EP1221948A2 - Verwendung von zusammensetzungen zur pflegenden behandlung der haut - Google Patents

Verwendung von zusammensetzungen zur pflegenden behandlung der haut

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EP1221948A2
EP1221948A2 EP00971338A EP00971338A EP1221948A2 EP 1221948 A2 EP1221948 A2 EP 1221948A2 EP 00971338 A EP00971338 A EP 00971338A EP 00971338 A EP00971338 A EP 00971338A EP 1221948 A2 EP1221948 A2 EP 1221948A2
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EP
European Patent Office
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inhibitor
skin
acid
inhibitors
use according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00971338A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andrea SÄTTLER
Thomas Förster
Kordula Schlotmann
Albrecht Weiss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Henkel AG and Co KGaA filed Critical Henkel AG and Co KGaA
Publication of EP1221948A2 publication Critical patent/EP1221948A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists

Definitions

  • compositions for the care treatment of the skin which contain special bioactive components.
  • Skin care products are products for cleaning and care of the skin, which have the task of gently cleansing the skin, keeping it supple and supporting the skin's natural layer in its natural regenerative capacity. Since the skin is not an isolated organ, but is connected to other layers of tissue in terms of function and structure, the requirements for the composition of a skin care product are very complex.
  • the cells of the homolayer (stratum corneum) on the skin surface are desquamated, while new basal cells are supplied from the stratum.
  • the protein structures (desmosomes) which are responsible for the cohesion of the cells, must be dissolved (A. Lundström, T. Egelrud, J. Invest. Dermatol. 1988, 91, 340-343 and 1990, 94, 216-220; idem, Arch. Dermatol. Res. 1990, 282, 234-237).
  • the desmosomes are broken down by proteases contained in the stratum corneum, two of which have been characterized in more detail. These are serine proteases of the chymotrypsin and trypsin type (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venereol. 1991, 71, 471-474; JP 8068791 A2).
  • Dry skin is characterized by increased desmosome structures in the uppermost layers of the stratum corneum (EP 0633765) and also by an increased desquamation of keratinocytes in the epidermis.
  • proteases have therefore been used as bioactive components in skin care products which break down the increased desmosome structures more quickly (WO 95/07688, EP 0 633 765, EP 0 719 132, EP 0 719 133, EP 0 719 134).
  • the use of dicarboxylic acids also leads to an accelerated breakdown of the desmosome structures (JP 10175844).
  • protease inhibitors are used for the treatment of skin diseases and for the pathologically accelerated formation of cells of the epidermis (JP 9025212, JP 9025214, US 5290762, EP 0 532 465).
  • the protease inhibitor trßrn_y-4- (aminomethyl) cyclohexanecarboxylic acid (tranexamic acid, t-AMCHA; cf. JP 9175986) inhibits the so-called tissue-type plasminogen activator (t-PA), a protease that is involved in fibrinolysis and only occurs in the epidermis if there is already an inflammatory complexion (J. Koyama et al., "The mechanism of desquamation in the stratum corneum and its relevance to skin care", Symposium paper No. 9, 19 * IFSCC Congress, Sidney 1996).
  • the components currently used in care products for the treatment of dry skin cannot yet influence the metabolic processes satisfactorily. For example, numerous active substances do not specifically inhibit the proteases involved in the desquamation reaction.
  • the task was to reduce the desquamation of the keratinocytes by targeted bioactive components, which inhibit proteases involved in construction, and in this way to achieve a significantly improved complexion.
  • the invention therefore relates to the use of a composition which contains at least one inhibitor for the proteinases involved in the desmosome degradation in a physiologically compatible carrier which can be distributed on the skin, for topical prophylactic and / or cosmetic treatment of dry skin.
  • Water-soluble inhibitors with a molecular weight of less than 5000 g / mol can be preferred in the sense of the invention, water solubility being understood as meaning a minimal solubility of the inhibitor of 0.001% by weight in 11 water at 25 ° C.
  • Inhibition or inhibition within the meaning of the invention is the decrease in activity (definition of enzyme activity, cf.
  • the inhibitor or the mixture of inhibitors can contain a concentration of 0.001-20.0% by weight, preferably 0.1-5% by weight
  • the physiologically compatible carrier can be, for example, an O / W or a W / O emulsion, a gel base or a suitable aqueous or alcoholic solution.
  • compositions which is characterized in that it contains at least one inhibitor which inhibits the serine pro- inhibiting teinases is preferred.
  • These proteinases contain an L-serine residue which is essential for catalysis in the active center.
  • Suitable inhibitors for the purposes of the invention are substances which modify the L-serine residue and / or block the substrate cleavage site by interaction with the L-serine residue or with amino acids from the environment and / or by changing the tertiary structure of the enzyme cause its inactivation.
  • an inhibitory effect in the sense of the invention is a decrease in the activity of the serine proteinases in the presence of the inhibitor in the vztro test and / or the reduced desquamation of keratinocytes on skin biopsies in the presence of the inhibitor.
  • composition which is characterized in that it contains at least one inhibitor which inhibits the trypsin or chymotrypsin-like serine proteinases involved in the desmosome breakdown.
  • Trypsin is an endopeptidase that arises in the small intestine from the precursor trypsinogen formed by the pancreas by splitting off a hexapeptide.
  • This serine proteinase is characterized by a negatively charged L-aspartate residue in the substrate binding pocket, which also determines the specificity of the enzyme. Trypsin cleaves peptide chains specifically on the carboxy side of the basic amino acids L-lysine and L-arginine.
  • Chymotrypsin arises in the pancreas from inactive precursors, so-called zymogens, through the action of trypsin. Chymotrypsin cleaves proteins, peptides, amino acid esters and amides specifically on the carboxy group of hydrophobic amino acids. Both types of enzyme are involved in the breakdown of protein structures (desmosomes), which are responsible for the cohesion of the horny cells in the skin.
  • An inhibitory effect in the sense of the invention is a decrease in the activity of the trypsin or chymotrypsin-like serine proteinases in the presence of the inhibitor in the -vz ' tro test.
  • boric acid or its derivatives are present as an inhibitor
  • the derivatives which can be used according to the invention include esters and salts of boric acid and C, -C 5 -alkyl- or aryl-substituted boric acid derivatives, such as, for example Phenylboronic acid and / or their mono- or diesters with C, -C 5 alkyl radicals.
  • the use of boric acid acetate or phenylboronic acid acetate can be preferred for the purposes of the invention. Boric acid and phenylboronic acid have a weak antiseptic effect.
  • phenylboronic acid is known as an inhibitor of proteolytic enzymes in order to increase their storage stability.
  • phenylboronic acid C 6 H 5 B (OH) 2
  • phenylboronic acid in the in vitro test in very low concentrations (0.1%) proved to be an extremely effective inhibitor of chymotrypsin, an enzyme which is involved in the breakdown of desmosomes.
  • boric acid and phenylboronic acid (Examples 7 and 8) proved to be inhibitors and are therefore particularly suitable for use in compositions for topical treatment of dry skin.
  • compositions which is characterized in that 4- (2-aminoethyl) phenylsulfonyl fluoride is present as an inhibitor.
  • This inhibitor Two embodiments of this inhibitor are known under the trade name Pefabloc ® and Pefabloc ® SC.
  • the substance is described as a non-toxic, irreversible and effective inhibitor of serine proteases (C. Dentan et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1299, 353-357).
  • the use of 4- (2-aminoethyl) phenylsulfonyl fluoride in compositions for the topical treatment of dry skin is suitable.
  • a composition which is characterized in that a chemical compound containing the pentapeptide sequence glycine-proline-phenylalanine-proline-leucine (GPFPL) is used as the inhibitor.
  • the pentapeptide sequence is known to be an inhibitor of serine proteinases. Claimed in For the purposes of the use according to the invention, end group-protected derivatives of this pentapeptide sequence, polypeptides, proteins and other chemical derivatives which contain this pentapeptide sequence have an inhibitory effect in the tests described overleaf.
  • Rosemary acid is known for its anti-inflammatory, cytostatic and antiviral effects.
  • rosemary acid is used as a bath additive and as an additive in hair care products.
  • rosemary acid is used together with other active ingredients as a synergistic combination of antioxidants.
  • usable derivatives are esters and salts of rosmarinic acid and C r C 5 includes alkyl or aryl esters. Almost complete inhibition of trypsin was observed in z ' w-vz ' tro tests using 0.05% rosemic acid (Example 5). When using 1.0% rosemary acid, the desquamation of the skin can be reduced by almost 70% (Example 11).
  • composition which is characterized in that the Elhibin Leguminosesamen obtained from a special procedure ® (Pentapharm AG) is contained as inhibitor.
  • Elhibin ® inhibits leukocyte elastase and fibroblast elastase, which are involved in inflammatory and aging processes of the skin.
  • the active ingredient is used in skin cosmetics to improve the general appearance of the skin.
  • Elhibin ® almost completely inhibits both trypsin and chymotrypsin in a concentration of 0.5% (Example 6).
  • the desquamation of the corneocytes is reduced by more than 90% when using 1.0% Elhibin ® (Example 12).
  • the inhibitor active ingredients are contained in the physiologically compatible carriers customary for cosmetic formulations.
  • physiologically compatible carriers customary for cosmetic formulations.
  • the composition can be formulated as an aqueous or alcoholic solution, as a gel, oil, W / O or O / W emulsion.
  • the inhibitors can also be used in personal cleansing agents such. B. soaps, shampoos, shower rooms u. ⁇ . Are used because they reduce the desquamation induced by detergents.
  • compositions for topical, prophylactic and / or cosmetic treatment of dry skin.
  • the compositions contain, in addition to the animal and / or vegetable fats and oils, which in many cases also have a care effect, also further care components.
  • a large number of caring active ingredients which can be used for this purpose are known to the person skilled in the art. These include:
  • the fatty alcohols used can be saturated or unsaturated and linear or branched.
  • the fatty alcohols are preferably derived from natural fatty acids, and it can usually be assumed that they are obtained from the esters of the fatty acids by reduction.
  • Fatty alcohol cuts can also be used according to the invention, which can be obtained by reducing naturally occurring fats and oils, such as. B. beef tallow, peanut oil, rape oil, cottonseed oil, soybean oil, sunflower oil, palm kernel oil, linseed oil, castor oil, corn oil, rapeseed oil, sesame oil, cocoa butter and coconut oil.
  • Vitamin and vitamin precursors such as tocopherols, vitamin A, niacic acid and niacic acid amide, other vitamins of the B complex, vitamin F and especially biotin.
  • panthenol also preferred within this group of caring active ingredients are panthenol, its derivatives, in particular the esters and ethers of panthenol, and cationically derivatized panthenols. Individual representatives are, for example, panthenol triacetate, panthenol monoethyl ether and its monoacetate and cationic panthenol derivatives.
  • Mono-, di- and oligosaccharides such as glucose, galactose, fructose, mannose, fructose and lactose.
  • Plant extracts which are usually produced by extracting the entire plant, but in some cases also exclusively from flowers and / or leaves of the plant.
  • Plant extracts are particularly referred to the extracts that are listed in the table beginning on page 44 of the 3rd edition of the Guide to the Declaration of Ingredients for Cosmetics, published by the Industrie diagramischen- und Waschstoff eV (IKW), Frankfurt.
  • the extracts from almond, aloe vera, coconut, mango, apricot, lime, wheat, kiwi and melon are particularly preferred. Mixtures of several, in particular two, different plant extracts can also be present in the agents according to the invention.
  • the plant extracts mentioned As an extractant for the production of the plant extracts mentioned, u. a. Water, alcohols and mixtures thereof can be used. Among the alcohols, lower alcohols such as ethanol and isopropanol, but especially polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol and butylene glycol are preferred both as the sole extracting agent and in a mixture with water. According to the invention, the plant extracts can be used both in pure and in diluted form.
  • Honey extracts which are obtained in an analogous manner to the plant extracts and usually contain 1-10% by weight, in particular 3-5% by weight, of active substance.
  • Phospholipids for example soy lecithin, egg lecithin and cephalins, • paraffin and silicone oils; the latter include dialkyl and alkylarylsiloxanes, such as dimethylpolysiloxane and methylphenylpolysiloxane, and their alkoxylated and quaternized analogs.
  • Fatty acid and fatty alcohol esters especially the monoesters of fatty acids with alcohols with 3 to 24 carbon atoms.
  • This group of substances concerns the products of the esterification of fatty acids with 8 to 24 carbon atoms such as, for example, caproic acid, caprylic acid, 2-ethylhexanoic acid, capric acid, lauric acid, isotridecanoic acid, myristic acid, palmitic acid, palmoleic acid, stearic acid, isostearic acid, oleic acid, elaidic acid, Petroselinic acid, linoleic acid, linolenic acid, elaeostearic acid, arachic acid, gadoleic acid, behenic acid and casa acid and their technical mixtures, which, for.
  • the serine proteases trypsin and chymotrypsin (Sigma) from bovine pancreas served as a model enzyme for the inhibitory effect of the inhibitors phenylboronic acid, boric acid, N-CBZ-Gly-Pro used according to the invention -Phe-Pro-Leu, Pefabloc ® and Pefabloc ® SC (Boehringer Mannheim), rosemary acid and Elhibin ® to be tested.
  • the t-AMCHA [tr ⁇ «s-4 (ammomethyl) -cyclohexane carboxylic acid] known as a t-PA inhibitor (tissue-type 7 lasminogen activator) was used as a reference.
  • the detection of the chymotrypsin enzyme activity is carried out with a modification analogous to the information in the Sigma Quality Control Test Procerfwre data sheet for chymotrypsin.
  • 1.32 ml of reagent A were added to the test batch, and 0.1 ml of a solution of the corresponding inhibitor in reagent A (concentration series).
  • the enzyme activity was determined spectrophotometrically by converting the substrate N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (BTEE) to N-benzoyl-L-tyrosine and ethanol.
  • the absorption of the proteolytically cleaved N-benzoyl-L-tyrosine is measured at 256 nm.
  • the detection of trypsin enzyme activity is also carried out with a modification analogous to the information in the Sigma Quality Control Test rocedwre data sheet for trypsin.
  • aprotinin Reagent F
  • the inhibitors according to the invention were used here. A series of concentrations of the inhibitors in reagent E was set up for this. The enzyme activity was spectrophotographically converted from N ⁇ -benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline (BAPNA) to N ⁇ -benzoyl-DL-arginine and p-nitroaniline. determined metrically. The absorption of the proteolytically cleaved p-nitroaniline is measured at 405 nm.
  • BAPNA N ⁇ -benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline
  • the reaction kinetics were detected for 5 minutes at 25 ° C., the linear increase in absorption (A) per unit time (t) being a measure of the activity of the enzyme ( ⁇ A / ⁇ t).
  • the activity of the enzyme in the absence of a proteinase inhibitor, ( ⁇ A, / ⁇ t,) was set to 100%.
  • the activities in the presence of an inhibitor ( ⁇ A 2 / ⁇ t 2 ) were determined under analogous conditions.
  • the inhibitory effect or reduction of the enzyme activity then corresponds to: 100% - ( ⁇ A 2 / ⁇ t 2 ) / ( ⁇ A, / ⁇ t,)%.
  • Phenylboronic acid only moderately affects the activity of trypsin in the selected concentration range. In contrast, a clear, concentration-dependent inhibition of chymotrypsin is observed.
  • Example 2 Boric acid as an inhibitor in the enzyme test
  • the inhibitory effect of boric acid on trypsin and chymotrypsin is only weak in the tested concentration range. Chymotrypsin is inhibited more than trypsin at a lower boric acid concentration.
  • Example 3 4- (2-aminoethyl) phenylsulfonyl fluoride (Pefabloc * 1 SC) as an inhibitor in the enzyme set
  • Pefabloc ® SC shows a strong, concentration-dependent inhibition of trypsin and chymotrypsin in the tested concentration range.
  • Example 4 Pentapeptide sequence GPFPL as an inhibitor in the enzyme test
  • Trypsin activity is not affected by GPFPL in the selected concentration range. A specific inhibition (27%) of chymotrypsin is detected at a concentration of the inhibitor of 0.33% by weight.
  • Rosemary acid shows a strong, concentration-dependent inhibition of trypsin. The inhibition of chymotrypsin is low at the investigable, low inhibitor concentrations.
  • Example 6 Elhibin ® as an inhibitor in the enzyme test
  • test results show that the reference inhibitor t-AMCHA (comparative example 1) only inhibits trypsin in the concentration range investigated and thus differs fundamentally from the inhibitors used according to the invention. Some of the inhibitors tested here achieve effective inhibition at very low concentrations.
  • 8mm 2 pieces of skin were punched out from fresh human skin explants (from breast reduction) and treated with a mixture of detergents (Na-dodecyl sulfate, N, N-dimethyldodecylamine oxide) in the absence and in the presence of the inhibitors.
  • a mixture of detergents Na-dodecyl sulfate, N, N-dimethyldodecylamine oxide
  • the number of desquamated horn cells was determined under the microscope in a Schilling counting chamber. A decrease in the number of corneocytes indicates an inhibitory effect of the potential inhibitors tested.
  • the inhibitors were set up in the appropriate concentrations (see tables in Examples 7-12) in the incubation buffer. This consisted of 0.1 M TRIS-HCl buffer (pH 8) with 0.1% by weight Na azide and the detergents Na dodecyl sulfate (0.2 mM) and N, N-dimethyldodecylamine oxide (8 mM) and EDTA (5 mM). These incubation buffer solutions with varying concentrations of the inhibitor are referred to below as test solutions.
  • the human skin was transported in a dry, sterile petri dish on cold packs. After removal of the subcutaneous fat and connective tissue, 8 mm 2 pieces of skin were prepared using sterile punches. These were washed in sterile, physiological NaCl (0.9%) for 15-20 minutes, added to the reaction batches (1 skin piece / reaction batch) and incubated at 37 ° C. for 44 hours. After the incubation phase had ended, the reaction vessels were shaken on a vortex mixer for 30 seconds in order to detach loosely adhering Komeozyten from the skin pieces. The skin pieces were removed and the remaining dispersion was centrifuged for 8 minutes at 11,000 rpm to isolate the coma cells.
  • Phenylboronic acid was tested in various concentrations as a desquamation inhibitor.
  • the corneocyte count of the positive control was set to 100%.
  • phenylboronic acid can significantly reduce the desquamation of the comateocytes.
  • Boric acid was tested in various concentrations as a desquamation inhibitor.
  • the positive control komeocyte value was set to 100%.
  • boric acid can halve the desquamation of the comate cells.
  • the pentapeptide N-CBZ-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu was tested in various concentrations as a desquamation inhibitor.
  • the positive control komeocyte value was set to 100%.
  • Rosemary acid was tested in various concentrations as a desquamation inhibitor.
  • the positive control komeocyte value was set to 100%.
  • Rosmarinic acid also causes a concentration-dependent reduction in desquamation. When using 1.0% rosemary acid, the desquamation can be reduced to 33.8%.
  • Example 12 Elhibin ® as an inhibitor in the desquamation test
  • Elhibin ® has been tested in various concentrations as a desquamation inhibitor.
  • the positive control komeocyte value was set to 100%.
  • T-AMCHA was used as the reference substance.
  • the positive control komeocyte value was set to 100%.
  • the desquamation of the human skin caused by the detergent mixture can be drastically reduced by phenylboronic acid, boric acid, the pentapeptide Z-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu, rosemary acid and Elhibin®. Concentration-dependent effects were shown, ie the corneocyte desquamation decreases with an increase in the inhibitor concentration.
  • phospholipid e.g. Sternprime ® N10
  • preservative e.g. Phenonip ®
  • cross-linked polyacrylate e.g. Carbopol ® ETD 2020
  • the liposome gel was formulated with N-CBZ-GPFPL, Pefabloc ® , Pefabloc ® SC, phenylboronic acid, boric acid, rosemic acid and Elhibin ® (0.2% by weight) as an inhibitor.
  • dicaprylyl ether e.g. Cetiol ® OE
  • dioctylcyclohexane e.g. Cetiol ® S
  • cetearyl alcohol e.g. Lanette ® O
  • ceteareth-20 e.g. Eumulgin ® B2
  • glyceryl palmitate e.g. Monomuls ® 60-35C
  • silicone oil e.g. Baysilon ® M 350
  • preservative e.g. Phenonip ®
  • the oil-in-water cream PIT was treated with N-CBZ-GPFPL, Pefabloc ®, ® Pefabloc SC, phenylboronic, boric acid, rosmarinic acid and Elhibin ® (0.2 wt.%) Formulated as an inhibitor.
  • an emulsion concentrate was prepared by the phase inversion process (PIT) (T. Förster in Surfactants in Cosmetics, ed .: MM Rieger and LD Rhein, Marcel Dekker, New York 1997, Vol. 2, pp. 105-125, "Principles of emulsion formation ”) is between 70 and 84 ° C.
  • PIT phase inversion process
  • the hot emulsion concentrate was cooled and the inhibitor was added at 40 ° C. in the form of a 5% strength aqueous solution.
  • dicaprylyl ether e.g. Cetiol ® OE
  • decyl oleate e.g. Cetiol ® V
  • preservative e.g. Phenonip ®
  • the oil constituents were heated to 40 ° C. together with the emulsifier and the aqueous solution of the further ingredients was added with stirring.
  • PEG-7-glyceryl cocoate Manufacturer Henkel KGaA

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Abstract

Ein vielversprechendes Potential für die topische Behandlung trockener Haut ergibt sich durch Verwendung von Zusammensetzungen, die in einem auf der Haut verteilbaren, physiologisch verträglichen Träger Inhibitoren für die am Desmosomen-Abbau beteiligten Proteinasen enthalten. Die Inhibitoren tragen dazu bei Desquamationsprozesse signifikant zu reduzieren und verbessern auf diese Weise das Erscheinungsbild der Haut. Geeignete Inhibitoren sind beispielsweise Borsäure und deren Derivate, 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid (Pefabloc® und Pefabloc® SC), die Pentapeptidsequenz Glycin-Prolin-Phenylalanin-Prolin-Leucin und Derivate, die diese Pentapetidsequenz enthalten, sowie Rosmarinsäure und der aus Leguminosensamen gewonnenen Wirkstoff Elhibin®.

Description

"Verwendung von Zusammensetzungen zur pflegenden Behandlung der Haut'
Die Lehre der Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur pflegenden Behandlung der Haut, die spezielle bioaktive Komponenten enthalten.
Hautpflegemittel sind Produkte zur Reinigung und Pflege der Haut, welche die Aufgabe haben, die Haut schonend zu reinigen, geschmeidig zu halten und die Homschicht der Haut in ihrem natürlichen Regenerationsvermögen zu unterstützen. Da die Haut kein isoliertes Organ ist, sondern mit anderen Gewebeschichten in Funktion und Aufbau verbunden ist, sind die Anforderungen an die Zusammensetzung eines Hautpflegemittels sehr komplex.
Ein besonderes Anforderungsprofil ergibt sich für Pflegemittel zur Behandlung der trockenen Haut. Hierzu werden Produkte eingesetzt, die einen hohen Anteil an Pflegekomponenten enthalten, beispielsweise natürliche Fette, Öle, Wachse und verschiedene rückfettende und wasserbindende Bestandteile, die auf die Haut einen glättenden Effekt haben. In jüngster Zeit werden zur Behandlung trockener Haut vermehrt bioaktive Komponenten eingesetzt. Unter dem Begriff werden Substanzen zusammengefaßt, die in Stoffwechselprozesse des Organismus eingreifen, z. B. indem sie relevante Enzyme des Stoffwechsels aktivieren oder inhibieren. Obgleich die Entstehung trockener Haut intensiv untersucht wird (K. Kitamura, K. Yamada, A. Ito und M. Fukuda J. Soc. Cosm. Chem. Japan 1995, 29 (2), 133-145), ist über die biochemischen Prozesse der trockenen Haut und die daran beteiligten Enzyme bisher nur wenig bekannt.
Gesunde Haut wird durch ein Fließgleichgewicht, welches die mittlere Schichtdicke der Haut aufrecht erhält, ständig erneuert. Die Zellen der Homschicht (Stratum corneum) an der Hautoberfläche werden abgeschuppt, während aus dem Stratum basale neue Zellen nachgeliefert werden. Für den Abschuppungsprozeß (Desquamation) müssen die Proteinstrukturen (Desmosomen), die für die Kohäsion der Zellen verantwortlich sind, aufgelöst werden (A. Lundström, T. Egelrud, J. Invest. Dermatol. 1988, 91, 340-343 und 1990, 94, 216-220; idem, Arch. Dermatol. Res. 1990, 282, 234-237). Der Abbau der Desmosomen erfolgt über im Stratum corneum enthaltene Proteasen, von denen zwei näher charakterisiert wurden. Es handelt sich hierbei um Serin-Proteasen vom Chymotrypsin- und Trypsin-Typ (T. Egelrud et al., Acta Derm. Venereol. 1991, 71, 471-474; JP 8068791 A2).
Trockene Haut zeichnet sich durch vermehrte Desmosomenstrukturen in den obersten Schichten des Stratum corneum (EP 0633765) und auch durch eine verstärkte Abschuppung von Keratinozyten in der Epidermis aus. Zur Behandlung der trockenen Haut wurden daher beispielsweise Proteasen als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, welche die vermehrten Desmosomenstrukturen schneller abbauen (WO 95/07688, EP 0 633 765, EP 0 719 132, EP 0 719 133, EP 0 719 134). Auch der Einsatz von Dicarbonsäuren führt zu einem beschleunigten Abbau der Desmosomenstrukturen (JP 10175844).
Protease-Inhibitoren werden dagegen zur Behandlung von Hauterkrankungen und bei krankhaft beschleunigter Bildung von Zellen der Epidermis eingesetzt (JP 9025212, JP 9025214, US 5290762, EP 0 532 465). Der Protease-Inhibitor trßrn_y-4-(Aminomethyl)- cyclohexancarbonsäure (Tranexamsäure, t-AMCHA; vgl. JP 9175986) hemmt den sogenannten tissue-type-Plasminogen-Aktivator (t-PA), eine Protease, die an der Fibrinolyse beteiligt ist und nur dann in der Oberhaut vorkommt, wenn bereits ein entzündliches Hautbild vorliegt (J. Koyama et al., „The mechanism of desquamation in the stratum corneum and its relevance to skin care", Symposium paper No. 9, 19* IFSCC Congress, Sidney 1996).
Die derzeit eingesetzten Komponenten in Pflegemitteln zur Behandlung der trockenen Haut können die Stoffwechselprozesse noch nicht zufriedenstellend beeinflussen. Beispielsweise hemmen zahlreiche Wirkstoffe nicht spezifisch die an der Abschuppungs- reaktion beteiligten Proteasen. Aufgabe war es, die Abschuppung der Keratinozyten durch gezielt wirkende bioaktive Komponenten zu reduzieren, welche die am Desmosomenab- bau beteiligten Proteasen hemmen, und auf diese Weise ein deutlich verbessertes Hautbild zu erreichen.
Überraschenderweise wurde nun eine Gruppe von Inhibitoren gefunden, welche die an der Abschuppungsreaktion der Haut beteiligten Proteasen hemmen und die Keratinozyten länger im Zellverbund halten. Als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln reduzieren sie den bei trockener Haut abnorm verstärkten Abschuppungsprozeß und normalisieren so das Erscheinungsbild der Haut. Ebenso wird bei gereizter und aus diesem Grund stark abschuppender Haut ein Hautschutz erreicht.
Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung einer Zusammensetzung, die in einem auf der Haut verteilbaren, physiologisch verträglichen Träger mindestens einen Inhibitor für die am Desmosomen-Abbau beteiligten Proteinasen enthält, zur topischen prophylaktischen und/oder kosmetischen Behandlung trockener Haut. Wasserlösliche Inhibitoren mit einem Molekulargewicht kleiner als 5000 g/mol können im Sinne der Erfindung bevorzugt sein, wobei unter Wasserlöslichkeit eine minimale Löslichkeit des Inhibitors von 0,001 Gew.-% in 11 Wasser bei 25°C verstanden wird. Unter Inhibition oder Hemmung im Sinne der Erfindung wird die Aktivitätsabnahme (Definition der Enzymaktivität, vgl. Stichwort „Enzyme" in: CD Römpp Chemie Lexikon, Version 1.0, Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag 1995) des entsprechenden, aus der Haut isolierten Enzyms oder eines geeigneten Modellenzyms in Anwesenheit des Inhibitors oder eines Gemisches von Inhibitoren im m-vz'tro-Test und/oder die verminderte Abschuppung von Keratinozyten an Hautbiopsien in Anwesenheit des Inhibitors oder eines Gemisches von Inhibitoren verstanden. Der Inhibitor oder das Gemisch von Inhibitoren kann in einer Konzentration von 0.001 - 20.0 Gew.-%, vorzugsweise 0.1 - 5 Gew.-% in den Zusammensetzungen enthalten sein. Der physiologisch verträgliche Träger kann beispielsweise eine O/W oder eine W/O-Emulsion, eine Gel-Grundlage oder eine geeignete wässrige oder alkoholische Lösung sein.
Die Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Inhibitor enthalten ist, der die am Desmosomen-Abbau beteiligten Serin-Pro- teinasen hemmt, ist bevorzugt. Diese Proteinasen enthalten im aktiven Zentrum einen für die Katalyse essentiellen L-Serin-Rest. Als Inhibitoren im Sinne der Erfindung eignen sich Substanzen, die den L-Serin-Rest modifizieren und/oder die Substratspaltungsstelle durch Wechselwirkung mit dem L-Serin-Rest bzw. mit Aminosäuren aus der Umgebung blockieren und/oder über die Änderung der Tertiärstruktur des Enzyms dessen Inaktivierung bewirken. Als Hemmwirkung im Sinne der Erfindung wird, wie bereits für den allgemeinen Fall erläutert, eine Aktivitätsabnahme der Serin-Proteinasen in Anwesenheit des Inhibitors im -vztro-Test und/oder die verminderte Abschuppung von Keratinozyten an Hautbiopsien in Anwesenheit des Inhibitors bezeichnet.
Besonders bevorzugt ist weiterhin die Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens ein Inhibitor enthalten ist, der die am Desmosomen- Abbau beteiligten Trypsin- oder Chymotrypsin-ähnlichen Serin-Proteinasen hemmt. Trypsin ist eine Endopeptidase, die im Dünndarm aus der vom Pankreas gebildeten Vorstufe Trypsinogen durch Abspaltung eines Hexapeptids entsteht. Kennzeichnend für diese Serin-Proteinase ist ein negativ geladener L-Aspartat-Rest in der Substrat-Bindungstasche, der die Spezifität des Enzyms mitbestimmt. Trypsin spaltet Peptidketten spezifisch auf der Carboxy-Seite der basischen Aminosäuren L-Lysin und L-Arginin. Chymotrypsin entsteht im Pankreas aus inaktiven Vorstufen, sogenannten Zymogenen, durch Einwirkung von Trypsin. Chymotrypsin spaltet Proteine, Peptide, Aminosäureester und Amide spezifisch an der Carboxy-Gruppe hydrophober Aminosäuren. Beide Enzym- Typen sind am Abbau von Proteinstrukturen (Desmosomen) beteiligt, welche für die Kohäsion der Hornzellen in der Haut verantwortlich sind. Als Hemmwirkung im Sinne der Erfindung wird, wie bereits für den allgemeinen Fall erläutert, eine Aktivitätsabnahme der Trypsin- oder Chymotrypsin-ähnlichen Serin-Proteinasen in Anwesenheit des Inhibitors im -vz'tro-Test bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Inhibitor Borsäure oder deren Derivate enthalten sind, ist besonders bevorzugt. Zu den erfindungsgemäß verwendbaren Derivaten gehören Ester und Salze der Borsäure sowie C,-C5-Alkyl- oder Aryl-substituierte Borsäure-Derivate, wie beispielsweise Phenylboronsäure und/oder deren Mono- oder Diester mit C,-C5-Alkylresten. Die Verwendung von Borsäureacetat oder Phenylboronsäureacetat kann im Sinne der Erfindung bevorzugt sein. Borsäure und Phenylboronsäure wirken schwach antiseptisch. In enzym- haltigen Waschmitteln ist Phenylboronsäure als Inhibitor für proteolytische Enzyme bekannt, um deren Lagerstabilität zu erhöhen. Die Verwendung von Phenylboronsäure, C6H5B(OH)2, als Aktivitätsregulator für α-Chymotrypsin in Gewebekulturen wurde in JP 08157800 gelehrt. Insbesondere Phenylboronsäure erwies sich im in-vitro-Test (Beispiel 1) in sehr geringen Konzentrationen (0,1 %) als äußerst wirkungsvoller Inhibitor von Chymotrypsin, einem Enzym, das am Desmosomenabbau beteiligt ist. Auch im Abschuppungstest an Haut-Biopsien erwiesen sich Borsäure und Phenylboronsäure (Beispiele 7 und 8) als Inhibitoren und sind daher für die Verwendung in Zusammensetzungen zur topischen Behandlung der trockenen Haut besonders geeignet.
Ebenso bevorzugt ist die erfindungsgemäße Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid enthalten ist. Zwei Ausführungsformen dieses Inhibitors sind unter dem Handelsnamen Pefabloc® und Pefabloc® SC bekannt. Die Substanz wird als nicht-toxischer, irreversibler und effektiver Inhibitor von Serin-Proteasen beschrieben (C. Dentan et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1996, 1299, 353-357). Insbesondere wegen seiner geringen Toxizität ist die Verwendung von 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid in Zusammensetzungen zur topischen Behandlung der trockenen Haut geeignet. Eine signifikante Hemmung von Trypsin und Chymotrypsin wurde in zΗ-v/tro-Tests bereits mit 0,02 bzw. 0,05 % des Inhibitors beobachtet, eine nahezu vollständige Hemmung tritt bei Verwendung von 0,5 % ein (Beispiel 3). Dies entspricht dem Ergebnis des Desquamationstest an Hautbiopsien, bei dem 0,5 % des Inhibitors die Abschuppung der Korneozyten um ca. 90 % reduziert (Beispiel 9).
Bevorzugt ist auch die erfmdungsgemäße Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Inhibitor eine chemische Verbindung, enthaltend die Pentapeptidsequenz Glycin-Prolin-Phenylalanin-Prolin-Leucin (GPFPL), verwendet wird. Die Pentapeptidsequenz ist als Inhibitor für Serin-Proteinasen bekannt. Beansprucht im Sinne der erfindungsgemäßen Verwendung sind u. a. endgruppengeschützte Derivate dieser Pentapeptidsequenz, Polypeptide, Proteine und andere chemische Derivate, die diese Pentapeptidsequenz enthalten, die eine inhibitorische Wirkung in den umseitig beschriebenen Tests aufweisen. Eine deutliche Hemmung von Chymotrypsin (27 %) wurde in in- vz'tro-Tests bei Verwendung von 0.33 Gew.-% N-CBZ-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu (N-CBZ=N- Benzyloxycarbonyl) beobachtet (Beispiel 4). Bei Verwendung von 0,5 % N-CBZ-GPFPL kann die Desquamation der Haut um die Hälfte reduziert werden (Beispiel 10).
Bevorzugt ist auch die erfindungsgemäße Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Inhibitor Rosmarinsäure enthalten ist. Rosmarinsäure ist für seine entzündungshemmende, cytostatische und antivirale Wirkung bekannt. In der Kosmetik wird Rosmarinsäure als Badezusatz und als Additiv in Haarpflegeprodukten eingesetzt. In Hautpflegeprodukten wird Rosmarinsäure zusammen mit anderen Wirkstoffen als synergistisch wirkende Antioxidantien-Kombination eingesetzt. Zu den erfindungsgemäß verwendbaren Derivaten gehören Ester und Salze der Rosmarinsäure sowie CrC5-Alkyl- oder Arylester. Eine nahezu vollständige Hemmung von Trypsin wurde in z'w-vz'tro-Tests bei Verwendung von 0.05 % Rosmarinsäure beobachtet (Beispiel 5). Bei Verwendung von 1 ,0 % Rosmarinsäure kann die Desquamation der Haut um nahezu 70 % reduziert werden (Beispiel 11).
Bevorzugt ist auch die erfmdungsgemäße Verwendung einer Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Inhibitor das aus Leguminosesamen nach einem besonderen Verfahren gewonnene Elhibin® (Pentapharm AG) enthalten ist. Elhibin® hemmt Leukozytenelastase und Fibroblastenelastase, die an Entzündungs- und Alterungsprozessen der Haut beteiligt sind. Der Wirkstoff wird in Hautkosmetika eingesetzt, um das generelle Aussehen der Haut zu verbessern. Im zΗ-vz'trσ-Tests hemmt Elhibin® bereits in einer Konzentration von 0.5 % sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin nahezu vollständig (Beispiel 6). Im Desquamationstest an Hautbiopsien wird die Abschuppung der Korneo- zyten bei Verwendung von 1,0 % Elhibin® um mehr als 90 % reduziert (Beispiel 12). Physiologisch verträgliche Träger
Die Inhibitor- Wirkstoffe sind in den für kosmetische Rezepturen üblichen, physiologisch veträglichen Trägem enthalten. Neben Wasser und physiologisch geeigneten Lösungsmitteln können u. a. pflegende Bestandteile, Öle, Wachse, Fette, rückfettende Substanzen, Verdickungsmittel, Emulgatoren, als Sonnenschutzfilter geeignete Substanzen und Duftstoffe enthalten sein. Die Zusammensetzung kann je nach Anforderung als wäßrige oder alkoholische Lösung, als Gel, Öl, W/O- oder O/W-Emulsion formuliert werden. Im Sinne der Erfindung können die Inhibitoren auch in Körperreinigungsmitteln wie z. B. Seifen, Shampoos, Duschbädern u. ä. verwendet werden, da sie die durch Detergentien induzierte Abschuppung reduzieren. Für geeignete Formulierungs-Grundlagen sei an dieser Stelle auf die in der Kosmetik üblichen Rezepturen verwiesen (K. Schrader. Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, 2. Aufl., Hüthig Buch Verlag, Heidelberg 1989, Seite 424- 437, 442-451, 456-465).
Pflegende Wirkstoffe
Für die erfindungsgemäße Verwendung der Zusammensetzung zur topischen, prophylaktischen und/oder kosmetischen Behandlung der trockenen Haut kann ein hoher Anteil an pflegenden Substanzen vorteilhaft sein. Gemäß einer bevorzugten Verwendungsform enthalten die Zusammensetzungen neben den in vielen Fällen ebenfalls Pflegewirkung aufweisenden tierischen und/oder pflanzlichen Fetten und Ölen noch weitere Pflegekomponenten. Dem Fachmann ist eine Vielzahl pflegender Wirkstoffe bekannt, die für diesen Zweck verwendet werden können. Hierzu zählen unter anderem:
• Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen
Die eingesetzten Fettalkohole können gesättigt oder ungesättigt und linear oder verzweigt sein. Einsetzbar im Sinne der Erfindung sind beispielsweise Decanol, Octanol, Octenol, Dodecenol, Decenol, Octadienol, Dodecadienol, Decadienol, Oleylalkohol, Erucaalkohol, Ricinolalkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol, Cetylalkohol, Laurylalkohol, Myristylalkohol, Arachidylalkohol, Caprylalkohol, Caprinalkohol, Linoleylalkohol, Linolenylalkohol und Behenylalkohol, sowie deren Guerbetalkohole, wobei diese Aufzählung beispielhaften und nicht limitierenden Charakter haben soll. Die Fettalkohole stammen bevorzugt von natürlichen Fettsäuren ab, wobei üblicherweise von einer Gewinnung aus den Estern der Fettsäuren durch Reduktion ausgegangen werden kann. Erfindungsgemäß einsetzbar sind ebenfalls Fettalkoholschnitte, die durch Reduktion natürlich vorkommender Fette und Öle, wie z. B. Rindertalg, Erdnußöl, Rüböl, Baumwollsaatöl, Sojaöl, Sonnenblumenöl, Palmkernöl, Leinöl, Rizinusöl, Maisöl, Rapsöl, Sesamöl, Kakaobutter und Kokosfett entstehen.
• Tierische und pflanzliche Proteinhydrolysate
Hierzu zählen insbesondere Elastin-, Kollagen-, Keratin-, Milcheiweiß-, Sojaprotein-, Seidenprotein-, Haferprotein-, Erbsenprotein-, Mandelprotein- und Weizenproteinhydrolysate, deren Kondensationsprodukte mit Fettsäuren sowie quaternisierte Proteinhydrolysate
• Vitamin und Vitaminvorstufen wie Tocopherole, Vitamin A, Niacinsäure und Niacinsäureamid, weitere Vitamine des B-Komplexes, Vitamin F und insbesondere Biotin. Weiterhin bevorzugt innerhalb dieser Gruppe von pflegenden Wirkstoffen sind Panthenol, dessen Derivate, insbesondere die Ester und Ether des Panthenols sowie kationisch derivatisierte Panthenole. Einzelne Vertreter sind beispielsweise das Panthenoltriacetat, der Panthenolmonoethylether und dessen Monoacetat sowie kationische Panthenolderivate.
• Mono-, Di- und Oligosaccharide wie beispielsweise Glucose, Galactose, Fructose, Mannose, Fruchtzucker und Lactose.
Pflanzenextrakte, die üblicherweise durch Extraktion der gesamten Pflanze, in einzelnen Fällen aber auch ausschließlich aus Blüten und/oder Blättern der Pflanze, hergestellt werden. Hinsichtlich der erfindungsgemäß verwendbaren Pflanzenextrakte wird insbesondere auf die Extrakte hingewiesen, die in der auf Seite 44 der 3. Auflage des Leitfadens zur Inhaltsstoffdeklaration kosmetischer Mittel, herausgegeben vom Industrieverband Körperpflege- und Waschmittel e.V. (IKW), Frankfurt, beginnenden Tabelle aufgeführt sind. Erfmdungsgemäß sind vor allem die Extrakte aus Eichenrinden, Brennessel, Hamamelis, Hopfen, Kamille, Klettenwurzel, Schachtelhalm, Weißdom, Lindenblüten, Mandel, Aloe Vera, Fichtennadel, Roßkastanie, Sandelholz, Wacholder, Kokosnuß, Mango, Aprikose, Limone, Weizen, Kiwi, Melone, Orange, Grapefruit, Salbei, Rosmarin, Birke, Malve, Wiesenschaumkraut, Quendel, Schafgarbe, Thymian, Melisse, Hauhechel, Huflattich, Eibisch, Meristem, Ginseng und Ingwerwurzel bevorzugt. Besonders bevorzugt sind die Extrakte aus Mandel, Aloe Vera, Kokosnuß, Mango, Aprikose, Limone, Weizen, Kiwi und Melone. Es können in den erfindungsgemäßen Mitteln auch Mischungen aus mehreren, insbesondere aus zwei, verschiedenen Pflanzenextrakten enthalten sein.
Als Extraktionsmittel zur Herstellung der genannten Pflanzenextrakte können u. a. Wasser, Alkohole sowie deren Mischungen verwendet werden. Unter den Alkoholen sind dabei niedere Alkohole wie Ethanol und Isopropanol, insbesondere aber mehrwertige Alkohole wie Ethylenglykol, Propylenglykol und Butylenglykol sowohl als alleiniges Extraktionsmittel als auch in Mischung mit Wasser, bevorzugt. Die Pflanzenextrakte können erfindungsgemäß sowohl in reiner als auch in verdünnter Form eingesetzt werden.
• Honigextrakte, die in analoger Weise zu den Pflanzenextrakten gewonnen werden und üblicherweise 1 - 10 Gew.-%, insbesondere 3 - 5 Gew.-%, Aktivsubstanz enthalten.
• Ceramide
• Phospholipide, beispielsweise Sojalecithin, Ei-Lecithin und Kephaline, • Paraffin- und Silikonöle; zu letzteren zählen u. a. Dialkyl- und Alkylaryl- siloxane, wie beispielsweise Dimethylpolysiloxan und Methylphenylpolysiloxan, sowie deren alkoxylierte und quaternierte Analoga.
• Fettsäure- und Fettalkoholester, insbesondere die Monoester der Fettsäuren mit Alkoholen mit 3 bis 24 C-Atomen. Bei dieser Stoffgruppe handelt es sich um die Produkte der Veresterung von Fettsäuren mit 8 bis 24 C-Atomen wie beispielsweise Capronsäure, Caprylsäure, 2-Ethylhexansäure, Caprinsäure, Laurinsäure, Isotridecansäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmoleinsäure, Stearinsäure, Isostearinsäure, Ölsäure, Elaidinsäure, Petroselinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Elaeostearinsäure, Arachinsäure, Gadoleinsäure, Behensäure und E casäure sowie deren technische Mischungen, die z. B. bei der Druckspaltung von natürlichen Fetten und Ölen, bei der Reduktion von Aldehyden aus der Roelen'schen Oxosynthese oder der Dimerisierung von ungesättigten Fettsäuren anfallen, mit Alkoholen wie beispielsweise Isopropylalkohol, Capronalkohol, Caprylalkohol, 2-Ethylhexylalkohol, Caprinalkohol, Laurylalkohol, Isotridecylalkohol, My- ristylalkohol, Cetylalkohol, Palmoleylalkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol, Oleylalkohol, Elaidylalkohol, Petroselinylalkohol, Linolylalkohol, Linolenyl- alkohol, Elaeostearylalkohol, Arachylalkohol, Gadoleylalkohol, Behenylalkohol, Erucylalkohol und Brassidylalkohol sowie deren technische Mischungen, die z. B. bei der Hochdruckhydrierung von technischen Methylestern auf Basis von Fetten und Ölen oder Aldehyden aus der Roelen'schen Oxosynthese sowie als Monomerfraktion bei der Dimerisierung von ungesättigten Fettalkoholen anfallen.
Überprüfung der inhibitorischen Wirkung
Die hemmende Wirkung der Protease-Inhibitoren wurde sowohl in vitro an geeigneten Modellenzymen als auch an Biopsien menschlicher Haut nachgewiesen. 1. Inhibitorische Wirkung auf eine Serin-Protease (in vitro)
Da die hauteigenen, am Desmosomenabbau beteiligten Proteasen nicht in ausreichender Menge zur Verfügung standen, dienten die Serin-Proteasen Trypsin und Chymotrypsin (Sigma) aus Rinderpankreas als Modellenzym, um die Hemmwirkung der erfindungsgemäß verwendeten Inhibitoren Phenylboronsäure, Borsäure, N-CBZ-Gly-Pro-Phe-Pro- Leu, Pefabloc® und Pefabloc® SC (Boehringer Mannheim), Rosmarinsäure und Elhibin® zu testen. Als Referenz wurde das als t-PA-Inhibitor (tissue-type 7lasminogen ύrctivator) bekannte t-AMCHA [trα«s-4(Ammometlιyl)-cyclohexancarbonsäure] verwendet.
Durchfuhrung:
Der Nachweis der Chymotrypsin-Enzymaktivität erfolgt mit einer Modifikation analog zu den Angaben im Sigma Quality Control Test Procerfwre-Datenblatt für Chymotrypsin. Bei Ansätzen ohne Inhibitor wurden 1,42 mL Reagens A (80 mM Tris/HCl-Puffer, pH = 7,8; 25 °C) zum Testansatz zugegeben. Bei Ansätzen mit Inhibitor wurden 1,32 mL Reagens A zum Testansatz zugegeben sowie 0,1 mL einer Lösung des entsprechenden Inhibitors in Reagens A (Konzentrationsreihe). Die Enzymaktivität wurde durch Umsetzung des Substrates N-Benzoyl-L-Tyrosinethylester (BTEE) zu N-Benzoyl-L-Tyrosin und Ethanol spektrophotometrisch bestimmt. Die Absorption des proteolytisch abgespaltenen N- Benzoyl-L-Tyrosins wird bei 256 nm gemessen.
Auch der Nachweis der Trypsin-Enzymaktivität erfolgt mit einer Modifikation analog zu den Angaben im Sigma Quality Control Test rocedwre-Datenblatt für Trypsin. Anstelle von Aprotinin (Reagens F) wurden hier die erfindungsgemäßen Inhibitoren eingesetzt. Hierfür wurde eine Konzentrationsreihe der Inhibitoren in Reagens E angesetzt. Die Enzymaktivität wurde durch Umsetzung des Substrates Nα-Benzoyl-DL-Arginin-p- Nitroanilin (BAPNA) zu Nα-Benzoyl-DL-Arginin und p-Nitroanilin spektrophoto- metrisch bestimmt. Die Absorption des proteolytisch abgespaltenen p-Nitroanilins wird bei 405 nm gemessen.
Die Reaktionskinetiken wurden je 5 Minuten bei 25 °C detektiert, wobei der lineare Anstieg der Absorption (A) pro Zeiteinheit (t) ein Maß für die Aktivität des Enzyms (ΔA/Δt) ist. Die Aktivität des Enzyms in Abwesenheit eines Proteinase-Inhibitors, (ΔA,/Δt,), wurde auf 100% gesetzt. Unter analogen Bedingungen wurden die Aktivitäten in Gegenwart eines Inhibitors (ΔA2/Δt2) bestimmt. Die Hemmwirkung oder Minderung der Enzymaktivität entspricht dann: 100% - (ΔA2/Δt2 )/( ΔA,/Δt, )%.
Hemmwirkung auf die Trypsin- bzw. Chymotrypsin-Aktiviät
Beispiel 1 : Phenylboronsäure als Inhibitor im Enzymtest
: weight per volume
Durch Phenylboronsäure wird die Aktivität von Trypsin im gewählten Konzentrationsbereich nur mäßig beeinträchtigt. Hingegen wird eine deutliche, konzentrationsabhängige Hemmung von Chymotrypsin beobachtet. Beispiel 2: Borsäure als Inhibitor im Enzymtest
* : weight per volume
Die Hemmwirkung von Borsäure auf Trypsin und Chymotrypsin ist im getesteten Konzentrationsbereich nur schwach. Chymotrypsin wird bei geringerer Borsäure-Konzentration stärker gehemmt als Trypsin.
Beispiel 3: 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid (Pefabloc*1 SC) als Inhibitor im Enzymtets
: weight per volume
Pefabloc® SC zeigt im getesteten Konzentrationsbereich eine starke, konzentrationsabhängige Hemmung von Trypsin und Chymotrypsin. Beispiel 4: Pentapeptidsequenz GPFPL als Inhibitor im Enzymtest
: weight per volume
Die Trypsin-Aktivität wird durch GPFPL im gewählten Konzentrationsbereich nicht beeinträchtigt. Bei einer Konzentration des Inhibitors von 0,33 Gew.% wird eine spezifische Hemmung (27%) von Chymotrypsin nachgewiesen.
Beispiel 5: Rosmarinsäure als Inhibitor im Enzymtest
: weight per volume ** = wegen Verfärbung der Lösungen durch Rosmarinsäure konnten diese Konzentrationen nicht getestet werden.
Rosmarinsäure zeigt eine starke, konzentrationsabhängige Hemmung von Trypsin. Die Hemmung von Chymotrypsin ist bei den untersuchbaren, niedrigen Inhibitor-Konzentrationen gering. Beispiel 6: Elhibin® als Inhibitor im Enzymtest
: volume per volume
Sowohl Trypsin als auch Chymotrypsin werden durch Elhibin® gleichermaßen stark im getesteten Konzentrationsbereich gehemmt.
Vergleichsbeispiel 1: t-AMCHA (Referenz) als Inhibitor
Nur die Trypsin-Aktivität wird durch t-AMCHA in Abhängigkeit von der Inhibitor-Konzentration beeinträchtigt. Hingegen wird die Aktivität von Chymotrypsin im gleichen Konzentrationsbereich durch t-AMCHA nicht beeinträchtigt. Bewertung der Tests:
Die Testergebnisse zeigen, daß der Referenz-Inhibitor t-AMCHA (Vergleichsbeispiel 1) im untersuchten Konzentrationsbereich nur Trypsin hemmt und sich somit grundlegend von den erfindungsgemäß verwendeten Inhibitoren unterscheidet. Einige der hier getesteten Inhibitoren erzielen bei sehr geringer Konzentration eine effektive Hemmung.
Eine spezifische Hemmung der Chymotrypsin-Aktivität wurde für niedrige Konzentrationen des Pentapeptids GPFPL beobachtet. Borsäure zeigt im getesteten Konzentrationsbereich eine schwache Hemmung beider Enzyme, Phenylboronsäure zeigt bereits in geringer Konzentration (0,1 %) eine schwache Hemmung von Trypsin und eine starke Hemmung von Chymotrypsin. Eine nahezu vollständige Hemmung beider Enzyme tritt auch mit Elhibin® (0,5 %) ein. Geringe Konzentrationen Rosmarinsäure (0,05 %) sind ein äußerst effektiver Inhibitor für Trypsin. Als effektiver Inhibitor beider Enzyme hat sich auch Pefabloc® erwiesen, wobei im untersuchten Konzentrationsbereich Trypsin stärker gehemmt wird als Chymotrypsin.
2. Tests der Inhibitoren an Haut-Biopsien
Der Einfluß der Protease-Inhibitoren Phenylboronsäure, Borsäure, des Pentapeptids N- CBZ-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu, Rosmarinsäure und Elhibin® auf die Desquamation des Stratum corneum wurde an Haut-Biopsien untersucht.
Aus frischen Humanhautexplantaten (aus Mammareduktion) wurden 8mm2-große Hautstücke ausgestanzt und mit einer Mischung aus Detergentien (Na-Dodecylsulfat, N,N- Dimethyldodecylaminoxid) in Abwesenheit und in Gegenwart der Inhibitoren behandelt. Unter dem Einfluß der Detergentien wird eine verstärkte Abschuppung (Desquamation) der Homschicht (Stratum corneum) künstlich induziert, also die Ausbildung trockener Haut im Versuch nachgeahmt. Die Anzahl abgeschuppter Hornzellen (Korneozyten) wurde unter dem Mikroskop in einer Schilling-Zählkammer bestimmt. Eine Verringerung der Korneozytenzahl weist auf eine hemmende Wirkung der getesteten potentiellen Inhibitoren hin.
Durchführung:
Die Inhibitoren wurden in den entsprechenden Konzentrationen (vgl. Tabellen der Beispiele 7-12) im Inkubationspuffer angesetzt. Dieser bestand aus 0,1 M TRIS-HCl-Puffer (pH 8) mit 0,1 Gew.% Na-Azid und den Detergenzien Na-Dodecylsulfat (0,2 mM) und N,N-Dimethyldodecylaminoxid (8 mM) sowie EDTA (5 mM). Diese Inkubationspufferlösungen mit variierender Konzentration des Inhibitors werden nachfolgend als Testlösungen bezeichnet.
Es wurden zwei Arten von Blindkontrollen durchgeführt, eine Positiv- und eine Negativkontrolle. Für die sogenannte Positivkontrolle wurde nur der Inkubationspuffer verwendet, d. h. ohne Zusatz der Inhibitoren. Für die sogenannte Negativkontrolle wurde eine 5 mM Lösung von EDTA in TRIS-HCl-Puffer eingesetzt, d. h. ohne Zusatz der Detergentien.
Pro Reaktionsansatz wurden 0,5 mL der jeweiligen Testlösung oder des für die Blindkontrollen verwendeten Puffergemisches in verschließbaren Reaktionsgefaßen vorgelegt. Alle Ansätze wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
Die Humanhaut wurde nach der Explantation in einer trockenen, sterilen Petrischale auf Kühlakkus transportiert. Nach Entfernung des Unterhautfett- und des Bindegewebes wurden mit Hilfe von sterilen Stanzen 8 mm2-große Hautstücke präpariert. Diese wurden 15 - 20 min in steriler, physiologischer NaCl (0,9 %) gewaschen, zu den Reaktionsansätzen gegeben (1 Hautstück/Reaktionsansatz) und 44 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationsphase wurden die Reaktionsgefaße 30 Sekunden auf einem Vortex-Mixer geschüttelt, um noch lose anhaftende Komeozyten von den Hautstücken abzulösen. Die Hautstücke wurden entnommen und die verbleibende Dispersion wurde 8 Minuten bei 11.OOOU/min zentrifugiert, um die Komeozyten zu isolieren. Der detergenshaltige Überstand (0,4 mL) wurde verworfen und der Rückstand mit 0,4 ml Aqua dest. gewaschen. Nach nochmaligem Zentrifugieren wurde der Überstand (0.4 mL) wiederum verworfen, das verbleibende Zellpellet in 0,4 mL Aqua dest. aufgenommen und die abgelösten Komeozyten in einer Schillingzählkammer unter einem Lichtmikroskop ausgezählt.
Nachfolgende Tabellen geben eine Zusammenstellung über die Anzahl abgelöster Komeozyten:
• nach Behandlung der Haut-Biopsien mit einem Detergentiengemisch in Abwesenheit der Inhibitoren (Positivkontrolle)
• nach Behandlung der Haut-Biopsien mit einer Pufferlösung in Abwesenheit der Detergentien und Inhibitoren (Negativkontrolle)
• nach Behandlung der Haut-Biopsien mit einem Detergentiengemisch, welches die Inhibitoren in variierender Konzentration enthält.
Beispiel 7: Phenylboronsäure als Inhibitor im Desquamationstest
Phenylboronsäure wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsmhibitor getestet. Der Korneozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
In einer Konzentration von 0,05 % kann Phenylboronsäure die Abschuppung der Komeozyten siginifikant reduzieren.
Beispiel 8: Borsäure als Inhibitor im Desquamationstest
Borsäure wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsinhibitor getestet. Der Komeozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
In einer Konzentration von 0,2 % vermag Borsäure die Abschuppung der Komeozyten zu halbieren.
Beispiel 9: Pefabloc® SC als Inhibitor im Desquamationstest
4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid (Pefabloc® SC) wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsinhibitor getestet. Der Komeozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Bei Verwendung von 0,5 % Pefabloc® SC wird die Abschuppung um nahezu 90 % reduziert.
Beispiel 10: Z-GPFPL als Inhibitor im Desquamationstest
Das Pentapeptid N-CBZ-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu (GPFPL) wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsinhibitor getestet. Der Komeozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Bei Verwendung von 0,5 % des Pentapetids wird die Abschuppung um die Hälfte reduziert.
Beispiel 11 : Rosmarinsäure als Inhibitor im Desquamationstest
Rosmarinsäure wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsinhibitor getestet. Der Komeozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Auch Rosmarinsäure bewirkt eine konzentrationsabhängige Reduktion der Komeozytenabschuppung. Bei Verwendung von 1,0 % Rosmarinsäure kann die Abschuppung auf 33,8 % reduziert werden.
Beispiel 12: Elhibin® als Inhibitor im Desquamationstest
Elhibin® wurde in verschiedenen Konzentrationen als Desquamationsinhibitor getestet. Der Komeozytenwert der Positivkontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Elhibin® wirkt auch in geringer Konzentration als starker Desquamationsinhibitor und zeigt bezüglich der Komeozytenabschuppung im untersuchten Konzentrationsbereich ein schwach konzentrationsabhängiges Profil. Vergleichsbeispiel 2: t-AMCHA (Referenz) als Inhibitor im Desquamationstest
Als Referenzsubstanz wurde t-AMCHA eingesetzt. Der Komeozytenwert der Positiv- Kontrolle wurde auf 100 % gesetzt.
Bewertung der Tests:
Die durch die Detergenzienmischung verursachte Desquamation der Humanhaut kann durch Phenylboronsäure, Borsäure, das Pentapeptid Z-Gly-Pro-Phe-Pro-Leu, Rosmarinsäure und Elhibin® drastisch reduziert werden. Dabei zeigten sich konzentrationsabhängige Effekte, d. h. mit Zunahme der Inhibitorkonzentration nimmt die Korneozyten- Abschuppung ab.
Erfindungsgemäße Formulierungsbeispiele
Alle nachfolgenden Mengenangaben beziehen sich auf Gew.% Aktivsubstanz.
1. Wäßriges Liposomengel
4,0 % Phospholipid (z. B. Sternprime® N10)
6,0 % Ethanol
0,2 % Konservierungsmittel (z. B. Phenonip®)
0,5 % vernetztes Polyacrylat (z. B. Carbopol® ETD 2020)
0,2 % Inhibitor ad l00 % H2O (dest.)
' Das Liposomengel wurde mit N-CBZ-GPFPL, Pefabloc®, Pefabloc® SC, Phenylboronsäure, Borsäure, Rosmarinsäure und Elhibin® (0,2 Gew.%) als Inhibitor formuliert.
Das Lecithin wurde oberhalb seiner Hauptphasenumwandlungstemperatur durch Einspritzen einer 40%-igen ethanolischen Stammlösung in Wasser (ca. 50-60 °C) disper- giert. Nach Abkühlen der Dispersion auf ca. 40 °C wurde der Inhibitor und die kalte Polyacrylat-Quellung zugegeben. Anschließend wurde mit 10%-iger NaOH-Lösung auf pH=7 neutralisiert. Gegebenenfalls können weitere wasser- oder öllösliche Wirkstoffe (Vitamin E, Panthenol, Sonnenschutzfilter, etc.) auf bekannte Weise eingearbeitet werden.
2. Ol-in- Wasser PIT-Creme
8,0 % Dicaprylylether (z. B. Cetiol® OE) 8,0 % Dioctylcyclohexan (z. B. Cetiol® S) 4,0 % Cetearylakohol (z. B. Lanette® O) 3,0 % Ceteareth-20 (z. B. Eumulgin® B2) 1,5 % Glycerylpalmitat (z. B. Monomuls® 60-35C)
0,5 % Silikonöl (z. B. Baysilon® M 350)
1,0 % Vitamin E
5,0% Glycerin
0,3 % Konservierungsmittel (z. B. Phenonip®)
0,2 % Inhibitor* ad l00 % H2O (dest.)
Die ÖI-in-Wasser-PIT-Creme wurde mit N-CBZ-GPFPL, Pefabloc®, Pefabloc® SC, Phenylboronsäure, Borsäure, Rosmarinsäure und Elhibin® (0,2 Gew.%) als Inhibitor formuliert.
Zuerst wurde ein Emulsionskonzentrat nach dem Phaseninversionsverfahren (PIT) hergestellt (T. Förster in Surfactants in Cosmetics, Hrsg.: M. M. Rieger und L. D. Rhein, Marcel Dekker, New York 1997, Bd. 2, S. 105-125, „Principles of emulsion formation") liegt zwischen 70 und 84 °C. Das heiße Emulsionskonzentrat wurde abgekühlt und der Inhibitor bei 40 °C in Form einer 5 %-igen wäßrigen Lösung zugegeben.
3. Wasser-in-Öl Emulsion
8,0 % Dicaprylylether (z. B. Cetiol® OE)
8,0 % Decyloleat (z. B. Cetiol® V)
3,5 % hydriertes Rizinusöl-Ethoxylat (z. B. Dehymuls® HRE 7)
0,7 % MgSO4*7H2O (z. B. Veegum®)
1,0 % Vitamin E
5,0 % Glycerin
0,3 % Konservierungsmittel (z. B. Phenonip®)
0,2 % Inhibitor* ad l00 % H2O (dest.) * Die Wasser-in-Öl-Emulsion wurde mit N-CBZ-GPFPL, Pefabloc®, Pefabloc® SC, Phenylboronsäure, Borsäure, Rosmarinsäure und Elhibin® (0,2 Gew.%) als Inhibitor formuliert.
Die Olbestandteile wurden zusammen mit dem Emulgator auf 40 °C erwärmt und die wäßrige Lösung der weiteren Inhaltsstoffe unter Rühren zugegeben.
Anhang
Verzeichnis der Warenzeichen der verwendeten Rohstoffe
1) Stemprime® N10 Hydriertes Soja-Lecithin Hersteller: Nattermann
2) Phenonip®:
Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Butylparaben Hersteller: Nipa Laboratorien GmbH
3) Carbopol® ETD 2020 Acrylat/C10-C30-Alkylacrylat-Copolymer Hersteller: Goodrich
4) Cetiol® OE Dicaprylylether Hersteller: Henkel KGaA
5) Cetiol® S Dioctylcyclohexan Hersteller: Henkel KGaA
6) Lanette® O Cetearylalkohol Hersteller: Henkel KGaA 7) Eumulgin® B2 Cetheareth-20 Hersteller: Henkel KGaA
8) Monomuls® 60-35C Hydrierte Palmölglyceride Hersteller: Henkel KGaA
9) Baysilon® M 350 Silicone, Viskosität 350 cP Hersteller: Bayer AG
10) Cetiol® V Decyloleat Hersteller: Henkel KGaA
11) Dehymuls® HRE 7 PEG-Hydriertes Rizinusöl+7-EO Hersteller: Henkel KGaA
12) Veegum® Magnesiumaluminiumsilkat Hersteller: Vanderbilt
13) Pefabloc® 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid Hersteller: Boehringer Mannheim 14) Pefabloc® SC
4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid mit speziellem Protector Hersteller: Boehringer Mannheim
15) Texapon® N 70 Natriumlaurethsulfat Hersteller: Henkel KGaA
16) Akypo-Soft® KA 250 BVC
Natrium-PEG-6-cocamidcarboxylat Hersteller: Kao Chemicals
17) Plantacare® 1200 UP Laurylglucosid Hersteller: Henkel KGaA
18) Cetiol® HE
PEG-7-Glycerylcocoat Hersteller: Henkel KGaA
19)Eumulgin® HRE 455
Ricmusölpolyglycolether, gehärtet Hersteller: Henkel KGaA
20)Arlypon® F Laureth-2 Hersteller: Henkel KGaA 1)Conditioner®P7 Quaternium-7 Hersteller: Sigma

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Zusammensetzung, die in einem auf der Haut verteilbaren, physiologisch verträglichen Träger mindestens einen Inhibitor für die am Desmosomen-Abbau beteiligten Proteinasen enthält, zur Hemmung des Abbaus von Desmosomen-Strukturen bei topisch prophylaktischer und/oder kosmetischen Behandlung trockener Haut.
2. Verwendung gemäß Anspmch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung mindestens einen Inhibitor enthält, der die am Desmosomen-Abbau beteiligten Serin- Proteinasen hemmt.
3. Verwendung gemäß Anspmch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung mindestens einen Inhibitor enthält, der die am Desmosomen-Abbau beteiligten Proteinasen vom Typ der Trypsin- oder Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteinasen hemmt.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Inhibitor Borsäure und/oder deren Derivate enthält.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)phenylsulfonylfluorid enthält.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Inhibitor eine chemische Verbindung, enthaltend die Pentapeptidsequenz Glycin-Prolin-Phenylalanin-Prolin-Leucin (GPFPL), enthält.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Inhibitor Rosmarinsäure und/oder deren Derivate enthält.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung als Inhibitor den aus Leguminosensamen gewonnenen Wirkstoff Elhibin® enthält.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibitoren in einer Konzentration von ca. 0,001-20 Gew.-% in der Zusammensetzung enthalten sind.
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