KR100517060B1

KR100517060B1 - 안정화된생물학적유효화합물로이루어지는조성물의사용

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Publication number: KR100517060B1
Application number: KR1019970706871A
Authority: KR
Inventors: 루포 에덴스; 홍 솅 탄; 요한네스 빌헬무스 야코부스 람버스
Original assignee: 코스모페름 베.파우
Priority date: 1996-01-31
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2006-05-25
Also published as: EP0817613A1; AU1721697A; US6117433A; AR006308A1; CA2216169C; ATE291897T1; DE69732881T2; JPH11503465A; MX9707487A; CA2216169A1; DE69732881D1; WO1997027841A1; ES2237789T3; BR9702049B1; PT817613E; ID18666A; KR19980703467A; CN1178460A; EP0817613B1; BR9702049A

Abstract

본 발명은 적당히 안정화된 생물학적 유효 화합물을 함유하는 수성 조성물의 적용을 허용하는 분배 시스템을 기술한다. 생물학적 유효 화합물로 이루어지는 안정화 조성물 및 수성 기본 조성물이 별도로 수용되는 이중 챔버식 분배 시스템이 사용된다. 두 조성물이 분배 시스템으로부터 동시에 전달되고, 그 후 조성물이 혼합되어 직접 적용에 적합한 조성물이 생성된다.

Description

안정화된 생물학적 유효 화합물로 이루어지는 조성물의 사용{USE OF COMPOSITIONS COMPRISING STABILIZED BIOLOGICALLY EFFECTIVE COMPOUNDS}

본 발명은 두 가지 수성 조성물의 동시 송달을 위한 분배 장치로서, 폴리올 존재 하에서 적어도 하나의 효소의 안정한 조제물인 제1 수성 조성물을 함유하는 제1 챔버 및 제2 수성 조성물을 함유하는 제2 챔버를 포함하는 분배 장치에 관한 것이다.

효소의 국소 적용은 화장품에서 뿐 아니라 제약 분야에서도 기술되었다. 예를 들면 프로테아제의 사용은 피부박리 제제에서 α-히드록시산을 지지 또는 대신한다고 제안되었다(일본특허출원 J04027388). 글루타티온 술프히드릴 옥시다제는 헤어-웨이브 세팅에 유용한 것으로 확인되었다(일본특허출원 J04005220). 게다가 국제특허출원 WO93/19731은 피부박리 프로세스를 향상시키기 위한 글리코시다제의 사용을 기술하고 있고 리소짐은 종창을 치료한다고 언급되었다(HUT 057608). 보다 최근에는 효소 트랜스글루타미나제를 사용하는 몇몇 특허출원이 공개되었다(WO94/18945, J02204407).

그러나 액체 수성 조제물내 효소의 제한된 저장안정성은 효소의 보다 광범위한 적용에 대한 주 제한요인으로 간주될 수 있다.

효소를 함유하는 시판 제제는 흔히 건조상태로 효소의 저장안정성을 이용한다. 이러한 개념에 따르면 효소함유제품을 판매하는 가장 쉬운 방법은 효소를 예컨대 정제로서 적당히 패킹된 제품으로 별도로 공급하는 것이다. 또 다른 접근법으로 건조효소분말을 오일 겔화제와 조합하여 적당한 오일과 같은 본질적으로 비수성이고 소수성인 베이스에 균질하게 분산시킬 수도 있다.

첫 번째 접근법의 단점은 수성 조성물에 효소 정제를 용해시킬 것이 요구되나 이 용해가 느리고 불편하다는 것이다. 두 번째 접근법에 대해서는 효소가 활성으로 되기 위해 물을 필요로 한다는 것에 주의해야 한다. 유효하게 되기 위해 수상과 유상의 혼합은 비교적 높은 에너지 입력을 필요로 하고 단순한 핸드-혼합으로는 달성될 수 없다. 따라서 수성 조성물과 소수성 효소 함유상의 혼합은 매우 비효과적일 것으로 예상된다.

상기 문제는 국소 적용에 수성 안정화 효소 조성물을 사용함으로써 회피될 수 있다. 공교롭게도 수성 효소 조제물은 조제물의 수활성을 저하시키도록 의도된 고농도의 수혼화성 안정화제를 필요로 한다. 폴리올이 이 목적에 흔히 사용되고 있고 장기 안정성은 40% (v/v)보다 훨씬 높은 폴리올 농도에 의해서만 영향을 받을 수 있다. 그러나 효소는 높은 폴리올 농도를 가진 조성물에서는 흔히 활성이 아니다. 특히 그렇게 안정화된 효소 조성물의 직접적 국소 적용은 효소를 재활성화시키기에 충분한 물을 제공하지 않을 것이다. 더욱이 국소용 조성물에 그러한 높은 폴리올 농도가 존재하는 것은 허용할 수 없는 것으로 간주되고 있다.

결과적으로 수성 환경에서 효소를 안정화시키는데 필요한 높은 폴리올 농도는 그렇게 안정화된 수성 효소 조성물의 직접적 국소 적용을 방해한다.

효소가 유리하게 사용될 수 있는 또 다른 분야는 세탁물의 손세탁 적용 분야이다. 유럽과 북아메리카에서는 기계세탁에 비하여 손세탁률이 매우 낮지만 섬세한 직물에 관한 한 손세탁은 여전히 인기가 있다. 섬세한 직물중 모직물 및 견직물 항목의 작은 카테고리는 얼룩 제거, 직물 제모, 색 재생 및 직물 수축에 관하여 특히 문제가 있는 분야를 대표한다. 특정 직물의 이 카테고리는 세탁동안 생기는 변형 응력에 반대작용하기 위해 중성 pH치 부근 및/또는 저온에서 활성인 프로테아제와 같은 특이적 효소 또는 단백질 디술파이드 이성화효소와 같은 황 가교 전위효소를 필요로 할 수 있다(EP 276547). 그러한 적소 산물의 단점은 그것은 명백히 광범위한 세제 또는 효소 조제물 개발 비용을 감당할 수 없다는 것이다.

마찬가지로 수성 최종 조제물, 즉 특정 적용에 직접 사용하기에 적합한 조제물에서 불안정한, 효소 이외의 여러가지 생물학적 유효 화합물이 알려져 있다. 전형적으로 효소, 항생물질, 비타민, 풀리불포화 화합물 등과 같은 생물학적 유효 화합물은 수성 조성물에 장기 저장시 그것의 활성을 잃는다. 상기 생물학적 유효 화합물이 안정하게 혼입되어 있는 특정 조제물이 알려져 있긴 하나 전형적으로 후자의 조제물은 원하는 적용에 직접 사용하기에는 적합하지 않다.

US-A-4,243,543은 전통적인 세탁을 통하여 직물로부터 단백질 얼룩을 제거하기 위한 수성 액체 세제 조성물에 관한 것이다. 세제 조성물은 제1 용기에 저장된 안정화된 단백질분해 효소 (프로테아제)를 포함한다. 효소 외에, 제1 용기는 일정량의 물, 계면활성제 및 효소에 대한 일정량의 안정화 시스템을 함유한다. 안정화 시스템은 물-분산성 항산화제를 함유하는데, 이는 기중 산화 현상 및 항산화제의 안정화 효과를 최적화하기 위한 유기 친수성 수용성 폴리올에 기인한 변성으로부터 효소를 보호하기 위한 것이다. 더욱이, 효소 활성을 유지하도록 세제 조성물의 pH를 5.2 이상으로 유지하기 위한 pH 완충제를 함유한다. 안정화된 액체 효소 세제 조성물은 또한 별개의 제2 용기 내에 바람직하게 포장되어 킬레이팅제 또는 금속이온봉쇄제를 포함하여 조성물이 두 부분 시스템으로서 운송되도록 할 수 있는데, 두 부분은 사용 전 또는 사용시에 원위치에서 혼합되어 효소의 효능을 극대화할 수 있다. 금속이온봉쇄제는 경수의 악영향에 대한 보호로서, 조성물 자체 내에 또는 세척수 내에서 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 높은 칼슘 안정도 상수를 갖는 금속이온봉쇄제는 안정화된 액체 효소 세제 시스템의 효율성을 증가시키는데, 특히 거품-및-세정 시스템에서 효소를 강화시킴으로써 또는 얼룩을 효소에 의한 콜로이드 용액화되기 쉽도록 함으로써 또는 두 가지 모두에 의하여 효율성을 증가시킨다.

WO9100094는 두 개의 폐쇄 구획으로 구성된 활성 성분으로서 파파베린을 위한 주사 장치에 관한 것이다. 제1 구획은 파파베린 술페이트를 함유하고, 제2 구획은 가능한 한 인체에 주사한 후 통증을 감소시키기 위한 파파베린과 혼합할 염기를 함유한다. 사용 직전에 두 개의 구획의 내용물이 혼합되고 혼합물이 주사된다.

WO93/15726은 여드름에 대한 활성이 있는 국소 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 벤조일 페르옥시드 분산물을 함유하는 제1 용기 및 클린다마이신염 또는 에스테르의 수성 용액을 함유하는 제2 용기를 포함한다. 벤조일 페르옥시드는 박리성 및 광범위 항미생물 활성을 나타낸다. 클린다마이신은 항생제이다. 안정성을 증강시키기 위하여 두 성분은 별개의 밀봉된 용기에 저장되는데, 혼합 약숟가락을 포함한 키트의 형태로서 함께 포장된다.

DE 41 21 820은 마이크로캡슐 외에 이온화유전자 콜로이드와 염을 함유하는 마이크로캡슐의 분산물에 관한 것이다.

WO91/09941는 개선된 저장 안정성을 갖는 효소 함유 제제 및 그 같은 효소 제제를 함유하는 세제를 제공하는 문제를 해결한다. 이것은 WO91/09941에서 적어도 50%의 효소 활성이 제제에서 결정으로서 존재함으로써 달성된다. 제제는 효소에 대한 안정화제를 함유한다. 과립의 경우, 폴리비닐피롤리돈이 사용되고 슬러리의 경우는 수크로스와 Ca²⁺가 사용된다.

US-A-4,556,554는 효소가 재활성화되거나 피부 분비물과 반응하기 위하여 유동화되는 피부 표면에 적용되기 위한 몇몇 고정화 효소를 포함하는 화장품 조성물에 관한 것이다. 조성물은 효소가 작용하여야 할 기질과 접촉하면 효소를 방출하기 위하여 활성화된다. 화장품 조성물은, 효소의 특이적 활성을 사용하기 위하여 유동화될 때까지 불활성 또는 약간 활성화된 형태인 효소를 함유 또는 감금시키는 물리적 또는 화학적 상 및 약제와 효소의 복합체에 관한 것이다. 효소 부분은 피부와의 접촉 후에 효소를 방출하도록 조정된다.

발명의 개요

본 발명은 직접 적용되는 최종 조성물을 얻기 위하여 제1 및 제2 수성 조성물의 동시 송달을 야기하는 분배 수단을 포함하는 분배 장치를 개시하는데, 제2 조성물은 효소를 재활성화하기 위한 수성 조성물이고, 최종 조성물은 유효농도의 재활성화 효소를 함유한다.

본 발명의 분배 시스템에서 안정화된 폴리올 존재 하의 효소로 이루어지는 수성 조성물 및 수성 기본 조성물은 별도로 수용된다. 본 분배 시스템을 사용하면 두 수성 조성물의 동시 전달이 가능하게 된다. 전달시 두 조성물이 혼합되고, 그 결과 기본 조성물에 안정화된 효소로 이루어지는 조성물이 희석되어 직접 적용에 적합한 최종 조성물이 생성된다.

본 발명의 분배 시스템은 효소의 국소 적용에 특히 적합하다.

도 1은 보통 및 희석된 안정화 수성 프로테아제 조성물의 단백질분해활성을 나타낸다. 단백질분해활성은 젤라틴 피복 필름 플레이트상에서 뚜렷한 반점으로서 측정된다.

도 2는 4 내지 7의 pH에서와 α-히드록시산 존재하에서의 상이한 프로테아제의 단백질분해활성을 나타낸다.

도 3은 두 조성물이 별도로 수용되는 분배펌프를 나타낸다. 두 조성물은 동시에 분배되어 분배펌프내에서 혼합될 수도 있고 별도로 전달되어 원위치에서 혼합될 수도 있다.

본 발명의 분배 시스템에서 안정하게 조제되는 효소로 이루어지는 수성 조성물 및 수성 기본 조성물은 별도로 수용된다.

상기 분배 시스템을 사용하면 안정하게 조제된 효소로 이루어지는 수성 조성물(본 발명에서 "효소 조성물" 또는 "제1 조성물"이라고 함) 및 수성 기본 조성물("제2 조성물"이라고도 함)의 동시전달이 가능하다. 전달시 두 수성 조성물은 원위치 또는 분배 시스템에서 혼합된다. 두 조성물의 혼합으로 활성 형태의 효소를 함유하고 또한 직접 사용에 적합한 최종 조성물이 생성된다.

용어 "기본 조성물"은 효소로 이루어지는 수성 조성물과 조합하여 효소의 직접 적용에 적합한 최종 조성물을 생성하는 조성물에 사용된다. 기본 조성물의 성질은 주로 원하는 적용에 좌우될 것이다. 수성 기본 조성물은 수중유 유제를 포함하는 것으로 이해된다.

바람직하게는 수성 기본 조성물은 국소, 세제 또는 클리닝 용도에 적합한 조성물이다. 보다 바람직하게는 수성 기본 조성물은 국소 용도에 적합한 조성물이다. 가장 바람직하게는 수성 기본 조성물은 화장품 용도에 적합한 조성물이다.

수성 기본 조성물은 크림, 겔, 샴푸, 클린싱액, 로션, 액체 세제, 경질 표면 클리닝 조성물 등일 수 있다.

효소의 공급원에 대해서, 상기 효소는 동물, 식물 또는 미생물 공급원으로부터 얻을 수 있다. 바람직하게는 상기 효소는 미생물 또는 식물 공급원으로부터 얻을 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 효소는 미생물 공급원으로부터 얻을 수 있다.

장기 저장 후 특히 인지할 수 있는, 수성 환경에서의 효소의 불안정성은 예를 들면 구조적 열화(예컨대 효소 및 다른 단백질의 경우에는 변성), 산화적 공격 또는 비최적 pH 조건과 같은 다른 불리한 조건에 기인하는 화학적 성질의 것일 수 있다. 불안정성은 또한 수성 환경에서의 미생물 성장에 의해, 또는 효소를 함유하는 수성 조성물의 물리적 불안정성에 기인할 수도 있다.

효소의 불안정성을 야기하는 인자(들)에 따라 예를 들면 다음 조건중 한가지 이상을 특징으로 하는 안정한 수성 조제물이 개발되었다: 낮은 수활성, 낮거나 높은 pH, 높은 항산화제 농도, 높은 금속이온봉쇄제 농도, 높은 항생제 농도, 효소의 결정화도, 높은 점성화제 농도. 전형적으로 수성 조성물에서 효소를 안정화시키는데 필요한 상기 조건(들)은 상기 수성 조성물의 직접 사용을 불가능하게 한다.

본 발명의 분배 시스템은 본래는 불안정성인 생물학적 유효 화합물의 안정한 조제물을 제조하기 위해 화학 안정화제를 비교적 높은 농도, 즉 최종 조성물에서 허용되는 것보다 훨씬 더 높을 수 있는 농도로 사용할 수 있게 하는데, 그 이유는 분배시 안정화제가 수성 기본 조성물로 희석되기 때문이다. 적당한 안정화제로는 염 또는 폴리올과 같은 활성저하제, 또는 아황산염, 글루타티온, 시스테인 또는 아스코르브산과 같은 항산화제를 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서 분배 시스템의 사용은 기본 조성물에 유효 조성물이 희석된 후 효소의 유효 농도가 확실히 달성되게 한다. 따라서 효소는 효능에 요구되는 것보다 상당히 높은 농도로 유효 조성물에 존재할 수 있다. 몇몇 효소는 이러한 높은 농도에서는 수성 조성물에 불용성이다. 이것은 효소가 결정 형태로 존재할 수 있다는 것을 암시한다. 상기 결정 형태는 효소의 안정성을 보장하는데 특히 유리하다.

그러나 결정성 화합물로 이루어지는 조성물이 갖는 중요한 문제점은 그러한 조성물에서는 결정이 침강하는 경향이 있다는 것이다. 즉 상기 조성물은 물리적으로 불안정하다는 것이다.

본 발명은 결정성 효소의 침강이 적당한 점성화제의 사용으로 방지된다는 것을 개시한다. 상기 점성화제는 바람직하게는 수성 환경에서 3차원 망상조직을 형성할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 점성화제는 크산탄, Carbopol^R 또는 관련 수지, 또는 카라기난의 군에서 선택된다. 가장 바람직하게는 상기 점성화제는 크산탄이다. 적당한 점성화제의 농도는 주로 현탁액에 유지될 입자의 중량 및 크기에 의해 결정된다. 편리하게는 농도는 0.1-3%, 바람직하게는 0.2-0.6% 범위일 수 있다.

본 발명의 분배 시스템은 분배시 효소를 함유하는 조성물에 존재하는 안정화제의 기본 조성물에 의한 희석을 허용한다. 본 발명의 분배 시스템은 더욱이 효소의 그것의 유효 농도로의 희석을 허용한다.

기본 조성물에서의 효소를 함유하는 조성물(효소 조성물)의 희석 인자는 적당히 선택된다. 즉 안정화제의 최종 농도가 최종 조성물의 적용을 불가능하게 하지 않고 효소가 그것의 적당한 유효 농도로 최종 조성물에 존재하도록 선택된다. 희석 인자는 효소 조성물과 기본 조성물이 분배 시스템에 의해 전달되는 비에 의해 결정된다. 바람직하게는 효소 조성물과 기본 조성물간의 비는 1:1 내지 1:50, 보다 바람직하게는 1:2 내지 1:20의 범위이고, 가장 바람직하게는 그 비가 1:5 내지 1:10이다.

본 발명에 따르면 효소 조성물의 점도는 바람직하게는 효소를 함유하는 조성물과 동시에 적용되는 기본 조성물의 점도에 필적하는 값을 가진다. 예를 들면 두 조성물 모두 로션같거나 크림같거나 또는 겔같은 점성을 가질 수 있다. 게다가 효소 조성물의 점도는 조성물을 전달하는데 사용되는 분배 시스템의 유형에 좌우된다. 예를 들면 튜브의 사용은 두 조성물 모두의 비교적 높은 점성을 요구한다.

효소 조성물에 첨가될 점성화제의 양은 많은 가운데 상기 조성물의 원하는 점도에 좌우된다. 최종 조성물 및 원하는 적용에 적합한 당업자에게 공지된 어떤 점성화제가 사용될 수 있다. 예를 들면 국소 적용을 위해서는 국소 용도에 대한 그것의 허용가능성을 고려해야 한다. 점성화제의 예로는 카라기난, 셀룰로스 유도체, 폴리아크릴산, 점토, 폴리에틸렌 글리콜, 히드로콜로이드, 예컨대 크산탄을 들 수 있다.

원한다면 두 조성물이 동일 또는 상이한 외관을 가지도록 약제를 효소 조성물 및/또는 기본 조성물에 가할 수 있다. 그러한 약제의 전형적 예는 착색제이다.

수성 효소 조성물은 수중유 유제를 포함하는 것으로 이해된다.

산화되기 쉬운 효소를 함유하는 조성물의 원하는 저장안정성을 얻기 위해서는 산소의 진입이 적은 불투명 패키징 물질이 바람직할 것이다. 본 발명의 분배 시스템은 빛의 영향 및 산소의 진입을 최소화하기 위해 고습도의 조건하에서도 매우 낮은 산소투과율을 가지는 불투명 물질로부터 제조된 구획에 효소를 함유하는 조성물을 패킹하는 옵션을 제공한다. 바람직한 패킹 물질로는 PVdC, EVOH 및 알루미나피복 폴리머를 들 수 있다(Food Manufacture, June 1991, pp 49-53 참조). 보다 큰 부피의 분배기로 적용된다면 효소를 분배하기 위한 에어-프리 로션 펌프의 사용이 또 하나의 요건이 된다.

본 발명의 방법에 사용될 분배 시스템은 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명은 안정화된 효소 조성물 및 기본 조성물의 별도 수용을 허용하는 어떤 시스템이든 예상한다. 별도 수용은 물이 한 조성물에서 다른 조성물로 실질적으로 확산되는 것을 방지할 수 있는 분리의 어떤 형태든 포함하는 것으로 이해된다.

예를 들면 분배 시스템은 비상용성 화합물, 즉 접촉되었을 때 상호 작용하는 화합물의 패키징 및 전달을 위해 개발된 다성분 분배 시스템중에서 선택될 수 있다. 예를 들면 다성분 분배기는 접착제의 분야에서 알려져 있다. 다성분 접착제의 패키징은 수지와 경화제의 완전 분리를 요한다. 게다가 사용중의 편리는 두 성분의 동시 전달을 요한다.

접착제와 별도로 치약에서 비상용성 화합물들의 조제를 위해 다성분 분배 시스템이 또한 기술되었다. US특허 4,487,757, US 4,098,435 및 US 4,211,341에는 가요성 2구획 가루치약 튜브가 기술되어 있다. 후자의 특허는 비상용성 화합물들을 분리하기 위해 다가 알코올 용액중의 카르복시메틸셀룰로스 겔과 같은 압출성 물질의 사용을 개시하고 있다. FR 2,051,922에는 수성 치약 조성물과 별도로 비수성 효소 조성물을 저장하기 위한 2구획 튜브가 기술되었다.

또 다른, 그러나 기본적으로 매우 간단한 접근법으로, 한쌍의 소성 파우치는 단 일회 사용분의 물질만을 제공한다. 두 파우치의 출구는 서로에 대해 폐쇄되어 있고 내용물의 방출은 파우치의 끝 조각을 찢어 개방함으로써 실행될 수 있다(독일특허출원 DE 3 630 849).

본 발명은 또한 사용자에 의해 조립되고 그리고/또는 적당한 분배기가 구비되는 별도 용기에서 적당한 효소 조성물 및 기본 조성물을 조제 및 저장하는 것을 예상한다. 한 조성물, 예를 들면 안정화된 효소 조성물을 수용하는 용기가 이미 구비되어 있는 분배 시스템에 다른 조성물, 예를 들면 기본 조성물을 수용하는 용기가 추가로 구비되는 것도 또한 가능하다.

본 발명의 분배 시스템은 불안정한 효소의 작용이 요구되는 어떤 적용에 편리하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 분배시스템은 관심있는 효소의 국소 적용을 위한 편리하고 간단한 수단을 제공한다. 국소 적용은 피부 및 모발상의 적용과 구강내, 예를 들면 치아상의 적용을 포함하는 것으로 이해된다.

전형적으로, 수성 효소 조성물은 폴리올과 같은 수활성 저하제의 고농도로 안정화된다.

본 발명의 분배기를 사용하면 효소 및 기본 조성물의 혼합은 기본 조성물에서 효소 조성물의 실제 희석을 초래한다. 예를 들면 효소 조성물내 폴리올의 고농도는 효소 조성물의 장기 저장 기간 후에도 희석시 효소의 활성을 보장한다.

효소 조성물의 상기 희석은 폴리올의 희석을 초래하고 그 다음 이것은 효소의 재활성화를 초래한다. 사용되는 효소 및 폴리올에 따라 효소 재활성화는 40% w/w 미만의 폴리올 농도에서 개시된다고 예상할 수 있다.

효소 조성물 및 기본 조성물이 분배 시스템에 의해 전달되는 비는 예를 들면 효소 조성물내의 폴리올 농도에 좌우되며, 이로써 그 비는 효소의 재활성화를 보장하는 식으로 조정되어야 한다. 더욱이 국소 용도를 원한다면, 상기 비는 효소를 기본 조성물과 혼합한 후 폴리올의 농도 레벨이 국소용 조제물에의 사용에 허용가능한 레벨을 초과하지 않는 식으로 조정되어야 한다.

본 발명의 분배 시스템을 사용하면 관심있는 어떤 효소의 안정한 조제 및 적용이 가능하게 된다. 바람직하게는 관심있는 효소는 산화환원효소, 전이효소, 가수분해효소 또는 이성화효소류에 속한다. 보다 바람직하게는 효소는 글루코스 옥시다제, 퍼옥시다제, 리폭시게나제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 티로시나제, 프로테아제, 포스파타제, 피타제, 글리코시다제, 글루카나제, 뮤타나제 (α-1,3-글루카나제), 덱스트라나제, 리소짐, 리파제, 포스포리파제, 술파타제, 우레아제, 트랜스글루타미나제 또는 단백질 디술파이드 이성화효소이다. 또한 두가지 이상의 효소의 혼합물로 이루어지는 안정화 조성물을 적용하는 것도 가능하다.

효소 조성물중의 효소 농도는 주로 적용의 유형에 의해 결정된다.

본 발명은 또한 효소가 입자 형태로 조제되는 효소 조성물을 예상한다. 입상 물질로서 조제된 효소는 적용후 건조될 때 효소분자의 포텐셜 흡입시 일어날 수 있는 감수성화의 위험을 크게 감소시킨다. 바람직하게는 효소는 적어도 약 5-10㎛의 입경을 가지는 입자로서 조제된다. 효소 입자 입경의 상한은 일반적으로 큰 입자는 불리한 표면 부하를 갖게 되고 피부에 적용시 껄끄러운 느낌을 줄 수 있다는 사실에 의해 결정된다. 편리하게는 입경의 상한이 약 100㎛이다.

적어도 약 5-10㎛의 효소 입자를 얻는 한가지 방법은 예를 들면 Methods in Enzymology, vol. 44 (1976)에 기재된 바와 같이 적당한 담체상에 효소를 공유적으로 고정화시키는 것이다. 적당한 입자형태의 또 다른 예는 소위 ChiroCLEC (Altus Biologics Inc., Cambridge, MA, USA)인데, 이것은 가교된 효소 결정들로 구성된다. 이들 가교된 효소 입자는 안정한 조제를 위해 폴리올과 같은 수활성 저하제의 고농도의 존재를 필요로 하지 않는다. 그것들은 그것들의 결정 형태 때문에 수성 조성물에서 화학적으로 안정하다. 그럼에도 불구하고 수활성 저하제는 수성 조성물의 미생물학적 안정성을 개선시키기 위해 여전히 가해질 수 있다.

효소 조성물을 안정화시키는데 사용되는 폴리올의 선택은 본 발명에 중요하지 않다. 수용액에서 효소를 효과적으로 안정화시킨다고 당업자에게 알려져 있는 어떤 폴리올이든 사용될 수 있다. 특히 유용한 폴리올은 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 말토덱스트린, 또는 수크로스, 락토스, 글루코스 또는 트레할로스와 같은 당의 군에서 선택된 폴리올이다. 국소 적용에 대해서는 국소 용도에 허용가능한 폴리올, 즉 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 트레할로스 또는 소르비톨을 고려한다.

폴리올은 고농도, 즉 효소 조성물에서 충분히 낮은 수활성을 초래하여 효소를 적당히 안정화시키는 농도로 사용된다. 이들 효소는 사용되는 폴리올에 따라 다소 변할 수 있다는 것이 알려져 있다. 바람직하게는 폴리올은 20-90%의 농도, 보다 바람직하게는 30-90%의 농도, 보다 더 바람직하게는 40-90%의 농도, 한층 더 바람직하게는 50-90%의 농도, 가장 바람직하게는 60-80%의 농도로 사용된다.

수성 조성물에서 낮은 수활성은 또한 조성물에서 미생물 성장을 방지하는 데에도 유리하다.

폴리올 외에 NaCl과 같은 염이 생성물의 저장 수명동안 효소의 안정성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 효소 안정성을 더욱 향상시키기 위해 환원제, 칼슘염 또는 기질 또는 기질 관련 리간드와 같은 효소안정화제가 저농도로 가해질 수도 있다(Gray, 1993, in: Thermostab. Enzymes, pp. 124-143. Narosa, New Delhi).

특히 폴리올 또는 다른 적절한 성분으로 인한 효소 조성물의 점도가 원하는 만큼 높지 않다면 선택적으로 점성화제가 효소 조성물에 가해질 수 있다. 효소 조성물에 가해질 점성화제의 양은 효소 조성물의 원하는 점도 뿐 아니라 효소 조성물의 안정화를 위해 사용되는 폴리올의 점성화 특성에 좌우된다.

고정화된 또는 결정성의 효소 제제가 사용된다면 효소 조성물의 점도는 효소 입자의 침강이 방지될 정도이어야 한다. 바람직하게는 앞에서 지적된 바와 같이 수성 조성물에서 3차원 망상 조직을 형성할 수 있는 점성화제가 사용된다.

본 발명에 따르면 효소 조성물은 적당한 수성 기본 조성물과 본질적으로 동시에 전달된다. 이 수성 기본 조성물의 성질은 본 발명에 중요하지 않으나 원하는 적용의 유형에 주로 좌우된다.

수성 기본 조성물이 순간적으로 효소를 불활성화시킬 것으로 예상될 수 있는 성분을 함유하는 것을 피하도록 더 주의해야 한다. 화장품 로션에 대해 효소를 불활성화시킬 것으로 예상되는 성분의 전형적 예는 고농도의 에탄올이다.

본 발명의 분배시스템은 효소의 작용을 원하는 어떤 적용에든 편리하게 사용될 수 있다. 특히 본 발명의 분배시스템은 관심있는 효소의 국소 적용을 위한 편리하고 간단한 수단을 제공한다. 본 발명의 분배기의 국소 용도에 바람직한 효소는 프로테아제이다.

본 발명의 분배시스템은 또한 효소 조성물 및 전활성 기질로 이루어지는 제2 조성물을 동시 전달하는데 적합하고, 이로써 효소는 두 조성물의 전달 및 혼합시 전활성 기질을 활성 성분으로 전환시키게 된다. 본 발명의 이 구체예는 활성 성분이 특정 조성물에서 불안정하고 보다 안정한 활성 성분의 전구체, 소위 전활성 기질을 조제할 수 있는 가능성이 존재할 때 바람직하다.

예를 들면 비타민 E-아세테이트, 비타민 A-아세테이트 및 비타민 A-팔미테이트는 피부상에 이러한 불안정하지만 바람직한 비타민을 적용하는데 전형적으로 사용되는 전구체 분자를 대표한다. 피부내 또는 피부상의 효소활성으로 인해 전구체의 일부는 활성 화합물로 서서히 전환되는 것으로 여겨진다(예를 들면 Boehnlein et al., Pharmaceutical Research Vol. II, no. 8 (1994), 1155-1159 참조). 본 발명의 효소분배방법에 따라 그러한 저장안정성 전구체와 적당한 가수분해효소를 조합하면 활성 레티놀 또는 토코페롤이 피부상에 방출된다. 본 발명의 분배시스템 사용의 중요한 이점은 전구체 분자의 가수분해율이 피부내에 존재하는 관련 효소에 좌우되는 상황과 비교하여 현저히 증가된다는 것이다. 일정한 적용, 예를 들면 볕에 타는 것을 방지하기 위한 적용에서 비타민 A의 원하는 농도가 순간 방출되는 이점은 명백하다(예를 들면 Beijersbergen van Henegouwen et al, Fat Sc. Technol. 94 (1992), 24-27 참조).

비타민 A 또는 비타민 E의 팔미테이트 유도체를 활성화하기 위해 적당한 리파제를 사용하는 것은 분명한 선택이다. 시중 입수가능한 지질분해 효소의 다수는 이들 전구체 분자를 활성 비타민 및 팔미트산으로 가수분해시킬 수 있을 것으로 예상될 수 있다. 그러나 화장품 용도에서의 리파제 사용은 화장품 조성물에 존재하는 오일의 파괴 및 사람 피부상에 존재하는 보호성 지질 화합물중 상당한 부분의 분해를 포함하여 몇가지 심각한 단점을 가지고 있다(Cosmetics & Toiletries 102 (1987), 36-42). 이러한 바람직하지 않은 상황을 회피하기 위해서는 각 비타민의 팔미테이트 유도체보다는 아세테이트를 사용하여 피부 지질을 공격하지 않고 비타민 전구체의 아세테이트 부분을 선택적으로 제거할 수 있는 효소의 사용을 가능하게 하는 것이 유리하다.

예를 들면 일정한 에스테라제/리파제는 짧은 사슬의 아실기(2-10 탄소원자)를 선호하며 긴(≥16 탄소원자) 지방 아실기를 가수분해시킬 수 없다. 그러한 에스테라제는 예를 들면 Recombinant Biocatalysis Inc. (Philadelphia, USA)로부터 시중 입수가능하다. 게다가 크실란 아세틸에스테라제(EP 507369 참조) 및 람노갈락투란 아세틸에스테라제(WO 93/20190 참조)는 식물세포벽 성분에 대해 활성이며 사람 피부상에 존재하는 지질을 가수분해시킬 것같지 않다. 효소의 이 카테고리와 별도로 에스테라제 활성은 또한 일정한 세린 프로테아제에 기인하였다. 이 용도에서 적당한 세린 프로테아제의 사용은 선택된 비타민 전구체의 동시 전환과 피부박리효과의 조합을 허용하기 때문에 유리하다.

또 다른 비타민인 아스코르브산은 사람 피부의 멜라민 형성에 대한 저해효과, 콜라겐형성 자극 및 항산화제 활성 때문에 화장품에서 이점이 주장되었다. 공교롭게도 아스코르브산은 그것의 불량한 안정성 때문에 어떤 화장품에도 적용될 수 없다. 따라서 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 안정한 수용성 아스코르브산 유도체가 몇몇 회사에 의해 개발 및 상품화되었다. 피부상에 포스파타제 효소가 존재함으로 인해 마그네늄 아스코르빌 포스페이트는 원위치에서 활성이지만 불안정한 아스코르브산으로 전환될 수 있다. 공교롭게도 피부상에서 자연발생하는 포스파타제 효소의 활성은 다소 낮다(Mima et al. Vitamins 41 (1970), 387). 본 발명의 분배시스템은 아스코르빌 포스페이트와 적당한 포스파타제의 조합을 가능하게 하여 피부상에서 아스코르브산의 신속한 형성을 보장한다. 이노시톨-헥사키스포스페이트(피테이트)로부터의 포스페이트 방출을 촉매화하는 효소 피타제, 특히 Aspergillus niger로부터의 피타제는 이 점에서 매우 적합한 포스파타제인 것같다.

전활성 비타민 유도체를 이 유도체의 안정화 부분의 원위치 제거에 의해 활성화시키는 접근법과 매우 유사하게 전구체 분자의 다른 유형은 효소적으로 변형될 수 있다. 안토시아닌 및 식품 등급 카민 레드를 포함하여 몇몇의 글리코실화 천연 착색제가 알려져 있다. 블롬(Blom)(Food Chemistry 12 (1983), 197-204)에 의해 기재된 바와 같이 β-글루코시다제와 레드 안토시아닌 안료의 조합은 수불용성의 착색 아글리콘을 초래한다. 본 발명의 분배시스템을 사용하면 아글리콘은 안정화된 β-글루코시다제 함유 조성물과 레드 안토시아닌을 함유하는 적당한 화장품 조성물의 분배 및 혼합시에 형성된다. 그것의 증가된 소수성으로 인해 아글리콘은 피부 또는 모발과 같은 소수성 표면에 보다 확고하게 부착되고 따라서 이들 표면으로부터 물에 의해 덜 효과적으로 제거된다.

다른 효소적 접근법은 본 발명의 분배시스템을 사용하여 모발의 산화 착색을 위해 반응성 착색제를 생성하는 것을 목적으로 한다. 이 때문에 안정화된 라카제 조성물은 착색제 전구체, 예를 들면 모노 또는 폴리페놀성 화합물을 함유하는 조성물과 조합된다(예를 들면 FR 2,694,018; EP 504005 참조).

본 발명의 분배시스템은 또한 살균 화합물의 원위치 퍼옥시다제-매개 생성을 위해 유리하게 사용된다. 한편으로 안정화된 옥시다제, 그리고 다른 한편으로 임의로 클리닝제와 함께 적당한 전구체 분자를 별도 수용하는 것은 한정된 기간의 세균활성을 가지는 일정한 살균제의 적용에 필수적인 것이다(US 4,476,108, US 4,588,586 참조). 그러한 자연발생 살균 화합물의 전형적 예는 과산화수소 및 할로겐화물로부터 할로퍼옥시다제에 의해 생성된 하이포할로산과 과산화수소 및 티오시안산염으로부터 락토퍼옥시다제에 의해 생성된 하이포티오시안산염이다. 모든 경우에 과산화수소는 필수적이지만 다소 불안정한 전구체이다.

과산화수소 용액은 주석산나트륨 또는 포스폰산과 같은 안정화제(예를 들면 Dequest 2010)를 사용하여 본 발명의 분배시스템에서 제2 수성 조성물에 안정하게 혼입될 수 있다. 이들 안정화제는 바람직하게는 Carbopol 934 또는 Rheovis CRXCA (Allied Colloids)와 같은 적당한 점성화제와 조합된다. 이 접근법에서 제1 조성물은 안정화된 효소 및 어떤 과산화수소-비상용성 화학약품을 함유한다.

본 발명의 분배시스템은 또한 과산화수소 생성 효소, 예를 들면 알코올 옥시다제에 의해 과산화수소의 효소적 원위치 생성을 가능하게 한다. 상기 과산화수소 생성 효소는 퍼옥시다제와 동일한 조성물에 혼입된다. 클리닝과 임의로 조합된 이러한 온화한 소독 형태는 습진 또는 종창의 여러 형태와 싸우기 위한 국소 적용의 분야에서 뿐 아니라 콘택트렌즈 클리닝 및 가정용 경질 표면 클리너와 같은 적용에서도 논점이 된다.

리포퍼옥시다제의 원위치 생성은 본 발명의 분배기 사용의 추가 예이다. 이 때문에 안정화된 리폭시게나제 조성물과 리놀레산 함유 조성물은 별도로 수용되고 분배시에 혼합된다. 한 조성물로 리폭시게나제와 리놀레산을 조제하는 것도 또한 가능한데 그 이유은 효소를 안정화시키는데 사용된 높은 폴리올 농도가 효소의 불활성을 더욱 보장하기 때문이다. 원위치에서 생성된 리포퍼옥사이드는 국소 적용, 예를 들면 탈모 또는 모발성장저해에 적합하다(Puig Muset et al., Arzneimittel & Forschung, 10 (1960), 234-239).

또한 효소로 이루어지는 제1 조성물을 추가의 활성 성분으로 이루어지는 제2 조성물과 조합하는 것이 가능하고, 이로써 상기 추가의 활성 성분도 당해 적용에서 원하는 활성을 나타내게 된다. 예를 들면 효소와 추가의 활성 성분 사이에 상승작용이 존재할 수 있다.

국소 적용과 전혀 다른 적용, 즉 빵 제조를 위해 분배기는 한편으로 베이킹 효소, 예를 들면 아밀라제, 헤미셀룰라제, 단백질 디술파이드 이성화효소, 리폭시게나제 및 다른 산화환원효소, 그리고 다른 한편으로 액체 빵 개선제의 추가 성분을 조합하는데 사용되고, 이로써 안정한 효소 기질이 밀가루 반죽에 존재하게 된다.

상승작용을 일으킬 수 있는 조합의 예는 프로테아제와 α-히드록시산과 같은 케라틴분해제의 조합이다. 소위 과산(α-히드록시산 또는 AHA)은 피부박리를 유도하여 항노화의 이점을 달성할 수 있는 약제로서 화장품 산업에서 명백해졌다. 단점은 높은 세포재생률에 필요한 낮은 pH치가 자극 현상을 동반한다는 것이다(Smith, W.P., Cosmetics & Toiletries Vol 109, pp 41-48, 1994). 자극을 최소화하기 위한 한 전략은 AHA 농도를 저하시키거나 화장품 조성물의 pH를 상승시키고 조성물에 단백질분해효소를 가하여 감소된 피부박리효과를 보충하는 것이다.

또 다른 예는 치아보호 제품의 분야에서 찾을 수 있다. 플루오르화 화합물을 함유하는 가루치약이 도입된 날로부터 치아 에나멜층의 플루오르화물 매개 강화를 통해 충치 발생률은 극적으로 감소되었다. 그 결과 치석에서 성장하는 세균 Streptococcus mutans는 충치의 주 잔류 원인의 하나로 부각되고 있다. S. mutans의 효과적 제거는 S. mutans를 에나멜에 부착시키는 보호성 수불용성 다당류 매트릭스를 용해시키는 것에 의해서만 가능하다(예를 들면 Hamada and Slade, Microbiol. Rev. 44 (1980), 331-384 참조). US 4,438,093에 개시된 바와 같이 뮤타나제 및 덱스트라나제와 같은 효소는 치석 형성을 방지 및 억제한다. 따라서 본 발명의 효소분배방법은 플루오르화물 함유 가루치약을 폴리올-안정화된 다당류 분해효소 조성물과 조합하는 편리한 수단을 제공한다.

본 발명에 따른 분배시스템은 국소 용도 이외의 다른 적용에도 유리하게 사용될 수 있다. 예는 모직물과 같은 섬세한 직물에 대한 세탁물의 손세탁 용도이다. 본 발명에 따른 분배시스템에서는 간단한 액체 세제와 안정화된 효소조성물이 별도로 수용되어 원하는 비로 동시에 분배된다.

실시예 1

상이한 유형의 폴리올로 이루어지는 조성물내 프로테아제의 저장안정성

상이한 유형의 폴리올내 여러가지 중성 프로테아제의 저장안정성을 예시하기 위해 상이한 공급원으로부터의 부분정제 프로테아제를 70% (w/w)의 부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 PEG 6000에 용해시키고 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 저장하였다. 여러가지 시간 간격으로 수성 완충제에 희석후 잔존하는 효소 활성을 측정하였다.

사용된 효소

Bacillus licheniformis로부터의 세린 프로테아제 분말을 Genencor International, Brughes, Belgium으로부터 얻었다.

비표준화된 중성 프로테아제(Bacillus amyloliquefaciens로부터의 메탈로-프로테아제)를 Gist-brocades, Seclin, France로부터 얻었다.

세린 프로테아제 또는 중성 프로테아제를 함유하는 안정화된 효소조제물을 70% (w/w) 부틸렌글리콜 (1,3-부탄 디올; BG), 프로필렌 글리콜 (1,2-프로판디올; PG) 또는 PEG 6000 (폴리에틸렌 글리콜 6000; PEG)에 효소 분말 요구량을 용해시켜 제조하였다. 각 용액에 아세트산칼슘 pH 6.0을 최대 효소안정성을 위해 0.1%의 농도로 가하였다. 어떤 생성된 침전물을 원심분리로 제거하고 그 후 다양하게 안정화된 효소용액을 5℃, 25℃ 또는 40℃에서 저장하였다. 여러가지 시간간격으로 샘플을 취하고 잔류 세린 및 중성 프로테아제 활성에 대해 시험하였다. 프로테아제 시험에서 폴리올 함유 효소 조제물의 천배 이상의 희석은 화학 오염물질로부터의 비-프로테아제 관련 상호작용의 부재를 보장하였다.

효소 활성은 중성 프로테아제 활성에 대해 기스트-브로카데스 프로토콜에 따라 측정하였다. 이 방법(ISL Method Number 61195)은 신청에 의하여 Gist-brocades Delft로부터 입수가능하다. 간단히 말하면 이 방법은 다음과 같다.

강하게 희석된 효소용액을 40℃, pH 7.0에서 0.3% Hammersten 카세인의 용액에 가한다. 60분동안 배양후 프로테아제 활성을 TCA의 첨가로 중지시킨다. 잘 혼합하고 4℃에서 30분동안 더 배양한 후 샘플을 원심분리한다. 맑은 상청액의 흡광도를 증류수에 대해 275nm의 파장에서 측정한다. 참고 프로테아제 샘플과 비교하여 최종 프로테아제 활성을 얻는다.

결론

- 70% 부틸렌 글리콜 또는 프로필렌 글리콜에 용해된 세린 프로테아제는 중성 프로테아제보다 더 안정하다.

- 부틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜은 효소 안정화에 있어서 PEG 6000보다 명백히 우수하다.

세린 프로테아제

잔류 단백질분해활성
	5℃			25℃			40℃
일	BG	PG	PEG	BG	PG	PEG	BG	PG	PEG
1	9670	10050	9970	9670	10050	9970	9670	10050	9970
9	9590	9840	9980	9770	9940	8420	9460	9580	2530
22	9390	9600	9500	9088	9540	4620	9120	9440	2030

중성 프로테아제

잔류 단백질분해활성
	5℃			25℃			40℃
일	BG	PG	PEG	BG	PG	PEG	BG	PG	PEG
1	17900	18500	5690	17900	18500	5690	17900	18500	5690
9	16900	16600	3580	15900	14600	1660	3840	3540	<2000
22	16300	17600	3370	15200	12600	2930	<2000	4410	<2000

실시예 2

안정화된 조제물로부터의 프로테아제 재활성화

재료

비표준화된 B. amyloliquefaciens로부터의 중성 프로테아제를 Gist-brocades Seclin (프랑스)으로부터 얻었다.

안정화된 효소 조제물

	중량 (g)	최종 농도
물	24.25	48.5%
중성 프로테아제	25 mg
프로필렌 글리콜	25.0	50%
히드록시프로필 셀룰로스(Hercules로부터의 Klucel 타입 H)	0.75	1.5%

제조: 점성화제 히드록시프로필 셀룰로스를 프로필렌 글리콜과 혼합한 후, 효소가 용해되어 있는 물을 가하여 하룻밤 혼합한다.

수성 조제물

	중량 (g)	최종 농도
물	48.5	97%
히드록시프로필 셀룰로스	0.75	1.5%
프로필렌 글리콜	1.0	2%

제조: 히드록시프로필 셀룰로스 및 프로필렌 글리콜을 혼합하고 계속해서 물에 가하여 하룻밤 혼합한다.

일정량의 안정화된 프로테아제 조제물(보통의 또는 수성 조제물로 희석된)을 Agfapan 25 필름 플레이트상에 스포팅하였다. 효소가 활성이라면 필름 플레이트상의 젤라틴이 단백질분해되어 다소 뚜렷한 반점을 남길 것이다. 이 분석법은 생체내에서 케라틴의 거친 상층을 분해시키는 프로테아제의 능력을 모방한다.

보통의 안정화된 프로테아제 조제물과 함께 필름 플레이트를 배양한 후에는 뚜렷한 반점이 관찰되지 않는데, 이것으로 이 프로테아제는 폴리올의 고농도로 인해 활성이 아님을 알 수 있다. 안정화된 프로테아제 조제물을 상기 수성 조제물로 1:1 및 1:2 희석하여 각각 26% 및 18%의 프로필렌 글리콜 농도를 만들면 희석인자에 따라 증가하는 직경을 가지는 뚜렷한 반점이 생기는데, 이것으로 프로테아제의 재활성화를 알 수 있다(도 1 참조). 1:1 희석은 곧 프로테아제의 부분재활성화를 초래하지만 폴리올 농도가 너무 높아 국소 용도에는 허용할 수 없다.

비안정화된, 즉 프로필렌 글리콜을 함유하지 않는 효소 제제는 약 1주일내에 불활성이 되는 것으로 보였다.

따라서 본 발명에 따라 안정화된 효소는 적당한 조성물에 의한 희석으로 재활성화될 때까지는 본질적으로 불활성이다.

실시예 3

상이한 α-히드록시산으로 이루어지는 조성물내의 단백질분해활성

이 실시예는 산성조건하 및 α-히드록시산(AHA) 존재하의 다수의 단백질분해효소의 효능을 예시한다. 단백질분해활성은 사진용 젤라틴 필름상에서 분석되었다.

사용된 효소 및 재료

Bacillus licheniformis로부터의 세린 프로테아제 분말을 Genencor International, Brughes, Belgium으로부터 얻어 35% (w/w) 부틸렌 글리콜, 35% (w/w) 글리세롤, 0.1% (w/w) Ca(Ac)₂ pH 6.0 및 물에 용해시켰다. 용액내의 효소활성을 37℃, pH 7.0에서 약 500 중성 프로테아제 단위의 활성을 얻도록 조정하였다(실시예 1 참조).

Rhizomucor miehei로부터의 아스파르트산 프로테이나제액체(210.000 우유응고단위/ml)를 Gist-brocades, Seclin, France로부터 얻었다.

파파야 과실로부터의 시스테인 프로테이나제(Food Chemical Codex III에 따라 분석할 때 6천만 파파인단위/그램)를 Gist-brocades, Seclin, France로부터 얻었다. 사용하기 전에 효소분말 20mg을 탈염수 2ml에 용해시켜 시스테인 프로테이나제의 용액을 갓 제조하였다.

AHA 저장 용액을 다음 프로토콜에 따라 제조하였다. l-락트산(Boom Chemie, Netherlands) 5그램 및 글리콜산(Merck, Germany) 5그램을 물 80ml에 각각 용해시키고 25% NaOH로 pH4.0으로 조정하고, 그 후 물을 100ml까지 가하여 각각 l-락트산 및 글리콜산의 5% 용액을 얻었다. 살리실산(Acros, Belgium) 5그램을 물 80ml에 용해시키고 25% NaOH로 pH 4.4(pH 4.0에서의 용해는 불가능하였다)로 조정하고 그 후 물을 100ml까지 가하여 살리실산의 5% 용액을 얻었다.

인산 완충제 pH 7.0 및 시트레이트 HCl 완충제 pH 4.0은 Merck, Germany로부터 얻었다.

실험

세린 프로테아제 용액 0.1그램을 수용하는 5개의 유리 바이얼, 아스파르트산 프로테아제 0.1그램을 수용하는 5개의 유리 바이얼, 및 시스테인 프로테아제 용액 0.1그램을 수용하는 5개의 유리 바이얼을 준비하였다.

각각의 5 바이얼 시리즈에 각각 완충제 pH 7.0, 완충제 pH 4.0, 5% l-락트산, 5% 글리콜산 및 5% 살리실산을 가하였다. 효소와 완충제 또는 산을 혼합한 후 15가지 용액 각각의 40 마이크로리터 샘플을 Agfapan APX100 사진용 필름에 행렬로 적용하였다. 그 다음 샘플을 가진 필름을 37℃에서 적셔지고 덮개가 있는 페트리접시에서 1시간동안 배양하였다. 배양후 사진용 필름을 수돗물로 잘 헹구고 건조시켰다. 젤라틴층의 제거를 단백질분해활성의 척도로서 사용하였다.

얻어진 결과(도 2 참조)로부터 세린 프로테아제는 여러가지 AHA의 존재 또는 부재하에 pH 7.0 부근에서만 활성이었고 4.0 부근의 pH치에서는 활성이 아니었음이 명백해진다.

아스파르트산 프로테이나제는 살리실산의 존재하에 pH 7.0 또는 pH 4.4에서 활성이 아니었으나 5% l-락트산 또는 5% 글리콜산의 존재 또는 부재하에 pH 4.0에서 충분히 활성이었다.

시스테인 프로테이나제는 l-락트산, 글리콜산 또는 살리실산의 존재하에 pH 7.0과 보다 낮은 pH치에서 활성이다. 놀랍게도 AHA중 어느 하나의 부재하에서는 pH 4.0에서 낮은 단백질보호활성이 기록되었다.

결론

- 낮은 pH치 및 AHA와 조합하여 아스파르트산 프로테이나제는 세린 프로테이나제보다 바람직하다.

- 파파야로부터의 시스테인 프로테이나제는 중성 및 산성 pH치 둘다에서 단백질분해활성을 나타낸다.

- 조건에 따라 가장 적당한 단백질분해효소를 선택해야 한다.

실시예 4

아스코르빌 포스페이트의 효소활성

보고된 포스파타제 활성을 가지는 3가지의 상이한 효소를 70% 프로필렌 글리콜중에서 조제하고 마그네슘 아스코르빌 포스페이트와 함께 여러가지 조건하에 배양하였다. 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 탈인산화를 600HMz 양성자 NMR을 사용하여 정량화하였다.

효소

피타제(Aspergillus niger: 글리세롤 비함유, 약 12.000 FTU/그램 함유) 및 포스파타제(Aspergillus niger: 동결건조분말, 약 10.000 단위/그램 함유)는 Gist- brocades, Delft, the Netherlands로부터 얻었다.

포테이토 포스파타제(동결건조분말)는 Sigma로부터 얻었다.

실험

D₂O 및 2mmol/ℓ의 EDTA(pH 7-8)중의 70% (w/w) 프로필렌 글리콜을 함유하는 용액에 1% (w/w)의 상기 효소 제제 각각을 용해시켰다.

아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 완충되고 37℃로 유지된, 1% (w/w) 마그네슘 아스코르빌 포스페이트(NIKKO Chemicals Co., Japan)를 함유하는, D₂O중의 이들 효소 저장 용액을 10배 희석하면 4시간의 기간내에 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 50%가 분해되었다.

이 분석에서 37℃에서 1주일동안 프로필렌 글리콜 함유 효소 저장용액의 저장은 효소 활성에 두드러진 영향을 미치지 않았다.

70% (w/w) 프로필렌 글리콜 존재하의 효소와 기질의 조합은 이들 조건하의 효소 불활성을 명백히 입증한다. D₂O중의 5% (w/w) 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 저장용액에서 출발하여

- 70% (w/w) 프로필렌 글리콜

- 1% (w/w) 마그네슘 아스코르빌 포스페이트

- 2mmol/ℓ EDTA

- pH 7-7.5

를 함유하는 혼합물을 제조하였다.

완전 용해(이 동안 겔같은 조직이 형성되었다)후, 1% (w/w)의 (사전용해된) 산성 포스파타제 및 포테이토 포스파타제 효소를 가하였다. 얻어진 혼합물을 37℃에서 1주일동안 배양하고 그 후 가수분해된 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 농도를 효소를 함유하지 않은 유사 샘플과 대비하여 측정하였다.

효소 가수분해가 검출될 수 없었기 때문에, 이것은 고농도의 폴리올이 존재할 경우에는 효소활성이 결핍됨을 한번 더 입증한다.

실시예 5

적용 조건하의 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 가수분해에 대한 피타제의 성능

피타제(NatuPhos^R 5000L, Gist-brocades, Delft, the Netherlands)는 적용조건하에 유효함이 증명된다. 이 시험에서는 100mM Na-아세테이트 pH 6.0중의 1% 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 2ml를 효소 용액 200μl와 혼합하였다. 효소용액은 70% 글리세롤을 함유하는 용액에 NatuPhos^R 5000L를 1 내지 5배 희석하여 얻었다(377U/g 마그네슘 아스코르빌 포스페이트를 얻기 위해; 1U는 pH 6.0 및 30℃에서 1% 비타민 C-포스페이트로부터 분당 포스페이트 1μmol을 유리시키는 효소의 양이다). 상이한 배양시간후 20% TCA 1ml를 가하여 반응을 종료시켰다.

마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 전환후 ³¹P-NMR을 사용하여 포스페이트 농도를 측정하였다. 30℃에서는 마그네슘 아스코르빌 포스페이트의 85% 전환이 30분내에 얻어짐이 증명될 수 있었다. 37℃에서는 89%의 전환이 동일 기간내에 얻어졌다. 60분 배양후에는 수율이 약 90%까지 증가되었다. 30분내의 완전배양에 필요한 최소 활성은 122U/g 비타민 C-포스페이트였다.

실시예 6

효소적 과산화수소 생성

카탈라제 농도가 낮은 알코올 옥시다제(Sigma로부터의 Hansenula sp.) 분말을 물에 용해시키고 그 후 글리세롤을 최종 글리세롤 농도가 60% (w/w)가 되도록 하였다. 이 안정화된 효소 용액을 실온에서 1개월동안 저장한 후 효소용액을 2% 에탄올 및 0.01M 포스페이트 pH 7을 함유하는 수용액에 10배 희석하였다. 과산화수소의 형성은 에탄올 수용액에 Perid 테스트스트립(Boehringer Mannheim, Germany)를 침지시킬 때 녹색-청색의 발색으로 입증되었다. 이와 같이 생성된 과산화수소는 계속해서 퍼옥시다제에 대한 기질로서 사용될 수 있다.

한 용기에 안정화용 액체중의 락토퍼옥시다제(Sigma)와 같은 적당한 퍼옥시다제와 과산화수소 생성효소를, 그리고 다른 용기에 필요한 효소 전구체를 도입함으로써 본 발명의 방법에 따라 두 용기의 내용물을 혼합할 때 활성 살균 화합물이 얻어진다.

실시예 7

비타민 A-아세테이트의 탈아세틸화

효소

피칸타제 농축물(Rhizomucor miehei, 약 30.000 BGLE/g 함유)은 Gist- brocades, Seclin, France로부터 얻었다.

순수 막사타제(Bacillus subtilis, 약 2.16 BYU/kg 함유)는 Genencor International B.V., Delft Netherlands로부터 얻었다.

G999 포스포리파제 L(Aspergillus niger, 약 1000u/g 함유)은 Enzyme Bio- Systems Ltd., Englewood Cliffs, NJ, U.S.A.로부터 얻었다.

크실란 아세틸에스테라제(EP0507369에 기재되어 있고 기탁된 미생물을 통해 얻을 수 있는 A. niger 형질전환체 TrA10). 접종후 형질전환체 TrA10을 리터당 대두 펄프 30그램을 함유하는 배양배지상에서 성장시켜 효소활성을 유도하였다. 통기 및 최소 pH치 4.0하에 30℃에서 48시간 성장후 발효 육즙을 원심분리하고 상청액을 여과하였다. 제1 여과는 Seitz K700 필터상에서, 제2 여과는 Seitz Supra 250 필터상에서, 미생물 여과는 Seitz Supra EKS상에서 수행하였다. 얻어진 액체를 한외여과를 사용하여 인자 10만큼 농축시키고 그 후 농축물을 동결건조시켰다. 최종 분말내의 크실란 아세틸에스테라제 활성은 약 300단위/그램 분말인 것으로 추정되었다.

레티놀-아세테이트 가수분해

효소용액을 효소분말(즉 피칸타제, 막사타제 및 크실란 아세틸에스테라제) 6밀리그램을 탈염수 1밀리리터에 용해시켜 제조하였다. 액체 G999 제제 16마이크로리터를 탈염수 1밀리리터에 희석시켰다. 레티놀 아세테이트(Sigma)의 저장용액을 레티놀 아세테이트 55밀리그램을 메탄올 1밀리리터에 용해시켜 제조하였다.

효소 배양을, 인산 완충제 pH 5.5 100 마이크로리터, 효소용액 100 마이크로리터 및 레티놀 아세테이트 저장용액 200 마이크로리터를 탈염수 500 마이크로리터에 가하여 수행하였다. 혼합후 여러가지 용액을 1 또는 4시간동안 37℃에서 아르곤하에 배양하였다. 계속해서 용액을 동결건조시키고 중수소화 클로로포름(Merck, Germany)을 가하였다. 레티놀 아세테이트의 아세테이트 부분 제거를 600 MHz 양성자 NMR을 사용하여 측정하였다.

효소	레티놀 아세테이트의 가수분해
효소	1시간후	4시간후
막사타제	-	-
G999	-	+
크실란 아세틸에스테라제	0	++
피칸타제	+	++
- = 가수분해없음; 0 = 검출가능한 가수분해 + = 현저한 가수분해; ++ = 완전한 가수분해

지질 가수분해

에스테르화 비타민의 몇몇 적용에서 지질분해활성을 가지는 효소에 의한 비타민의 재활성화는 덜 바람직하다. 예를 들면 화장품에 포함된 비타민 전구체의 재활성화동안 화장품에 포함된 오일의 효소분해는 회피되어야 한다. 이 점에서 트리글리세리드 오일에 대해 분해효과를 갖지 않는 비타민 활성화 효소를 이용하는 것이 유리할 것이다. 상기한 레티놀 아세테이트 분해 효소의 트리글리세리드 분해효과를 입증하기 위해 3가지 활성효소에 대해 유화된 올리브유의 가수분해를 정량화하는 시험을 실시하였다.

폴리비닐알코올 및 물중의 올리브유의 유액을 제조하였다. 10미크론보다 큰 오일 방울은 생기지 않는다. 효소용액의 첨가후 지방산의 효소유리에 의해 생기는 pH 저하는 수산화나트륨에 의한 일정한 적정으로 상쇄된다. pH 7.5 및 37℃에서 고정된 배양기간후, 사용된 수산화나트륨의 총량을 측정하고 지질분해활성에 대한 (상대)값으로서 사용한다. 이 방법의 상세한 내용은 문서 CQA 4047에 기재되었으며 신청에 의하여 Gist-brocades, Seclin, France로부터 얻을 수 있다.

효소	지질분해활성/그램 효소
G999	<1
크실란 아세틸에스테라제	110
피칸타제 농축물	20.000

결론

- 리파제를 포함한 여러가지 효소는 비타민 A-아세테이트를 탈아세틸화할 수 있다.

- G999 및 크실란 아세틸에스테라제 둘 다 탈아세틸화 활성을 매우 낮은 지질분해활성과 조합시키기 때문에 특히 관심있는 효소이다. 더욱이 이들 효소에 대한 천연 기질(즉 리소포스포리피드 및 아세틸화 크실란)은 보통 사람 피부상에서는 생기지 않는다.

실시예 8

결정성 프로테아제의 현탁

다중 투여량 분배 시스템에서 고정화되고 안정화된 물질의 적당한 현탁은 최종 조성물에 활성 물질을 균일하게 투여하는 것을 보장하기 위해 중요하다. 현탁방법은 고정화된 활성 물질의 침강없이 장기간저장을 가능하게 해야 한다.

재료

가교된 프로테아제(서브틸리신) 결정의 수용액인 ChiroCLEC-BL은 Altrus Biologics Inc., Cambridge, MA, USA로부터 얻었다.

점성화용 폴리머인 Carbopol-Ultrez-10은 BF Goodrich, The Hague, Netherlands로부터 얻었다.

ChiroCLEC-BL의 균질한 수성 현탁액으로부터 4.8그램의 샘플을 얻고 원심분리하여 결정성 물질을 수집하였다. 상청액의 제거후 결정을 탈염수로 1회 세척하고 재원심분리하고 그 후 결정을 35% 글리세롤, 35% 부틸렌 글리콜 및 0.4% Carbopol을 함유하는 조성물 10그램의 최종량에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액의 pH를 트리에탄올아민을 사용하여 5.5로 조정하였다.

잘 균질화시킨 후 현탁액을 40℃에 두었다. 이 온도에서 1개월 배양후 결정의 침강은 관찰되지 않았다. 효소현탁액의 최종희석은 효소활성을 회복시킨다.

실시예 12

분배 시스템

2가지의 별도 수용된 비상용성 화합물을 동시 투여하는데 적합한 분배시스템은 잘 알려져 있다. 그것으로서 도 3에 개략적으로 도시된 분배시스템(Maplast, Italy제 분배기)은 소형의 2챔버식 일회용 파우치로부터 상이한 제품 구획을 사용하는 튜브 또는 비상용성 압출물들을 분리하기 위해 압출성이고 점성이며 비교적 불활성인 물질을 사용하여 구획화된 튜브에 이르는 많은 제품중에서 단지 일례에 불과하다.

도 3에 도시된 분배기는 투여 헤드(C)를 가압함으로써 A와 B에 별도 수용된 2가지 화합물을 동시 투여할 수 있다. 투여 헤드(C)를 가압하면 2개의 소형 펌프가 작동되고 이것은 계속해서 2가지 화합물을 대략 같은 부피로 분배한다. 투여 헤드의 설계에 따라 화합물은 2개의 별도 흐름 또는 단지 한 개의 흐름으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따르면 안정화된 수성 효소 조성물을 비효소 함유 기본 조성물과 함께 예를 들면 1:2의 비로 전달할 수 있는 분배장치가 요구된다.

도 2에 도시된 분배기에 대해 설명하면, 2개의 펌프중 한 개는 투여 헤드(C)의 단 한번의 스트로크로 다른 펌프 부피의 적어도 2배를 투여할 수 있다.

2챔버식 일회용 파우치에 대해 설명하면, 효소 조성물을 수용하는 챔버는 다른 챔버의 적어도 절반의 제품 부피를 수용한다.

2구획 튜브에 대해 설명하면, 동일 압력하에 효소없는 조성물을 수용하는 구획용의 방출 오리피스는 다른 구획의 방출 오리피스의 적어도 2배의 제품 통과를 허용한다.

압출성 물질을 사용하여 구획화된 튜브에 대해 설명하면, 효소없는 조성물은 효소함유 제품부피의 적어도 2배로 튜브내에 존재한다.

Claims

제1 수성 조성물을 함유하는 제1 챔버 및 제2 수성 조성물을 함유하는 제2 챔버를 포함하는 두 가지 수성 조성물의 동시 송달을 위한 분배 시스템으로서,

제1 챔버는 폴리올의 존재에 의하여 안정화되는 적어도 하나의 효소의 안정한 조제물을 함유하고, 제2 챔버는 제 1 수성 조성물을 희석함에 의하여 효소를 재활성화하기 위한 수성 조성물을 함유하며, 분배 장치는 직접 적용되는 최종 조성물을 얻기 위하여 두 가지 수성 조성물의 동시 송달을 야기하는 분배 수단을 포함하고, 최종 조성물은 유효농도의 재활성화된 효소를 함유하는 것을 특징으로 하는, 두 가지 수성 조성물의 동시 송달을 위한 분배시스템.
제 1 항에 있어서, 제1 및 제2 조성물은 1:1 내지 1:50 범위의 비로 분배되는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제2 조성물은 수중유형 에멀젼을 포함하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 조성물은 카라기난, 셀룰로스 유도체, 폴리아크릴산, 점토, 폴리에틸렌 글리콜, 및 크산탄 같은 하이드로콜로이드를 포함하는 점성화제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 4 항에 있어서, 점성화제는 수성 조성물에서 3차원 망상조직을 형성할 수 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제1 조성물은 일정량의 염을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제1 조성물은 환원제, 칼슘염, 기질 또는 기질관련 리간드의 군으로부터 선택되는 효소 안정화제의 일정량을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소는 입자형태로 조제되는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 8 항에 있어서, 입자는 적어도 5 내지 10 ㎛의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 8 항에 있어서, 입자 형태는 결정인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 8 항에 있어서, 입자 형태는 고체 담체 상에 고정화된 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제2 조성물은 효소에 대하여 기질인 활성 화합물 전구체를 함유하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 12 항에 있어서, 전구체는 비타민 전구체인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 폴리올은 글리세롤, 솔비톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 말토덱스트린, 수크로스, 락토스, 포도당, 트레할로스의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제1 조성물의 폴리올은 30-90%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 15 항에 있어서, 제1 조성물의 폴리올은 40-90%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소는 프로테아제인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소는 10 개 미만의 탄소 원자를 갖는 저급 사슬 아실기를 선호하는 에스테라제인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소는 포스파타제인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.
제 19 항에 있어서, 포스파타제는 피타제인 것을 특징으로 하는 분배 시스템.