸残基使用下列缩写：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；蛋氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)及缬氨酸(Val，V)。 

不天然存在并可在本发明化合物中存在的氨基酸残基包括：β-丙氨酸(b-Ala)和其他ω-氨基酸(如3-氨基丙酸(Dap)、2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)、4-氨基丁酸等)、α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、甲基甘氨酸(MeGly)、鸟氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔丁基丙氨酸(t-BuA)、叔丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、苯基甘氨酸(Phg)、环己丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle，J)、2-萘丙氨酸(2-Nal)、4-氯苯丙氨酸(Phe(4-Cl))、2-氟苯丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、蛋氨酸亚砜(MSO)、高精氨酸(hArg)、N-乙酰赖氨酸(AcLys)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、2，3-二氨基丁酸(Dbu)、对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH₂))、N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)和高丝氨酸(hSer)。涉及的更多氨基酸类似物包括：磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸、α-甲基-丙氨酸、对-苯甲酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸和肌氨酸。 

可互相取代的氨基酸通常属于相似的类或亚类。如本领域任一技术人员所知，主要取决于所述氨基酸侧链的化学和物理特性而将氨基酸分进不同类中。例如，通常认为一些氨基酸为亲水性或极性氨基酸 而认为其他的为疏水性或非极性氨基酸。极性氨基酸包括有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸而非极性氨基酸包括有芳香族或疏水性侧链的氨基酸。可进一步将非极性氨基酸细分成包括尤其是脂肪族氨基酸。 

可通过常规的化学合成(固相或液相合成)或通过酶法合成从组成型氨基酸或它们的衍生物获得本文所述的化妆组合物实施方式。 

定义

阐述了在本公开内容所属的技术中使用的某些术语。除另有说明外，在本文和随附的权利要求中使用时下列术语具有下列含义。 

本文术语“盐”指本发明所述肽或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。可通过本领域已知的方法形成羧基盐，且其包括无机盐(例如钠、钙、铵、铁或锌盐等)和与有机碱(例如，与胺(如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等))所形成的盐。酸性盐包括，例如与无机酸(如盐酸或硫酸)的盐和与有机酸(如醋酸或草酸)的盐。当然，所述的任何盐必须保留本发明的肽或其类似物的活性。 

本申请所用“类似物”包括已被修饰但保留MNTF活性(例如相对于33聚体MNTF，SEQ ID NO：1，通过截短、取代、共价连接至另一部分等)的肽。MNTF肽类似物包括例如MNTF肽的酯、酰胺、前药和盐形式。MNTF肽类似物包括通过连接至另一部分而被共价修饰的MNTF肽，例如将MNTF肽共价连接至亲脂部分(例如脂肪酸)、载质分子或异源多肽以产生融合蛋白。在某些实施方式中，本发明所述的类似物包括“保守”取代(例如相对于SEQ ID NO：1)。保守的氨基酸取代包括使用同组内的同义氨基酸的氨基酸替换，其具有足够相似的物理化学特性即组成员间的取代会保持分子的生物学功能(Grantham，Science，Vol.185，pp.862-864(1974))。MNTF肽类似物还包含本文所述的肽或类似物的MNTF功能衍生物。在一些实施方式中，与在SEQ ID NO：1或其截短形式(包括SEQ ID NO：2～22)所示的序列相比，所述MNTF类似物包括20％、25％、30％、35％或多达40％的保守氨基酸取代。 

本文所用定义“功能衍生物”指依据已知方法从氨基酸部分侧链或 末端的N-或C-基上存在的功能基制备的衍生物，且当其为化妆学可接受时即当其不破坏蛋白活性或不把不可接受的毒性给予包含它们的化妆组合物时其被包含在本公开内容中。所述衍生物包括例如羧基的脂肪酯或酰胺和游离氨基的N-酰基衍生物、及游离羟基的O-酰基衍生物和用酰基形成的例如链烷酰基或芳酰基、前药、功能基的盐或它们的组合。可通过对MNTF肽进行共价修饰来制备功能衍生物。通过靶氨基酸与能与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂间的反应将共价修饰引入至肽中。使用有机衍生化试剂共价修饰多肽为本领域技术人员所熟知。例如，用α-卤代乙酸(和相应的胺)(如氯乙酸或氯乙酰胺)与半胱氨酰残基反应以给出羧甲基或甲酰氨基甲基衍生物。可通过与pH5.5～7.0的焦碳酸二乙酯或与pH6的对溴苯酰甲基溴在1M二甲胂酸钠溶液中反应而将组氨酰残基衍生化。赖氨酰和氨末端残基可与琥珀酸或其他羧酸酐反应。可通过与苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮、茚三酮之中的一种或多种常规试剂的反应修饰精氨酰残基。通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应将谱标记引入至酪氨酰残基；最常见的是，使用N-乙酰咪唑和四硝基甲烷来分别形成0-乙酰酪氨酰类和3-硝基衍生物。可通过与碳二亚胺类(R’-N-C-N-R’)(如1-环己基-3-(2-吗啉-(4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3(4氮鎓4，4-二甲基戊基)碳二亚胺)反应来选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)。此外，通过与铵离子反应使天冬氨酰和谷氨酰残基转换成天冬酰胺酰或谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可被去酰胺至相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。其他修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，1983，Proteins：Structure and Molecule Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86)，N-末端胺的乙酰化和在一些情况下、C-末端羧基的酰胺化。 

本文所用术语“生物活性肽”和“生物活性片段”指依据上述运动神经元分化因子(MNDF)和/或运动神经元营养因子(MNTF)的肽或 多肽，其中MNDF可使干细胞分化成运动神经元，而其中MNTF显示出神经保护、修复和治疗功能。 

本文所用术语“蛋白”指如当键合至一个氨基酸的α-C的羧酸基的羧基碳原子被共价结合至邻近的氨基酸残基的氨基氮原子时所发生，经肽键连接的两个或更多个独立氨基酸残基(无论是否为天然存在)的任何聚合物。所述肽键键合和包含它们(即α-C原子、羧基C原子(及它们的取代氧原子)和氨基N原子(及它们的取代氢原子))的原子形成蛋白的“多肽骨架”。另外，认为本文所用术语“蛋白”包括术语“多肽”和“肽”(它们可在本文互换使用)。术语蛋白的“片段”指包含少于蛋白的全部氨基酸残基的多肽。蛋白的“结构域”也为片段，且包含蛋白通常所需的氨基酸残基以赋予活性或功能。 

“抑制”指在频率、范围、程度或持久性上的减少。因此，当症状被抑制时，症状发生的频率、症状的范围(即症状在身体上显示的几何面积)、症状被表现出的程度(即症状的严重程度)和症状的持久性(即症状显示出的持续时间)的至少一个被减少。 

本文所用“纤维化”疾病、病症或病况包括本文所述疾病，且还包括急性和慢性，临床或亚临床表现，其中与生物学或病理学相关的纤维化是显而易见的。纤维化疾病、病症或病况包括通过纤维化材料的过量产生(包括在细胞外基质内纤维化材料的过量生产，或正常组织元件被异常、非功能组织元件的取代和/或基质相关成分的过量积累)整体或部分表征的疾病、病症或病况。“纤维化”疾病、病症或病况包括例如通过纤维化表征的纤维化相关的生物学或病理学。例示“纤维化”疾病、病症或病况包括例如硬皮病(包括硬斑病、全身性硬斑病或线性硬皮病)。 

本文所用“预防”指整体或部分预防、或改善或控制。在某些方面，“预防”包括抑制或减少归因于皮肤过早衰老的不良皮肤病反应。 

本文所用“受试者”指被分类为哺乳动物的任何动物，其包括人、家养和耕作动物、动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、马、猫、绵羊、猪、牛等。优选的受试者为人。 

术语“百分比(％)同一性”指在两个或更多个序列的比较中发现的序列相似性的百分比。例如，可使用任何合适的生物信息学软件(例如BLAST)电子确定百分比同一性。同样，通过将一个序列与第二个序列的序列相比较来确定两个序列(或两个序列中各个或两个的一个或更多个部分)间的相似性。本文所用术语“同源性和同源物”包括包含同源于目的蛋白序列的氨基酸序列的肽。所述肽与相关序列(例如超过所述同源序列的至少约15、20、30、40、50、100个以上的连续氨基酸/多肽的区域)通常具有至少约70％的同源性，并可为至少约80％、90％、95％、97％或99％同源性。取决于所述肽和参照序列的长度，相对于参照序列(例如SEQ ID NO：1)其还可包含多达约25％、30％、40％或50％的保守氨基酸变化。 

制备MNTF肽和其类似物的方法

用于制备本文所述MNTF肽的方法不是关键。基本上可使用已知的任何肽合成方法，今后发展的方法也可使用。如熟知本领域和本公开内容的技术人员所了解，包含MNTF活性结构域的序列和其肽类似物可将神经保护、修复和治疗功能体内和体外给予运动神经元。可合成或重组产生、或从自然细胞中分离本文所述的MNTF因子。 

技术人员应了解，取决于大量因素，包含各种MNTF肽或其类似物的肽的准确化学结构会有所不同。例如，因为在分子中发现了可电离的氨基和羧基，可以酸性盐或碱性盐、或中性形式获得给定的多肽。 

可通过本领域熟知的任何方案(如固相合成或液相合成)制备本公开内容的肽。作为固相合成，例如对应于要合成的肽C末端的氨基酸被结合至不溶于有机溶剂的支持物上，并通过反应的交替重复，其中一个反应为具有用适当的保护基保护的α-氨基和侧链功能基的氨基酸以C-末端至N-末端的顺序依次被缩短，而其中另一个为释放结合至树脂或肽α-氨基的保护基的氨基酸，所述肽链从而以此方式延伸。取决于使用的保护基的类型，在很大程度上由tBoc方法和Fmoc方法分类固相合成方法。 

通常使用的保护基包括：对于氨基的tBoc(叔丁氧羰基)、Cl-Z (2-氯苄氧羰基)、Br-Z(2-溴苄氧羰基)、Bzl(苄基)、Fmoc(9-芴甲氧羰基)、Mbh(4，4′-二甲氧基二苯甲基)、Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)、Trt(三苯甲基)、Tos(甲苯磺酰基)、Z(苄氧羰基)和Cl₂-Bzl(2，6二氯苄基)；对于胍基的NO₂(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基色烷-6-磺酰基；及对于羟基的tBu(叔丁基)。 

应了解可通过本领域熟知的方法(包括但不限于通过固相合成的化学合成和通过HPLC从化学反应的其他产物的纯化、或通过在体外翻译系统或在活细胞中编码包含本文所述的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如DNA序列)的表达)制备包含本公开内容所述MNTF肽组合物。可分离和大规模透析组合物的MNTF肽以去除一种或多种不需要的小分子量分子和/或被冻干以使更易制剂进入所需媒质。还应了解在制备入MNTF肽成分中的额外氨基酸、突变、化学修饰等(无论何者)应基本上不干扰MNTF对接序列的受体识别。 

在所需肽的合成后，其要经受去保护反应并从固体支持物上切割出。可用Boc方法的氟化氢或三氟甲烷磺酸及用Fmoc方法的TFA进行所述肽切割反应。 

然后获得的粗肽要经受纯化。通过所述目的已知的任一方法即包括提取、沉淀、色谱、电泳等的任何常规方案进行纯化。例如，可使用HPLC(高效液相色谱)。可使用常用于蛋白纯化的基于水-乙腈的溶剂进行所述洗脱。 

对应于MNTF一种或多种片段的肽或多肽在长度上通常可为至少两个氨基酸残基，且可包含多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、约15、约20或约30个氨基酸残基左右，及功能衍生物，例如棕榈酰化物。优选，本文所述MNTF肽或其类似物包含不多于SEQID NO：1的33个氨基酸残基的氨基酸残基。合适的肽包含SEQ IDNO：1的32个连续氨基酸残基、31个连续氨基酸残基、30个连续氨基酸残基等、缩短至同二肽一样小的肽。在优选的实施方式中所述MNTF肽和其类似物包含SEQ ID NO：1的位置17和18处的苯丙氨酸和丝氨酸残基。 

可在测定和用于测定的试剂盒中以游离的形式或连接至载质分子(如蛋白或固体颗粒)的形式及连接至标记物或示踪物(例如生物素或荧光素异硫氰酸酯)的修饰的肽使用本文所述的MNTF肽或其类似物。 

可用本领域熟知的双功能试剂(包括1，1双(重氮乙酰基)2乙苯、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如4-叠氮基水杨酸酯、同型双功能酰亚胺酯(包括双琥珀酰亚胺酰酯(如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸))和双功能马来酰亚胺(如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷))))进行MNTF肽或其类似物与水不溶性支持基质间的交联。甲基-3-[(对叠氮基苯基)二硫代]丙亚胺酸酯之类的双功能试剂产生在光存在下能形成交联的光活性中间体。另外，可将反应性水不溶性基质(如溴化氰活化的碳水化合物)用于蛋白固定。 

可使用本文所述的双功能试剂进行MNTF肽或其类似物与包括第二MNTF1肽或其类似物的第二蛋白间的交联。在一些实施方式中，有插入的间隔基，例如二巯基或二氨基或多个氨基酸残基(例如，甘氨酸)。所述间隔基也可为同型或异型双功能交联剂，例如异型双功能交联剂N-(4-羧基-环己基-甲基)-马来酰亚胺。 

化妆和皮肤病组合物

本文所述使用的组合物可包含与一种或多种合适的稀释剂、载质和其他相对惰性成分一起的一种或多种MNTF肽或类似物。所述组合物包括大量防腐剂、溶剂、粘合剂、乳化稳定剂，膜生成剂、消结块剂、保湿剂、及常用于化妆用品、皮肤病产品和其他局部施用产品的其他成分的任一种。本领域已知所述大量的各种成分。 

本发明的化妆制剂包括化妆学可接受的载质、稀释剂、增溶剂或乳化剂、及本领域可得类型的盐。除了本文所述MNTF肽之外，在化妆组合物中包含的合适的试剂的例子包括化妆学可接受载质、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载质化合物及其他化妆学可接受的载质或赋形剂等。 

已知渗透增强剂的大量类型，如脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 8，91-192(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33(1990))。在本文所述组合物中可包含一种或多种渗透增强剂。 

作为渗透增强剂的各种脂肪酸和它们的衍生物包括例如：cabrylic 酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸、神经酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖酸酯、甘油单油酸酯(又名1-单油酰基-消旋-甘油酯)、二月桂精、花生四烯酸、甘油1-癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单-和双-甘油酯及其生理可接受的盐(即油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)。(Lee et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems page 92(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1(1990)；El-Hariri et al.，J.Pharm.Pharmacol.44，651-654(1992))。 

在某些实施方式中，例示MNTF肽和其类似物包括通过脂肪酸和/或从2～22个碳原子的烷羰基(Alk-C(O)-)的N-末端修饰的肽、或保护基(其选自：苄氧羰基、叔丁氧羰基、芴-甲氧羰基和烯丙氧基羰基)且Y为OH或NH₂及它们的盐。在某些实施方式中，所述烷羰基包含10～20、12～18或2～22个碳，例如6、8、10、12、14或16个碳。在一特定的实施方式中，在MNTF肽或类似物上适合的N末端修饰为通过棕榈酰化(例如棕榈酸)。 

可以各种形式中的任一种局部施用本文所述组合物。 

局部施用的制剂包括：皮贴、软膏、洗剂、血清、霜、凝胶剂、滴剂、喷雾剂、液体和粉末。也可使用常规的化妆载质、水、粉末或含油碱、增稠剂等。 

本文所用的用于化妆、护肤和/或皮肤病应用的本文所述MNTF肽和类似物的制剂包括例如已知的抗皱活性成分(包括例如黄酮苷类 (如α-glycosylrutin)、辅酶Q₁₀、维生素E和衍生物等)及已知的阳光阻断成分、保湿剂和香水。 

可为“化妆”或“护肤”(即皮肤病)应用单独或作为与其他合适的试剂或成分相组合的“添加剂”施用本文所述的包含MNTF肽或类似物的组合物。本文所用“化妆”或“护肤”应用包括例如：与皮肤中皮肤病变化(例如，在皮肤过早衰老期间、干燥、粗糙、干燥皱纹的形成、瘙痒、减少的加脂(refatting)(如清洗后)、可见血管扩张(如毛细血管扩张，cuperosis)、痿、皱纹(wrinkles)和皱纹(lines)的形成、局部色素沉着、色素沉着不足、不正确的色素沉着(如老年斑)、增强的对机械应激的敏感性(如裂缝等)、皮肤松弛(如硬度不足)及干燥或粗糙的皮肤表面特征的出现)相关的预防性和/或恢复性应用。 

可将本文所述MNTF肽和类似物制备成用于局部施用的皮肤药物制剂，以对抗通过异常疤痕、肥厚性疤痕、烧伤、皮肤创伤、瘢痕疙瘩、银屑病、皮肤疾病、全身性疾病、病变、肿瘤和癌症、痤疮/滤泡性疾病、湿疹、皮炎和过敏症、水泡病、免疫性皮肤病、鳞状皮肤疾病、糜烂及溃疡、血管性皮肤问题、色素沉着问题、过多的瘙痒(瘙痒)、对外部试剂的局部皮肤反应、及深度皮肤疾病和纤维化疾病来整体或部分表征的任何皮肤病疾病、病症或病况。在其他的实施方式中，可使用本公开内容的方法来最小化或预防在人或其他哺乳动物，尤其是倾向于过度疤痕的个体中的疤痕(如肥厚性疤痕、瘢痕疙瘩和过度烧伤疤痕、萎缩性疤痕、及普遍的疤痕)形成。 

可通过各种方法将本文所述MNTF肽和类似物制备成用于局部施用的皮肤药物制剂。所述方法的例子包括包裹适当量的MNTF肽或类似物于选自下列的载体中：巨囊、微囊、纳米囊、脂质体、乳糜微粒和微海绵。所述方法的另一例子包括吸附MNTF肽或类似物于选自下列的材料上：粉状有机聚合物、滑石、皂粘土及其他矿物支持物。所述方法的第三个例子包括混合所述MNTF肽或类似物与选自下列的成分：提取的脂质、蔬菜提取物、脂溶性有效成分、水溶性有效成 分、无水凝胶、乳化聚合物、表面张力活性聚合物、合成的脂质、凝胶化聚合物、组织提取物、海洋提取物、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、太阳光过滤剂和抗氧化剂。例如可在美国专利申请公开No.2005/0249720中发现合适组合物的其他例子。 

可将本文所述MNTF肽和类似物并入任何gelanic形式，如O/W型乳剂和W/O型乳剂、乳、洗剂、胶凝剂和增厚剂、表面活性和乳化聚合物、润发油、洗剂、毛细管、洗发水、肥皂、粉末、棒和铅笔、喷雾剂、体油。 

无论通过何种方法将化合物施用于患者，可使用胶体分散系统作为递送媒质以增强肽的体内稳定性和/或使所述肽靶向特定的器官、组织或细胞类型。胶体分散系统包括但不限于：高分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统(包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体和脂质：未鉴定结构的肽复合物)。胶体分散系统的例子为多种脂质体。脂质体为微观球体，其具有由双层构型中排列的脂质构成的一个或多个外层包围的水性核心(通常见Chonn et al.，Current Op.Biotech.6，698-708(1995))。可使用本文所述化合物的持续释放剂型 

剂量和施用

施用于受试者的MNTF肽或类似物的准确量不是关键，除非其为足以实现被施用包含所述肽或类似物的组合物的疾病的改善的量。剂量可取决于大量因素，其包括要治疗的病情的严重性和反应性，和持续数天至数月的治疗过程、或直到实现治疗或达到病情的减弱。 

举例而言，可施用MNTF肽和类似物以在靶位点处达到约0.01微克/毫升(μg/mL)～约10mg/ml、约0.1μg/mL～约500μg/mL、约0.1μg/mL～约1500μg/mL、约1μg/mL～约2000μg/mL及约0.1μg/mL～约5000μg/mL(包括所述范围的任一范围)的最终浓度。包含以在所述范围的一个或多个中的浓度的所述肽或类似物的组合物是合适的。同样地，可基于本文所提供的实验数据估计合适的剂量值。 

合适的剂量值可取决于要被施用所述组合物的位点的特征和所述 肽的形式。举例而言，棕榈酰化的MNTF肽类似物的水溶性比对应的非棕榈酰化MNTF肽小许多。例如，具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的棕榈酰化六聚体的水溶性在约1mg/ml。包含约1mg/ml的所述肽类似物的凝胶可被稀释约20倍，以产生适于人日常局部使用的产物，所述产物每毫升包含约50μg所述肽。 

在文献中提供了给药具体剂量和具体方法的指导且对于本领域技术人员通常可得。本领域技术人员将使用不同的核苷酸制剂，而非蛋白或其抑制剂。基于在体液或组织中测量的药物残留时间和浓度，本领域普通技术人员可轻易估计给药的重复频率。成功治疗后，需要使患者经历维持性治疗以防止病情的复发，其中以在0.01mg/kg～100mg/kg体重的范围内的维持剂量、每天一次或多次至每20年一次施用所选定化合物。在某些疾病的治疗和预防中，适当的剂量水平通常应为约0.001mg/kg～100mg/kg患者体重/天，其可以单剂量或多剂量施用。合适的剂量水平可为约1～约40mg/kg/天。在某些实施方式中，以达到约1μmol～约10mmol、约10μmol～约5000μmol、或约30μmol～约3000μmol和约25μmol～约3000μmol损伤位点上最终浓度的体内浓度，且包括约25μmol、或约1600μmol或约3000μmol损伤位点上的最终浓度，且仍更通常在约1μmol～约1000μmol之间的量施用本文所提供的包括MNTF肽或其类似物的化合物。 

可参考下列实施例、通过举例的方式而不通过限制的方式提供的某些方面中了解本发明。可从商业来源获得在下列例子中参考的材料和试剂等，除非另有强调。 

实施例

实施例1：脂肪酸MNTF肽的制备方法和共价连接

通过为Merrifield所述的肽制备所良好建立的固相合成方法合成所述成分。用Fmoc基保护每个氨基酸的α-氨基。也用各种合适的保护基阻断侧链功能基。通过c-末端氨基到树脂上的衍生化形成肽链。所述保护基被去除(去阻断步骤)且与序列中的各氨基酸偶联。通过茚三酮(NIN)测试监测每个偶联的完成。对贯穿整个肽链的每个氨 基酸进行所述添加/偶联过程。当完成了全肽序列时，彻底清洗和干燥肽树脂，然后所述肽可从所述肽树脂被切割。通过RP-HPLC检查所述粗肽的纯度。当所述粗肽达到了所需的最低纯度标准时，提交通过制备性RP-HPLC纯化的纯化。达到最终纯度标准(＞95％)的所述级分被集中且被发送以冻干。 

将冻干的六肽与棕榈酰衍生物缀合以依据Rijkers，D.T.S.，et al.，Tetrahedron Letters 46(19)：3341-3345(2005)所述的方案产生棕榈酰六肽。所述方法利用S-棕榈酰跨膜肽的方便的固相合成。对于半胱氨酸侧链的保护，高度酸不稳定性S-(4-甲氧三苯甲基)基团优于S-(叔丁基硫基)基团，因为后者在树脂去保护期间可引起定量脱硫。用棕榈酸经碳二亚胺介导的偶联修饰所得游离巯基功能，且以很好的产量和纯度获得标题化合物。通过制备性的RP-HPLC将棕榈酰六肽送去离子交换以转换为乙酸盐。 

使用Rijkers，D.T.S.，et al所述方案，将具有SEQ ID NO：2～27的MNTF肽被缀合至具有5、6、8、10、12、14和16个碳的脂肪酸及具有替代数量的碳的脂肪酸。缀合至MNTF肽和其类似物的脂肪酸选自下列：cabrylic酸、油酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸和神经酸。然后就其在利于皮肤渗透的局部制剂中被使用的能力，对通过共价连接至所述脂肪酸形成的MNTF肽或其类似物及其他的肽进行测试。 

实施例2：

下列为MNTF肽(棕榈酰化MNTF肽类似物)化妆制剂的例子，其被制成局部无水凝胶的形式。 

局部无水凝胶	％w/w
		甘油	37.91
丁羟甲苯(BHT)	0.11
		二乙二醇单乙醚(DGME)	46.98
十二烷基乳酸(LL)	5.01
		Germaben II	0.34
重氮烷基脲	0.10
		羟基苯甲酸甲酯	0.01
尼泊金丙酯	0.01
		丙二醇(PG)	0.19
Pal-六肽(Pal-FSRYAR；SEQ ID NO：2)	0.10
		SiO2	5～9
总计	100.00

实施例3：

下列为棕榈酰化MNTF肽类似物的化妆制剂的例子，其被制成含水醇凝胶的形式。 

含水醇凝胶	％w/w
		乙醇，190proof	68.86
水	24.12
		Chrystaphyl 98TM(乙酸月桂酯)	5.00
Carbopol 980	1.00
		Pal-六肽(Pal-FSRYAR；SEQ ID NO：2)	1.00
总计	100.00

实施例4：

下列为棕榈酰化MNTF肽类似物的化妆制剂的例子，其被制成乳膏的形式。 

乳膏	％w/w
		DermabaseTM霜	88.90
纯化水(～55％)
		矿物油
凡士林
		鲸蜡基硬脂醇
十二烷基硫酸钠
		棕榈酸异丙酯
丙二醇
		咪唑烷基脲
尼泊金甲酯
		尼泊金丙酯
水	5.00
		Chrystaphyl 98TM(乙酸月桂酯)	5.00
丁羟基茴香醚	0.10
		Pal-六肽(Pal-FSRYAR；SEQ ID NO：2)	1.00
总计	100.00

实施例5：

作为炎症抑制模型的一氧化氮产生的抑制的测量 

方法

所选择的研究方法类似于在Tsai et al文献发表的研究方法。(Tsai et al，Inhibition of inflammatory nitric oxide production and epidermis damages by Saccharomycopsis Ferment Filtrate.JDermatol Sci 2006 Jun 42(3)：249-57.Laskin，Multifunctional Role of Nitric Oxide in Inflammation，Trends Endocrinol Metab 1994；5：377-382.Lyons，Emerging Roiles of Nitric Oxide in Inflammation，Hospital Practice，July 15，1996：69-86)。 

所述研究的目的为研究Pal-六肽(SEQ ID NO：2、以棕榈酰化形式)对培养的表皮角质形成细胞中γ-干扰素诱导的NO产生的抑制 作用。 

实验简述

可以角质形成细胞中一氧化氮产生的减少观测到抗炎症作用。将角质形成细胞单独与γ-干扰素(300U/ml)(作为对照)或者与γ-干扰素及不同浓度(0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM)的Pal-六肽一起培养48小时。使用γ-干扰素加氨基胍(10mg/ml)作为阳性对照。通过Griess反应检测NO产生的量。一氧化氮在水介质中易被氧化成亚硝酸盐，且可以介质中亚硝酸盐的积累衡量所述反应。在室温温育15分钟后，存在的亚硝酸盐的衍生导致了具有542纳米的最大吸光度的发色团的形成。使用Tibertek Mutiskan(MCC酶标仪在540nm的波长处，减去在620nm参考波长处的吸光度)读取所述孔的光密度。通过酶标仪生成吸光值的打印输出，且将数据输入EXCEL表格以用于分析。以对照吸光度的百分比表示平均吸光度和标准偏差。 

如图2A所示，在0.1μM、1μM、10μM、100μM和1000μM的Pal-六肽(具有序列SEQ ID NO：2的棕榈酰化肽)存在下，由γ-干扰素诱导的一氧化氮产物分别为对照的92％、72％、57％、24％和31％。在相同条件下，阳性对照(γ-干扰素加AG)降低一氧化氮产生至对照水平的42％。通过Pal-六肽以剂量依赖性方式减少所述一氧化氮产生，其表明所述化合物能抑制发炎。通过100μM和1000μM Pal-六肽而对一氧化氮产生的减少在统计学上是显著的。所述研究提供了证据以表明Pal-六肽在预防角质形成细胞中的一氧化氮产生中的有益作用和在皮肤上抗炎症作用的潜力。 

如图2B所示，在100μM、1,000μM和10,000μM的六肽存在下，以剂量依赖方式和统计意义显著的，由γ-干扰素诱导的一氧化氮产生为对照的68％、46％、42％；而阳性对照降低一氧化氮产生至对照水平的25％。 

实施例6：

脂质过氧化物测定

使用过氧化物特异性(荧光)染料和流式细胞仪确定Pal-六肽对 人表皮角质形成细胞中细胞过氧化物水平的作用。 

方法

过氧化氢可诱导皮肤细胞的损伤。在化合物存在和不存在下通过测量基本的过氧化物水平评估Pal-六肽的表皮保护性作用。 

通过正常的细胞代谢产生的基本过氧化物产物诱导低水平过氧化物特异性细胞荧光的逐渐显影。 

胞外过氧化物(例如H₂O₂，外源性添加的)可渗透入细胞膜并导致在细胞的过氧化物特异性荧光的快速和急剧增强。可使用过氧化物特异性染料2’，7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)通过流式细胞仪测量细胞过氧化物水平。DCFH-DA起初是非荧光的且通过酶依赖性过程在活细胞内被快速集中。在通过细胞过氧化物的修饰后，当其被激光激发时所述染料显示出强烈的绿色荧光。所述测定的结果表明测试化合物是否作为细胞系统中的氧化剂或抗氧化剂起作用。如果测试物品作为抗氧化剂起作用，也可使用所述测定来确定测试化合物是否能渗透入化合物以淬灭细胞内过氧化物或其是否能影响细胞外的过氧化物水平(Bass et al.，1983，J.Immunol.130：1910-1917；Bombick et al.，1992，Toxicol.Meth.2：255-264)。 

实验简述

通常将第三期的人原发性角质形成细胞接种在T75培养瓶中并培养至70％～80％的汇合度。创建细胞悬液并向所述细胞加载染料DCFH-DA。以每个稀释两个一式三份组，每个一式三份组使预培养的细胞接触具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的Pal-六肽的稀释液。一个一式三份组与H₂O₂(过氧化物的外源性来源)温育，且用碘化丙啶染色两个组。通过在FACScan流式细胞仪上的荧光测定数据确定细胞活力和过氧化物产生。认为与媒质对照值相比过氧化物值提高或降低25％是生物学上显著的。 

如下所述评估Pal-六肽对细胞过氧化物水平的作用。如图3A和表1中所示，在没有外源性H₂O₂(即由角质形成细胞本身的内源性过氧化物产物)的内源性过氧化物测定中，用0.079mM和0.79mM的 Pal-六肽，所述过氧化物水平分别被降低至对照的70.05％和40.21％。阳性对照300μM Trolox降低过氧化物水平至69.79％。在具有添加的外源性过氧化物(即由角质形成细胞的过氧化物产物和外源性H₂O₂)的测定中，以0.079mM和0.79mM，所述过氧化物水平分别为对照的50.18％和9.88％。阳性对照300μM Trolox降低过氧化物水平至24.97％。对于用Pal-六肽处理的细胞和未用Pal-六肽处理的细胞，以非存活的％表示的细胞活力是基本相同的。以剂量依赖性方式通过Pal-六肽的过氧化物产物的减少在生物学上是显著的且在统计学意义上也是高度显著的。所述数据证明所述肽能影响细胞过氧化物水平。 

六肽对细胞过氧化物水平的作用如下。如图3B和表1中所示，在没有外源性H₂O₂(即由角质形成细胞本身的内源性过氧化物产物)的内源性过氧化物测定中，用1mM和10mM的六肽，所述过氧化物水平分别被降低至对照的73.57％和25.02％。阳性对照300μM Trolox降低过氧化物水平至69.79％。在具有添加的外源性过氧化物(即由角质形成细胞的过氧化物产物和外源性H₂O₂)的测定中，以1mM和10mM，所述过氧化物水平分别为对照的56.00％和14.29％。阳性对照300μM Trolox降低过氧化物水平至24.97％。对于用六肽处理的细胞和未用六肽处理的细胞，以非存活的％表示的细胞活力是基本相同的。以剂量依赖性方式通过Pal-六肽的过氧化物产物的减少在生物学上是显著的且在统计学意义上也是高度显著的。所述数据证明所述肽能影响细胞过氧化物水平并由此降低或抑制与光损伤相关的发炎或皮肤细胞中自由基损伤。 

表1：过氧化物水平的总结(6聚体) 

“-”＝过氧化物水平既未升高又未降低 

表2～4示例示3、4和5聚体MNTF在人皮肤细胞抗氧化中的作用的数据。所述MNTF 3聚体(SEQ ID NO：9)以剂量依赖性方式以1mM和10mM的浓度降低内源性和外源性过氧化物水平。所述MNTF 4聚体(SEQ ID NO：11)以10mM降低内源性和外源性过氧化物水平，但以1mM仅降低外源性过氧化物水平(由25％的截止所定义)。所述MNTF 5聚体(SEQ ID NO：17)以剂量依赖性方式以1mM和10mM降低内源性和外源性过氧化物水平。当在DPBS中为1mM浓度时，所述Pal 3聚体、Pal 4聚体和Pal 5聚体降低外源过氧化物水平。 

表2：过氧化物水平的总结(3聚体) 

“-”＝过氧化物水平既未升高又未降低 

结论：在以1mM的浓度施用例示MNTF3聚体(SEQ ID NO：9)的实验中，与对照相比，内源性过氧化物水平被降低至60.6％，而外源性过氧化物水平被降低至对照的62.5％。以10mM的浓度，内源性过氧化物水平被降低至0，且外源性过氧化物水平被降低至0％。因此，在所述例示分析中，包含例示3聚体MNTF分子的测试物品以剂量依赖性方式以1mM和10mM降低内源性和外源性过氧化物水平。 

表3：过氧化物水平的总结(4聚体) 

“-”＝过氧化物水平既未升高又未降低 

结论：在以1mM的浓度施用例示MNTF4聚体(SEQ ID NO：11)的实验中，与对照相比，内源性过氧化物水平被降低至77.2％，而外源性过氧化物水平被降低至对照的54.9％。以10mM的浓度，内源性过氧化物水平被降低至0，而外源性过氧化物水平被降低至25.2％。因此，在所述例示分析中，包含例示4聚体MNTF分子的测试物品以剂量依赖性方式以1mM和10mM降低内源性和外源性过氧化物水平。 

表4：过氧化物水平的总结(5聚体) 

“-”＝过氧化物水平既未升高又未降低 

结论：在以1mM的浓度施用例示MNTF5聚体(SEQ ID NO：17)的实验中，与对照相比，内源性过氧化物水平被降低至61.6％，而外源性过氧化物水平被降低至对照的46.2％。以10mM的浓度，内源性过氧化物水平被降低至3.6％，而外源性过氧化物水平被降低至0％。因此，在所述例示分析中，包含例示5聚体MNTF分子的测试物品CS2309，Lot#D267以剂量依赖性方式以1mM和10mM降低内源性和外源性过氧化物水平。 

所述数据肯定地显示例示MNTF分子(例如3聚体、4聚体、5聚体)在以剂量依赖性方式降低内源性和外源性过氧化物水平中是有效的。所述MNTF化合物家族中代表性分子的抗氧化活性证实了它们在降低皮肤中氧化损伤中的用途。 

实施例7：

抗UV接触的化妆制剂的保护性作用的确定

用于评估化妆产品的保护性作用的体内方法。使用类胡萝卜素的漂白来评价天然产品的自动氧化活性。通过测量作为能量暴露功能的β-胡萝卜素的UVA漂白来评估用于皮肤后脂质过氧自由基的清除剂的相对作用。 

在研究中选择了在19岁～64岁之间的12个健康男性和女性受试者及其Fitzpatrick皮肤型I和II。达到纳入标准的受试者签署了与21CFR Part 50：“Protection of Human Subjects”一致的知情同意书并完成了专家小组成员特征/病史表。 

通过在为皮肤色评估的CIE(Commission Internationale de I’Eclairage)建议的系统的L^＊a^＊b^＊色空间中表达测量的表面值的色使用CHROMAMETER比色计(TM，Minolta Model CR-300)来测量色上的变化。在所述色空间中，L^＊为亮度且给出了从全黑(L^＊＝0)至全白(L^＊＝100)的相对明度。所述a^＊值代表红色(正值)和绿色(负值)间的平衡。所述b^＊值代表黄色(正值)和蓝色(负值)间的平衡。所述b^＊值最密切地描述了β-胡萝卜素染色的橙色的强度且与色指数I直接相关。所述CHROMAMETER提供了方法，通过其可测量由自 由基引起的氧化损伤及相反的通过自由基清除剂的氧化的防止。由UVA辐射诱导的自由基氧化激发β-胡萝卜素染色的色漂白和减少。通过CHROMAMETER可测量通过测试物质的漂白和漂白的防止。以b^＊对比UVA辐射能量上的变化报告了漂白。其也可以色指数I的方式表示，被定义作： 

I＝[(b_n ^＊-b_i ^＊)/(b₀ ^＊-b_i ^＊)]×100 

其中，b_n ^＊为在用化妆制剂处理并用β-胡萝卜素染色的区域的nJ/cm²辐射后测量的b^＊值；b₀ ^＊为使用β-胡萝卜素后但在辐射前的b^＊值；及b_i ^＊为在使用β-胡萝卜素前的b^＊值。所述指数补偿在b_n ^＊和b₀ ^＊上皮肤色的任何影响。漂白可导致b_n ^＊值和I值(以百分比)降低。当被暴露于辐射时漂白的防止将导致更高的I值或在I值上的更少减少。 

用70％异丙醇prep pad(Medium，Dynarex)清洗所组成的受试者的指定前臂并使其变干。在每个受试者的指定前臂的掌表面选择测试位点，并通过自粘环(Professional ProFoot^TM Products，P.P.R.Co，Inc.)的开放、中央区域定义每个测试位点。将环的粘侧直接放置在皮肤上。使用所述环来保留测试物质和β-胡萝卜素及起到作为用CHROMAMETER进行测量的指导的作用。 

依据随机的安排将凝胶制剂(0.1％Pal-六肽)和(0.1％六肽)用于前臂。用β-胡萝卜素对照、阳性对照(内部对照)和未处理的对照处理其他的位点。对于每个受试者处理的位点是随机的。 

在测试物质或β-胡萝卜素应用之前，使用CHROMAMETER测量初始b^＊参数，并记录前臂所有重复测试位点(基线)。将约2mg/cm²的每种物质用于指定的测试位点，并用手指套将其手动扩散以确保平均的分布。指定为不处理的位点，用或不用β-胡萝卜素，此时保持不处理。允许所述测试物质和内部对照与皮肤表面温育15分钟的一段时间。在所述温育阶段后，记录所有位点的b^＊测量值(产品基线)。 

将在癸和辛酸甘油三酯的混合物中的β-胡萝卜素溶液用于所有处理的位点。再次测量b^＊参数并记录(β-胡萝卜素基线)。 

长坡长UVA(320～420nm)被使用，因为其比UVB辐射(290～ 320nm)更不可能引起皮肤的灼伤，且已知有助于自由基的形成。 

使用日光灯将受试者的前臂暴露于1.0J/cm²的UVA辐射，通过CHROMAMETER再次测量b^＊参数并记录。对于以2.0、3.0、4.0、5.0和6.0J/cm²的UVA辐射的5个额外能量暴露重复所述测试方法的过程。在图4A和4B中显示所述结果。 

对每个重复的测试物质位点计算色指数。 

β-胡萝卜素溶液的制备

在测试管中测量由Stepan Company制造的在癸和辛酸甘油三酯混合物(44∶55)中的30ml β-胡萝卜素饱和溶液。添加约0.70克β-胡萝卜素至甘油三酯溶液中，并经约2分钟而达100℃的电热板加热直到所述混合物变为深橙/红色。所述溶液被过滤以去除任何多余的β-胡萝卜素并被冷藏以防止氧化。当氧化的证据、色从深橙/红至浅黄/橙的变化被观察到时，丢弃所述溶液。 

使用方差分析(ANOVA)在统计学意义上比较用每个测试或对照物质处理的位点的色指数值。当以95％可信度的所有p值小于或等于0.05时存在统计显著性。使用Dunnett’s检验来确定以95％可信度的每个处理产品和对照之间差异的显著性。 

通过评估作为辐射能量功能的β-胡萝卜素的UVA漂白来测量Pal-六肽和六肽的保护性作用并将其与单独的β-胡萝卜素相比较。 

在下列表中总结以0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0J/cm²通过CHROMAMETER测量的Pal-六肽、六肽和β-胡萝卜素的平均色指数值。 

能量J/cm2

0

1

2

3

4

5

6

(0.1％Pal-六肽)凝胶

100％

70％

57％

47％

44％

37％

35％

PC(β-胡萝卜素)

100％

36％

27％

23％

16％

14％

13％

P值

0.0001

0.0002

0.0024

0.0002

0.0033

0.0016

寡肽(0.1％六肽)凝胶

100％

60％

54％

49％

45％

39％

39％

PC(β-胡萝卜素)

100％

36％

27％

23％

16％

14％

13％

P值

0.0001

0.0006

0.0044

0.0003

0.0016

0.0028

 由UVA辐射诱导的自由基氧化引起β-胡萝卜素的漂白，且随着辐射能量提高，色指数值I显示在I值上的更大下降。将用Pal-六肽或六肽及β-胡萝卜素处理的位点与单独用β-胡萝卜素处理的位点相比较，经Pal-六肽或六肽处理的位点具有更高的I值，即与β-胡萝卜素对照相比，Pal-六肽或六肽能防止β-胡萝卜素的漂白。在所述基础上，证明Pal-六肽或六肽作为自由基清除剂是有效的。6聚体非-Pal的皮肤数据：与pal6聚体包括在一起 

实施例8：

MNTF对抑制人瘢痕疙瘩形成的作用

瘢痕疙瘩可被表征为皮肤创伤后的纤维疤痕组织的增生/生长。实施例8证明了例示MNTF/MNTF类似物分子在如通过人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖动力学研究所测量的表皮应用中的作用。实验方案基于瘢痕疙瘩成纤维细胞生长动力学的公开研究设计且如Polo et al.，1999，Ann.Plastic Surg.43(2)：185-190所述。 

简言之，从新鲜的手术样本中获得的皮肤组织中培养成纤维细胞。在10ml补充庆大霉素(20mg/ml)的无钙和镁的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(Sigma Chemical Co，St.Louis，MO)中于室温冲洗所述皮肤组织30分钟。使用1％10,000U/ml青霉素G、25μg/ml两性霉素B、10,000μg/ml硫酸链霉素溶液(Gibco BRL，Gran Island，NY)进行第二抗体冲洗10分钟。从来自每块的真皮分离表皮。所述样本被切成相等尺寸的四块。每一块以真皮侧面向下被放置进包含Dispase溶液(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)的60-mm培养皿中。在没有额外的培养基下37℃培养所述外植体15分钟。缓慢添加总计10ml Dulbecco’s修饰的Eagle’s培养基(DMEM；Gibco BRL)至培养皿中，然后将其在37℃、5％二氧化碳下培养。直到获得80％的汇合度时传代所述细胞。添加胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Gibco BRL)以从培养板的表面裂解细胞，且用DMEM洗涤细胞并将其转移至离心管。在1,000g离心所述培养物5分钟。上清被轻轻倒出并用5mlDMED重悬所述细胞沉淀。重复所述冲洗/洗涤和5分钟的离心三次。 使用血球计数板计数所述细胞，并将它们的细胞数量调整至1×10⁶细胞，然后将其放置在有2ml DMED和1％胎牛血清的35-mm培养皿中并在37℃、5％二氧化碳下培养。10ml例示MNTF/类似物溶液被添加至有100,000细胞的培养皿中。 

在第1、2、3和4天移去来自每个组的样品。胰酶消化、洗涤、离心、并在1ml DMEM中悬浮来自每个样品的细胞，并使用台盼蓝染料排斥法和血球计数板对其进行计数。结果如图1所示。 

结果表明通过MNTF对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制在统计学上是显著的。在第2天P＜0.003。使用所述参数的剂量响应研究表明以10^-5M或10μg/ml的MNTF浓度是高度有效的。 

实施例8-MNTF对透明质酸的刺激

透明质酸(hyaluronan，HA)(天然存在的糖类聚合物)是结缔组织、上皮细胞和神经组织的关键成分。HA参与细胞的流体力学、运动和增殖。所述测试目的为确定棕榈酰化和非棕榈酰化MNTF六肽的样品对成人真皮成纤维细胞(aHDF)条件培养基中透明质酸水平有作用。 

方法

Pal-六肽

在补充来自Hyclone、UT)的5％cosmic血清的高糖无磷酸DMEM中以6000细胞/孔接种成HDF(面部的，第2代，Cell Applications，San Diego，CA cat.# 106-05A lot#1392)，并在随后一天添加测试物质。测试物质为：Pal-六肽(棕榈酰化SEQ ID NO：2、冻干粉末标记的APC 341055，lot V08150A1、从DermaCareNeuroscience Institute收到的)、I型无菌水(阴性对照)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF，阳性对照)。以20mg/ml在水中溶解Pal-六肽。测试的最终浓度为：对于DNP为400、200、100、50和25μg/ml及对于bFGF为5ng/ml(板507)。在96小时后，收集细胞培养物条件培养基，并将100μl等分物用于所述HA测定。使用来自Echelon (Salt Lake City，UT)的透明质酸酶联免疫检测试剂盒(HA-ELISA， cat.# K-1200)进行HA测定。通过在96孔板中发色反应产物的生成后，在410nm处的BioRad酶标仪的使用测量所述HA产量并使用公式：吸光度410(样品)/吸光度410(0HA)×100确定测试物质的作用。 

如图5A所示，Pal-六肽以400μg/ml和200μg/ml强烈刺激(40％刺激)成纤维细胞条件培养基中的透明质酸，而以100μg/ml和50μg/ml为中度刺激(通过约15％)成纤维细胞条件培养基中的透明质酸。阳性对照(bFGF)以证明所述实验的技术成功的测试浓度具有中度刺激。 

非棕榈酰化六肽

在补充来自Hyclone、UT)的5％胎牛血清的高糖无磷酸DMEM中以6000细胞/孔接种成人HDF(面部的，第2代，Cell Applications，San Diego，CA cat.# 106-05A lot#1392)，并在随后一天添加测试物质。测试物质为：六肽(SEQ ID NO：2(非棕榈酰化)、冻干粉末lot#D294、从DermaCare Neuroscience Institute收到的)、I型无菌水(阴性对照)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF，阳性对照)。以20mg/ml在水中溶解Pal-六肽。测试的最终浓度为：对于六肽为2000、1000、500和250μg/ml及对于bFGF为5ng/ml(板507)。在96小时后，收集细胞培养物条件培养基，并将100μl等分物用于所述HA测定。使用来自Echelon(Salt Lake City，UT)的透明质酸酶联免疫检测试剂盒(HA-ELISA，cat.#K-1200)进行HA测定。通过在96孔板中发色反应产物的生成后，在410nm处的BioRad酶标仪的使用测量所述HA产量并使用公式：吸光度410(样品)/吸光度410(0HA)×100确定测试物质的作用。 

如图5B所示，非棕榈酰化六肽具有以1000μg/ml对成纤维细胞条件培养基中的透明质酸的良好刺激活性(22％刺激)。阳性对照(bFGF)以证明所述实验的技术成功的测试浓度具有中度的刺激活性。 

所有专利、出版物、科学文章、网站及本文参考或提及的其他文献和材料显示了本公开内容所属领域技术人员的技术水平，且各所述 参考文献和材料通过引用以其已通过独立的整体并入或通过整体阐述本文的相同程度并入本文。申请者保留将来自任何所述专利、出版物、科学文章、网站、电子方式可得的信息及其他参考的材料或文献的任何和全部材料和信息完全并入本说明书的权利。 

本文所述的具体方法和组合物为一些代表性的实施方式且为例示的且不希望其作为随附权利要求的范围上的限制。本领域技术人员基于本说明书可想到其他的目的、方面和实施方式，且其被包含在通过权利要求的所述范围所定义的公开内容的精神内。本领域技术人员明晰本文所公开技术做出的不同取代和修饰不背离其范围和精神。本文所述的适合的例示技术可在无任何一种或多种因素、或一种或多种限制下被应用，其在本文中不需要被具体公开。 

Claims (20)

1.用于恢复或保护皮肤的局部组合物，其含：

(a)有效量的由SEQ ID NO：2、9、11或17的氨基酸序列构成的MNTF肽；和

(b)化妆学或皮肤病学可接受载质。

2.权利要求1的组合物，其中所述MNTF肽是SEQ ID NO：9。

3.权利要求1的组合物，其中所述MNTF肽是SEQ ID NO：11。

4.权利要求1的组合物，其中所述MNTF肽是SEQ ID NO：17。

5.权利要求1～4中任一项的MNTF肽，其中所述MNTF肽通过与渗透增强剂共价键合而被修饰，由此所述组合物的组织渗透能力被提高。

6.权利要求5的MNTF肽，其中所述MNTF肽于通过其N-末端与所述渗透增强剂共价键合而被修饰。

7.权利要求5的MNTF肽，其中所述渗透增强剂通过游离氨基的N-酰基衍生物与所述MNTF肽共价连接。

8.权利要求5的MNTF肽，其中所述渗透增强剂是任选被取代的2～22碳的烷基羧酸，其中所述烷基羧酸任选被羟基化、不饱和化和/或硫化。

9.权利要求5的MNTF肽，其中所述渗透增强剂是选自下列的脂肪酸：cabrylic酸、月桂酸、癸酸、辛酸、己酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、戊酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、油酸、反油酸、芥酸、神经酸。

10.权利要求1～9中任一项的组合物，其中：

(a)所述量的肽被包裹于选自下列的载体中：巨囊、微囊、纳米囊、脂质体、乳糜微粒和微海绵，或

(b)所述肽被吸附于选自下列的材料上：粉状有机聚合物、滑石、皂粘土及其他矿物支持物，或

(c)所述肽与选自下列的成分混合：提取的脂质、蔬菜提取物、脂溶性有效成分、水溶性有效成分、无水凝胶、乳化聚合物、表面张力活性聚合物、合成的脂质、凝胶化聚合物、组织提取物、海洋提取物、维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、太阳光过滤剂和抗氧化剂。

11.权利要求1～10中任一项定义的组合物用于制备用于恢复或保护受试者皮肤的治疗方法中的药物的用途，其中所述药物用于局部施用。

12.权利要求11的用途，其中所述方法减少或抑制有需要的受试者的伴随光损伤的发炎或自由基损伤。

13.权利要求11的用途，其中所述方法减少有需要的受试者的皮肤中过氧化物或自由基产生。

14.权利要求11的用途，其中所述方法减少有需要的受试者的皱纹。

15.权利要求11的用途，其中所述方法改善有需要的受试者的皮肤色调。

16.权利要求11的用途，其中所述方法减少有需要的受试者的皮肤的UV或光损伤。

17.权利要求11的用途，其中所述方法促进有需要的受试者的皮肤再生。

18.用于恢复或保护皮肤的方法中的组合物，其中所述组合物含有选自SEQ ID NO：2、9、11和17的氨基酸序列构成的MNTF肽，且其中所述组合物用于局部施用。

19.用于恢复或保护皮肤的化妆方法，所述方法包括局部施用权利要求18中定义的组合物。

20.权利要求18中定义的组合物用于制备用于恢复或保护皮肤的治疗方法中的药物的用途。