JP5866015B2 - 絹ベースの生物活性オリゴペプチド組成物及びその製造方法 - Google Patents
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Description
図1に、典型的に無菌環境下で行われる、本開示の一実施形態によるオリゴペプチドを調製、作製又は製造するプロセス100のフローチャートを示す。第1のプロセス部分110では、カイコ(ボンビックス・モリ)によって産生される絹繭を準備又は入手する。絹繭の例としては、黄絹繭、白絹繭等が挙げられるが、これらに限定されない。絹繭を物質又は混入物を手で取り除いてきれいにした後、水道水で洗浄することができる。様々な実施形態では、絹繭のサイズを(例えば切断することにより)、例えば元のサイズの2分の1、4分の1、6分の1、8分の1又は10分の1に縮小する。
実験により、体重180g〜200gの8週齢の雄ウィスターラットである糖尿病ラットの血中グルコースレベルに対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。糖尿病は体重(BM)1kg当たり55mgの濃度のストレプトゾトシンの単回静脈内(i.v.)注射を用いて導入した。7日目に、ラットの血糖レベルを、血液採取及びグルコース試験キット(ACCUCHEK、Roche Laboratory Pharma.)によって決定した。血糖レベルが300mg/dlを超えるラットを更なる実験工程の糖尿病群に選択した。
(i)群1:蒸留水を投与した正常対照ラット群。
(ii)群2:蒸留水を投与した糖尿病対照ラット群。
(iii)群3:糖尿病ラットに体重1kg当たり0.6mgのグリベンクラミド(血糖レベルを低減する標準薬)を単回所定量投与した。
(iv)群4:糖尿病ラットに体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
(v)群5:糖尿病ラットに体重1kg当たり300mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
(vi)群6:糖尿病ラット体重1kg当たり600mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを単回所定量投与した。
図2に、対照ラット並びにグリベンクラミド及び異なる濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した糖尿病ラットの血糖レベルを示している。対照群1のラットの血糖レベルはBW1kg当たり5gの濃度でグルコース溶液を導入して30分後に増大し、その後続いて、180分で初期血糖レベルまで低減した。対照群2のラットの血糖レベルはグルコース溶液を投与して30分後及び60分後に増大した。群2のラットの血糖レベルはその後もほとんど低減しないか又は相対的に同じ状態を維持した。これに対して、グリベンクラミド(群3)、BW1kg当たり100mg(群4)、BW1kg当たり300mg(群5)、及びBW1kg当たり600mg(群6)の濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したラットの血糖レベルはグルコース溶液を投与して30分後及び60分後で増大し、180分後に有意に低減した。群2と比較した上での180分での群3〜群6のラットの血糖レベルの低減はp値<0.05で統計的に有意であった。
本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したラットの血糖レベルは、或る特定の期間にわたって大幅に低減し、血糖レベルを低減することで知られる薬物であるグリベンクラミドを投与したラットの血糖レベルと相対的に同程度であった。BW1kg当たり100mg、300mg及び600mgの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドは血糖レベルを低減する有効性又は生物活性を備える。
実験により、体重180g〜200gの8週齢の雄ウィスターラットである糖尿病ラットの血圧低下に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
(i)群1:対照群、ラットに蒸留水を投与した。
(ii)群2:大腿静脈注射により10−7mg/ml〜10−1mg/mlの範囲の濃度(すなわち10−7mg/ml、10−6mg/ml、10−5mg/ml、10−4mg/ml、10−3mg/ml、10−2mg/ml及び10−1mg/ml)の本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した。最小オリゴペプチド濃度の用量(すなわち10−7mg/ml)を注射することにより本開示によるオリゴペプチドを導入した後、ラットの血圧をモニタリングした。血圧値が初期値に戻った後、オリゴペプチド濃度の2番目のより高い用量(すなわち10−6mg/ml)を投与した。これを実施例2に用いられる最大オリゴペプチド濃度(すなわち10−1mg/ml)に達するまで繰り返した。
(iii)群3:ラットにアンジオテンシン(Angiotensin)IIの活性を阻害することにより血圧を低下することで知られる物質であるエナラプリルを所定量投与した。群2と同様に、エナラプリルを、大腿静脈注射により10−7mg/ml〜10−1mg/mlの範囲の濃度(すなわち10−7mg/ml、10−6mg/ml、10−5mg/ml、10−4mg/ml、10−3mg/ml、10−2mg/ml及び10−1mg/ml)で使用した。初めに最小エナラプリル濃度の用量(すなわち10−7mg/ml)を注射することによりエナラプリルを導入した後、ラットの血圧をモニタリングした。血圧が初期値に戻った後、2番目のより高い用量(すなわち10−6mg/ml)のエナラプリルを導入した。これを実施例2に用いられる最大エナラプリル濃度(すなわち10−1mg/ml)に達するまで繰り返した。
図3Aに、対照ラットの血圧及び本開示に従って調製されたオリゴペプチドを投与したラットの血圧を示している。本開示により提供されるオリゴペプチドの濃度は10−7mg/ml〜10−1mg/mlで変えた。対照群1の血圧は100mmHg〜120mmHgであった。群2のラット(上述されたオリゴペプチドを投与した)の血圧は群1の対照ラットと比較して大幅に低下した。血圧の低下は統計的に有意であった。より具体的には、ラットに本開示により提供されるオリゴペプチドを10−7mg/mlの濃度で導入した場合、血圧は基準値と比べて64%の低下である39.33±5.39mmHgまで激減した。ラットに本開示により提供されるオリゴペプチドを10−6mg/ml、10−5mg/ml、10−4mg/ml、10−3mg/ml、10−2mg/ml及び10−1mg/mlの濃度で導入した場合、血圧はそれぞれ51.17±7.99mmHg、57.5±9.93mmHg、88.33±10.95mmHg、81.33±9.42mmHg、72.33±6.28mmHg及び92.33±13.22mmHgへと大幅に低下した。
本開示により提供されるオリゴペプチドを摂取したラットの血圧は対照ラットと比較して大幅に低下した。10−7mg/ml〜10−1mg/mlの範囲の濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドは血圧を低下する有効性又は生物活性を備える。その上、本開示により提供されるオリゴペプチドを摂取したラットの血圧は同一又は同等の濃度のエナラプリルを摂取したラットの血圧よりも大幅に低下し、このことから本開示の幾つかの実施形態により調製されるオリゴペプチドは、既存の血圧低下物質(例えばエナラプリル)を超える優れた特性又は利点を有することが示唆される。したがって、本開示の様々な実施形態に従って調製されたオリゴペプチドは、従来の血圧低下剤と比較して少なくとも同等の又は増進した生物活性を有する。
実験により、本開示による特定のセリシン由来のオリゴペプチドの抗酸化特性又は抗酸化効果を評価した。脂質の酸化分解が脂質の過酸化を伴うものであることは当該技術分野において既知である。本開示により提供されるオリゴペプチドの抗酸化特性を、血漿から単離した低比重リポタンパク質(LDL)の酸化度を測定することにより決定した。
群1:50μMのCuSO4とともにインキュベートした1mg/mlのLDLを含む対照群。
群2:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした10μg/mlのオリゴペプチド。
群3:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした10μg/mlのBSA。
群4:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした20μg/mlのオリゴペプチド。
群5:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした20μg/mlのBSA。
群6:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした50μg/mlのオリゴペプチド。
群7:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした50μg/mlのBSA。
群8:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした100μg/mlのオリゴペプチド。
群9:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした100μg/mlのBSA。
群10:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした200μg/mlのオリゴペプチド。
群11:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした200μg/mlのBSA。
群12:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした400μg/mlのオリゴペプチド。
群13:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした400μg/mlのBSA。
群14:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした800μg/mlのオリゴペプチド。
群15:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした800μg/mlのBSA。
群16:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした1200μg/mlのオリゴペプチド。
群17:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした1200μg/mlのBSA。
群18:ヒトLDLとともに30分間インキュベートした100μMのトロロックス。
図4Aに、上記の群1〜群18に対応する脂質過酸化産物(MDA)のレベルを示す。本開示により提供されるオリゴペプチドの濃度が増大するにつれて、MDAのレベル又は量が低減し、このことから試験濃度の範囲全体にわたってオリゴペプチド濃度が増大するにつれて過酸化反応が低減することが示唆される。これに対してBSA濃度が10μg/ml〜800μg/mlの範囲で増大しても、MDAのレベル又は量はほぼ同一のままであるか又は僅かに低減する。さらに、50μg/ml〜1200μg/mlの範囲の濃度のオリゴペプチドに対応するMDAレベルは同じ濃度のBSAに対応するMDAレベルより大幅に低下した。結果として、本開示により提供されるオリゴペプチドはLDL脂質過酸化の阻害に関して同一の濃度条件下でBSAよりも高い有効性を備える。
本開示によるオリゴペプチドはLDLの脂質過酸化に対する阻害活性を示す。BSA対照タンパク質と比較して、本開示により提供されるオリゴペプチドはLDLの脂質過酸化の阻害においてより高い有効性を備える。実施例3の結果から、本開示に記載される様々な実施形態に従って提供又は調製されるオリゴペプチドがLDLのCu2+誘導性の酸化に対する抗酸化特性又は生物活性を有することが示唆される。
実験により、本開示による特定のセリシン由来のオリゴペプチドのナチュラルキラー細胞(NK細胞)活性又は特性を調べた。より具体的には、ナチュラルキラー細胞活性又は特性の亢進を、脾臓単核細胞のリンパ腫細胞を溶解する能力に基づき評価した。
(i)群1:対照群、セリシン由来のオリゴペプチド補給剤を含まない標準的食餌を7日間与えた。
(ii)群2:標準的食餌及び50mg/kg(体重)/日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを7日間与えた。
(iii)群3:標準的食餌及び100mg/kg(体重)/日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを7日間与えた。
(iv)群4:標準的食餌及び500mg/kg(体重)/日で補給剤として所定量の本開示により提供されるオリゴペプチドを7日間与えた。
NK細胞活性(%)={1−[(OD試験−ODエフェクター細胞対照)/OD標的細胞対照]}×100
図5A及び図5Bに、それぞれ25:1及び50:1のエフェクター対標的比で本開示により提供されるオリゴペプチドを投与したマウスから単離される調製脾臓単核細胞のNK細胞活性(%)を示す。50mg/kg(体重)/日〜150mg/kg(体重)/日の濃度範囲のオリゴペプチドを投与した(すなわち群2〜群4の)マウスから単離される脾臓単核細胞のNK細胞活性(%)は試験した両方のエフェクター対標的比で群1の対照マウスのものよりも高かった。
対照群と比較して、上記で提供されるオリゴペプチドはより高いNK細胞活性をもたらし、このことから本開示の実施形態に従って提供又は調製されたオリゴペプチドがNK細胞活性の亢進又は改善を促す又は可能にすることが示唆される。
実験により、体重180g〜200gの8週齢の雄ウィスターラットである2型糖尿病ラットの血漿グルコースレベル、血漿インスリンレベル及び糖尿病網膜症に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。糖尿病ラット(下記においてDMと選択的に特定される)を、クエン酸バッファー0.2mlに溶解した体重1kg当たり35mgのストレプトゾトシンの単回の静脈内(i.v.)注射を用いることにより誘導した。ストレプトゾトシン注射の1週間後、ラットの血漿グルコースレベルを、血液採取及びグルコース試験キット(ACCUCHEK、Roche Laboratory Pharma.)の使用によって決定した。血漿グルコースレベルが300mg/dlを超えるラットを実施例5の更なる実験の糖尿病ラットに選択した。
(i)群1:蒸留水を投与した正常対照ラット群。
(ii)群2:1日に付き体重1kg当たり50mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
(iii)群3:1日に付き体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
(iv)群4:1日に付き体重1kg当たり200mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与した正常ラット。
(v)群5:群5の糖尿病対照ラットに蒸留水を投与した。
(vi)群6:1日に付き体重1kg当たり50mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
(vii)群7:1日に付き体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
(viii)群8:1日に付き体重1kg当たり200mgの本開示により提供されるオリゴペプチドを所定量投与した糖尿病ラット。
(ix)群9:1日に付き体重1kg当たり0.6mgのグリベンクラミドを所定量投与した糖尿病ラット。
表1に、蒸留水、グリベンクラミド及び様々な濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常ラット及び糖尿病ラットの平均体重を示す。正常対照群1のラットの平均最終体重は453.33gであり、これは50mg/kg/日、100mg/kg/日、200mg/kg/日の濃度の本開示によるオリゴペプチドを投与した正常ラット(すなわち群2〜群4)の平均最終体重よりも有意に高かった。正常ラットと比較して、蒸留水及び50mg/kg/日、100mg/kg/日、200mg/kg/日の濃度のオリゴペプチドを投与した糖尿病ラット(すなわち群5〜群8)の平均最終体重は有意に低かった。さらに、全ての濃度のオリゴペプチドを投与した糖尿病ラット(すなわち群6〜群8)の平均最終体重は糖尿病対照群5のラットの平均最終体重よりも有意に高かった。0.6mg/kgの濃度のグリベンクラミドを投与した群9の糖尿病ラットの平均最終体重は初期体重よりも僅かに低かった。
実施例5の結果から、本開示の実施形態に従って調製され、50mg/kg/日〜200mg/kg/日の範囲の濃度で投与されたオリゴペプチドは、2型糖尿病ラットにおいて血漿グルコースレベルを低減するとともに、血漿インスリンレベルを増大することに加えて、網膜症を低減する有効性又は生物活性を備えることが示唆される。上記の濃度で投与された本開示によるオリゴペプチドには、既存の血漿グルコース低減物質及び既存の血漿インスリン増大物質(すなわちグリベンクラミド)を超える利点がある。
実験により、4週齢の雄ICRマウスの自発運動及び中枢神経系(CNS)刺激特性に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
(i)群1:蒸留水を投与したビヒクル対照マウス群。
(ii)群2:体重1kg当たり1mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
(iii)群3:体重1kg当たり10mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
(iv)群4:体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量投与したマウス。
(v)群5:体重1kg当たり30mgのプソイドエフェドリンを所定量投与したマウス。
図6に、本開示により提供されるオリゴペプチドに関連する弱い中枢神経系刺激特性に関する実験グラフを示す。結果から、マウスにエフェドリンを投与した場合(すなわち群5)のマウスの運動回数が、20分以降、マウス対照群(すなわち群1)の運動回数よりも有意に高くなったことが示される。マウスに体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを投与した場合(すなわち群4)のマウスの運動回数は、40分以降、マウス対照群(すなわち群1)の運動回数よりも有意に高くなった。マウスに体重1kg当たり1mg及び10mgの濃度のセリシン由来のオリゴペプチドを投与した場合(すなわち群2及び群3)のマウスの運動回数は、50分以降、マウス対照群(すなわち群1)の運動回数よりも有意に高くなった。
実施例6の結果から、本開示の実施形態に従って調製され、1mg/kg〜100mg/kgの範囲の濃度で投与されたオリゴペプチドは、弱い中枢神経系刺激物質として有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
実験により、4週齢の雄ICRマウスであるアルツハイマー病のマウスモデルにおける神経保護特性、認知機能保護特性及び/又は記憶保護特性、特に空間記憶に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。
(i)群1:偽対照群。マウスに蒸留水を与え、生理食塩水溶液を脳室内注射した。
(ii)群2:健忘対照群。マウスに蒸留水を与え、10μg/10μlの濃度のAβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射した(図7では「対照AB」と示す)。
(iii)群3:マウスに体重1kg当たり1mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、10μg/10μlの濃度のAβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射した(図7では「AB+OP1」と示す)。
(iv)群4:マウスに体重1kg当たり10mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、10μg/10μlの濃度のAβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射した(図7では「AB+OP10」と示す)。
(v)群5:マウスに体重1kg当たり100mgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを与え、10μg/10μlの濃度のAβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射した(図7では「AB+OP100」と示す)。
図7に、アルツハイマー病マウスモデルにおける本開示により提供されるオリゴペプチドにより促進される又は本開示により提供されるオリゴペプチドから生じる神経保護特性に関する実験グラフを示す。結果から、蒸留水並びに体重1kg当たり1mg及び10mgの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Aβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス(すなわち群2、群3及び群4)は、蒸留水を与え、生理食塩水溶液を脳室内注射した対照マウス群(すなわち群1)よりも逃避台を見つけるのに有意に多くの時間を要したことが示された。一方で、体重1kg当たり100mgの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Aβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス(すなわち群5)が逃避台を見つけるのに要した時間は、偽対照群(すなわち群1)のマウスの時間と同程度であったか又は有意に異なるものではなかった。結果から、十分な用量(例えば体重1kg当たり100mgの用量)での本開示により提供されるオリゴペプチドの投与は、Aβ25−35ペプチドの作用を逆転させ、神経保護効果の促進若しくは実現及び/又はアルツハイマー病においてAβ25−35ペプチドにより引き起こされる記憶障害又は認知機能不全の抑制若しくは逆転を助けることができることが示唆される。
実施例7の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドは、アルツハイマー病に関連する記憶欠如、特に空間記憶欠如を抑制、実質的に抑制若しくは改善する、神経保護、認知機能保護及び/又は記憶保護の有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
実験により、4週齢の雄ICRマウスを伴ったアルツハイマー病のマウスモデルにおける新規物体認識試験を用いることで、認知及び/又は記憶、特に認識記憶の側面に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの或る特定の神経保護効果を評価した。
図8に、新規物体認識試験を用いたアルツハイマー病マウスモデルにおける本開示により提供及び/又は投与されるオリゴペプチドに関連する神経保護特性、認知機能保護特性及び/又は記憶保護特性に関する実験グラフを示す。結果から、偽対照群のマウス(すなわち群1)は生理食塩水溶液の脳室内注射の前後で認識記憶の変化を示さなかったことが示された。これに対して、蒸留水を与えた後、Aβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス(すなわち群2)は記憶欠如を示し、新規物体(C)を認識することができなかった。体重1kg当たり10mg及び100mgの濃度の本開示により提供されるオリゴペプチドを与えた後、Aβ25−35ペプチドを含む溶液を脳室内注射したマウス(すなわち群4及び群5)は、これらのマウスが試験段階において新規物体(C)を探索するのに実質的により長い期間を費やしたことから、群2のマウスよりも良好な認識記憶を呈した。結果から、体重1kg当たり10mg〜100mgの適切な用量での本開示により提供されるオリゴペプチドの投与が、Aβ25−35ペプチドに関連するようなアルツハイマー病により引き起こされる認識記憶欠如の矯正又は抑制を促進することができることが示唆される。
実施例8の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドが、認知衰退、特に認識記憶欠如に対する保護を助ける若しくは認識衰退、特に認識記憶欠如を軽減する神経保護の有効性又は生物活性を備えることが示唆される。
実験により、老齢ラットにおける学習及び記憶の改善に対する本開示により提供される特定のセリシン由来のオリゴペプチドの効果を評価した。より具体的には、実施例9の実験を、長期増強(LTP)評価を用いて自然に加齢した14ヶ月齢の雌スプラーグ−ドーリー(S.D.)ラットにおける海馬伝達に関して行った。
(i)群1:対照群。マウスに所定量の蒸留水を2ヶ月間毎日与えた。
(ii)群2:マウスに1mg/kgの濃度のドネペジル(アリセプト(商標))を所定量、2ヶ月間毎日与えた。
(iii)群3:マウスに10mg/kgの本開示により提供されるセリシン由来のオリゴペプチドを所定量、2ヶ月間与えた。
図9に、本開示により提供及び/又は投与されるオリゴペプチドに関連する学習及び記憶の改善に関する実験グラフを示す。図9に示されるように、海馬LTPは対照老齢ラット(すなわち群1)では誘導することができなかった。驚くべきことに、ドネペジル及び本開示により提供されるオリゴペプチドを与えたマウス(すなわち群2及び群3)は海馬LTPの誘導を示した。結果から、本開示によるオリゴペプチドが、海馬におけるシナプス伝達を促進することにより示されるように老齢ラットにおいて学習及び記憶の改善を促進することができることが示唆される。
実施例9の結果から、本開示の実施形態に従って調製されたオリゴペプチドが、(例えば長期増強に伴って)海馬におけるシナプス伝達を促進することにより示されるように学習及び記憶の改善を助ける生体活性特性を備えることが示唆される。
Claims (7)
- 絹由来のオリゴペプチドを製造する方法であって、
絹繭を準備することと、
抽出溶媒中へ前記絹繭からセリシンを含むタンパク質又はペプチドを抽出することと、
該抽出溶媒を濾過することと、
該抽出溶媒の濾過後、目的のオリゴペプチドを得るために、抽出されたタンパク質の消化のために前記濾過された抽出溶媒中へプロテアーゼを含む酵素溶液を導入することと、
6000ダルトン未満の分子量をもつ目的のオリゴペプチドを得るために中空繊維膜を通過させ、該目的のオリゴペプチドを他のペプチドから分離することと、
ここで、前記酵素溶液は前記プロテアーゼの効果を上昇させるために塩化カルシウムを含んでいる、
を含む、方法。 - 抽出が、抽出圧120psi〜190psiで行われる、請求項1に記載の方法。
- 抽出が、抽出温度摂氏80度〜摂氏160度で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記抽出溶媒が水である、請求項1に記載の方法。
- 水と前記絹繭が30:1の重量比である、請求項4に記載の方法。
- 酵素活性を不活性化することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- プロテアーゼ酵素が絹タンパク質1g当たり0.008単位の濃度を持ち、塩化カルシウムが絹タンパク質1g当たりおよそ2mgの濃度をもつ、請求項1に記載の方法。
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