JPH09224696A - アルカリプロテアーゼを用いた毛髪構成成分の採取法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 毛髪のキューティクル部位を構成するケラチ
ン蛋白種中のキューティクル起源の分解ペプチド及びア
ミノ酸と形状を維持したコルテックス部位、コルテック
ス細胞及びその断片や、エンドキューティクルの蛋白種
中のエンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部
取り除かれた毛髪等を特異的に採取する手段の提供。 【解決手段】 毛髪に還元剤共存下アルカリプロテアー
ゼを作用させ、毛髪のキューティクル部位を構成するケ
ラチン蛋白種を優先的に分解してキューティクル部位起
源の分解ペプチド及びアミノ酸を採取した後、残渣から
形状を維持したコルテックス部位、コルテックス細胞及
びその断片を採取する。同様に毛髪に還元剤非共存下ア
ルカリプロテアーゼを作用させ、エンドキューティクル
部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持した
エンドキューティクルが一部取り除かれた毛髪を採取す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、毛髪のキューティ
クル部位を構成するケラチン蛋白種を優先的に分解し、
キューティクル起源の分解ペプチド及びアミノ酸と形状
を維持したコルテックス部位あるいはコルテックス細胞
及び断片を採取する方法、毛髪のキューティクル部位を
構成するエンドキューティクルの蛋白種を優先的に分解
し、エンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部
取り除かれた毛髪を採取する方法、更に、キューティク
ル層数を任意に剥離させたキューティクル層の薄いモデ
ル毛髪を作製する方法であり、得られたものの解析から
毛髪物性や機能の解明、損傷モデル毛髪試料の調製、毛
髪損傷の診断など、学問上等の有益な手法となり得るほ
か、得られた分解ペプチド、アミノ酸及び形状を維持し
たコルテックス細胞及び断片は、香粧品原料、洗浄剤原
料並びに医薬、化学原料、生化学試薬などとして利用で
きるものである。なお、本発明において、「毛髪」は人
の毛髪以外に羊毛などの哺乳動物の毛を含む意味で用い
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】毛髪の
７０〜８０％は蛋白質からなる。毛髪中の蛋白質は、構
造や特性の異なる数種類のものが複雑に絡み合い不溶性
のケラチンを形成し、強固な繊維状態で存在している。
そのため、毛髪中の蛋白質の分解法については数多くの
提案がなされているが、完全なものはない。

【０００３】即ち、これまでに報告されている毛髪中の
蛋白質の分解法としては、単純に毛髪をアルカリ剤で分
解する方法（Ｗｅｒｔｚ，Ｐ．Ｗ．，Ｄｏｗｎｉｎｇ，
Ｄ．Ｔ．，ＬＩＰＩＤＳ ２３，８７８−８８１（１９
８８））、テトラメチルアンモニウムヒドロオキシド
（四級アミン）及び塩酸による分解とメラニン顆粒の採
取（日本化粧品技術者会会誌、１２，３９−４５（１９
７８））が提案されているが、これら方法では、毛髪の
特定の部位のみを壊すことは不可能であり、また、酵素
法（特開昭５６−７３０９５号公報、特開昭６１−１８
３２９８号公報）も提案されているが、これら方法は、
特定部位のみを分解採取することはできないという欠点
があった。

【０００４】また、毛髪のコルテックス部位又はキュー
ティクル部位を構成する蛋白種の分解ペプチド、アミノ
酸及びコルテックス部位に局在するメラニン顆粒を得る
には、予めそれらの部位を分画後、処理して得る方法が
第一に考えられる。

【０００５】前者のコルテックス部位を得る方法として
は、いくつか提案されており、毛髪や羊毛を過蟻酸や過
酢酸水溶液の処理でＳ−Ｓ結合を酸化切断し、スルホン
酸基として分離する方法（Ｃｏｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．
Ｃ．，Ｒｏｂｓｏｎ．Ａ．，Ｔｅｘ．Ｒｅｓ．Ｊ．６
８，３４８（１９５８））、毛髪中の蛋白質を尿素水溶
液で解きほぐしながら２−メルカプトエタノールやチオ
グリコール酸によりＳ−Ｓ結合を切断し、採取する方法
（Ｍａｃｌａｒｅｎ，Ｊ．Ａ． ＆ Ｋｉｌｐａｔｒｉ
ｃｋ，Ｄ．Ｊ．，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２
１，８０５−８１３（１９６８））、チオ硫酸ナトリウ
ムでＳ−Ｓ結合をＳ−ＳＯ₃Ｎａに変化させ抽出する方
法（Ｔｈｏｍａｓ，Ｈ．，Ｃｏｎｒａｄｓ，Ａ．，Ｐｈ
ａｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｌｏｃｈｔ，Ｍ．，Ｚａｈｎ．Ｈ．，
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，８，２５
８−２６４（１９８６））などがあるが、いずれの方法
も抽出効率が悪かったり、ありのままの姿のケラチン蛋
白種が得られない等の課題がある。

【０００６】また、抽出効率については、羊毛を尿素、
還元剤、ＳＤＳなどの界面活性剤との三者混合物で処理
した報告があるが、その収率は未だ満足できるものでは
ない（高分子加工、４３巻１号１４−１９（１９９
４））。

【０００７】一方、キューティクル部位を得る方法とし
ては、機械的な破壊などでキューティクル部位のみを剥
離する方法があるものの、この方法でもキューティクル
部位を定量的に分取することは難しい（Ｓｗｉｆｔ，
Ｊ．Ａ． ＆ Ｂｅｗｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｓｏｃ．Ｃｏｓｍ
ｅｔ．Ｃｈｅｍ．２５，１３−２２（１９７４））。

【０００８】更に、予め採取したキューティクル部位を
パパイン、プロナーゼ、トリプシン等のプロテアーゼで
段階的に分解する方法も報告されている（Ｓｗｉｆｔ，
Ｊ．Ａ．Ｃｏｓｍｅｔ．Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ．９１，
４６−４８（１９７６））が、この方法は、毛髪全体に
適用した場合、特異性の点で特定部分のみを分解、採取
することはできない。

【０００９】このように、毛髪のコルテックス部位又は
キューティクル部位を採取する方法には、上記課題のほ
か長時間を要するという問題もあり、効率的ではない。

【００１０】以上のように、毛髪を構成する部位を直
接、特異的に分解し、高収率かつ迅速に採取する方法は
提案されておらず、その開発が強く要望されていた。

【００１１】本発明は、上記要望に応えるためになされ
たもので、毛髪のキューティクル部位を構成するケラチ
ン蛋白種を優先的に分解し、キューティクル起源の分解
ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したコルテックス部
位あるいはコルテックス細胞及び断片を採取する方法を
提供すること、また毛髪のキューティクル部位を構成す
るエンドキューティクルの蛋白種を優先的に分解し、エ
ンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及びアミノ
酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部取り除
かれた毛髪を採取する方法を提供すること、更に、キュ
ーティクル層数を任意に剥離させたキューティクル層の
薄いモデル毛髪を作製する方法を提供することを目的と
する。

【００１２】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた
結果、毛髪に還元剤共存下、好アルカリ性のバチルス属
細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテアーゼを
ｐＨ７〜１１の条件下で作用させることにより、毛髪の
キューティクル部位を構成するケラチン蛋白種を優先的
に分解して採取し得、更に、その残渣からキューティク
ル部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持し
たコルテックス部位、コルテックス細胞及びその断片を
採取することができること、また、毛髪に還元剤非共存
下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生するセリンタ
イプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１の条件下で
作用させることにより、毛髪のキューティクル部位を構
成するエンドキューティクルの蛋白種を優先的に分解
し、エンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部
取り除かれた毛髪を採取することができること、更には
この後者の採取法を行った後、超音波処理を行うことに
より、キューティクル層数を任意に剥離させた薄いキュ
ーティクル層を有する毛髪を採取することができること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】この場合、還元剤共存下、上記セリンタイ
プのアルカリプロテアーゼを作用させて毛髪のキューテ
ィクル部位を構成するケラチン蛋白種を優先的に分解
し、キューティクル起源の分解ペプチド及びアミノ酸と
形状を維持したコルテックス細胞及びその断片が採取で
きる理由としては、まずキューティクル部位を構成する
蛋白種とコルテックス部位を構成するマトリックス及び
ミクロフィブリルの蛋白種の組成及び結合様式の違いに
よるプロテアーゼ耐性差のため、また処理ｐＨをなるべ
く低くおさえたことで、毛髪があまり膨潤しない環境下
となり得ること、更に、用いたアルカリプロテアーゼが
不溶性ケラチンに対して比較的分解力が弱いことなどの
ためであり、低い膨潤と酵素の基質特異性のバランスが
幸いし、キューティクル部位で、より酵素分解反応が早
く進んだためと考えられる。

【００１４】また、還元剤非共存下、上記セリンタイプ
のアルカリプロテアーゼを作用させ、毛髪キューティク
ルを構成するエンドキューティクル部位起源の分解ペプ
チド及びアミノ酸と形状を維持したエンドキューティク
ルが一部取り除かれた毛髪が採取できる理由について
は、エンドキューティクル部位が水溶液中で容易に膨潤
し、その蛋白種が活性剤水溶液あるいは水溶液中での振
盪で溶出することはよく知られており、酵素の特性も加
わり、還元剤でのシスチン結合を切断することなく、容
易にその部分だけが分解されたものであると考えられ
る。

【００１５】更に、上記処理の後、超音波処理を行うこ
とにより、毛髪のキューティクル層数を任意に剥離させ
た薄いキューティクル層を有する毛髪を容易に得ること
ができる理由としては、エンドキューティクル部位が破
壊されると接着機能が低下し、毛羽立ち状態になってい
るため、機械力により容易に剥離されるものと考えられ
る。

【００１６】従って、本発明は、（１）毛髪に還元剤共
存下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生するセリン
タイプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１の条件下
で作用させ、毛髪のキューティクル部位を構成するケラ
チン蛋白種を優先的に分解して採取した後、残渣からキ
ューティクル部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸と形
状を維持したコルテックス部位、コルテックス細胞及び
その断片を採取することを特徴とする毛髪構成成分の採
取法、（２）毛髪に還元剤非共存下、好アルカリ性のバ
チルス属細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテ
アーゼをｐＨ７〜１１の条件下で作用させ、毛髪のキュ
ーティクル部位を構成するエンドキューティクルの蛋白
種を優先的に分解し、エンドキューティクル部位起源の
分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したエンドキュ
ーティクルが一部取り除かれた毛髪を採取することを特
徴とする毛髪構成成分の採取法、（３）上記（２）の採
取法を行った後、超音波処理を行い、キューティクル層
数を任意に剥離させた薄いキューティクル層を有する毛
髪を採取することを特徴とする毛髪構成成分の採取法を
提供する。

【００１７】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明の第一の毛髪構成成分の採取法では、毛髪に
還元剤共存下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生す
るセリンタイプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１
の条件下で作用させ、毛髪のキューティクル部位を構成
するケラチン蛋白種を優先的に分解して採取した後、残
渣からキューティクル部位起源の分解ペプチド及びアミ
ノ酸と形状を維持したコルテックス部位、コルテックス
細胞及びその断片を採取することができるものである。

【００１８】また、本発明の第二の毛髪構成成分の採取
法では、毛髪に還元剤非共存下、好アルカリ性のバチル
ス属細菌が産生するアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１
１の条件下で作用させ、毛髪のキューティクル部位を構
成するエンドキューティクルの蛋白種を優先的に分解
し、エンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部
取り除かれた毛髪を採取することができるものである。

【００１９】ここで、本発明で用いられる還元剤として
は、チオグリコール酸、２−メルカプトエタノール、ジ
チオスレイトールなどが挙げられ、これらの還元剤は１
種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

【００２０】還元剤を使用する場合、処理溶液中の還元
剤の含有量は０．０１〜４０％（重量％、以下同様）、
好ましくは０．０５〜３０％、より好ましくは０．０５
〜１５％の範囲であり、特にチオグリコール酸の場合は
０．５〜１０％、特に１〜６％、２−メルカプトエタノ
ールの場合は０．５〜２０％、特に０．８〜１５％、ジ
チオスレイトールの場合は０．０５〜１５％、特に０．
１〜３％であることが好ましい。これら還元剤が上記範
囲より少ないと、毛髪ケラチン蛋白種のＳ−Ｓ結合の還
元切断が不十分で所期の目的を達成することが難しくな
る場合があり、その含有量が上記範囲を超えると、酵素
活性への影響並びに分解ペプチドの精製過程での負担な
どが懸念され好ましくない場合がある。

【００２１】次に、本発明で用いられるアルカリプロテ
アーゼとしては、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生
するセリンタイプのアルカリプロテアーゼが用いられ
る。具体的には、好アルカリ性のバチルス属細菌から生
産されるセリンタイプのエンド型のプロテアーゼが好適
であり、特に商品名エスペラーゼ（ノボ社製）が好適で
ある。

【００２２】プロテアーゼの一次構造は、Ｎ末端側配列
がＱＴＶＰＷＧＩＳＦＩＮＴＱＱＡＨＮＲＧＩＦＧＮＧ
ＡＲＶＡＶＬＤＴＧＩ−−で、活性中心Ｓｅｒ以降の配
列がＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＡＬＶＫ−−である。

【００２３】アルカリプロテアーゼの処理溶液中の最適
含有量は、カゼイン基質での活性が５０〜１００，００
０ＡＰＵ／ｍｌ、特に１００〜１０，０００ＡＰＵ／ｍ
ｌの範囲が好適である。アルカリプロテアーゼが５０Ａ
ＰＵ／ｍｌより少ないと、分解反応が遅く、特異性も低
下するため所期の目的を達成することが難しくなる場合
があり、他方その含有量が１００，０００ＡＰＵ／ｍｌ
を超えると、分解ペプチドの精製過程での負担など経済
的に好ましくない場合がある。

【００２４】本発明の還元剤共存下又は還元剤非共存下
で、上記アルカリプロテアーゼを作用させるｐＨについ
ては、毛髪への浸透及びプロテアーゼ反応を制御する上
で、ｐＨ７〜１１の範囲、好ましくは８〜１０の範囲と
する。ｐＨが７未満では、毛髪の膨潤が遅く、またプロ
テアーゼの至適ｐＨからも分解速度が低下してしまい、
ｐＨが１１より大きいと、毛髪が膨潤し、酵素が毛髪内
部のコルテックス部位にも弱いながらも作用するため好
ましくない。なお、ｐＨ調整には、通常用いられている
４０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨなどの緩衝剤が利用できる。

【００２５】しかして、本発明では、上記方法で毛髪構
成成分を採取し得るものであるが、使用する毛髪は、通
常の毛髪のほか、パーマ処理毛髪など種々の毛髪を使用
可能であるが、予め脱脂しておくことが好ましい。毛髪
の脱脂は、クロロホルム−メタノール溶媒で処理するこ
とにより行うことができるが、その他の慣用の方法で処
理してもよい。なお、脱脂しない毛髪を用いた場合、処
理に時間がかかるなどの支障が生じる場合がある。

【００２６】上記方法において、毛髪の処理溶液による
処理時間は４〜８時間が望ましく、パーマ毛髪を用いる
場合は３〜６時間が好ましい。また、処理温度は３０〜
６０℃が好ましく、処理温度が３０℃未満では毛髪への
浸透並びに酵素反応が遅く、処理時間が長くかかる場合
があり、６０℃を越えると、前記同様、酵素の失活並び
にペプチド結合の切断や置換基変換、架橋などを伴って
しまう場合がある。

【００２７】また、脱脂毛髪と処理溶液の浴比について
は、酵素反応を行うため、酵素量、還元剤の量並びに反
応ｐＨに左右されるが、１〜５０ｍｇ脱脂毛髪／ｍｌ処
理溶液の範囲が好ましい。

【００２８】更に、本発明では、上記したように毛髪に
還元剤非共存下でアルカリプロテアーゼを作用させて、
毛髪のキューティクル部位を構成するエンドキューティ
クルの蛋白種を優先的に分解し、エンドキューティクル
部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持した
エンドキューティクルが一部取り除かれた毛髪を採取し
た後、超音波処理を行うことにより、毛髪のキューティ
クル層数を任意に剥離させた薄いキューティクル層を有
する毛髪を得ることができる。

【００２９】この場合、超音波処理は、特に特殊な装置
を用いて行う必要はなく、例えばヤマト科学（株）のブ
ランソン２２００型など、通常用いられている超音波発
生装置を用いて通常の方法で行うことができる。

【００３０】なお、キューティクルの層数については、
プロテアーゼの処理時間を調整することでエンドキュー
ティクル部位の分解程度が調整でき、これにより任意に
調整できるが、通常約３時間の処理でキューティクルを
１層剥離できる。

【００３１】本発明において、分解採取されたキューテ
ィクル部位起源の分解ペプチドの分子量については、反
応処理に任意の分子ふるいをセットした限外濾過器を取
り付けて行うことにより、任意の分子量分布のものや、
酵素や還元剤を除去した分解ペプチドを得ることができ
る。

【００３２】また、採取された分解ペプチド溶液は、利
用目的に応じてそのまま用いるか、アルキル化、イオン
化などの修飾や慣用される添加剤、例えば粉体、油分、
界面活性剤、溶剤、殺菌剤、包接化合物、ビタミン類、
抗炎症剤、冷温感付与剤、紫外線吸収剤、酸化剤、還元
剤、酸化防止剤、生薬、香料、液化噴射剤などを添加し
て利用することができる。更に、慣用の加工処理、例え
ば乾燥処理などを行い、粉体化して利用することもでき
る。

【００３３】更に、本発明で得られた毛髪構成成分は、
それを解析することで毛髪物性や機能の解明、損傷モデ
ル毛髪試料の調製、毛髪損傷の診断など、学問上等で有
益な手法となり得るほか、得られた分解ペプチド、アミ
ノ酸、形状を維持したコルテックス細胞及びその断片
は、香粧品原料、洗浄剤原料、医薬、化学原料、生化学
試薬などとして利用することができる。

【００３４】

【発明の効果】本発明の毛髪構成成分の採取法によれ
ば、毛髪のキューティクル部位を構成するケラチン蛋白
種中のキューティクル部位起源の分解ペプチド及びアミ
ノ酸と形状を維持したコルテックス部位、コルテックス
細胞及びその断片、エンドキューティクル部位起源の分
解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したエンドキュー
ティクルが一部取り除かれた毛髪、更には毛髪のキュー
ティクル層数を任意に剥離させた薄いキューティクル層
を有するモデル毛髪を特異的に、かつ効率良く採取する
ことができる。

【００３５】また、本発明の方法は、傷んだ毛髪にも広
く適用することが可能であり、ヒト毛髪と構造及び成分
が類似している羊毛など哺乳動物の毛の処理にも利用で
きるものである。

【００３６】更に、本発明の方法で処理して得られたケ
ラチン蛋白種の分解ペプチド及びアミノ酸は、毛髪構成
成分の分析やそれに基づいた物性、機能及び代謝系の解
明など、学問上、有益な材料となり得るほか、得られた
ケラチン蛋白種の分解ペプチド、アミノ酸及びメラニン
は、香粧品原料、洗浄剤原料並びに医薬、化学品原料、
生化学試薬等として利用することができる。

【００３７】

【実施例】以下、実験例及び実施例を挙げて本発明を具
体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限される
ものではない。

【００３８】〔実験例１〕毛髪が不溶性ケラチン蛋白で
構成されていること、また処理ｐＨがアルカリ側で行う
ことを前提に、好アルカリ性細菌が産生するセリンタイ
プのアルカリプロテアーゼの基質特異性を調べ、ノボ社
のエスペラーゼをスクリーニングした。基質特異性は、
ノボ社のエスペラーゼの各基質に対する特異性をズブチ
リシンカルスベルグタイプのアルカリプロテアーゼとの
対比で示した。各基質に対する分解力指数（力価）は、
プロテアーゼ蛋白の１ｍｇ当たりの分解量を萩原変法に
準じて測定し、ズブチリシンカルスベルグタイプのアル
カリプロテアーゼを１００として換算した。結果を表１
に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１の結果より、エスペラーゼは、ズブチ
リシンカルスベルグタイプのアルカリプロテアーゼに比
べ、シスチン含量の多い獣毛ケラチンに対してはあまり
強い分解力を示さないが、卵黄に対する分解力が他のも
のに比べ比較的強いプロテアーゼであることがわかっ
た。

【００４１】〔実験例２〕キューティクル部位を構成す
る蛋白種とコルテックス部位を構成するマトリックス及
びミクロフィブリル蛋白種に対する特異性を羊毛モスリ
ン布を用いて下記方法で調べた。結果を表２に示す。

【００４２】評価方法：１０ｍｌのプラスチック試験管
に羊毛モスリン布（染色試剤（株）谷頭商品）を約８０
ｍｇ入れ、ｐＨ７から１３の各所定ｐＨに調整した５０
ｍＭ緩衝液を８ｍｌ加え、更にノボ社のエスペラーゼを
カゼイン基質での力価で８００ＡＰＵになるように添加
し、３７℃で１６時間インキュベートした。処理後、水
洗し、乾燥後の重量減少を求め、緩衝液のみで行ったも
のとの差し引きで示した。なお、緩衝液はｐＨ７〜１１
については四硼酸系を使用し、ｐＨ７〜９は塩酸で、ｐ
Ｈ１０〜１１は水酸化ナトリウムで調整した。また、ｐ
Ｈ１２〜１３はリン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム
で調整し使用した。

【００４３】

【表２】

【００４４】表２の結果より、羊毛モスリン布を用いて
のエスペラーゼの特異性を評価したところ、ｐＨ７から
１２の範囲で羊毛モスリン布を分解する作用があり、特
にｐＨ８から１１で強い分解力を示すことがわかった。

【００４５】更に、走査型電子顕微鏡（日立製Ｓ−５２
０型）で観察したところ、キューティクル部位の破壊が
観察された。

【００４６】〔実験例３〕還元剤共存下でのエスペラー
ゼによる毛髪キューティクル部位の蛋白種の特異的分解
性を確認するため、走査型電子顕微鏡（日立製Ｓ−５２
０型）で観察評価した。毛髪は２８才女性のノーマル毛
髪を用い、クロロホルム−メタノール溶媒で１６時間脱
脂処理後、５ｍｍから１ｃｍに裁断したものを使用し
た。処理条件はスクリュー管（１３ｍ／ｍ×４０ｍ／
ｍ）に毛髪２．５ｍｇを入れ、実験例２と同様にｐＨ７
から１３の各所定ｐＨに調整した５０ｍＭ緩衝液を２５
０μｌ加え、更に最終濃度が１％になるようにチオグリ
コール酸を加え、また、エスペラーゼを最終量で５００
ＡＰＵ（カゼイン基質での活性）を加え、３４℃で４時
間まで処理し、走査型電子顕微鏡で破壊部位を経時的に
観察した。結果を表３に示す。

【００４７】

【表３】

【００４８】表３の結果より、エスペラーゼは、還元剤
共存下、ｐＨ７〜１１、特にｐＨ８〜１０の範囲内でキ
ューティクル部位を構成する蛋白種を特異的に分解する
ことが確認された。

【００４９】〔実験例４〕３０才男性のノーマル毛髪を
あらかじめクロロホルム−メタノール溶媒で１６時間脱
脂処理後、５ｍｍから１ｃｍに裁断した毛髪１０ｍｇを
スクリュー管（１３ｍ／ｍ×４０ｍ／ｍ）に入れ、続い
てｐＨ９．３に調整した４０ｍＭホウ酸緩衝液１ｍｌを
加え、更に最終濃度が所定濃度になるように還元剤を加
えた後、エスペラーゼを最終量で１，０００ＡＰＵ（カ
ゼイン基質を用い、萩原変法での活性値）を加え、３４
℃で８時間処理し、キューティクル部位及び続いて分解
するコルテックス部位の分解量から還元剤の最適含有量
を調べた。分解量については、処理後の毛髪重量を測定
し、その減少量で相対的に評価した。表４に重量減少量
を示す。

【００５０】

【表４】

【００５１】表４の結果より、キューティクル部位をプ
ロテアーゼで分解する際の処理溶液中の還元剤の最適含
有量は、チオグリコール酸の場合、０．５〜１０重量
％、２−メルカプトエタノールの場合、０．５〜２０重
量％、ジチオスレイトールの場合、０．０５〜１５重量
％であることがわかった。

【００５２】〔実験例５〕エスペラーゼの処理溶液中で
の含有量を調べるため、還元剤をチオグリコール酸１％
と一定にし、２９才女性の脱脂裁断毛髪を用い、上記実
験例４記載の条件に準じて処理を行い、プロテアーゼを
所定濃度添加し、３４℃で６時間処理後の毛髪重量を測
定し、表５に重量減少量を示した。

【００５３】

【表５】

【００５４】表５の結果から、プロテアーゼの含有量は
カゼイン基質での活性値で５０〜１００，０００ＡＰＵ
／ｍｌ処理液が好適であることがわかった。

【００５５】〔実施例１〕脱脂、裁断したノーマル毛髪
からキューティクル部位を構成する蛋白種の分解ペプチ
ド及びアミノ酸と、形状を維持したコルテックス部位及
びコルテックス細胞、断片を下記方法で採取した。

【００５６】採取方法：２０ｍｌのスクリュー管に毛髪
を１０ｍｇ入れ、ｐＨ９．３に調整した４０ｍＭホウ酸
緩衝液を０．４ｍｌ加え、次にチオグリコール酸を最終
濃度１％になるように加え、更にエスペラーゼ８Ｌを
２．９３μｌ（カゼイン基質での力価で９５０ＡＰＵ）
添加し、３７℃で６時間インキュベートした。処理後、
デカンテーションを行い、キューティクル部位由来の分
解ペプチド及びアミノ酸を含む溶液とコルテックス部位
及びコルテックス細胞、断片を含む残渣を得た。上清溶
液はアミコン社のダイヤフローメンブレンＹＣ０５（分
子量５００）で洗浄、濃縮を行い、凍結乾燥後、１．６
ｍｇの採取物を得た。

【００５７】一方、残渣はｐＨ８．３の２５ｍＭトリス
−１９２ｍＭグリシン緩衝液、各１ｍｌに懸濁し、静置
後、デカンテーションし、更に、蒸留水１ｍｌで２回水
洗し、凍結乾燥後、７．２ｍｇの採取物を得た。

【００５８】得られたキューティクル部位由来の分解ペ
プチドとコルテックス部位を含む残渣のアミノ酸組成を
測定した。結果を表６に示す。

【００５９】表６の結果より、得られたキューティクル
部位由来の分解ペプチドとコルテックス部位を含む残渣
のアミノ酸組成は、既知情報とよく一致した値を示すこ
とが確認された。

【００６０】

【表６】

【００６１】〔実施例２〜９〕パーマ処理した傷んだ毛
髪にも適用できるか否かを調べるため、枝毛、切れ毛で
悩む２９才の女性毛髪を用いて下記方法で分解処理を行
った。

【００６２】２０ｍｌのスクリュー管に脱脂パーマ処理
毛髪の毛先を５０ｍｇ入れ、ｐＨ８．３に調整したホウ
酸緩衝液を２ｍｌ加えた後、最終濃度１％になるように
ジチオスレイトール０．５％と２−メルカプトエタノー
ル０．５％を加え、更にエスペラーゼをカゼイン基質で
の力価で５００ＡＰＵになるように添加し、４０℃で所
定時間処理した。結果を表７に示す。

【００６３】

【表７】

【００６４】パーマ処理毛髪は、酸化剤やアルカリ剤で
損傷分解や種々の架橋により高分子化したり、キューテ
ィクル層数も減少しているが、表７に示したように、本
発明の方法は、処理時間を調整することでパーマ処理毛
髪にも有効に活用できることがわかった。

【００６５】また、本発明のプロテアーゼを用いた毛髪
構成部位の分解は、キューティクル部位が破壊された
後、徐々にコルテックス部位も分解されてくるため、コ
ルテックス中のメラニン溶出による処理液の着色が終点
の指標となる。溶液の着色を指標にすれば、ノーマル毛
髪が６時間であるのに対して、損傷が認められるパーマ
毛髪では、処理時間が４時間で十分であることがわかっ
た。

【００６６】更に、得られたキューティクル部位の分解
採取液及びコルテックス部位の成分分析を行うことによ
り、損傷の部位並びに損傷程度が容易に把握できる。毛
髪の酸化損傷程度をシステイン酸とシステインをアミノ
酸分析で測定した結果を表８に示す。

【００６７】

【表８】

【００６８】上記結果より、本発明の方法で得られた分
解物及び残渣を調べることにより、パーマ処理した毛髪
のシスチン結合が減少し、システイン酸の量が多くなっ
ていることが、容易に推察できることが確認された。

【００６９】〔実施例１０〜１４〕毛髪キューティクル
部位を構成するエンドキューティクルの蛋白質を優先的
に分解し、エンドキューティクル部位起源の分解物と形
状を維持したエンドキューティクルが一部取り除かれた
毛髪を採取することを試みた。

【００７０】３０才男性のノーマル脱脂毛１０ｍｇをス
クリュー管に入れ、続いてｐＨ９．３に調整した４０ｍ
Ｍホウ酸緩衝液を加え、更にエスペラーゼを最終量で１
０，０００ＡＰＵになるように加え、３４℃で所定時間
処理した。処理時間とエンドキューティクル蛋白の分解
率を表９に示した。

【００７１】ここで、エンドキューティクルの分解率
は、超音波処理で剥離したキューティクル断片をＳｗｉ
ｆｔらの段階的な分解法でキューティクル中のエンドキ
ューティクル量を蛋白量測定で求めておき、キューティ
クル部位とコルテックス部位の比率を２：８として、毛
髪中のエンドキューティクル量を算出し、未処理時を１
００とした。なお、蛋白量測定は、バイオラッド社のＤ
Ｃプロティンアッセイキットを使用した。

【００７２】表９に処理前を７層と仮定した時のキュー
ティクル層数を剥離及び分解物の測定アミノ酸の量から
推定したものを示す。

【００７３】更に、所定時間処理し、エンドキューティ
クル蛋白を任意に分解後、超音波装置（ヤマト科学
（株）製のブランソン２２００型）で１０分処理した後
の毛髪のキューティクル層数を調べた。その結果は表９
に示すとおりである。

【００７４】また、表１０に分解物のアミノ酸分析値を
示す。

【００７５】

【表９】

【００７６】

【表１０】

【００７７】表９の結果より、超音波装置で１０分処理
すると、毛髪のキューティクル層数を減少させ得ること
がわかった。

【００７８】また、表１０に示したように、分解物のア
ミノ酸分析値からキューティクル部位のエンドキューテ
ィクル蛋白種が特異的に分解していることがわかる。

【００７９】また、エンドキューティクルの損傷は、日
常の生活行動でみられるトラブルであり、パーマ処理毛
髪では特に顕著な現象で、毛羽立ちなど深刻な問題を引
き起こすものであるが、本方法で作製した損傷毛は、そ
れを分析するなどにより、製品の安全性、有効成分の評
価に有効な手法となり得る。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年４月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１２】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた
結果、毛髪に還元剤共存下、好アルカリ性のバチルス属
細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテアーゼを
ｐＨ７〜１１の条件下で作用させることにより、毛髪の
キューティクル部位を構成するケラチン蛋白種を優先的
に分解してキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸を採取し得、更に、その残渣から形状を維持し
たコルテックス部位、コルテックス細胞及びその断片を
採取することができること、また、毛髪に還元剤非共存
下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生するセリンタ
イプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１の条件下で
作用させることにより、毛髪のキューティクル部位を構
成するエンドキューティクルの蛋白種を優先的に分解
し、エンドキューティクル部位起源の分解ペプチド及び
アミノ酸と形状を維持したエンドキューティクルが一部
取り除かれた毛髪を採取することができること、更には
この後者の採取法を行った後、超音波処理を行うことに
より、キューティクル層数を任意に剥離させた薄いキュ
ーティクル層を有する毛髪を採取することができること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１６】従って、本発明は、（１）毛髪に還元剤共
存下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生するセリン
タイプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１の条件下
で作用させ、毛髪のキューティクル部位を構成するケラ
チン蛋白種を優先的に分解してキューティクル部位起源
の分解ペプチド及びアミノ酸を採取した後、残渣から形
状を維持したコルテックス部位、コルテックス細胞及び
その断片を採取することを特徴とする毛髪構成成分の採
取法、（２）毛髪に還元剤非共存下、好アルカリ性のバ
チルス属細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテ
アーゼをｐＨ７〜１１の条件下で作用させ、毛髪のキュ
ーティクル部位を構成するエンドキューティクルの蛋白
種を優先的に分解し、エンドキューティクル部位起源の
分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したエンドキュ
ーティクルが一部取り除かれた毛髪を採取することを特
徴とする毛髪構成成分の採取法、（３）上記（２）の採
取法を行った後、超音波処理を行い、キューティクル層
数を任意に剥離させた薄いキューティクル層を有する毛
髪を採取することを特徴とする毛髪構成成分の採取法を
提供する。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１７】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明の第一の毛髪構成成分の採取法では、毛髪に
還元剤共存下、好アルカリ性のバチルス属細菌が産生す
るセリンタイプのアルカリプロテアーゼをｐＨ７〜１１
の条件下で作用させ、毛髪のキューティクル部位を構成
するケラチン蛋白種を優先的に分解してキューティクル
部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸を採取した後、残
渣から形状を維持したコルテックス部位、コルテックス
細胞及びその断片を採取することができるものである。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２８】更に、本発明では、上記したように毛髪に
還元剤非共存下でアルカリプロテアーゼを作用させて、
毛髪のキューティクル部位を構成するエンドキューティ
クルの蛋白種を優先的に分解し、エンドキューティクル
部位起源の分解ペプチド及びアミノ酸を採取した後、形
状を維持したエンドキューティクルが一部取り除かれた
毛髪を更に超音波処理を行うことにより、毛髪のキュー
ティクル層数を任意に剥離させた薄いキューティクル層
を有する毛髪を得ることができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛髪に還元剤共存下、好アルカリ性のバ
   チルス属細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテ
   アーゼをｐＨ７〜１１の条件下で作用させ、毛髪のキュ
   ーティクル部位を構成するケラチン蛋白種を優先的に分
   解して採取した後、残渣からキューティクル部位起源の
   分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したコルテック
   ス部位、コルテックス細胞及びその断片を採取すること
   を特徴とする毛髪構成成分の採取法。
2. 【請求項２】 毛髪に還元剤非共存下、好アルカリ性の
   バチルス属細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロ
   テアーゼをｐＨ７〜１１の条件下で作用させ、毛髪のキ
   ューティクル部位を構成するエンドキューティクルの蛋
   白種を優先的に分解し、エンドキューティクル部位起源
   の分解ペプチド及びアミノ酸と形状を維持したエンドキ
   ューティクルが一部取り除かれた毛髪を採取することを
   特徴とする毛髪構成成分の採取法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の採取法を行った後、超音
   波処理を行い、キューティクル層数を任意に剥離させた
   薄いキューティクル層を有する毛髪を採取することを特
   徴とする毛髪構成成分の採取法。
4. 【請求項４】 還元剤がチオグリコール酸、２−メルカ
   プトエタノール及びジチオスレイトールから選ばれる１
   種又は２種以上であり、また、好アルカリ性のバチルス
   属細菌が産生するセリンタイプのアルカリプロテアーゼ
   が好アルカリ性のバチルス属細菌から産生されるエンド
   型のプロテアーゼである請求項１，２又は３記載の毛髪
   構成成分の採取法。