DE69732881T2

DE69732881T2 - Verwendung von zusammensetzungen mit stabilisierten enzymen

Info

Publication number: DE69732881T2
Application number: DE69732881T
Authority: DE
Inventors: Luppo Edens; Sheng Hong TAN; Wilhelmus Johannes LAMBERS
Original assignee: Cosmoferm BV
Current assignee: Evonik Operations GmbH
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2017-02-01
Also published as: ID18666A; KR19980703467A; CA2216169A1; DE69732881D1; EP0817613B1; BR9702049A; PT817613E; CN1140261C; BR9702049B1; US6117433A; CA2216169C; ATE291897T1; MX9707487A; CN1178460A; AR006308A1; AU1721697A; EP0817613A1; ES2237789T3; JPH11503465A; WO1997027841A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Abgabevorrichtung zur gleichzeitigen Abgabe einer ersten und einer zweiten wässrigen Zusammensetzung, wobei die Abgabevorrichtung eine erste Kammer, die eine erste wässrige Zusammensetzung mindestens eines Enzyms in Gegenwart einer Menge mindestens eines Polyols enthält, und eine zweite Kammer umfasst, die eine zweite wässrige Zusammensetzung enthält, gemäß der Präambel der ersten Anspruchs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die topische Anwendung von Enzymen ist sowohl im kosmetischen als auch im pharmazeutischen Fachgebiet beschrieben. Zum Beispiel wurde die Verwendung von Proteasen vorgeschlagen, um α-Hydroxysäuren in Hautschälzubereitungen zu unterstützen oder zu ersetzen (japanische Patentanmeldung J04027388). Glutathionsulfhydryloxidase wurde als wirkungsvoll zum Festigen von Haarwellen identifiziert (japanische Patentanmeldung J04005220). Ferner beschreibt die internationale Patentanmeldung WO93/19731 die Verwendung von Glycosidasen zur Verstärkung des Hautentschuppungsvorgangs, und Lysozym wurde für die Behandlung von Akne erwähnt (HUT 057608). Vor kurzem wurden mehrere Patentanmeldungen veröffentlicht, die das Enzym Transglutaminase verwenden (WO94/18945, J02204407).
Die begrenzte Lagerungsstabilität von Enzymen in flüssigen wässrigen Formulierungen muss jedoch als der hauptsächliche beschränkende Faktor für eine breitere Anwendung von Enzymen angesehen werden.
Kommerzielle Zubereitungen, die Enzyme enthalten, nutzen oft die Lagerfähigkeit eines Enzyms im trockenen Zustand. Einem solchen Konzept zufolge ist die leichteste Weise, ein enzymhaltiges Produkt zu vermarkten, das Enzym getrennt mit dem Produkt, z.B. geeigneterweise als Tabletten abgepackt, zu liefern. Bei einem alternativen Ansatz kann trockenes Enzympulver in einer im Wesentlichen nichtwässrigen hydrophoben Phase, wie einem geeigneten Öl, in Kombination mit einem Öl-Geliermittel homogen dispergiert werden.
Nachteil des ersten Ansatzes ist, dass das erforderliche Lösen der Enzymtablette in einer wässrigen Zusammensetzung langsam und unbequem ist. Hinsichtlich des zweiten Ansatzes sollte beachtet werden, das ein Enzym Wasser benötigt, damit es aktiv ist. Damit es effizient ist, erfordert das Mischen einer wässrigen und einer öligen Phase gewöhnlich einen relativ hohen Energieeintrag und kann nicht durch einfaches manuelles Mischen erzielt werden. So wird erwartet, dass das Mischen einer wässrigen Zusammensetzung und einer hydrophoben enzymhaltigen Phase sehr ineffizient ist.
Die vorstehenden Probleme können durch Verwendung wässriger stabilisierter Enzymzusammensetzungen für topische Anwendungen umgangen werden. Unglücklicherweise erfordern wässrige Enzymformulierungen hohe Konzentrationen mit Wasser mischbarer Stabilisatoren, die die Wasseraktivität der Formulierung senken sollen. Polyole werden oft zu diesem Zweck eingesetzt, und eine Langzeitstabilität kann nur durch Polyolkonzentrationen von gut über 40% (v/v) erzielt werden. Enzyme sind jedoch in Zusammensetzungen mit hohen Polyolkonzentrationen oft inaktiv. Insbesondere die direkte topische Anwendung einer derart stabilisierten Enzymzusammensetzung liefert nicht ausreichend Wasser, um das Enzym zu reaktivieren. Außerdem wird das Vorhandensein derart hoher Polyolkonzentrationen in Zusammensetzungen zur topischen Verwendung als inakzeptabel angesehen.
Folglich verhindert die hohe Polyolkonzentration, die benötigt wird, um ein Enzym in einer wässrigen Umgebung zu stabilisieren, die direkte topische Anwendung einer derart stabilisierten wässrigen Enzymzusammensetzung.
Ein weiteres Gebiet, auf dem Enzyme vorteilhaft verwendet werden können, ist das Gebiet der Wäscherei- Handwäsche-Anwendungen. Obwohl das Vorkommen von Handwäsche verglichen mit Maschinenwäsche in Europa und Nordamerika sehr selten ist, bleibt Handwäsche in Anbetracht empfindlicher Stoffe weiterhin üblich. Unter den empfindlichen Stoffen stellt die kleine Kategorie wollener und seidener Sachen ein besonders problematisches Gebiet hinsichtlich Fleckenentfernung, Stoffentfusselung, Farbauffrischung und Einlaufen des Stoffs dar. Diese Kategorie spezieller Stoffe kann spezifische Enzyme erfordern, wie Proteasen, die um einen neutralen pH-Wert und/oder bei niedriger Temperatur aktiv sind, oder Schwefelbrücken umlagernde Enzyme, wie Proteindisulfidisomerase, um Spannungen; die Wolle verformen und während des Waschens ausgeübt werden, entgegenzuwirken ( EP 276547 ). Ein Nachteil solcher Nischenprodukte ist, dass sie die Kosten ausgiebiger Detergenz- oder Enzymformulierungsentwicklungen offensichtlich nicht tragen können.
Ebenso sind verschiedene andere biologisch wirksame, von Enzymen verschiedene Verbindungen bekannt, die in wässrigen Endformulierungen, d.h. solchen Formulierungen, die sich für die direkte Verwendung bei einer speziellen Anwendung eignen, instabil sind. Üblicherweise verlieren biologisch wirksame Verbindungen, wie Enzyme, Antibiotika, Vitamine, mehrfach ungesättigte Verbindungen und dergleichen, ihre Aktivität nach längerer Aufbewahrung in wässrigen Zusammensetzungen. Obwohl spezifische Formulierungen bekannt sind, in die diese biologisch wirksamen Verbindungen eingebracht worden sind, eignen sich letztere Formulierungen nicht für die direkte Verwendung bei gewünschten Anwendungen.
US-A-4.243.543 betrifft eine wässrige flüssige Detergenzzusammensetzung zur Entfernung proteinhaltiger Flecken aus Stoff durch herkömmliches Waschen. Die Detergenzzusammensetzung wird als zweiteiliges System versandt, wobei die zwei Teile an Ort und Stelle vor oder zum Zeitpunkt des Gebrauchs gemischt werden, so dass maximale Stärke des Enzyms gewährleistet ist. Der erste Behälter enthält eine Menge Wasser, ein Tensid, etwa 1 Gew.-% Enzym, eine pH-Puffersubstanz und eine Menge eines Stabilisierungssystems für das Enzym. Das Stabilisierungssystem umfasst in Wasser dispergierbares Antioxidans, um das Enzym gegen Denaturierung infolge von Luftoxidation zu schützen. Das Stabilisierungssystem umfasst auch organisches, hydrophiles, wasserlösliches Polyol, von dem gesagt wird, dass es die vom Antioxidans bereitgestellte Stabilisierungswirkung optimiert. Der zweite Teil enthält ein Chelatisierungs- oder Sequestrierungsmittel, um das Enzym gegen nachteilige Wirkungen von hartem Wasser zu schützen.
WO91/09941 löst das Problem der Bereitstellung eines Detergenz auf Enzymbasis mit verbesserter Lagerungsstabilität, wobei zwischen 0,001–10 mg Enzym pro g Detergenz enthalten sind, indem mindestens 50% der in der Zubereitung vorliegenden enzymatischen Aktivität als Kristalle vorhanden sind. Die Zubereitung kann ferner ein Stabilisierungsmittel für das Enzym enthalten.
FR-A-101.377 offenbart ein nichtwässriges Zwei-Kompartimenten-System, in dem das erste Kompartiment eine Menge alpha-Chymotrypsin, dispergiert in Polyethylenglycol bei einem pH von weniger als 6, enthält. Das zweite Kompartiment enthält eine Fettsalbe mit alkalischem pH und vorzugsweise ferner einen Aktivator für das Enzym, wie Calciumionen, Aminosäuren oder hydrolysierte Gelatine. Bei Gebrauch wird ¼ der Säurephase mit ¾ der alkalischen Phase gemischt, um ein Gemisch mit einem pH von 7,5 zu erhalten.
US-A-4.556.554 betrifft eine Kosmetikzusammensetzung, die zwischen 0,5 und 20 Gew.-% Enzyme umfasst, die mit physikalischen oder chemischen Phasen und Mitteln immobilisiert sind, die das Enzym in einer inaktiven oder leicht aktiven Form halten, bis es remobilisiert wird. Die Enzyme werden infolge eines Kontakts mit der Haut, die mit ausgeschiedenen Schweiß- und Talgrückständen bedeckt ist, reaktiviert oder mobilisiert, wonach das Enzym wirken kann.
WO9100094 betrifft eine Injektionsvorrichtung für Papaverin als Wirkstoff, die aus zwei abgeschlossenen Kompartimenten besteht. Das erste Kompartiment enthält Papaverinsulfat, das zweite Kompartiment enthält eine Base, die mit dem Papaverin gemischt werden soll, um bei der Injektion in den menschlichen Körper Schmerz so weit wie möglich zu verringern. Die Inhalte der zwei Kompartimente werden kurz vor Gebrauch gemischt, und das Gemisch wird injiziert.
WO93/15726 betrifft ein Kit zur Herstellung einer topischen Zusammensetzung, die gegen Akne wirkt. Das Kit umfasst einen ersten Behälter, der eine Benzoylperoxidsuspension enthält, und einen zweiten Behälter, der eine wässrige Lösung eines Clyndamycinsalzes oder -esters enthält. Um stabile Lagerung zu erzielen, werden die zwei Komponenten in getrennten, verschossenen Behältern aufbewahrt, die zusammen in Form eines Kits, das einen Mischspatel umfasst, abgepackt sind.
EP-A-381.262 offenbart eine enzymatische flüssige Detergenzzusammensetzung, die sowohl lipolytische als auch proteolytische Enzyme und ein Stabilisierungssystem für die Enzyme umfasst. Das Stabilisierungssystem ist eine Kombination aus einem Polyol mit größtenteils benachbarten Hydroxylgruppen und einer Borverbindung, die mit dem Polyol reagieren kann. Das Polyol liegt in einer Menge von 1–20 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der endgültigen Zusammensetzung, vor.
WO95/15371 offenbart die Stabilisierung von Enzymen gegen Verlust der Aktivität bei erhöhten Temperaturen oder durch Wasser, indem es mit einer stabilisierenden Menge eines nichtionischen Polyether-Polyol-Blockcopolymer-Tensids des Typs I – (A_m– B_n)_x kombiniert wird. Dabei ist I ein monofunktionales Ausgangsmaterial, zum Beispiel ein einwertiger Alkohol, A ist eine hydrophobe Alkylenoxideinheit, B ist eine im Wässrigen solubilisierende Gruppe, z.B. Oxyethylen. Polyoxyalkylenglycolether sind die bevorzugten nichtionischen Blockcopolymer-Tenside. Die Zusammensetzung enthält 2–95 Gewichtsteile eines Enzyms, 1–90 Gewichtsteile Wasser, 0–70 Gewichtsteile Polyol und 0,2–40 Gewichtsteile des nichtionischen Polyether-Polyol-Blockcopolymer-Tensids.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Abgabevorrichtung gemäß dem kennzeichnenden Teil des ersten Anspruchs, wobei das mindestens eine Enzym in der ersten Zusammensetzung in Gegenwart von zwischen 40 und 90 Gew.-% mindestens eines Polyols, bezogen auf das Gesamtgewicht der ersten wässrigen Zusammensetzung, enthalten ist, die zweite wässrige Zusammensetzung eine Zusammensetzung zur Reaktivierung des Enzyms ist, die Vorrichtung Abgabevorrichtungen umfasst, welche die gleichzeitige Abgabe der ersten und zweiten wässrigen Zusammensetzung in einem Verhältnis von etwa 1:1 bis etwa 1:50 bewirken, um eine endgültige Zusammensetzung zu erhalten, die direkt angewendet wird und eine wirksame Konzentration des reaktivierten Enzyms enthält.
In dem erfindungsgemäßen Abgabesystem sind eine wässrige Zusammensetzung, die ein stabilisiertes Enzym in Gegenwart eines Polyols umfasst, und eine wässrige Basiszusammensetzung getrennt enthalten. Unter Verwendung des Abgabesystems ist die gleichzeitige Abgabe beider wässriger Zusammensetzungen möglich. Nach der Abgabe werden beide Zusammensetzungen gemischt, was zu einer Verdünnung der Zusammensetzung, die das stabilisierte Enzym umfasst, in der Basiszusammensetzung führt, wodurch eine für die direkte Anwendung geeignete endgültige Zusammensetzung erzeugt wird.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem, eignet sich ganz besonders zur topischen Anwendung eines Enzyms.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im erfindungsgemäßen Abgabesystem sind eine wässrige Zusammensetzung, die ein stabil formuliertes Enzym umfasst, und eine wässrige Basiszusammensetzung getrennt enthalten.
Unter Verwendung dieses Abgabesystems ist die gleichzeitige Abgabe der wässrigen Zusammensetzung, die ein stabil formuliertes Enzym umfasst, (bei der gesamten Erfindung als "Enzymzusammensetzung" oder "erste Zusammensetzung" bezeichnet) und der wässrigen Basiszusammensetzung (auch als "zweite Zusammensetzung" bezeichnet) möglich. Nach Abgabe werden beide wässrigen Zusammensetzungen entweder in situ oder im Abgabesystem gemischt. Mischen der beiden Zusammensetzungen führt zu einer endgültigen Zusammensetzung, die ein Enzym in einer aktiven Form enthält und ferner zur direkten Verwendung geeignet ist.
Der Begriff "Basiszusammensetzung" wird für eine Zusammensetzung verwendet, die in Kombination mit der wässrigen Zusammensetzung, die das Enzym umfasst, eine endgültige Zusammensetzung erzeugt, die sich zur direkten Anwendung des Enzyms eignet. Die Art der Basiszusammensetzung hängt hauptsächlich von der gewünschten Anwendung ab. Wässrige Basiszusammensetzung sollen Öl-in-Wasser-Emulsionen umfassen.
Vorzugsweise ist die wässrige Basiszusammensetzung eine Zusammensetzung, die sich zur topischen, Detergenz- oder Reinigungsverwendung eignet. Stärker bevorzugt ist die wässrige Basiszusammensetzung eine Zusammensetzung, die sich zur topischen Verwendung eignet. Am stärksten bevorzugt ist die wässrige Basiszusammensetzung eine Zusammensetzung, die sich zur kosmetischen Verwendung eignet.
Die wässrige Basiszusammensetzung kann eine Creme, ein Gel, ein Schampoo, eine Reinigungsflüssigkeit, eine Lotion, ein flüssiges Detergenz, eine Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen und dergleichen sein.
Im Hinblick auf die Quelle des Enzyms lässt sich sagen, dass das Enzym aus einer tierischen, einer pflanzlichen oder einer mikrobiellen Quelle erhältlich ist. Vorzugsweise ist das Enzym aus einer mikrobiellen oder pflanzlichen Quelle erhältlich. Stärker bevorzugt ist das Enzym aus einer mikrobiellen Quelle erhältlich.
Die Instabilität eines Enzyms in einer wässrigen Umgebung, die besonders nach längerer Aufbewahrung wahrnehmbar ist, kann chemischer Art sein, beispielsweise durch Strukturverschlechterung (z.B. Denaturierung im Fall von Enzymen oder anderen Proteinen), oxidativen Angriff oder andere ungünstige Umstände, wie nichtoptimale pH-Bedingungen, verursacht.
Instabilität kann zusätzlich durch Mikrobenwachstum in einer wässrigen Umgebung oder durch physikalische Instabilität der wässrigen Zusammensetzung, die das Enzym enthält, verursacht werden.
Je nach dem/den Faktor(en), der/die die Instabilität des Enzym verursach(t/en) wurden stabile Formulierungen entwickelt, die beispielsweise durch eine oder mehrere der folgenden Bedingungen gekennzeichnet sind: eine niedrige Wasseraktivität, einen niedrigen oder hohen pH, eine hohe Konzentration eines Antioxidans, eine hohe Konzentration eines Sequestrierungsmittels, eine hohe Konzentration eines antimikrobiellen Mittels, Kristallinität des Enzyms, eine hohe Konzentration eines viskos machenden Mittels. Üblicherweise gestatte(t/n) diese Bedingung(en), die zur Stabilisierung des Enzyms in einer wässrigen Zusammensetzung erforderlich ist/sind, keine direkte Verwendung der wässrigen Zusammensetzung.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem ermöglich die Verwendung relativ hoher Konzentrationen chemischer Stabilisatoren zur Herstellung stabiler Formulierungen von sich aus instabiler Enzyme, d.h. Konzentrationen, die viel höher als diejenigen sein können, die in einer endgültigen Zusammensetzung möglich sind, weil Stabilisatoren bei der Abgabe mit einer wässrigen Basiszusammensetzung verdünnt werden. Geeignete Stabilisatoren umfassen die Wasseraktivität senkende Mittel, wie Salze oder Polyole, oder Antioxidantien, wie Sulfite, Glutathion, Cystein oder Ascorbinsäure.
Unter einem anderem Aspekt der Erfindung gewährleistet die Verwendung des Abgabesystems, dass die wirksame Konzentration des Enzyms nach Verdünnen der Enzymzusammensetzung in der Basiszusammensetzung erreicht wird. Deshalb kann das Enzym in der Enzymzusammensetzung in einer erheblich höheren Konzentration, als für die Wirksamkeit erforderlich wäre, vorhanden sein. Mehrere Enzyme sind in wässrigen Zusammensetzungen in diesen höheren Konzentrationen unlöslich. Dies impliziert, dass das Enzym in einer kristallinen Form vorhanden sein kann. Die kristalline Form ist besonders vorteilhaft zur Gewährleitung der Stabilität des Enzyms.
Ein erhebliches Problem bei Zusammensetzungen, die kristalline Verbindungen umfassen, ist, dass Kristalle dazu neigen, sich in solchen Zusammensetzungen abzusetzen, d.h. solche Zusammensetzungen sind physikalisch instabil.
Die vorliegende Erfindung offenbart, dass das Absetzen eines kristallinen Enzyms durch Verwendung eines geeigneten viskos machenden Mittel verhindert wird. Das viskos machende Mittel ist vorzugsweise in der Lage, in einer wässrigen Umgebung ein dreidimensionales Netzwerk zu bilden. Stärker bevorzugt wird das viskos machende Mittel aus der Gruppe mit Xanthan, Carbopol.RTM. oder verwandten Harzen oder Carrageenan ausgewählt. Am stärksten bevorzugt ist das viskos machende Mittel Xanthan. Die Konzentration eines geeigneten viskos machenden Mittels wird hauptsächlich durch Gewicht und Größer der Teilchen, die in Suspension gehalten werden sollen, bestimmt. Geeigneterweise kann die Konzentration von 0,1–3%, vorzugsweise von 0,2–0,6%, reichen.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem gestattet die Verdünnung des in der Zusammensetzung, die ein Enzym enthält, vorhandenen Stabilisierungsmittels mit der Basiszusammensetzung bei der Abgabe. Das erfindungsgemäße Abgabesystem gestattet ferner die Verdünnung des Enzyms auf seine wirksame Konzentration.
Der Verdünnungsfaktor der Zusammensetzung, die ein Enzym enthält, (der Enzymzusammensetzung) in der Basiszusammensetzung wird angemessen gewählt, d.h. derart, dass die Endkonzentration des Stabilisierungsmittels die Anwendung der endgültigen Zusammensetzung nicht verhindert, und derart, dass das Enzym in der endgültigen Zusammensetzung in seiner angemessenen wirksamen Konzentration vorliegt. Der Verdünnungsfaktor wird durch das Verhältnis bestimmt, in dem die Enzymzusammensetzung und die Basiszusammensetzung durch das Abgabesystem abgegeben werden. Vorzugsweise variiert das Verhältnis zwischen Enzymzusammensetzung und Basiszusammensetzung von 1:1 bis 1:50, stärker bevorzugt von 1:2 bis 1:20, am stärksten bevorzugt beträgt das Verhältnis 1:5 bis 1:10.
Erfindungsgemäß hat die Viskosität der Enzymzusammensetzung vorzugsweise einen Wert, der mit der Viskosität der Basiszusammensetzung vergleichbar ist, die gleichzeitig mit der Zusammensetzung, die das Enzym enthält, angewendet wird. Zum Beispiel können beide Zusammensetzungen eine lotionsartige, cremeartige oder gelartige Konsistenz haben. Die Viskosität der Enzymzusammensetzung hängt zusätzlich von der Art des Abgabesystems ab, das zur Abgabe der Zusammensetzungen verwendet wird. Beispielsweise erfordert die Verwendung eines Schlauchs eine relativ hohe Viskosität beider Zusammensetzungen.
Die Menge an viskos machendem Mittel, die zur Enzymzusammensetzung hinzugefügt werden muss, hängt u.a. von der gewünschten Viskosität der Zusammensetzung ab. Jedes dem Fachmann bekannte viskos machende Mittel, das mit der endgültigen Zusammensetzung sowie der gewünschten Anwendung kompatibel ist, kann verwendet werden. Beispielsweise sollte bei topischen Anwendungen seine Akzeptanz für die topische Verwendung in Betracht gezogen werden. Beispiele für viskos machende Mittel umfassen Carragennane, Cellulosederivate, Polyacrylsäuren, Tone, Polyethylenglycole, Hydrokolloide, wie Xanthan.
Wenn gewünscht, können zur Enzymzusammensetzung und/oder zur Basiszusammensetzung Mittel hinzugefügt werden, so dass beide Zusammensetzungen das gleiche oder ein verschiedenes Aussehen haben. Ein typisches Beispiel für ein solches Mittel ist ein Farbstoff.
Die wässrige Enzymzusammensetzung soll Öl-in-Wasser-Emulsionen umfassen.
Um eine gewünschte Lagerfähigkeit von Zusammensetzungen zu erhalten, die Enzyme enthalten, die zu Oxidation neigen, ist undurchsichtiges Verpackungsmaterial mit niedrigem Eindringen von Sauerstoff wünschenswert. Das erfindungsgemäße Abgabesystem stellt die Möglichkeit bereit, die Zusammensetzung, die das Enzym enthält, in einem aus undurchsichtigem Material hergestellten Kompartiment mit sehr niedrigen Sauerstoffpermeationsraten sogar unter Bedingungen hoher Feuchtigkeit zu verpacken, so dass die Wirkung von Licht und Eindringen von Sauerstoff minimiert wird. Bevorzugte Verpackungsmaterialien umfassen PVdC, EVOH und aluminiumoxidbeschichtete Polymere (siehe Food Manufacture, Juni 1991, S. 49–53). Wenn sie in Spendern mit größerem Volumen angewendet wird, ist die Verwendung einer luftfreien Lotionspumpe zur Abgabe des Enzyms eine weitere Anforderung.
Das Abgabesystem, das beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden soll, ist für die Erfindung nicht entscheidend. Die vorliegende Erfindung zieht jedes System in Betracht, welches das getrennte Enthalten der stabilisierten Enzymzusammensetzung und der Basiszusammensetzung gestattet. Getrenntes Enthalten soll jede Form von Trennung umfassen, die in der Lage ist, eine erhebliche Diffusion von Wasser von einer zur anderen Zusammensetzung zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung zieht auch die Formulierung und Lagerung der stabilisierten Enzymzusammensetzung und der basischen Zusammensetzung in getrennten Behältern in Betracht, die vom Verbraucher zusammengesetzt und/oder mit einem geeigneten Spender ausgestattet werden. Es ist ebenfalls möglich, ein Abgabesystem, das bereits mit einem Behälter, der eine Zusammensetzung, z.B. die stabilisierte Enzymzusammensetzung, enthält, ausgestattet ist, zusätzlich mit einem Behälter mit der anderen Zusammensetzung, z.B. der Basiszusammensetzung, auszustatten.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem kann geeigneterweise für jede Anwendung verwendet werden, bei der die Wirkung eines labilen Enzyms gewünscht ist. Insbesondere stellt das erfindungsgemäße Abgabesystem eine angenehme und einfache Weise zur topischen Anwendung eines Enzyms von Interesse bereit. Topische Anwendung soll Anwendung auf Haut und Haar und Anwendung in der Mundhöhle, z.B. auf Zähne, umfassen.
Üblicherweise wird eine wässrige Enzymzusammensetzung mit einer hohen Konzentration eines die Wasseraktivität senkenden Mittel, wie eines Polyols, stabilisiert.
Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Spenders führt das Mischen der Enzym- und der Basiszusammensetzung zu einer tatsächlichen Verdünnung der Enzymzusammensetzung in der Basiszusammensetzung. Die hohe Konzentration beispielsweise eines Polyols in der Enzymzusammensetzung garantiert die Aktivität eines Enzyms nach Verdünnung sogar nach einer längeren Lagerungsdauer der Enzymzusammensetzung.
Die Verdünnung der Enzymzusammensetzung führt zu einer Verdünnung des Polyols, was wiederum zu einer Reaktivierung des Enzyms führt. Je nach dem verwendeten Enzym und Polyol kann man erwarten, dass die Enzymreaktivierung bei Polyolkonzentrationen unter 40% w/w beginnt.
Das Verhältnis, in dem die Enzymzusammensetzung und die Basiszusammensetzung durch das Abgabesystem abgegeben werden, hängt beispielsweise von der Konzentration des Polyols in der Enzymzusammensetzung ab, wobei das Verhältnis derart angepasst werden sollte, dass Reaktivierung des Enzyms gewährleistet ist. Ferner sollte, wenn topische Verwendung gewünscht ist, das Verhältnis derart eingestellt werden, dass das Konzentrationsniveau des Polyols nach Mischen der Enzym- mit der Basiszusammensetzung das annehmbare Niveau für die Verwendung in topischen Formulierungen nicht übersteigt.
Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabesystems ermöglicht die stabile Formulierung und Anwendung jedes Enzyms von Interesse. Vorzugsweise gehört das Enzym von Interesse zur Klasse der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen oder Isomerasen. Stärker bevorzugt ist das Enzym eine Glucoseoxidase, Peroxidase, Lipoxygenase, Superoxiddismutase, Tyrosinase, Protease, Phosphatase, Phytase, Glycosidase, Glucanase, Mutanase (α-1,3-Glucanase), Dextranase, Lysozym, Lipase, Phospholipase, Sulfatase, Urease, Transglutaminase oder Proteindisulfidisomerase. Es ist ebenfalls möglich, eine stabilisierte Zusammensetzung, die ein Gemisch von zwei oder mehreren Enzyme umfasst, anzuwenden.
Die Konzentration des Enzyms in der Enzymzusammensetzung wird hauptsächlich durch die Art der Anwendung bestimmt.
Die vorliegende Erfindung zielt auch auf Enzymzusammensetzungen, in denen das Enzym in Teilchenform formuliert ist. Enzyme, die als teilchenförmige Substanz formuliert sind, verringern stark die Gefahr einer Sensibilisierung, die nach potenziellem Inhalieren von Enzymmolekülen, wenn sie nach der Anwendung getrocknet sind, auftreten kann. Vorzugsweise wird das Enzym als Teilchen mit einer Teilchengröße von mindestens etwa 5–10 μm formuliert. Die Obergrenze der Teilchengröße der Enzymteilchen wird gewöhnlich durch die Tatsache bestimmt, dass größere Teilchen eine ungünstige Oberflächenbeladung aufweisen und sich beim Auftragen auf die Haut grobkörnig anfühlen. Geeigneterweise beträgt die Obergrenze der Teilchengröße etwa 100 μm.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Enzymteilchen von mindestens etwa 5–10 μm ist, das Enzym an einem geeigneten Träger, wie z.B. in Methods in Enzymology, Bd. 44 (1976) beschrieben, zu immobilisieren. Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Teilchenform ist so genanntes ChiroCLEC (Altus Biologics Inc., Cambridge, MA, USA), das aus vernetzten Enzymkristallen besteht. Diese vernetzten Enzymteilchen benötigen zur stabilen Formulierung kein Vorhandensein hoher Konzentrationen eines die Wasseraktivität senkenden Mittels, wie eines Polyols; sie sind in einer wässrigen Zusammensetzung aufgrund ihrer kristallinen Form chemisch stabil. Dennoch kann ein die Wasseraktivität senkendes Mittel zur Verbesserung der mikrobiologischen Stabilität der wässrigen Zusammensetzung zugesetzt werden.
Die Auswahl des Polyols, das zum Stabilisieren der Enzymzusammensetzung verwendet wird, ist für die Erfindung nicht entscheidend. Jedes Polyol, von dem der Fachmann weiß, dass es Enzyme in wässrigen Lösungen effizient stabilisiert, kann verwendet werden. Polyole, die besonders geeignet sind, sind Polyole, die aus der Gruppe mit Glycerin, Sorbit, Propylenglycol, Maltodextrinen oder einem Zucker, wie Saccharose, Lactose, Glucose oder Trehalose, ausgewählt sind. Für topische Anwendungen sollte man ein Polyol in Betracht ziehen, das zur topischen Verwendung annehmbar ist, d.h. Glycerin, Polyethylenglycol, Butylenglycol, Propylenglycol, Trehalose oder Sorbit.
Das Polyol wird in einer hohen Konzentration verwendet, d.h. einer Konzentration, die zu einer ausreichend niedrigen Wasseraktivität in der Enzymzusammensetzung führt, so dass das Enzym angemessen stabilisiert wird. Im Stand der Technik ist bekannt, dass diese Konzentrationen je nach dem verwendeten Polyol etwas variieren. Vorzugsweise wird das Polyol in einer Konzentration von 50–90%, am stärksten bevorzugt in einer Konzentration von 60–80%, verwendet.
Eine niedrige Wasseraktivität in einer wässrigen Zusammensetzung ist ebenfalls vorteilhaft, um Mikrobenwachstum in der Zusammensetzung zu verhindern.
Zusätzlich zu einem Polyol kann ein Salz, wie NaCl, dazu verwendet werden, die Stabilität des Enzyms während der Lagerfähigkeit des Produkts zu verstärken. Um die Enzymstabilität weiter zu verbessern, können kleine Konzentrationen von Enzymstabilisatoren, wie Reduktionsmitteln, Calciumsalzen oder Substrat- oder Substrat-verwandte Liganden, hinzugefügt werden (Gray, 1993, in: Thermostab. Enzymes, S. 124–143. Narosa, New Delhi).
Gegebenenfalls kann ein viskos machendes Mittel zur Enzymzusammensetzung gegeben werden, insbesondere wenn die Viskosität der Enzymzusammensetzung aufgrund des Polyols oder anderer relevanter Bestandteile nicht so hoch ist, wie es wünschenswert wäre. Die Menge an viskos machendem Mittel, das zur Enzymzusammensetzung hinzugefügt werden muss, hängt von den viskos machenden Eigenschaften des Polyols, das zur Stabilisierung der Enzymzusammensetzung verwendet wird, sowie von der gewünschten Viskosität der Enzymzusammensetzung ab.
Wird eine immobilisierte oder kristalline Enzymzubereitung verwendet, sollte die Viskosität der Enzymzusammensetzung derart sein, dass Absetzen der Enzymteilchen verhindert wird. Vorzugsweise wird, wie vorstehend beschrieben, ein viskos machendes Mittel verwendet, das ein dreidimensionales Netzwerk in einer wässrigen Zusammensetzung bilden kann.
Erfindungsgemäß wird die Enzymzusammensetzung im Wesentlichen gleichzeitig mit einer geeigneten wässrigen Basiszusammensetzung abgegeben. Die Art dieser wässrigen Basiszusammensetzung ist für die Erfindung nicht entscheidend, hängt aber größtenteils von der gewünschten Art der Anwendung ab.
Man sollte ferner darauf achten, zu vermeiden, dass die wässrige Basiszusammensetzung Bestandteile enthält, von denen erwartet werden kann, dass sie die Enzyme sofort inaktivieren. Bei Kosmetiklotionen ist ein typisches Beispiel für einen Bestandteil, von dem erwartet wird, dass er Enzyme inaktiviert, Ethanol in hohen Konzentrationen.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem kann geeigneterweise für jede Anwendung verwendet werden, bei der die Wirkung eines Enzyms gewünscht ist. Insbesondere stellt das erfindungsgemäße Abgabesystem eine geeignete und einfache Weise der topischen Anwendung eines Enzyms von Interesse bereit. Ein bevorzugtes Enzym zur topischen Anwendung des erfindungsgemäßen Spenders ist eine Protease.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem eignet sich auch zur gleichzeitigen Abgabe einer Enzymzusammensetzung und einer zweiten Zusammensetzung, die ein proaktives Substrat umfasst, wobei das Enzym das proaktive Substrat nach Abgabe und Mischen beider Zusammensetzungen in einen Wirkstoff umwandelt. Diese Ausführungsform der Erfindung ist bevorzugt, wenn der Wirkstoff in einer bestimmten Zusammensetzung instabil ist und die Möglichkeit besteht, eine Vorstufe des Wirkstoffs, das so genannte proaktive Substrat, das stabiler ist, zu formulieren.
Beispielsweise sind Vitamin-E-acetat, Vitamin-A-acetat und Vitamin-A-palmitat Vorstufenmoleküle, die üblicherweise zum Auftragen dieser instabilen, aber wünschenswerten Vitamine auf die Haut eingesetzt werden. Es wird angenommen, dass aufgrund der enzymatischen Aktivität in oder auf der Haut ein Teil der Vorstufe langsam in den Wirkstoff umgewandelt wird (siehe beispielsweise: Boehnlein et al., Pharmaceutical Research Bd. II, Nr. 8 (1994), 1155–1159). Gemäß dem erfindungsgemäßen Enzymabgabeverfahren könnte durch Kombination dieser lagerungsbeständigen Vorstufe und der geeigneten Hydrolyseenzyme aktives Retinol oder Tocopherol auf der Haut freigesetzt werden. Ein wichtiger Vorteil der Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabesystems ist, dass verglichen mit der Situation, bei der man von entsprechenden Enzymen, die in der Haut vorhanden sind, abhängt, die Hydrolyserate der Vorstufenmoleküle signifikant gesteigert wird. Bei bestimmten Anwendungen, z.B. Anwendungen gegen Sonnenbrand, sind die Vorteile einer momentanen Freisetzung der gewünschten Konzentrationen an Vitamin A offensichtlich (siehe beispielsweise Beijersbergen van Henegouwen et al., Fat Sc. Technol. 94 (1992), 24–27).
Um Palmitatderivate von Vitamin A oder Vitamin E zu aktivieren, ist die Verwendung einer geeigneten Lipase eine offensichtliche Wahl. Man kann erwarten, dass viele der kommerziell erhältlichen lipolytischen Enzyme diese Vorstufenmoleküle zu aktivem Vitamin und Palmitinsäure hydrolysieren können. Die Verwendung einer Lipase in Kosmetikanwendungen hat jedoch einige schwerwiegende Nachteile, einschließlich des Abbaus von Ölen, die in Kosmetikzusammensetzungen vorliegen, und des Abbaus eines erheblichen Anteils der schützenden Lipidverbindungen, die auf menschlicher Haut vorliegen (Cosmetics & Toiletries 102 (1987), 36–42). Um diese unerwünschte Situation zu vermeiden, ist es vorteilhaft, wenn man Acetat- an Stelle von Palmitatderivaten der entsprechenden Vitamine verwendet, wodurch Enzyme verwendet werden können, die selektiv die Acetateinheit der Vitaminvorstufe entfernen können, ohne Hautlipide anzugreifen.
Beispielsweise haben bestimmte Esterasen/Lipasen eine Präferenz für kurze Acylketten (2–10 Kohlenstoffatome) und können keine längeren (≥ 16 Kohlenstoffatome) Fettacylgruppen hydrolysieren. Solche Esterasen sind beispielsweise von Recombinant Biocatalysis Inc. (Philadelphia, USA) kommerziell erhältlich. Zusätzlich sind Xylanacetylesterase (vgl. EP 507369 ) und Rhamnogalacturanacetylesterase (vgl. WO 93/20190) gegenüber Pflanzenzellwandkomponenten aktiv und hydrolysieren wahrscheinlich keine auf menschlicher Haut vorhandenen Lipide. Abgesehen von dieser Enzymkategorie hat man Esteraseaktivität auch bestimmten Serinproteasen zugeschrieben. Die Verwendung einer geeigneten Serinprotease bei dieser Anwendung ist vorteilhaft, weil sie die Kombination einer Hautschälwirkung mit der gleichzeitigen Umwandlung einer ausgewählten Vitaminvorstufe gestattet.
Einem anderen Vitamin, Ascorbinsäure, hat man Vorteile in der Kosmetik zugeschrieben, weil es die Melaninbildung in menschlicher Haut hemmt, die Kollagenbildung stimuliert und Antioxidansaktivität besitzt. Unglücklicherweise kann Ascorbinsäure jedoch aufgrund ihrer geringen Stabilität auf kein Kosmetikprodukt angewendet werden. Deshalb wurde Magnesiumascorbylphosphat, ein stabiles und wasserlösliches Ascorbinsäurederivat, entwickelt und wird von mehreren Firmen vertrieben. Aufgrund des Vorhandenseins von Phosphataseenzymen auf der Haut kann Magnesiumascorbylphosphat in situ in die aktive, aber instabile Ascorbinsäure umgewandelt werden. Unglücklicherweise ist die Aktivität von Phosphataseenzymen, die natürlicherweise auf der Haut vorkommen, sehr niedrig (Mima et al. Vitamins 41 (1970), 387). Das erfindungsgemäße Abgabesystem ermöglicht die Kombination von Ascorbylphosphat und einer geeigneten Phosphatase zur Gewährleistung einer schnellen Bildung von Ascorbinsäure auf der Haut. Das Enzym Phytase, das die Freisetzung von Phosphat aus Inosithexakisphosphat (Phytat) katalysiert, insbesondere die Phytase von Aspergillus niger, scheint in dieser Hinsicht eine sehr geeignete Phosphatase zu sein.
Sehr ähnlich diesem Ansatz, bei dem proaktive Vitaminderivate durch In-situ-Entfernung der stabilisierenden Einheit des Derivats aktiviert werden, können andere Typen von Vorstufenmolekülen enzymatisch modifiziert werden. Mehrere glycosylierte natürliche Farbstoffe sind bekannt, einschließlich Anthocyaninen und Carminrot von Lebensmittelqualität. Wie von Blom (Food Chemistry 12 (1983), 197–204) beschrieben, führt die Kombination einer β-Glucosidase und eines roten Anthocyaninpigments zu einem wasserunlöslichen gefärbten Aglycon. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabesystems wird das Aglycon bei der Abgabe und beim Mischen einer Zusammensetzung, die stabilisiert β-Glucosidase enthält, und einer geeigneten Kosmetikzusammensetzung, die ein rotes Anthocyanin enthält, gebildet. Aufgrund seiner erhöhten Hydrophobie haftet das Aglycon fester an hydrophoben Oberflächen, wie Haut und Haar, und wird daher durch Wasser weniger effizient von diesen Oberflächen entfernt.
Andere enzymatische Ansätze zielen auf die Erzeugung reaktiver Farbstoffe zur oxidativen Färbung von Haar unter Verwendung des erfindungsgemäßen Abgabesystems. Dazu wird eine stabilisierte Laccase-Zusammensetzung mit einer geeigneten Zusammensetzung, die eine Farbstoffvorstufe beispielsweise einer Mono- oder Polyphenolverbindung (siehe z.B. FR 2,694,018 ; EP 504005 ), enthält, kombiniert.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem wird auch vorteilhaft für die peroxidasevermittelte In-situ-Bildung bakterizider Verbindungen verwendet. Das getrennte Enthalten der stabilisierten Peroxidase einerseits und geeigneter Vorstufenmoleküle, gegebenenfalls mit Reinigungsmitteln, andererseits, ist für die Anwendung bestimmter Bakterizide mit einer begrenzten Dauer der bakteriologischen Aktivität essenziell (vgl. US 4,476,108 , US 4,588,586 ). Typische Beispiele für solche natürlich vorkommenden bioziden Verbindungen sind hypohalogenige Säuren, die durch Haloperoxidasen aus Wasserstoffperoxid und Halogeniden erzeugt werden, und Hypothiocyanat, das durch Lactoperoxidasen aus Wasserstoffperoxid und Thiocyanat erzeugt wird. In allen Fällen ist Wasserstoffperoxid eine wesentliche, aber instabile Vorstufe.
Wasserstoffperoxidlösungen können in die zweite wässrige Zusammensetzung im erfindungsgemäßen Abgabesystem durch Verwendung von Stabilisatoren, wie Natriumstannat oder Phosphonsäure (z.B. Dequest 2010), stabil eingebracht werden. Diese Stabilisatoren werden vorzugsweise mit einem geeigneten viskos machenden Mittel, wie Carbopol 934 oder Rheovis CRXCA (Allied Colloids), kombiniert. Bei diesem Ansatz enthält die erste Zusammensetzung das stabilisierte Enzym und sämtliche mit Wasserstoffperoxid inkompatiblen Chemikalien.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem gestattet auch die enzymatische In-situ-Erzeugung von Wasserstoffperoxid durch ein Wasserstoffperoxid erzeugendes Enzym, beispielsweise eine Alkoholoxidase. Das Wasserstoffperoxid erzeugende Enzym wird in die gleiche Zusammensetzung wie die Peroxidase eingebracht. Diese Form schwacher Desinfektion, gegebenenfalls in Kombination mit Reinigung, ist nicht nur auf dem Gebiet der topischen Anwendung zur Bekämpfung von Ekzem oder Akne, sondern auch bei Anwendungen, wie Kontaktlinsenreinigung und Reiniger für harte Oberflächen im Haushalt, ein Thema.
Die In-situ-Erzeugung von Lipoperoxidasen ist ein weiteres Beispiel für die Verwendung des erfindungsgemäßen Spenders. Dazu sind eine stabilisierte Lipoxyggenase-Zusammensetzung und eine 1inolensäurehaltige Zusammensetzung getrennt enthalten und werden beim Abgeben gemischt. Es ist ebenfalls möglich, Lipoxygenase und Linolensäure in einer Zusammensetzung zu formulieren, weil die zur Stabilisierung des Enzyms verwendete hohe Polyolkonzentration zusätzlich die Inaktivität des Enzyms gewährleistet. In situ erzeugte Lipoperoxide eignen sich zur topischen Anwendung, z.B. zum Enthaaren oder zur Hemmung des Haarwachstums (Puig Muset et al., Arzneimittel & Forschung, 10 (1960), 234–239).
Es ist ebenfalls möglich, eine erste Zusammensetzung, die ein Enzym umfasst, mit einer zweiten Zusammensetzung, die einen zusätzlichen Wirkstoff umfasst, zu kombinieren, wobei der zusätzliche Wirkstoff bei der in Frage kommenden Anwendung ebenfalls eine gewünschte Aktivität aufweist. Beispielsweise kann eine Synergie zwischen dem Enzym und dem zusätzlichen Wirkstoff bestehen.
Für eine völlig andere Anwendung als die topische Anwendung, d.h. zur Brotherstellung, wird ein Spender verwendet, der Backenzyme, z.B. Amylasen, Hemicellulasen, Proteindisulfidisomerase, Lipoxygenase und andere Redoxenzyme, einerseits und zusätzliche Bestandteile eines flüssigen Brotverbesserers andererseits kombiniert, wobei die geeigneten Enzymsubstrate im Teig vorhanden sind.
Ein Beispiel für eine Kombination, die eine Synergie erzeugen kann, ist die Kombination einer Protease und eines keratinolytischen Mittels, wie einer α-Hydroxysäure. Die so genannten Fruchtsäuren (α-Hydroxysäuren oder AHAs) sind in der Kosmetikindustrie als Substanzen aufgekommen, die Hautschälung induzieren und so Vorteile hinsichtlich der Alterungsbekämpfung erzielen können. Ein Nachteil ist, dass die niedrigen pH-Werte, die für hohe Zellerneuerungsraten erforderlich sind, von Reizungsphänomenen begleitet sind (siehe Smith, W. P., Cosmetics & Toiletries Bd. 109, S. 41–48, 1994). Um die Reizung zu minimieren, kann entweder die Senkung der AHA-Konzentration oder die Erhöhung des pH der Kosmetikzusammensetzung eine Strategie sein, wobei die verringerte Hautschälwirkung durch Zugabe eines proteolytischen Enzyms zur Zusammensetzung kompensiert wird.
Ein weiteres Beispiel findet man auf dem Gebiet der Zahnpflegeprodukte. Seit der Einführung von Zahnputzmitteln mit Fluoridverbindungen wurde das Auftreten von Zahnkaries aufgrund der fluoridvermittelten Verstärkung der Zahnschmelzschicht drastisch verringert. Dadurch verbleibt das Bakterium Streptococcus mutans, das in Zahnplaque wächst, als eine der hauptsächlichen restlichen Ursachen von Karies. Wirksame Entfernung von S. mutans ist nur möglich durch Auflösen der schützenden und wasserunlöslichen Polysaccharidmatrix, durch die S. mutans am Schmelz haftet (siehe beispielsweise Hamada und Slade, Microbiol. Rev. 44 (1980), 331–384). Wie in US 4,438,093 offenbart, verhindern und unterdrücken Enzyme, wie Mutanase und Dextranase, die Plaquebildung. Deshalb bietet das erfindungsgemäße Enzymabgabeverfahren einen bequemen Weg, ein fluoridhaltiges Zahnputzmittel mit einer polyolstabilisierten, polysaccharidabbauenden Enzymzusammensetzung zu kombinieren.
Das erfindungsgemäße Abgabesystem kann bei anderen Anwendungen als der topischen Verabreichung vorteilhaft eingesetzt werden. Ein Beispiel sind Wäscherei-Handwäsche-Anwendungen für empfindliche Stoffe, wie Wolle. Bei dem erfindungsgemäßen Abgabesystem sind ein einfaches flüssiges Detergenz und eine stabilisierte Enzymzusammensetzung getrennt enthalten und werden in dem gewünschten Verhältnis gleichzeitig abgegeben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen.
1 zeigt die proteolytische Aktivität einfacher und verdünnter wässriger Protease-Zusammensetzungen. Die proteolytische Aktivität wird als klarer Fleck auf gelatinebeschichteten Filmplatten gemessen.
2 zeigt die proteolytische Aktivität verschiedener Proteasen bei einem pH von 4 und 7 und in Gegenwart von α-Hydroxysäuren.
3 zeigt eine Abgabepumpe, in der zwei Zusammensetzungen getrennt enthalten sind. Die zwei Zusammensetzungen werden gleichzeitig abgegeben und können innerhalb der Abgabepumpe gemischt oder getrennt abgegeben und in situ gemischt werden.
Beispiel 1
Lagerungsstabilität von Proteasen in Zusammensetzungen, die verschiedene Arten von Polyolen umfassen
Um die Lagerungsstabilität verschiedener neutraler Proteasen in verschiedenen Arten von Polyolen zu veranschaulichen, wurden partiell gereinigte Proteasen aus verschiedenen Quellen in Flüssigkeiten gelöst, die entweder 70% (w/w) Butylenglycol, Propylenglycol oder PEG 6000 enthielten, und bei entweder 5°C, 25°C oder 40°C aufbewahrt. In unterschiedlichen Zeitabständen nach Verdünnung in wässrigem Puffer wurden die verbleibenden Enzymaktivitäten gemessen.
Verwendete Enzyme
Serinprotease-Pulver von Bacillus licheniformis wurde von Genencor International, Brügge, Belgien, erhalten.
Nichtstandardisierte neutrale Protease (Metalloprotease von Bacillus amyloliquifaciens) wurde von Gist-brocades, Séclin, Frankreich, erhalten.
Stabilisierte Enzymformulierungen, die entweder Serinprotease oder neutrale Protease enthielten, wurden durch Lösen der erforderlichen Mengen an Enzympulver in entweder 70% (w/w) Butylenglycol (1,3-Butandiol; BG), Propylenglycol (1,2-Propandiol; PG) oder PEG 6000 (Polyethylenglycol 6000; PEG) hergestellt. Zu jeder Lösung wurde für maximale Enzymstabilität Calciumacetat pH 6,0 bis zu einer Konzentration von 0,1% hinzugefügt. Jeder erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt, wonach die verschiedentlich stabilisierten Enzymlösungen bei entweder 5°C, 25°C oder 40°C aufbewahrt wurden. In unterschiedlichen Zeitabständen wurden Proben entnommen und hinsichtlich der verbleibenden Aktivität von Serin- und neutraler Protease getestet. Die mehr als tausendfache Verdünnung der polyolhaltigen Enzymformulierungen im Proteasetest gewährleistete das Fehlen von nicht mit Protease zusammenhängenden Wechselwirkungen chemischer Verunreinigungen.
Die Enzymaktivitäten wurden gemäß dem Gist-brocades-Protokoll für die Aktivität von neutraler Protease bestimmt. Dieses Verfahren (ISL-Verfahren Nummer 61195) ist von Gist-brocades Delft auf Anfrage erhältlich. Kurz gesagt, erfolgt das Verfahren wie folgt:
Eine stark verdünnte Enzymlösung wird zu einer Lösung von 0,3% Hammersten-Casein bei 40°C, pH 7,0, gegeben. Nach Inkubation für 60 Minuten wird die Proteaseaktivität durch Zugabe von TCA abgestoppt. Nach gründlichem Mischen und einer zusätzlichen Inkubation bei 4°C für 30 Minuten werden die Proben zentrifugiert. Die Extinktion des klaren Überstands wird bei einer Wellenlänge von 275 nm gegen destilliertes Wasser gemessen. Durch Vergleich mit Bezugs-Proteaseproben wird die endgültige Proteaseaktivität erhalten.
Schlussfolgerungen

– In entweder 70% Butylenglycol oder Propylenglycol gelöste Serinprotease ist stabiler als neutrale Protease.
– Butylenglycol und Propylenglycol sind bei der Enzymstabilisierung PEG 6000 klar überlegen.

Tabelle 2. Serinprotease
Tabelle 3. Neutrale Protease
Beispiel 2
Reaktivierung von Protease aus einer stabilisierten Formulierung
Materialien
Neutrale Protease B. amyloliquefaciens, nichtstandardisiert, wurde von Gist-brocades, Séclin, Frankreich, erhalten.
Stabilisierte Enzymformulierung
Herstellung: Nach Mischen des viskos machenden Mittels Hydroxypropylcellulose mit Propylenglycol wird Wasser, in dem das Enzym gelöst ist, hinzugefügt und über Nacht gemischt.
Wässrige Formulierung
Herstellung: Hydroxypropylcellulose und Propylenglycol werden gemischt, anschließend zum Wasser gegeben und über Nacht gemischt.
Eine bestimmte Menge der stabilisierten Proteaseformulierung (einfach oder mit der wässrigen Formulierung verdünnt) wird auf eine Agfapan-25-Filmplatte punktförmig aufgetragen. Ist das Enzym aktiv, wird die Gelatine auf der Filmplatte proteolysiert, und es verbleibt ein mehr oder weniger klarer Fleck. Dieser Test ahmt die Fähigkeit der Protease nach, die raue Oberschicht aus Keratin in vivo abzubauen.
Nach Inkubation der Filmplatte mit der einfachen stabilisierten Proteaseformulierung wird kein klarer Fleck beobachtet, was zeigt, dass die Protease aufgrund der hohen Polyolkonzentration inaktiv ist. Eine 1:1- und eine 1:2-Verdünnung der stabilisierten Proteaseformulierung mit der vorstehenden wässrigen Formulierung, die Propylenglycolkonzentrationen von 26% bzw. 18% ergeben, führen zu einem klaren Fleck mit einem Durchmesser, der mit dem Verdünnungsfaktor zunimmt, was die Reaktivierung der Protease zeigt (siehe 1). Obwohl die 1:1-Verdünnung bereits zu einer partiellen Reaktivierung der Protease führt, ist die Polyolkonzentration immer noch zu hoch, als dass sie für die topische Verwendung annehmbar wäre.
Eine unstabilisierte Enzymzubereitung, d.h. ohne Propylenglycol, erschien innerhalb von etwa einer Woche inaktiv zu sein.
So sind erfindungsgemäß stabilisierte Enzyme im Wesentlichen inaktiv, bis sie durch Verdünnen mit einer geeigneten Zusammensetzung reaktiviert werden.
Beispiel 3
Proteolytische Aktivität in Zusammensetzungen, die verschiedene α-Hydroxysäuren umfassen
Dieses Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit einer Reihe proteolytischer Enzyme unter sauren Bedingungen in Gegenwart von α-Hydroxysäuren (AHAs). Die proteolytische Aktivität wurde auf fotografischem Gelatinefilm getestet.
Verwendete Enzyme und Materialien
Serinprotease-Pulver von Bacillus licheniformis wurde von Genencor International, Brügge, Belgien, erhalten und in einem Gemisch von 35% (w/w) Butylenglycol, 35% (w/w) Glycerin, 0,1% (w/w) Ca(Ac)₂ pH 6,0 und Wasser gelöst. Die Enzymaktivität in Lösung wurde derart eingestellt, dass eine Aktivität von etwa 500 neutrale Protease-Einheiten bei 37°C, pH 7,0, erhalten wurden (siehe Beispiel 1).
Aspartatproteinase-Flüssigkeit von Rhizomucor miehei (210000 Milchgerinnungseinheiten/ml) wurde von Gist-brocades, Séclin, Frankreich, erhalten.
Cysteinproteinase-Pulver aus Papayafrüchten (60 Millionen Papaineinheiten/Gramm, gemäß Food Chemical Codex III getestet) wurde von Gist-brocades, Séclin, Frankreich, erhalten. Vor Gebrauch wurde eine Cysteinproteinase-Lösung durch Lösen von 20 mg Enzympulver in 2 ml entmin. Wasser frisch hergestellt.
AHA-Stammlösungen wurde gemäß dem folgenden Protokoll hergestellt. Fünf Gramm L-Milchsäure (Boom Chemie, Niederlande) und fünf Gramm Glycolsäure (Merck, Deutschland) wurden jeweils in 80 ml Wasser gelöst, mit 25% NaOH auf pH 4,0 eingestellt, danach wurde Wasser bis auf 100 ml hinzugefügt, so dass 5%ige Lösungen von L-Milchsäure bzw. Glycolsäure erhalten wurden. Fünf Gramm Salicylsäure (Acros, Belgien) wurden in 80 ml Wasser gelöst und mit 25% NaOH auf pH 4,4 eingestellt (Lösen bei pH 4,0 war nicht möglich), danach wurde Wasser auf 100 ml hinzugefügt, so dass eine 5%ige Salicylsäurelösung erhalten wurde.
Phosphatpuffer pH 7,0 und Citrat-HCl-Puffer pH 4,0 wurden von Merck, Deutschland, erhalten.
Experiment
Fünf Glasgefäße, die 0,1 Gramm Serinprotease-Lösung enthielten, fünf Glasgefäße, die 0,1 Gramm Aspartatproteinase enthielten, und fünf Glasgefäße, die 0,1 Gramm Cysteinproteinase-Lösung enthielten, wurden hergestellt.
Zu jeder Reihe von fünf Gefäßen wurden 0,9 ml Puffer pH 7,0, Puffer pH 4,0, 5% L-Milchsäure, 5% Glycolsäure bzw. 5% Salicylsäure gegeben. Nach Mischen von Enzym und Puffer oder Säure wurde eine 40-Mikroliter-Probe aus jeder der fünfzehn Lösungen in einer Matrix auf Agfapan-APX100-Fotografiefilm aufgetragen. Der Film mit den Proben wurde dann für 1 Stunde in einer befeuchteten und abgedeckten Petrischale bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde der fotografische Film ausgiebig mit Leitungswasser gespült und getrocknet. Entfernen der Gelatineschicht wurde als Maß für proteolytische Aktivität verwendet.
Aus den erhaltenen Ergebnissen (siehe 2) ergab sich, dass Serinprotease entweder in An- oder Abwesenheit der verschiedenen AHAs nur um pH 7,0 und nicht bei pH-Werten um 4,0 aktiv war.
Dagegen war Aspartatproteinase bei pH 7,0 oder pH 4,4 in Anwesenheit von Salicylsäure nicht aktiv, das Enzym war mit oder ohne 5% L-Milchsäure oder 5% Glycolsäure bei pH 4,0 voll aktiv.
"Cysteinproteinase ist in Gegenwart von entweder L-Milch-, Glycol- oder Salicylsäure bei pH 7,0 und bei niedrigeren pH-Werten aktiv. Überraschenderweise wurde eine niedrige proteolytische Aktivität bei pH 4,0 in Abwesenheit jeder der AHAs gemessen.
Schlussfolgerungen

– In Kombination mit niedrigen pH-Werten und AHAs sind Aspartatproteinasen gegenüber Serinproteasen bevorzugt.
– Cysteinproteinase aus Papaya zeigt sowohl bei neutralen als auch sauren pH-Werten proteolytische Aktivität.
– Je nach den Bedingungen sollte das am besten geeignete Enzym gewählt werden.

Beispiel 4
Enzymatische Aktivierung von Ascorbylphosphat
Drei verschiedene Enzyme mit dokumentierter Phosphataseaktivität wurden in 70% Propylenglycol formuliert und unter verschiedenen Bedingungen mit Magnesiumascorbylphosphat inkubiert. Die Dephosphorylierung von Magnesiumascorbylphosphat wurde unter Verwendung von 600-MHz-Protonen-NMR quantifiziert.
Enzyme
Phytase (Aspergillus niger; ohne Glycerin, mit etwa 12000 FTU/Gramm) sowie saure Phosphatase (Aspergillus niger; lyophilisiertes Pulver mit etwa 10000 Einheiten/Gramm) wurden von Gist-brocades, Delft, Niederlande erhalten.
Kartoffelphosphatase (lyophilisiertes Pulver) wurde von Sigma erhalten.
Experiment
In einer Flüssigkeit, die 70% (w/w) Propylenglycol in D₂O und 2 mmol/l EDTA (pH 7–8) enthielt, wurde etwa 1% (w/w) jeder der vorstehend genannten Enzymzubereitungen gelöst.
Eine zehnfache Verdünnung dieser Enzymstammlösungen in D₂O, das 1% (w/w) Magnesiumascorbylphosphat (NIKKO Chemicals Co., Japan) enthielt, die unter Verwendung von Essigsäure auf pH 5,0 gepuffert und bei 37°C gehalten wurde, führt zu 50%igem Abbau von Magnesiumascorbylphosphat in einem Zeitraum von 4 Stunden.
Aufbewahrung der Enzymstammlösung mit 70% Propylenglycol bei 37°C für 1 Woche beeinflusste die Enzymaktivität in diesem Test nicht merklich.
Die Kombination von Enzym und Substrat in Gegenwart von 70% (w/w) Propylenglycol zeigte deutlich die Inaktivität des Enzyms unter diesen Bedingungen. Ausgehend von einer Stammlösung mit 5% (w/w) Magnesiumascorbylphosphat in D₂O wurde ein Gemisch hergestellt, das Folgendes enthielt:

– 70% (w/w) Propylenglycol
– 1% (w/w) Magnesiumascorbylphosphat
– 2 mmol/l EDTA
– pH 7–7,5

Nach vollständigem Lösen (während dessen sich eine gelartige Struktur bildete) wurden 1% (w/w) (vorgelöstes) saure Phosphatase- und Kartoffelphosphatase-Enzym hinzugefügt. Das erhaltene Gemisch wurde für 1 Woche bei 37°C inkubiert, wonach die Konzentration an hydrolysiertem Magnesiumascorbylphosphat gegen eine ähnliche Probe, die kein Enzym enthielt, gemessen wurde.
Da keine enzymatische Hydrolyse nachgewiesen werden konnte, zeigt dies einmal mehr das Fehlen von enzymatischer Aktivität in Anwesenheit hoher Polyolkonzentrationen.
Beispiel 5
Leistung von Phytase hinsichtlich der Magnesiumascorbylphosphat-Hydrolyse unter Anwendungsbedingungen
Es wird gezeigt, dass Phytase (NatuPhos^® 5000L, Gist-brocades, Delft, Niederlande) unter Anwendungsbedingungen wirksam ist. Im Test wurden 2 ml 1% Magnesiumascorbylphosphat in 100 mM Na-Acetat pH 6,0 mit 200 μl Enzymlösung gemischt. Die Enzymlösung wurde durch Verdünnen von NatuPhos^® 5000L eins zu fünf in einer Lösung, die 70% Glycerin enthielt, (um 377 U/g Magnesiumascorbylphosphat zu erhalten; 1 U ist die Enzymmenge, die 1 μmol Phosphat pro Minute aus 1% Vitamin-C-phosphat bei pH 6,0 und 30°C freisetzt) erhalten. Nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde die Umsetzung durch Zugabe von 1 ml 20% TCA beendet.
Die Umwandlung von Magnesiumascorbylphosphat wurde durch Messen der Phosphatkonzentration unter Verwendung von ³¹P-NMR verfolgt. Es konnte gezeigt werden, dass bei 30°C eine 85%ige Umwandlung von Magnesiumascorbylphosphat innerhalb von 30 Minuten erhalten wurde. Bei 37°C wurde eine Umwandlung von 89% im gleichen Zeitraum erhalten. Nach 60 min Inkubation steig die Ausbeute auf etwa 90%. Die zur vollständigen Umwandlung innerhalb von 30 Minuten benötigte Mindestaktivität betrug 122 U/g Vitamin-C-phosphat.
Beispiel 6
Enzymatische Erzeugung von Wasserstoffperoxid
Alkoholoxidase- (Hansenula spec., von Sigma) Pulver mit niedriger Katalasekonzentration wurde in Wasser gelöst, anschließend wurde Glycerin hinzugefügt, um eine Glycerinendkonzentration von 60% (w/w) zu erhalten. Nach Aufbewahrung dieser stabilisierten Enzymlösung für einen Monat bei Raumtemperatur wurde die Enzymlösung in einer wässrigen Lösung, die 2% Ethanol uns 0,01 M Phosphat pH 7 enthielt, zehnfach verdünnt. Die Bildung von Wasserstoffperoxid wurde durch eine grünblaue Farbe gezeigt, die sich beim Eintauchen eines Perid-Teststreifens (Boehringer, Mannheim, Deutschland) in die wässrige Ethanollösung entwickelte. Das so erzeugte Wasserstoffperoxid kann anschließend als Substrat für eine Peroxidase verwendet werden.
Durch Einbringen eines Wasserstoffperoxid erzeugenden Enzyms und einer geeigneten Peroxidase, wie Lactoperoxidase (Sigma), in eine stabilisierende Flüssigkeit in den einem Behälter und der erforderlichen Enzymvorstufen in den anderen Behälter wird die aktive Biozidverbindung nach Mischen des Inhalts der beiden Behälter gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten.
Beispiel 7
Desacetylierung von Vitamin-A-acetat
Enzyme
Piccantase-Konzentrat (Rhizomucor miehei, mit etwa 30000 BGLE/g) wurde von Gist-brocades, Sélin, Frankreich, erhalten.
Maxatase, rein (Bacillus subtilis, mit etwa 2,16 BYU/kg) wurde von Genencor International B. V., Delft, Niederlande, erhalten.
G999 Phospholipase L (Aspergillus niger, mit etwa 1000 U/g) wurde von Enzyme Bio-Systems Ltd., Englewood Cliffs, NJ, U.S.A., erhalten.
Xylanacetylesterase (A. niger-Transformante TrA10, wie in EP0507369 beschrieben und durch hinterlegte Mikroorganismen erhältlich). Nach Verdünnen wurde die Transformante TrA10 auf einem Kulturmedium gezüchtet, das 30 Gramm Sojabrei pro Liter enthielt, um die Enzymaktivität zu induzieren. Nach 48 Std. bei 30°C unter Belüftung und einem Mindest-pH-Wert von 4,0 wurde die Fermentationsbrühe zentrifugiert, und der Überstand wurde filtriert. Die erste Filtration erfolgte über Seitz-K700-Filter, die zweite Filtration über Seitz-Supra-250-Filter und die Keimfiltration über Seitz-Supra-EKS. Die erhaltene Flüssigkeit wurde unter Verwendung von Ultrafiltration um einem Faktor 10 konzentriert, wonach das Konzentrat lyophilisiert wurde. Die Xylanacetylesterase-Aktivität im endgültigen Pulver wurde zu etwa 300 Einheiten/Gramm Pulver bestimmt.
Retinolacetat-Hydrolyse
Enzymlösungen wurden durch Lösen von 6 Milligramm Enzympulver (d.h. Piccantase, Maxatase und Xylanacetylesterase) in einem Milliliter entmin. Wasser hergestellt. Von der flüssigen G999-Zubereitung wurden 16 Milliliter in einem Milliliter entmin. Wasser verdünnt. Eine Stammlösung von Retinolacetat (Sigma) wurde durch Lösen von 55 Milligramm Retinolacetat in einem Milliliter Methanol hergestellt.
Die Enzyminkubationen erfolgten durch Zugabe von 100 Mikroliter Phosphatpuffer pH 5,5, 100 Mikroliter Enzymlösung und 200 Mikroliter Retinolacetat-Stammlösung zu 500 Mikroliter entmineralisiertem Wasser. Nach Mischen wurden die verschiedenen Lösungen unter Argon bei 37°C für entweder 1 oder 4 Std. inkubiert. Anschließend wurden die Lösungen lyophilisiert, und deuteriertes Chloroform (Merck, Deutschland) wurde hinzugefügt. Die Entfernung des Acetatteils von Retinolacetat wurde unter Verwendung von 600-MHz-Protonen-NMR gemessen.

–: = keine Hydrolyse;
0: = nachweisbare Hydrolyse;
+: = signifikante Hydrolyse;
++: = vollständige Hydrolyse

Lipidhydrolyse
Bei einigen Anwendungen veresterter Vitamine ist die Reaktivierung der Vitamine durch Enzyme mit lipolytischen Aktivitäten weniger wünschenswert. Zum Beispiel sollte während der Reaktivierung von Vitaminvorstufen, die in Kosmetika enthalten sind, enzymatischer Abbau der im Kosmetikprodukt enthaltenen Öle vermieden werden. In dieser Hinsicht wäre es vorteilhaft, vitaminaktivierende Enzyme ohne abbauende Wirkung gegenüber Triglyceridölen zu verwenden. Um die triglyceridabbauende Wirkung der vorstehend genannten retinolacetatabbauenden Enzyme festzustellen, wurden drei aktive Enzyme einem Test unterzogen, in dem die Hydrolyse von emulgiertem Olivenöl quantifiziert wurde.
Eine Emulsion von Olivenöl in Polyvinylalkohol und Wasser wurde hergestellt. Es treten keine Öltröpfchen auf, die größer als 10 Mikron sind. Nach Zugabe der Enzymlösung wird der pH-Abfall, der durch die enzymatische Freisetzung von Fettsäuren hervorgerufen wird, durch eine stetige Titration mit Natriumhydroxid kompensiert. Nach einer festgelegten Inkubationszeit bei pH 7,5 und 37°C wird die Gesamtmenge an verwendetem Natriumhydroxid gemessen und als (relativer) Wert für die lipolytische Aktivität verwendet. Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind im Dokument CQA 4047 beschrieben und können von Gist-brocades, Séclin, Frankreich, auf Anfrage erhalten werden.
Schlussfolgerung

– Verschiedene Enzyme, einschließlich Lipasen, können Vitamin-A-acetat desacetylieren.
– Sowohl G999 als auch Xylanacetylesterase sind von besonderem Interesse, weil diese Enzyme eine Desacetylierungsaktivität mit sehr niedriger lipolytischer Aktivität kombinieren. Die natürlichen Substrate dieser Enzyme (d.h. Lysophospholipide und acetylierte Xylane) kommen außerdem auf der menschlichen Haut gewöhnlich nicht vor.

Beispiel 8
Suspension von kristalliner Protease
In Mehrfachdosisabgabesystemen ist die richtige Suspension des immobilisierten und stabilisierten Materials wichtig, damit eine gleichmäßige Dosierung des Wirkstoffs in der endgültigen Zusammensetzung gewährleistet ist. Das Suspensionsverfahren sollte Langzeitaufbewahrung ohne Absetzen des immobilisierten Wirkstoffs gestatten.
Materialien
ChiroCLEC-BL, eine wässrige Lösung vernetzter Protease- (Subtilisin-) Kristalle, von Altrus Biologics Inc., Cambridge, MA, USA erhalten.
Carbopol-Ultrez-10, ein viskos machendes Polymer, wurde von BF Goodrich, Den Haag, Niederlande, erhalten.
Aus einer homogenen wässrigen Suspension von ChiroCLEC-BL wurde eine Probe von 4,8 Gramm entnommen und zentrifugiert, um das kristalline Material zu gewinnen. Nach Entfernen des Überstands wurden die Kristalle ein Mal in entmineralisiertem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert, danach wurden die Kristalle in einer endgültigen Menge von 10 Gramm einer Zusammensetzung, die 35% Glycerin, 35% Butylenglycol und 0,4% Carbopol enthielt, suspendiert. Der pH der erhaltenen Suspension wurde unter Verwendung von Triethanolamin auf 5,5 eingestellt.
Nach gründlicher Homogenisierung wurde die Suspension bei 40°C untergebracht. Kein Absetzen der Kristalle wurde nach einmonatiger Inkubation bei dieser Temperatur beobachtet. Die endgültige Verdünnung der Enzymsuspension stellt die enzymatische Aktivität wieder her.
Beispiel 12
Abgabesysteme
Abgabesysteme, die sich zur gleichzeitigen Dosierung von zwei getrennt enthaltenen inkompatiblen Verbindungen eignen, sind wohlbekannt. Als solches ist das in 3 schematisch dargestellte Abgabesystem (Spender von Maplast, Italien) nur ein Beispiel einer Reihe von Produkten, die von kleinen, zweikammerigen Beuteln zur Einmalverwendung bis zu Schläuchen, die verschiedene Produktkompartimente verwenden, oder Schläuchen, die unter Verwendung extrudierbarer, viskoser und relativ inerter Materialien kompartimentiert werden, um die unverträglichen Verbindungen zu trennen, reichen.
Der in 3 gezeigte Spender kann zwei Verbindungen, die in A und B getrennt enthalten sind, durch Drücken des Dosierkopfs C gleichzeitig dosieren. Drücken des Dosierkopfs C aktiviert zwei kleine Pumpen, die anschließend die zwei Verbindungen in etwa gleichen Volumina abgeben. Je nach der Bauweise des Dosierkopfs können die Verbindungen in zwei getrennten Strömen oder in nur einem Strom dosiert werden.
Erfindungsgemäß ist eine Abgabevorrichtung erforderlich, die eine stabilisierte wässrige Enzymzusammensetzung zusammen mit einer kein Enzym enthaltenden Basiszusammensetzung in einem Verhältnis von beispielsweise 1:2 abgeben kann.
Auf den in 2 gezeigten Spender angewendet, bedeutet dies, dass eine der zwei Pumpen mindestens das doppelte Volumen der anderen Pumpe bei nur einmaligem Drücken des Dosierkopfs C dosieren können muss.
Angewendet auf einen zweikammerigen Beutel zur Einmalverwendung, bedeutet dies, dass die Kammer, die die Enzymzusammensetzung enthält, mindestens halb so viel Produktvolumen enthält wie die andere Kammer.
Angewendet auf einen Schlauch mit zwei Kompartimenten, bedeutet dies, dass unter gleichem Druck die Auslassöffnung für das Kompartiment, das die Zusammensetzung ohne Enzym enthält, das Hindurchtreten von mindestens doppelt so viel Produkt gestattet wie die Auslassöffnung des anderen Kompartiments.
Angewendet auf einen Schlauch, der unter Verwendung von extrudierbarem Material kompartimentiert wurde, bedeutet dies, dass die Zusammensetzung ohne Enzym im Inneren des Schlauchs in mindestens dem doppelten Volumen des enzymhaltigen Produkts vorliegt.

Claims

Abgabevorrichtung zur gleichzeitigen Abgabe einer ersten und einer zweiten wässrigen Zusammensetzung, wobei die Abgabevorrichtung eine erste Kammer, die eine erste wässrige Zusammensetzung einer stabilen Formulierung mindestens eines Enzyms in Gegenwart einer Menge mindestens eines Polyols enthält, und eine zweite Kammer umfasst, die eine zweite wässrige Zusammensetzung enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym in der ersten wässrigen Zusammensetzung in Gegenwart von zwischen 40 und 90 Gew.-% mindestens eines Polyols, bezogen auf das Gesamtgewicht der ersten wässrigen Zusammensetzung, enthalten ist, dass die zweite wässrige Zusammensetzung eine Zusammensetzung zur Reaktivierung des Enzyms ist, dass die Vorrichtung Abgabevorrichtungen umfasst, welche die gleichzeitige Abgabe der ersten und zweiten wässrigen Zusammensetzung in einem Verhältnis von etwa 1:1 bis etwa 1:50 bewirken, um eine endgültige Zusammensetzung zu erhalten, die direkt angewendet wird und eine wirksame Konzentration des reaktivierten Enzyms enthält.
Abgabesystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abgabevorrichtungen derart bereitgestellt werden, dass sie die erste und zweite Zusammensetzung in einem Verhältnis von etwa 1:2 bis etwa 1:20, vorzugsweise in einem Verhältnis von etwa 1:5 bis etwa 1:10, abgeben.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zusammensetzung eine Menge zusätzlichen Wirkstoffs enthält.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zusammensetzung zusätzlich eine Menge eines viskos machenden Mittels enthält.
Abgabesystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das viskos machende Mittel eine Verbindung ist, die ein dreidimensionales Netzwerk in einer wässrigen Zusammensetzung bilden kann.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zusammensetzung zusätzlich eine Menge eines Salzes enthält.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zusammensetzung zusätzlich eine Menge eines Enzymstabilisators enthält, der aus der Gruppe der Reduktionsmittel, Calciumsalze, Substrat- oder substratverwandten Liganden ausgewählt ist.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in Teilchenform formuliert ist.
Abgabesystem nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen eine Größe von mindestens etwa 5–10 μm besitzen.
Abgabesystem nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchenform ein Kristall ist.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchenform das auf einem festen Träger immobilisierte Enzym umfasst.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Zusammensetzung einen Wirkstoffvorläufer enthält, der ein Substrat für das Enzym ist.
Abgabesystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorläufer ein Vitaminvorläufer ist.
Abgabesystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Laccase ist und dass die Zusammensetzung eine Menge eines Farbstoffvorläufers enthält.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyol aus der Gruppe von Glycerin, Sorbit, Propylenglycol, Polyethylenglycol, Butylenglycol, Maltodextrin, Saccharose, Lactose, Glucose, Trehalose ausgewählt ist.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Polyol in der ersten wässrigen Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 50–90 Gew.-%, vorzugsweise etwa 60–80 Gew.-%, vorhanden ist.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Protease ist.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Esterase mit einer Präferenz für Acylgruppen mit kürzerer Kette ist.
Abgabesystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase eine Präferenz für Acylgruppen mit kürzerer Kette hat, die 2 bis 10 Kohlenstoffatome besitzen.
Abgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Phosphatase ist.
Abgabesystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Phosphatase eine Phytase ist.
Verwendung eines Abgabesystems nach einem der Ansprüche 1 bis 21 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur topischen Anwendung eines Enzyms geeignet ist.